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Facultad de Ciencias
Departamento de Química
Tesis Doctoral
Barcelona, 2006
Bueno, por fin llegó el momento más esperado de todas las tesis, el que
indica que ya acabó el suplicio que supone escribir una memoria, los
agradecimientos.
A mis amigos, los que he ido haciendo durante estos años y, por suerte,
aún mantengo. A Alex (gracias por aguantar así de bien mi “buen” humor estos
últimos meses de convivencia), Diego, Lidia y Noly (los abdulas).A Tony y
cristina, de la época del instituto. A Olga, a pesar de llevar mucho tiempo lejos
sigues siendo una buena amiga, Laura y Belén, de la uni. A Quico (y Sonia),
Víctor, Iván, Germán y el resto del equipo de basket. A Felix, Cigui, Isaac, Sara,
Raúl, Bea, Piluca, a la peña los trapalas (+ Sara) con los que tan buenos ratos he
pasado en Berlanga de Duero. De estos buenos ratos en el pueblo (y no solo en
el pueblo) tiene gran parte de culpa mi primita Marta, pensar que hace años nos
ignorábamos mutuamente y ahora somos casi inseparables! Y a Ana, de las
últimas personas que ha entrado a formar parte de mi vida pero posiblemente
la que más ha aguantado en estos últimos meses, gracias por tu paciencia y por
seguir aguantándome.
Hay dos amigos a los que les debo no solo les debo muchos buenos
momentos, también ayuda en los momentos malos, tanto para escucharme
como para distraerme y ayudarme a olvidar ciertas cosas cuando ha sido
necesario. Son como de la familia (de hecho mi madre dice que ha criado a uno
de ellos…) Jose, Ferran: muchísimas gracias.
Bueno, si estas leyendo esto es muy posible que merezcas estar en estas
páginas. Si no estás, no me lo tengas en cuenta, ya me conoces y sabes que el
despiste es una de mis “virtudes”, así que GRACIAS.
Índice. i
Capítulo I: Introducción.
I.- INTRODUCCIÓN 3
III.- OBJETIVOS. 57
III.1.- INTRODUCCIÓN. 59
III.2.- TÉCNICAS DE FABRICACIÓN MICROELECTRÓNICA. 61
III.2.1.- TÉCNICAS DE DEPOSICIÓN Y CRECIMIENTO. 61
ii Índice
IV.- OBJETIVOS. 95
IV.1.-INTRODUCCIÓN. 97
IV.1.1.- PANTALLAS. 98
IV.1.2.- SUSTRATOS. 100
IV.1.3.- PASTAS Y TINTAS. 101
IV.2.- REACTIVOS, EQUIPOS Y SOFTWARE. 102
IV.3.- DISEÑO Y FABRICACIÓN DE LOS DISPOSITIVOS. 103
IV.3.1.- DISEÑO DE LOS DISPOSITIVOS. 103
IV.3.2.- FABRICACIÓN DE LOS DISPOSITIVOS. 105
IV.4.- CARACTERIZACIÓN DE LOS DISPOSITIVOS. 108
IV.4.1.- PERFILOMETRÍA. 109
IV.4.2.- CARACTERIZACIÓN ELECTROQUÍMICA. 111
IV.- BIBLIOGRAFÍA. 117
Índice. iii
IX.- CONCLUSIONES i
I.- INTRODUCCIÓN.
I.- Introducción. 3
Los campos donde los sensores químicos han tenido una mayor
implantación son principalmente, la biomedicina, el medioambiental y, en los
últimos años, en la industria alimentaria, si bien otros sectores como la
bioseguridad se están desarrollando de forma exponencial.
Entre este tipo de sensores caben destacar los biosensores, ya que son
los dispositivos con más selectividad y por tanto, con más aplicaciones
potenciales en química analítica. Desde hace varios años algunos de ellos ya
han sido comercializados. Por ejemplo, los utilizados para los análisis de
glucosa en sangre, de vital importancia en pacientes diabéticos.
¾Enzimas
¾Sust.
Sust. electroactiva Electrodo
¾Cambio de pH Electrodo de pH
¾Anticuerpos
¾Calor Termistor Señal
¾Luz Transductor óptico analítica
¾Material genético
¾Cambio de masa Transductor
piezoeléctrico
¾Microorganismos
Componente Transductor
biológico
En los últimos años, los transductores electroquímicos son los que más
publicaciones científicas han generado (Fig. II.1.2) [7-9]. Esto está claramente
ligado al hecho que estos dispositivos son más robustos, su fabricación es más
16 II.- Fundamentos teóricos y antecedentes bibliográficos.
1200
1985-1989
1000 1990-1991
1992-1993
N º artícu los/añ o
800
1994-1997
600
400
200
co
s sa ic o
s s
rm
i ma t ic o
té óp uí
m
q
c t ro
e le
Transductores conductimétricos.
Transductores potenciométricos.
RT ⎛ ⎞
E = Eo + ln ⎜ ai + ∑ kipot
zi zj
, j *aj ⎟ (1.2)
nF ⎝ j ⎠
1985-1989
450
1990-1991
400 1992-1993
Nº artículos/año 350 1994-1997
300
250
200
150
100
50
0
os os os
t ric t ric t ric
é é é
cio
m om t im
er c
ten p du
po am co
n
Transductores amperométricos.
δ ( C0 ( 0, t ) ) (1.3)
I = nFADo
δx
nFADo (1.4)
I= C0
δ
¾ Anticuerpos.
¾ Ácidos nucleicos.
¾ Microorganismos.
¾ Tejidos orgánicos.
¾ Enzimas.
Anticuerpos.
Los anticuerpos son, junto con el ADN, los agentes biológicos más
selectivos que existen. Debido a su estructura tridimensional puede enlazarse
con una sustancia (antígeno) de una manera muy específica.
22 II.- Fundamentos teóricos y antecedentes bibliográficos.
Ácidos nucleicos.
Microorganismos.
Enzimas.
E + S E-S E + P (1.6)
Métodos
Métodosde
deinmovilización
inmovilización
Retención
Retenciónfísica
física Unión
Uniónquímica
química
Adsorción
Adsorción Entrecruzamiento
Entrecruzamiento Enlace
Enlace
Atrapamiento
Atrapamiento Microencapsulación
Microencapsulación en
enlalasuperficie
superficie (cross-linking)
(cross-linking) covalente
covalente
Atrapamiento.
Microencapsulación.
Adsorción en la superficie.
Entrecruzamiento (cross-linking)
Unión covalente.
a) b)
(i)
(v)
(ii) (iii)
membrana
(iv) transductor
e-
Figura II.1.10: Esquema de un biosensor de glucosa. (i) difusión del analito y del cofactor
al interior de la membrana; (ii) reacción enzimática; (iii) difusión de los
productos hacia el electrodo y fuera de la membrana; (iv) reacción
electroquímica; (v) difusión de los productos de la reacción
electroquímica hacia la muestra.
II.1.- Sensores químicos y biosensores. 33
H2O2
O2
Ez
Ez Ez Mox
O2 Mred Ez
H2O2
a) b) c)
Primera generación.
GOx
glucosa + O2 ac. glucónico + H 2O2 (1.7)
O2 + 4H + + 2H2O
Segunda generación.
Tercera generación.
a) b)
Aplicaciones médicas.
Aplicaciones medioambientales.
Los análisis necesarios para el control de calidad del vino, son largos y
costosos y necesitan de técnicos especializados en control de calidad
alimentaria [81]. Recientemente se han publicado diferentes biosensores
amperométricos, no miniaturizados, para la determinación de glucosa,
fructosa y etanol en vino [46, 82-84], que obvian estos inconvenientes.
II.- Bibliografía. 43
II.- Bibliografía.
1. L. Ristic, Sensor technology and devices, ed. I. Artech House. 1994, Norwood.
Bellaterra.
15(11): p. 913-947.
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Pardubice.
19. Y. Taniy Y. Umezawa, Ion-selective electrodes. Sensor Letters, 2005. 3(2): p. 99-
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25. D. Griffithsy G. Hall, Biosensors - What Real Progress Is Being Made. Trends in
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78: p. 575-580.
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44. M. Arroyo, Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications. Ars
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Proteins and Enzymes. Enzyme and Microbial Technology, 1992. 14(11): p. 866-
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as basis for third generation biosensors. Analytica Chimica Acta, 1999. 400(1-3): p.
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II.- Bibliografía. 49
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62. M. A. Tartagni, L.; Guerrieri, R, Micreoelectronic Chip for Molecular and Cell
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Whole cell- and protein-based biosensors for the detection of bioavailable heavy metals
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2405.
124(3): p. 325-329.
Zaragoza.
52 II.- Fundamentos teóricos y antecedentes bibliográficos.
1119.
based on solid binding matrix. Biosensors & Bioelectronics, 1998. 13(2): p. 181-
191.
SEGUNDA PARTE, TECNOLOGÍA DE FABRICACIÓN.
III.- MICROELECTRÓNICA DE SILICIO: FABRICACIÓN DE
MICROSENSORES.
III.- Objetivos. 57
III.- Objetivos.
III.1.- Introducción.
particulas / m³
Clase 0.1 µm 0.2 µm 0.3 µm 0.5 µm 1 µm 5 µm
ISO 1 10 2
ISO 2 100 24 10 4
ISO 3 1000 237 102 35 8
ISO 4 10000 2370 1020 352 83
ISO 5 100000 23700 10200 3520 832 29
ISO 6 1000000 237000 102000 35200 8320 293
ISO 7 352000 83200 2930
ISO 8 3520000 832000 29300
ISO 9 35200000 8320000 293000
Controladores de
H2 caudal
O2
H2O
N2/Ar
Evaporación térmica
Cámara de vacío
Sistema de
refrigeración
Gas
Sustratos inerte
Válvula de
vacío
Material a
evaporar
Sputtering
Cámara de vacío
Ánodo Sistema de
refrigeración
Gas
Obleas inerte
Muestra
Cátodo
CVD
CVD
APCVD
APCVD LPCVD
LPCVD PECVD
PECVD LCVD
LCVD PhCVD
PhCVD
(Presión
(Presiónatmosférica)
atmosférica) (Baja
(Bajapresión)
presión) (asistida
(asistidapor
porplasma)
plasma) (asistida
(asistidapor
porláser)
láser) (asistida
(asistidapor
porfotones)
fotones)
III.2.2.- Fotolitografía.
fotoresina
Alineamiento
e irradiación
Grabado
Decapado
III.2.3.- Grabado.
Grabado húmedo.
a) b)
Figura III.2.6: Esquema de ataques isotrópico (a) y anisotrópico (b).
Grabado seco.
Entrada de gas
Ánodo
Cámara de vacío
Sistema de
refrigeración
Sustratos
Cátodo
Fotolitografía
Metalización
Decapado
electrodos sino que también implica el diseño de cada una de las máscaras o
niveles de fabricación necesarios. Ha de tenerse en cuenta el tipo de fotoresina
que se utilizará y el proceso que se llevará a cabo una vez la resina haya sido
irradiada y revelada.
a) Electrodo auxiliar b)
Electrodo de
Electrodo de referencia
referencia
Electrodos de
trabajo
Tabla III.4.1: Áreas teóricas de cada uno de los electrodos. Aw: área del electrodo de
trabajo, Ac: área del contraelectrodo y Ar área del electrodo de referencia.
Diseño A Diseño B
2 2
Aw 0.32 mm / 0.64 mm 0,50 mm2
Ac 1.56 mm2 0,85 mm2 / 0,51 mm2 / 1,36 mm2
Ar 0.06 mm2 0,35 mm2
Platino
Titanio
Fotoresina
a) b)
Oxido
de silicio
Silicio
c) d)
Oro
Níquel
Platino
Titanio
a) b)
Fotoresina
Oxido
de silicio
Silicio c) d)
Oxinitruro
de silicio
Oro
Níquel
Platino
Titanio
a) b)
Fotoresina
Oxido
de silicio
Silicio
c) d)
Figura III.4.5: Imagen de una oblea una vez acabado el proceso de fabricación.
82 III.- Microelectrónica de silicio: fabricación de microsensores.
Generalmente, los procesos térmicos a que han sido sometidos este tipo
de microtransductores generan una fina capa de óxido sobre la superficie del
metal, provocado así su pasivación y, por tanto, una disminución de su área
activa [30].
1.00
sin limpieza
1ª limpieza
0.50
2ª limpieza
3ª limpieza
0.00
I ( µ A)
-0.50
-1.00
-1.50
-0.05 0.05 0.15 0.25 0.35 0.45
E (V)
nFD
Ip = ψ nFA[c] υ
RT (3.1)
donde,
Ip = intensidad de pico
n = número de electrones
R = número de Faraday
A = área del electrodo
[c] = concentración de ferricianuro
D = coeficiente de difusión del ferricianuro
R = 8,314 J/Kmol
T = temperatura = 298 K
0.80
-0.20
-0.40
-0.60
-0.80
-1.00
-1.20
-0.05 0.05 0.15 0.25 0.35 0.45
E (V)
1.00
0.50
0.00
I ( µ A)
-0.50
-1.00
-1.50
-0.05 0.05 0.15 0.25 0.35 0.45
E (V)
III.- Bibliografía.
27. GPES, General Purpose Electrochemical System for Windows, 4.9. ver. 4.9,
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33. E. Crouch, D. C. Cowell, S. Hoskins, R. W. Pittson, y J. P. Hart, Amperometric,
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biocomposite water-based carbon ink incorporating glucose oxidase. Analytical
Biochemistry, 2005. 347(1): p. 17-23.
IV.- TECNOLOGÍA DE FABRICACIÓN DE ELECTRODOS SERIGRÁFICOS.
IV.- Objetivos. 95
IV.- Objetivos.
IV.1.-Introducción.
IV.1.1.- Pantallas.
Malla libre
Malla obturada
Una pantalla debe ser fácil y rápida de confeccionar, poseer una buena
definición, durabilidad para grandes tiradas, resistente a las tintas y ser fácil
de borrar o de desemulsionar en caso de requerirlo [4].
IV.1.2.- Sustratos.
Existe una gran variedad de tintas comerciales con una amplia gama
de propiedades fisicoquímicas. Posteriormente, pueden ser modificadas con
mediadores o elementos de reconocimiento, para adaptarlas al proceso de
fabricación o a la aplicación del dispositivo [9]. También es frecuente
desarrollar formulaciones específicas en los laboratorios [9-11].
102 IV.- Tecnología de fabricación de electrodos serigrafiados
a) b)
a) b)
c)
b)
a)
c)
a)
b)
Figura IV.4.1: Resultados del método Scotch para comprobar la adhesión. (a) fibra de
vidrio. (b) poliéster.
IV.4.1.- Perfilometría.
a)
b)
Figura IV.4.3: Perfiles de la capa de grafito que define el electrodo de trabajo (a) y el
electrodo de referencia (b).
15.00
Sin limpieza
10.00 Limpieza mecánica
5 CV's
5.00 15 CV's
20 CV's
0.00
I ( µ A)
-5.00
-10.00
-15.00
-20.00
-0.75 -0.55 -0.35 -0.15 0.05 0.25 0.45 0.65 0.85
E (V)
nFD (4.1)
Ip = ψ nFA[c] υ
RT
10.00
KCl
ferricianuro + KCl
5.00
voltamperograma resta
0.00
I ( µ A)
-5.00
-10.00
-15.00
-0.7 -0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9
E (V)
IV.- Bibliografía.
V.- Objetivos.
V.1.- Introducción.
⎛ RT ⎞
E = Eo − 2.303 ⎜ ⎟ log acl − (5.1)
⎝ nF ⎠
V.1.-Introducción. 125
donde,
E = potencial en equilibrio
Eo = potencial en condiciones estándar
R = 8,314 J/Kmol
T = temperatura
n = número de electrones = 1
F = número de Faraday
aCl-= actividad de cloruros, a = γ [Cl-]
Por otro lado, ciertos óxidos metálicos están siendo utilizados como
electrodos de pseudo-referencia, tales como óxido de iridio (IrOx) [9, 10] o de
volframio (WOx) [11]. Los electrodos formados con IrOx han sido utilizados
incluso como electrodos sensibles al pH [9, 12-14], ya que presentan una gran
estabilidad en un amplio rango de pH y la deriva de potencial es mínima en
un periodo largo de tiempo [9,15]. Por tanto, manteniendo constante la
concentración de protones de una solución, el potencial de este electrodo
también será constante y podría ser utilizado como electrodo de pseudo-
referencia.
126 V.-Integración del electrodo de referencia.
tampón fosfato 0.05 mol dm-3 pH 7, 0.1 mol dm-3 de KCl (Panreac, Barcelona,
Spain).
un motivo de platino (Fig. V.3.1) que se modificó para actuar como electrodo
de referencia.
Electrodo de
referencia
a) b)
Figura V.3.3 Fotografía de un microsensor antes (a) y después (b) de depositar la tinta.
Fuente de
corriente
- +
A Amperímetro
V
Voltímetro
M+ A-
100
50
0
I (µ A)
-50
-100 Electrodo 1
Electrodo 2
-150
-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
E (V)
(a) (b)
Electrodo de
referencia
Figura V.3.8 Imagen parcial de un electrodo de óxido de iridio una vez finalizado el proceso
fabricación en sala blanca.
Figura V.3.9: Imagen de la parte inferior de un electrodo de referencia una vez finalizado el
proceso de fabricación en sala blanca.
V.3.-Fabricación de los electrodos. 137
15
10
0
I (µ A)
-5
-10
E final =0.40 V
-15 E final =0.25 V
E final =0.23 V
-20 E final =0.21 V
-25
-0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4
E(V)
Figura V.3.7: Imagen parcial de un electrodo de referencia una vez finalizado el proceso
oxidación.
V.4.-Caracterización de los electrodos. 139
como la rugosidad (1.8 ± 0.5 µm, n = 6, α = 0.05) son similares a los obtenidos
en la fabricación de electrodos serigráficos.
68 25.5
66
25
64
24.5
62
60 24
E (mV)
T(ºC)
58 23.5
56
Elect 1 23
54 Elect 2
Elect 3 22.5
52
T ºC
50 22
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00
t (h)
Tabla V.4.1: Valores de la media y la deriva para cada uno de los electrodos estudiados.
-1
Electrodo media (mV) deriva (mV h )
1 62.1 0.13
2 61.6 0.07
3 62.3 0.23
90 25.8
-3 -3
KCl 3 mol dm KCl 3 mol dm Elect 1 25.6
70
Elect 2
25.4
T (ºC)
50
25.2
30 25
E (mV)
T (ºC)
10 24.8
24.6
-10
24.4
-30
-3 24.2
KCl 0.1 mol dm KCl 0.1 mol dm
-3
-50 24
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
t (h)
4.00
Referencia comercial
3.00
Pseudo-referencia
2.00
1.00
I ( µA)
0.00
-1.00
-2.00
-3.00
-4.00
-5.00
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
a)
E (V)
3.00
0.00
I (µA)
-1.00
-2.00
-3.00
-4.00
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
b)
E (V)
a)
b)
Figura V.4.5: Imágenes de un electrodo de plata antes (a) y después (b) de clorinizar.
45 25
44.5 Electrodo 1 24
Electrodo 2
44 23
Electrodo 3
43.5 Temperatura 22
43 21
E (mV)
T (ºC)
42.5 20
42 19
41.5 18
41 17
40.5 16
40 15
2 4 6 8 10 12 14
t (h)
Tabla V.4.3: Valores de la media y la deriva para cada uno de los electrodos estudiados.
-1
Electrodo media (mV) deriva (mV h )
1 41.8 0.06
2 41.3 0.08
3 41.5 0.03
V.4.-Caracterización de los electrodos. 147
80 28
20 27
E (mV)
T (ºC)
electrodo 1 26.5
-20
electrodo 2
-40 temperatura 26
-60
KCl 0.1 mol dm-3 25.5
-80 KCl 0.1 mol dm-3
-100 25
0 2 4 6 8 10 12
t (h)
0.001 mol dm-3 – 0.1 mol dm-3 de KCl. En la tabla V.4.4 se muestran los
resultados obtenidos.
contacto con la sal de cloruro de plata que forma los electrodos de pseudo
referencia y comercial.
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
I ( µ A)
-1.00
-2.00
-5.00
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
a) E (V)
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
I ( µ A)
-1.00
-2.00
-5.00
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
b) E (V)
-180 24.4
-185 24.2
-190 24
-195 23.8
E (mV)
T (ºC)
-200 23.6
-205 23.4
diferencia de pontencial
-210 temperatura 23.2
-215 23
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
t (h)
3.00E+01
2.50E+01
2.00E+01
I ( µ A)
1.50E+01
1.00E+01
5.00E+00
0.00E+00
-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
E (mV)
60 23.65
20 Temperatura 23.55
23.5
0
23.45
-20
E (mV)
T (ºC)
23.4
-40
23.35
-60
23.3
-80 23.25
-100 23.2
-120 23.15
0 0.5 1 1.5 2 2.5
t (h)
a) b)
Figura V.4.14: Fotografías de un electrodo de óxido de iridio antes (a) y después (b) de la
sobreoxidación.
a)
b)
Figura V.4.15: Perfiles de un electrodo de plata antes de oxidar (a) y después (b) de la
oxidación.
156 V.-Integración del electrodo de referencia.
30 26.4
20 26.2
10 26
0
25.8
-10
25.6
E (mV)
T (ºC)
-20 Oxidación hasta 0.40V
25.4
-30 Oxidación hasta 0.25 V
V.- Bibliografía.
VI.- Objetivos.
VI.1.- Introducción.
Hexoquinasa
Glucosa + ATP Glucosa 6 fosfato + ADP (7.1)
glucosa 6 fosfato
Glucosa 6 fosfato + NADP+ deshidrogenasa Gluconato 6 fosfato + NADPH
H H H
N oxidación N polimerización N
* *
N N
H H
VI.2.- Experimental
40.00
34.00 Ferrocianuro
MB
28.00
22.00
I ( µ A)
16.00
10.00
4.00
-2.00
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
E (V)
19.00
Barrido 1
15.00 Barrido 2
11.00
I ( µ A)
7.00
3.00
-1.00
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
E (V)
electrodo
modificado
contraelectro
d
y Py, así como las de los enzimas, se mantuvieron en una relación constante
2:1 y 1:1, respectivamente, durante toda la optimización [16].
Los valores correspondientes a los niveles alto (+), bajo (-) y al punto
central (0) para cada factor fueron los siguientes,
Eap (+) = 0.1 V CMB (+) = 4.0 mmol dm-3 CPy (+) = 0.07 mol dm-3
Eap (-) = - 0.3 V CMB (-) = 1.3 mmol dm-3 CPy (-) = 0.03 mol dm-3
Eap (0) = - 0.1 V CMB (0) = 2.65 mmol dm-3 CPy (0) = 0.05 mol dm-3
El diseño así construido recorre cinco niveles para cada uno de los
factores (Fig. VII.3.1.), con lo que se estudia un considerable intervalo de los
mismos.
14
6 8
5 7
12
9 10
11
2 4
1 3
13
Tabla VI.3.1.: Puntos del diseño central compuesto 23 para la optimización de los
parámetros experimentales en un sensor bienzimático para la
determinación de glucosa empleando MB como mediador (CGLUC = 1.9 x
10-4 mol dm-3).
R2 = 0.8554
siendo su región crítica, Fexp > Ftab. El valor Fexp se obtiene al dividir la
suma de cuadrados de cada efecto (SC) entre la suma de cuadrados del error
(SCE), mientras que el valor de Ftab depende tanto del nivel de significación
como de los grados de libertad del efecto y del error. En muchas ocasiones se
muestra el valor de Pactual, en la tabla de la ANOVA, en lugar de Ftab, ya que
ambos están relacionados.
CC
AA
BB
A:Eap
AC
C:CPy
B:CMB
AB
BC
0 2 4 6 8
5
4
3
I ((nA)
2
1
0.07
0 0.05
-0.3 -0.2 -3
-0.1 0 0.03 C Py ( mol dm )
0.1
Eap(V)
Los valores seleccionados para los diferentes niveles de cada uno de los
factores fueron,
CEz (+) = 0.08 % (m/v) CFe (+) = 9 mmol dm-3 CPy (+) = 0.058 mol dm-3
CEz (-) = 0.04 % (m/v) CFe (-) = 5 mmol dm-3 CPy (-) = 0.017 mol dm-3
CEz (0) = 0.06 % (m/v) CFe (0) = 7 mmol dm-3 CPy (0) = 0.037 mol dm-3
R2 = 0.8233
AA
CC
BB
A:CPy
C:CEnz
AB
AC
BC
B:CFe
0 2 4 6 8 10 12
I (nA)
9 I (nA)
2.0
2.4
8 2.8
dm-3-3))
moldm
3.2
(10-3-3mol
7 3.6
4.0
CCFeFe(10
4.4
6 4.8
5.2
5 5.6
17 27 37 47 57 67 6.0
Figura VI.3.5: Curvas de nivel para la variable respuesta obtenidas para el valor
correspondiente a 0.056 % (m/v) de enzimas.
-7.00E-08
-6.50E-08
-6.00E-08
-5.50E-08
I(A)
-5.00E-08
-4.50E-08
-4.00E-08
-3.50E-08
-3.00E-08
1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
Tiempo(s)
Los parámetros del calibrado, así como la desviación típica, deben ser
óptimamente evaluados. La presencia de puntos anómalos y/o un rango
lineal que no sea completamente válido, llevarían a estimaciones incorrectas
en el cálculo de dichos parámetros, alterando la sensibilidad del biosensor.
40
35 I = - 2.306 + 0.491 C
2
R = 0.99780
30
25
I = - 1.954 + 0.474 C
I (nA)
20 2
R = 0.99508
I = - 6.053 + 0.464 C
15 I = - 2.269 + 0.449 C 2
2 R = 0.99459
R = 0.99772
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
-3
C Glu (mmol dm )
Figura VI.4.1: Rectas de calibración obtenidas para estimar la repetibilidad del biosensor en
la determinación de glucosa, utilizando MB como mediador.
Una vez que los puntos anómalos son detectados, se eliminan del
calibrado y se construye nuevamente una regresión basada en OLS que
proporciona una correcta valoración de la pendiente (sensibilidad) y del
término independiente del calibrado, siendo ambos importantes para juzgar
la calidad del calibrado y a partir de ésta, la del método analítico.
190 VI.- Determinación de glucosa utilizando microchips amperométricos.
-3.00E-08
-2.50E-08
Fructosa Glucosa
-2.00E-08 Fructosa Glucosa
I (A)
-1.50E-08
-1.00E-08
-5.00E-09
0.00E+00
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300
Tiempo (s)
10
9
8
7
6 I = 1.418 + 0.412 C
2
I (nA)
R = 0.99275
5
4
I = 1.349 + 0.361 C
3 2
R = 0.99900
2 I = 1.297 + 0.375 C
2
1 R = 0.99761
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
-3
C Glu (mmol dm )
VI.- Bibliografía.
VII.- Objetivos.
VII.1.- Introducción.
O
H3C CH AOx (ox) O2
a) e-
H3 C CH 2 AOx (red) H2O2
OH
O
H3C CH AOx (ox) Fe3+
b) e-
H3 C CH 2 AOx (red)
Fe 2+
OH
O
AOx (ox) O2
H3C CH
Figura VII.1.1: (a) biosensor de primera generación, (b) biosensor de segunda generación y
(c) sensor bienzimático de segunda generación.
VII.2.- Experimental
0.06
0.04
I (µ A)
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100
t (s)
Figura VII.2.1: Cronoamperogramas registrados para una adición de EtOH (5 µmol dm-3)
con y sin AOx en el medio. Potencial aplicado, 0.75 V.
208 VII.- Deteminación de EtOH utilizando microchips amperométricos.
0.06
0.04
0.02
0.00
-0.02
I (µ A)
Blanco
-0.04 AOx 1U ml-1
-0.06 AOx + Fe
-0.12
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
E (V)
0.4
blanco
AOx 1 Uml-1
0.3
AOx + 5micromol dm-3 EtOH
AOx +10micromol dm-3 EtOH
0.2 AOx +20micromol dm-3l EtOH
I (µA)
0.1
-0.1
-0.2
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
E (V)
80
70
60
50
40
I (µ A)
30
20
10
-10
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
E (V)
100
90 Barrido 1
80 Barrido 2
70
60
50
I (µ A)
40
30
20
10
0
-10
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
E (V)
Los valores correspondientes a los niveles alto (+), bajo (-) y al punto
central (0) para cada factor se presentan a continuación.
Eap (+) = 0.1 V CFe (+) = 10.0 mmol dm-3 CEnz (+) = 4.0 mg ml-1
Eap (-) = - 0.3 V CFe (-) = 5.0 mmol dm-3 CEnz (-) = 1.0 mg ml-1
Eap (0) = - 0.1 V CFe (0) = 7.5 mmol dm-3 CEnz (0) = 2.5 mg ml-1
Los resultados obtenidos para este diseño experimental son los que
aparecen en la tabla VII.3.1. Las experiencias en las que no se obtuvo
respuesta alguna, se cuantificaron con el valor de 0.01 nA para poder realizar
el análisis de los resultados, que se presenta en forma de ANOVA (tabla
VII.3.2).
Tabla VII.3.1.: Resultados del diseño central compuesto 23 para la optimización de los
parámetros experimentales en la determinación de EtOH (CEtOH = 10 mmol
dm-3).
R2 = 0.93383
A: Eap
AA
AB
B: Enz
BC
AC
C: Fe
CC
BB
0 5 10 15 20 25
a) C Enz=2.5 mg ml-1
22
18
14
I (nA)
10
6
2
-2 9 10
-0.3 -0.2 6 7 8
-0.1 0 0.1 5
CFe( mmol dm-3)
E ap (V)
18
13
8
3 4
3
-2 2
-0.3 -0.2 1
-0.1 0 0.1 CEnz (mg ml-1)
Eap (V)
40 8
respuesta amperométrica
35 7
respuesta amperométria / ruido relación respuesta/ruido
30 6
25 5
I (nA)
20 4
15 3
10 2
5 1
-0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1
Eap (V)
-74
-75
-76
-77
-78
I (nA)
-79
-80
-81
-82
-83
-84
820 920 1020 1120 1220 1320 1420
t (s)
18.00
8.00
y = 152.87x + 0.8435
6.00 R2 = 0.9961
y = 137.26x + 0.0751
4.00 R2 = 0.9994
2.00
0.00
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
-3
C EtOH (mol dm )
16.00
4.00
y = 159.6x - 0.4645
2.00 2
R = 0.994
0.00
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 -3 0.06 0.07 0.08 0.09
C EtOH (mol dm )
El LOD medio obtenido, para α = β= 0.05 y una réplica, fue de 2.9 ± 0.4
mmol dm-3.
VII.6.Determinación de alcohol en muestras reales. 223
Los resultados obtenidos con estos biosensores así como los datos
facilitados por el INCAVI se muestran el la tabla VII.6.1. Como se puede ver,
grado alcohólico volumétrico adquirido calculado se corresponde con los
datos calculados con el método estándar.
224 VII.- Deteminación de EtOH utilizando microchips amperométricos.
-75.00
-76.00
-77.00
-78.00
I (nA)
-79.00
-80.00
-81.00
-82.00
-83.00
1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000
t (s)
Figura VII.6.1: Cronoamperograma obtenido para una de las adiciones estándar realizadas.
Potencial aplicado, - 0.2V.
Tabla VII.6.1: Concentración de etanol en distintas muestras de vino calculada con los
biosensores desarrollados (n = 3, α = 0.05), y valores estimados por el INCAVI.
VII.- Bibliografía.
VIII.- Objetivos.
VIII.1.- Introducción.
enlaces tan estables con los mismos se cree que es posible la formación de
ciclos similares a los mostrados en la figura VII.1.2 [12].
Figura VIII.1.2: Posible estructura del entrecruzamiento de los enzimas (línea verde) con
BSA (línea roja) y gluteraldehído (línea azul).
VIII.2.- Experimental
Inmovilización enzimática
disolvieron los enzimas y el BSA en 0.05 mol dm-3 tampón fosfato pH 7, 0.1
mol dm-3 (Concentración de cada uno de ellos, 1.66% [13]). Esta solución se
mezcló a su vez, en una relación 1:1, con gluteraldehído (GA) (2.5% solución
acuosa).
¾ SPE + GOx-HRP-BSA-GA
¾ SPE + BSA-GA
0.01
0.00
I (µ A) -0.01
-0.02
-0.03
Blanco
-0.04 0.1 mmol dm-3 Fe
1 mmol dm-3 Fe
-0.05
1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200
t (s)
Eap (+) = 0.1 V Cglut (+) = 3.9 % CFe (+) = 0.15 mmol dm-3
Eap (-) = - 0.3 V Cglut (-) = 1.1 % CFe (-) = 0.05 mmol dm-3
Eap (0) = - 0.1 V Cglut (0) = 2.5 % CFe (0) = 0.10 mmol dm-3
Tabla VIII.3.1.: Resultados del diseño central compuesto 23 para la optimización de los
parámetros experimentales en un sensor bienzimático para la determinación
de glucosa (CGLU = 10 × 10-6 mol dm-3).
R2 = 0.81423
AA
A: Eap
BB
C: CFe
AC
BC
AB
B: Cglut
CC
0 1 2 3 4 5 6
15
12
9
I (µ A)
6
3
0
-0.3 -0.2 3.6 4.1
-0.1 2.1 2.6 3.1
0 1.1 1.6
0.1
Eap (V) C glut (%)
Figura VIII.3.3: Superficie de respuesta para la variable respuesta obtenida para el valor
correspondiente al punto central de mediador.
0.00
-20.00
-40.00
-60.00
I (nA)
-80.00
-100.00
-120.00
-140.00
5000 5200 5400 5600 5800 6000 6200 6400
t (s)
160
y = 2.862x + 7.0363
140 2
R = 0.9957
2
80 R = 0.9991 y = 2.282x - 1.803
2
R = 0.9992
60
40 y = 1.903x - 4.3524
2
R = 0.9973
20
0
0.00 10.00 20.00 30.00 -3
40.00 50.00 60.00
Cglu (µ mol dm )
120
y = 1.963x + 13.148
R2 = 0.9962
100
y = 1.845x + 15.725
80
R2 = 0.9968
I (nA)
y = 1.921x - 4.3629
60
R2 = 0.9993
y = 2.175x - 3.7267
40 R2 = 0.9992
y = 1.903x - 4.3524
20 R2 = 0.9973
0
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
-3
C glu ( µ mol dm )
El LOD medio obtenido para α = β = 0.05 y una réplica fue de 4.4 ± 0.1
µmol dm-3 (n = 4).
El mosto fue facilitado por el “institut català del vi” (INCAVI), así
como la concentración de azúcares totales expresado en ºBrix, calculados
mediante refractometría. Éste es un método indirecto, a través del cual se
puede determinar la concentración de azúcares totales en el mosto mediante
la medida del índice de refracción.
0.00
-50.00
-100.00
I (nA)
-150.00
-200.00
-250.00
1500 1700 1900 2100 2300 2500
t (s)
Tabla VIII.6.1: Cálculo del factor que relaciona ºBrix y concentración de glucosa, para este
tipo de biosensores.
VIII.- Bibliografía