BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian meliputi pipet tetes, gelas

kimia, gelas ukur, kertas saring, timbangan analitik, kapas, timbangan analitik, rak

tabung, tabung reaksi, tabung efendorf, blender, sonde oral, disposable 1 mL,

sarung tangan, pinset, objek gelas, jarum pentul, sterofoam, tisu, cawan petri, rotary

evaporator, photometer, ram kawat, baki untuk tikus.

3.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Buah nanas (Ananas

comoscus L. Merr.), tikus putih, pakan tikus, NaCl 0,9%, etanol 70%, eter, gelatin

1%, vanillin 10%, asam klorida 2N, asam sulfat pekat, pereaksi Dragendorf,

pereaksi Mayer, pereaksi Lieberman-Burchard, serbuk Mg, larutan besi(III)

klorida, ammonium sulfat., reagen kit SGOT dan SGPT.

3.2 Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan

galur wistar berumur sekitar 6-8 bulan bulan, dengan bobot 200-250 gram. Hewan

uji diperoleh dari Kecamatan Sukaraja. Tikus yang digunakan sudah dipastikan

identitasnya dan dinyatakan sehat.

22
 Untuk menentukan jumlah subjek/hewan uji minimal ditentukan

berdasarkan rumus Federer yaitu (𝑡 − 1)(𝑟 − 1) ≥ 15. t merupakan jumlah

perlakuan yang akan diujikan pada hewan, sedangkan r merupakan banyak

pengulangan pada tiap perlakuan

(𝑡 − 1)(𝑟 − 1) ≥ 15

(6 − 1)(𝑟 − 1) ≥ 15

5𝑟 − 5 ≥ 15

𝑟=4

Sehingga jumlah tikus putih jantan galur wistar sebagai subjek yang akan

digunakan dalam penelitian yaitu sejumlah 24 ekor tikus untuk 6 kelompok

perlakuan.

3.3 Sampel Penelitian

3.3.1 Determinasi

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah nanas muda

(Ananas comoscus L. Merr.) yang diperoleh dari Tasikmalaya, Jawa Barat. Bahan

baku yang telah dikumpulkan kemudian dipastikan identitasnya di Universitas

Padjajaran, Bandung.

3.3.2 Proses Pengolahan Simplisia Kering

Buah nanas yang digunakan pada penelitian ini adalah buah yang masih

muda, dengan ciri kulit yang berwarna hijau, daging buah berwarna putih sedikit

kekuningan. Kulit buah nanas dikupas dan membersihkan dari kotoran yang

menempel, lalu dicuci menggunakan air yang mengalir. Kemudian buah dipotong-

23
potong, setelah itu dikeringkan dengan menggunakan oven kemudian langsung

dimasukkan ke dalam blender sehingga didapatkan serbukan buah nanas yang

halus.

3.3.3 Pembuatan Ekstrak

Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Yaitu dengan cara

memasukkan bahan yang telah ditimbang kedalam maserator. Ditambahkan dengan

pelarut etanol 70% sebagai pelarut kedalam maserator hingga simplisia terendam

pada suhu ruang selama 24 jam. Kemudian disaring menggunakan kertas saring,

sambil sesekali dilakukan pengadukan. Residu direndam beberapa kali dengan jenis

dan jumlah pelarut yang sama sampai filtrat menjadi tidak berwarna lagi, setelah

itu diuapkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

3.4 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia ini dilakukan terhadap simplisia dan ekstrak buah nanas.

Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui senyawa metabolit sekunder dari

simplisia yang meliputi uji alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, polifenol,

seskuiterpenoid, steroid, triterpenoid, dan kuinon.

3.4.1 Alkaloid

Simplisia dari buah nanas ditambahkan menggunakan ammonia encer

kemudian digerus didalam mortir. Lalu ditambahkan beberapa mL kloroform

sambil digerus, setelah itu disaring. Setelah disaring, filtrat kemudian dikocok

dengan asam klorida 2N. Lapisan asam dipisahkan, dan dibagi menjadi 3 bagian.

Bagian pertama digunakan sebagai blanko. Bagian kedua diberi pereaksi Mayer,

24
untuk diamati ada atau tidak adanya endapan warna putih yang terbentuk. Dan

untuk bagian ketiga ditetesi pereaksi Dragendorf, dan juga diamati ada atau tidak

adanya endapan (Farnsworth, 1966).

3.4.2 Flavonoid

Simplisia digerus dalam mortar dan dipanaskan dengan air diatas penangas

air, kemudian disaring. Filtrat yang dihasilkan dimasukkan kedalam tabung reaksi.

Setelah itu, ditambahkan serbuk Zn, larutan alkohol asam klorida (1:1) dan amil

alkohol. Kemudian campuran dikocok kuat-kuat. Adanya flavonoid akan

menyebabkan filtrat berwarna merah, kuning atau jingga yang dapat ditarik oleh

amil alkohol (Farnsworth, 1966).

3.4.3 Saponin

Simplisia dari buah nanas dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian

ditambahkan air, setelah itu dipanaskan. Setelah dingin dikocok kuat-kuat selama

beberapa menit. Pembentukan busa sekurang-kurangnya setinggi 1 cm. dan selama

beberapa menit dan tidak hilang dengan penambahan asam menunjukkan adanya

senyawa saponin. (Farnsworth, 1966).

3.4.4 Steroid dan Triterpenoid

Simplisia dari buah nanas dimasukkan ke dalam mortar, kemudian

ditambahkan eter lalu digerus. Setelah itu fase eter diambil, kemudian diuapkan

sampai kering yang menandakan bahwa eter telah menguap. Pada residu diteteskan

pereaksi Lieberman-Burchard. Jika terbentuk warna ungu menunjukkan adanya

25
triterpenoid, jika terbentuk warna hijau hingga biru menunjukkan adanya steroid.

(Farnsworth, 1966).

3.4.5 Tanin dan Polifenol

Simplisia buah nanas dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian

dipanaskan diatas penangas air selama kurang lebih 5 menit, lalu didinginkan dan

disaring. Filtrat dibagi menjadi 2 bagian. Filtrat pertama ditambah dengan gelatin

1%, jika terbentuk endapan warna putih maka menunjukkan adanya tanin. Filtrat

kedua ditambah dengan larutan FeCl3 1%, jika terbentuk warna biru tua

menunjukkan positif asanya polifenol. (Farnsworth, 1966).

3.4.6 Monoterpen dan Seskuiterpen

Simplisia buah nanas ditambahkan dengan eter lalu dilakukan penyaringan.

Filtrat ditempatkan pada cawan uap, lalu dibiarkan sampai eter menguap. Pada

residu filtrat ditambahkan larutan vanillin 10% dalam asam sulfat pekat. Jika

terbentuk warna-warna maka menunjukkan adanya senyawa monoterpene dan

seskuiterpen. (Farnsworth, 1966).

3.4.7 Kuinon

Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air, kemudian disaring. Filtrat

ditetesi larutan NaOH, terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan

adanya senyawa kelompok kuinon (Farnsworth, 1966).

26
3.5 Perhitungan Dosis

Telah dilakukan pengujian pengaruh ekstrak buah nanas muda terhadap

tikus bunting dengan dosis 0,2392 gram/200 gram BB tikus yang dapat menurunkan

jumlah embrio. Sehingga penelitian ini dilakukan dengan dosis yang tercantum

dalam OECD untuk pemberian dosis sediaan uji toksisitas akut apakah toksik

terhadap organ hati pada tikus atau tidak. Penelitian sebelumnya menguji 1 buah

nanas dengan bobot buah nanas 710,94 gram.

Tahapan perhitungan dosis:

a. Dosis empiris buah nanas basah : 710,94 gram

b. Dosis empiris kering : 35 gram

Konversi dosis empiris kering ke ekstrak

Serbuk buah nanas yang dimaserasi sebanyak 500 gram kering didapatkan

ekstrak kental sebanyak 189,86 gram.

𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑛𝑎𝑛𝑎𝑠 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔

× 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑘𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙
𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑛𝑎𝑛𝑎𝑠 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘

35 𝑔𝑟𝑎𝑚
= × 189,86 𝑔𝑟𝑎𝑚 = 13,2902 𝑔𝑟𝑎𝑚
500 𝑔𝑟𝑎𝑚

Konversi ke tikus = 13,2902 𝑔𝑟𝑎𝑚 × 0,018 = 0,2392 𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠

(doosis efektif) (Puspasari, 2016).

Dosis toksisitas akut lainnya digunakan dosis dari hasil evaluasi berdasarkan

kriteria bahaya yang tercantum dalam Thirteenth Addendum to The OECD

Guidelines for The Testing of Chemicals.

Dosis 1 = 0,2392 g/200 g BB tikus

200
Dosis 2 = 5 mg/kg BB tikus = 1000 × 5 𝑚𝑔 = 1 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠

27
 200
Dosis 3 = 50 mg/kg BB tikus = 1000 × 50 𝑚𝑔 = 10 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠

200
Dosis 4 = 300 mg/kg BB tikus = 1000 × 300 𝑚𝑔 = 60 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠

200
Dosis 5 = 2000 mg/kg BB tikus = × 2000 𝑚𝑔 =
1000

400 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠

Pada penelitian ini dosis efektif ekstrak etanol buah nanas (Ananas

comoscus L. Merr.) untuk penurunan jumlah embrio tikus yaitu sebesar 0,2392

gram/200 gram BB tikus.

Untuk pengujian toksisitas hati/hepatotoksik dari ekstrak etanol buah nanas

(Annanas comoscus Merr.) digunakan 6 kelompok hewan uji, yaitu:

Tabel 3.1 Kelompok Perlakuan

Kelompok Perlakuan Waktu
Normal Kelompok normal hanya diberi pakan dan air minum 14 hari
saja
Dosis Efektif Kelompok yang diberi ekstrak etanol buah nanas 14 hari
(Annanas comoscus Merr.) dosis 0,2392 gram/200
gram BB tikus.
Dosis 1 Kelompok yang diberi ekstrak etanol buah nanas 14 hari
(Annanas comoscus Merr.) dosis
1 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠 .
Dosis 2 Kelompok yang diberi ekstrak etanol buah nanas 14 hari
(Annanas comoscus Merr.) dosis
10 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠 .
Dosis 3 Kelompok yang diberi ekstrak etanol buah nanas 14 hari
(Annanas comoscus Merr.) dosis
60 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠.
Dosis 4 Kelompok yang diberi ekstrak etanol buah nanas 14 hari
(Annanas comoscus Merr.) dosis
400 𝑚𝑔⁄200 𝑔 𝐵𝐵 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠 .

Sebelum dilakukan percobaan, hewan uji atau tikus diadaptasikan selama 7

hari. Tikus dibagi menjadi enam kelompok yang masing-masing terdiri dari 4 ekor

tikus. Setiap kelompok tikus diberi dosis kemudian diamati selama 14 hari.

28
 Pada hari ke 15, tikus tersebut diambil darah dari tikus, darah diambil dari

vena lateralis yang berada di ekor tikus. Darah tersebut kemudian ditampung pada

tabung efendorf, kemudian dimasukkan kedalam sentrifuga dengan kecepatan 3000

rpm selama 15 menit. Dari proses ini didapat plasma dan serum darah secara

terpisah. Selain itu, organ hati diambil kemudian ditimbang untuk mengetahui

indeks organnya.

3.6 Prosedur Penetapan Kadar Enzim SGPT dan SGOT

Sebelum melakukan pemeriksaan serum darah yang telah dipisahkan dari

hasil sentrifugasi, terlebih dahulu dilakukan pemeriksaan terhadap blanko. Berikur

merupakan penetapan kadar SGOT dan SGPT. Untuk menentukan kadar SGOT,

sebanyak 100 µL serum yang diperoleh, ditambah reagen kit sebagai berikut:

Tabel 3.2 Penambahan Reagen Kit SGOT dengan Sampel

Reagen Blanko Standar Sampel
R1 1000 µL 1000 µL 1000 µL
R2 250 µL 250 µL 250 µL
Standar - 100 µL -
Sampel - - 100 µL

Pada suhu ruang langsung dibaca pada fotometer dengan panjang

gelombang 340 nm dengan faktor 1746 tanpa diinkubasi terlebih dahulu. Karena

menggunakan metode enzimatik dimana proses inkubasi langsung pada saat sampel

sudah berada dalam fotometer (Diasys, 2014).

Reagen SGOT terdiri dari :

Tabel 3.3 Komponen Reagen Kit SGOT

R1 R2
TRIS 2-Oxoglutarate
L-Aspartate NADH

29
 MDH (Malat dehydrogenase)
LDH (Lactate dehydrogenase)
(Diasys, 2014).

Prinsip pemeriksaan SGOT:

𝑆𝐺𝑂𝑇/𝐴𝑆𝑇
𝛼 − 𝑘𝑒𝑡𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡 + 2𝑎𝑠𝑝𝑎𝑟𝑡𝑎𝑡 → 𝑂𝑥𝑎𝑙𝑜𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡 + 𝐿 − 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡

𝑀 𝐷𝐻
𝑂𝑥𝑎𝑙𝑜𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻 + → 𝐿 − 𝑚𝑎𝑙𝑎𝑡 + 𝑁𝐴𝐷 + + 𝐻2 𝑂

Untuk menentukan kadar SGPT, sebanyak 100 µL serum yang diperoleh,

ditambah reagen kit sebagai berikut:

Tabel 3.4 Penambahan Reagen Kit SGPT dengan Sampel

Reagen Blanko Standar Sampel
R1 1000 µL 1000 µL 1000 µL
R2 250 µL 250 µL 250 µL
Standar - 100 µL -
Sampel - - 100 µL

Pada suhu ruang langsung dibaca pada fotometer dengan panjang

gelombang 340 nm dengan faktor 1746 tanpa diinkubasi terlebih dahulu. Karena

menggunakan metode enzimatik dimana proses inkubasi langsung pada saat sampel

sudah berada dalam fotometer (Diasys, 2014).

Reagen SGPT terdiri dari:

Tabel 3.5 Komponen Reagen Kit SGPT

R1 R2
TRIS 2-Oxoglutarate
L-Alanine NADH
LDH (Lactate dehydrogenase)
(Diasys, 2014).

30
 Prinsip pemeriksaan SGPT:

𝑆𝐺𝑃𝑇/𝐴𝐿𝑇
𝐿 − 𝑎𝑙𝑎𝑛𝑖𝑛𝑒 + 𝛼 − 𝑘𝑒𝑡𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑖𝑐 𝑎𝑐𝑖𝑑 → 𝐴𝑠 𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡 + 𝐿 − 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡

𝐿𝑎𝑘𝑡𝑎𝑡 𝑑𝑒ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑠𝑒 (𝐿𝐷𝐻)

𝐴𝑠 𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻 + → 𝐴𝑠 𝐿𝑎𝑘𝑡𝑎𝑡 + 𝑁𝐴𝐷+

3.7 Penimbangan Organ

Organ yang akan ditimbang harus dikeringkan terlebih dahulu dengan kertas

penyerap, kemudian segera ditimbang untuk mendapatkan bobot organ absolut.

Bobot organ relatif dapat diperoleh dengan rumus berikut: 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑓 =

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡

(BPOM, 2014).
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎𝑑𝑎𝑛

3.8 Analisis Data

Data yang diperoleh dari penelitian ini kemudian dianalisis menggunakan

ANOVA melalui tahapan uji normalitas, homogenitas, ANOVA, dan uji LSD.

3.8.1 Uji Normalitas

Tujuan dilakukan uji normalitas adalah untuk mengetahui apakah suatu

variable normal atau tidak. Penentuan didapat berdasarkan nila signifikan yaitu Ho

diterima jika nilai > 0,05 dan Ho ditolak jika nilai < 0,05.

Hipotesis Ho : Data berdistribusi normal

Hi : Data tidak berdistribusi normal

3.8.2 Uji Homogenitas

Uji homogenitas dilakukan untuk memperlihatkan apakah semua varian

homogen atau tidak. Ketentuan hipotesis uji homogenitas yaitu Ho diterima jika

nilai > 0,05 dan Ho ditolak jika nilai <0,05.

31
3.8.3 Uji ANOVA

Uji ANOVA bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan yang

signifikan dari masing-masing kelompok, didapatkan ketentuan untuk hipotesis uji

homogen yaitu Ho diterima jika nilai < 0,05 dan Ho ditolak jika > 0,05.

3.8.4 Uji LSD

Uji ini dimaksudkan untuk mengetahui perbedaan kelompok uji yang

memberikan perbedaan yang bermakna, maka dilakukan uji selanjutnya yaitu uji

LSD. Ketentuan untuk hipotesis uji LSD yaitu Ho diterima jika nilai > 0,05 dan Ho

ditolak jika nilai < 0,05.

32