FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

INFORME N° 2:

“TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM”

Integrantes:

- 20160091…………….Alcalá Bacigalupo, Silvana

- 20160107…………….Mallqui Argüelles, Nathalie
- 20160060…………….Pastor Arbulú, Paulo
- 20151081…………….Tineo Balcazar, Gabriela

MESA N° 4

GRUPO F: Miércoles 3-5 p.m.

2018-II
I. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos no solo difieren de su entorno, sino también muestran diferencias físicas y
químicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan reaccionar diferencialmente ante un proceso de
tinción. Una técnica muy importante en microbiología es la tinción de Gram, Fue desarrollada por el
científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más
utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta. Según sea el resultado
de esta tinción, las bacterias se pueden dividir en dos grandes grupos: las grampositivas y las
gramnegativas. Una vez teñidas, las primeras muestran un color morado, mientras las otras se
distinguen por el color rosa. La diferencia de colores en este tipo de tinción se debe a que las paredes
celulares de ambos grupos de procariotas difieren en su estructura molecular. Madigan M. Martinko J.
Bender K. Buckley D. Stahl D. (2015).

La pared celular de las grampositivas es principalmente una capa gruesa de peptidoglucano (hasta un
90% del peso molecular), mientras que en las gramnegativas la pared es una multicapa formada por un
fragmento de peptidoglucano (menos del 10%) que forma parte del periplasma y que está rodeado por
una membrana interna que comunica con el citoplasma y una membrana externa, formada por
lipopolisacáridos, lipoproteínas y proteínas. La diferente permeabilidad de estas estructuras de
superficie ante los reactivos de Gram permite observar los resultados en la coloración final. Madigan
M. Martinko J. Bender K. Buckley D. Stahl D. (2015).

La técnica de esta tinción diferencial requiere primero la fijación de la muestra en una lámina
portaobjetos y la posterior aplicación de un colorante básico (como el cristal violeta). Luego, se debe
añadir un reactivo mordiente que incrementa la afinidad entre el colorante y las moléculas de la pared
celular (como el lugol, una solución acuosa de yodo molecular y yoduro de potasio). Ejemplos de los
mordientes son ácidos, bases y sales metálicas; bajo la acción de alguna de estas sustancias una célula
se tiñe más intensamente y es muy complicado para decolorar. El siguiente paso es donde se produce
la primera diferenciación, debido a que al aplicar un agente decolorante (como el alcohol-cetona, una
solución de etanol y propanona) solo las células grampositivas resistirán la acción química del
reactivo y mantendrán su color azul-morado, mientras que las gramnegativas se volverán
transparentes y prácticamente invisibles al microscopio. ​Las tinciones básicas en el laboratorio de
microbiología (2014).

Hasta antes de este paso, no era posible distinguir entre las bacterias a través de la microscopía debido
a que acusaban la misma coloración. Finalmente, la aplicación de un contrastante es fundamental para
poder observar a las procariotas que perdieron la tinción inicial. Es una sustancia colorante de carácter
básico y diferente a la del principio. El propósito de su aplicación es dar a las células decoloradas un
color contrastante que las distinga de las que no perdieron coloración. En la práctica se utilizó el
colorante rojizo safranina (compuesto orgánico formado por anillos quinoides, bencenoides y grupos
metilos y aminos). ​Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología (2014). Así, las
grampositivas quedan teñidas de un color azul-morado y las gramnegativas quedan de color rosa.

II. OBJETIVOS
- Comprender el fundamento teórico de la tinción diferencial de Gram.
- Reconocer y aplicar la metodología de esta técnica de laboratorio.
- Demostrar, a través de la técnica, la existencia de dos grupos principales de bacterias.
III. MARCO TEÓRICO

Esta tinción diferencial fue propuesta por el médico danés Christian Gram (1884) (Tortora et al.,
2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumonía observó que la bacteria
Streptococcus pneumoniae​, presente en los pulmones, retenía el colorante conocido como marrón
Bismark (sustituido posteriormente por el cristal violeta), mientras que el tejido pulmonar no era
capaz de retener el colorante.

Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se
someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial,
además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared
que presentan las bacterias (Madigan, 2015).

Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram
positivas y gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con
carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar
su tamaño y forma al organismo, así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es
gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicóico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la
célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos,
lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es
peptidoglicano (Tortora, 2007).

Las bacterias gram positivas cuentan con una envoltura celular que comprende la membrana
citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la
interior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido
lipoteicoico, la capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y una de las
responsables de retener el tinte durante la tinción de Gram. Una de las diferencias de las bacterias
gram positivas con gram negativas es que presentan una segunda membrana lipídica externa a la pared
celular.

Las bacterias gram negativas son todas aquellas que no se tiñen de azul oscuro o de violeta por la
tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: Es por eso el nombre gram negativas o también
Gram-negativas. Esta característica está íntimamente ligada a la estructura didérmica dada por la
envoltura celular, ya que presenta doble membrana celular (una es externa y la otra citoplasmática) lo
que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales supergrupos de
bacterias y cuando se trata como taxón se le puede llamar con el nombre de Negibacteria o bien
Didermata (Madigan, 2015). Las que restan son las bacterias gram positivas.

Las que presentan dos membranas lipídicas son las bacterias gram negativas, entre las que se le
localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias gram positivas presentan
sólo una membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa.
Luego de saber el concepto de cada una y ver similitudes entre uno con la otra, te presentamos en
resumen las diferencias entre bacterias gram positivas y gram negativas.

● Las bacterias gram positivas posee una pared celular interna y una pared de peptidoclucano en
cambio las bacterias gram negativas poseen una pared celular más completa.
● Las bacterias gram positivas no cuentan con una membrana externa en cambio las gram
negativas tiene membrana externa que forma un saco rígido alrededor de la bacteria.
● Las bacterias gram positivas no tienen espacio periplasmático, en cambio las gram negativas
tienen espacio periplasmático entre la superficie externa de la membrana citoplasmática y la
interna de la membrana externa.
● Las bacterias gram positivas tiene una red de mureína que está bien desarrollada y puede
llegar a tener hasta 40 capas, en cambio las gram negativas cuenta solamente con una capa.
● La penicilina mata a la gram positivas en cambio las gram negativas no las mata.
● Las bacterias gram positivas no contiene LPS en cambio las gram negativas contienen LPS.
● Las gram positivas retienen la tinción azul, en cambio las gram negativas quedan decoloradas.

Fig1 .Diferencias estructurales en la pared celular de Bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta
(otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de
colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están
teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El
ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las
células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células gram
positivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la
decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo
I2-cristal violeta (Madigan, 2015). Algunos organismos (gram positivos) no se decoloran, mientras
que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por
tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que
se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal
violeta-yodo y la célula se decolora. Las células gram positivas, a causa de sus paredes celulares más
espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que
el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la
decoloración las células gram positivas son todavía azules, pero las gram negativas son incoloras. Para
poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración de contraste (Tortora, 2007).
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen azules.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Materiales:
- Cultivos jóvenes (18-24 horas) de microorganismos ​(Bacillus sp., Streptococcus sp.,
Escherichia coli).
- Colorantes básicos: cristal violeta, safranina.
- Decolorante: alcohol-cetona.
- Láminas porta objetos
- Mordiente: lugol.
- Papel secante.
- Piseta de agua destilada.
- Soporte para tinción.
- Asa de kolle.
- Aceite de inmersión.

2. Procedimiento:

Preparación de una muestra fija

- Desengrasar el portaobjetos con ayuda de un algodón con alcohol.

- Una vez desengrasado el portaobjetos, se colocó una gota de agua sobre la lámina y con el asa
de Kolle, esterilizada gracias al mechero, se colocó una pequeña porción de la muestra a fijar
encima de la gota de agua. Se realizó un suave rasgado a la muestra que se encontró dentro
del tubo. Después se esterilizó la entrada del tubo y se cerró.
- Se distribuyó la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película delgada.
Se usó la misma asa de Kolle para ello y luego se esterilizó para matar las bacterias que se
encontraban en la punta y evitar contaminar todos los materiales que se encontraban en la
mesa del laboratorio.
Se prepararon 3 muestras fijas de los siguientes microorganismos: ​Bacillus sp., Streptococcus sp. y
Escherichia coli.

Tinción Gram

- Agregar cristal violeta en cada lámina y dejar actuar por 30 segundos.

- Enjuagar con agua destilada.
- Aplicar lugol en cada lámina y dejar que áctue por 30 segundos.
- Enjuagar con agua destilada.
- Decolorar con alcohol cetona: se enjuaga la lámina unas 2 o 3 veces.
- Enjuagar con agua destilada.
- Aplicar el colorante contrastante por 30 segundos.
- Enjuagar con agua destilada.
- Secar la lámina con el papel secante.
- Examinar la muestra bajo el objeto de inmersión.

http://seramix.blogs.uv.es/2013/05/15/tinciones-diferenciales-tincion-de-gram/

V. RESULTADOS

​ rado de aumento de 1000X. De forma abastonada y agrupación en

1. Bacillus sp. : G
cadena. Gram positiva (+)
 2. Escherichia coli : Grado de aumento de 1000X. De forma cocobacilar y sin
agrupación. Gram negativa (-)

​ . Staphylococcus sp. : Grado de aumento de 1000X. En forma de coco y agrupación en

3
racimo. Gram positiva (+)

VI. DISCUSIÓN

De acuerdo con los resultados obtenidos se pudo observar tres cepas bacterianas: ​Staphylococcus sp.,
Escherichia coli y Bacillus sp., y determinar si estas eran gram positivas o gram negativas, luego de
aplicarles la tinción de Gram. La tinción de Gram consta de varios pasos, como ya se revisó en el
marco teórico. El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto, tiene afinidad por
sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacterias, por lo que las tres
cepas se tiñeron de color violeta.(Soto, 2014)

El lugol es una sustancia que aumenta la fijación de un colorante, en este caso cristal violeta, sobre
una superficie determinada. En la pared bacteriana el lugol forma un complejo junto con el cristal
violeta insoluble en agua, lo que evita que se pierda el color durante el enjuague. En la pared de las
bacterias gram positivas, existe una abundante cantidad de ácidos teicoicos no saturados que muestran
una gran afinidad por los agentes oxidantes. Como sabemos el lugol es un agente oxidante y su efecto
consiste en aumentar la acidez, haciendo que los ácidos teicoicos tengan más afinidad por el colorante
básico (cristal violeta).(Soto, 2014)

La mezcla de alcohol-cetona es un disolvente que decolora la pared bacteriana disolviendo el

complejo cristal violeta-lugol. Esta decoloración no afecta a las bacterias gram positivas.(Soto, 2014)
El decolorante provoca una disminución de la permeabilidad de la pared celular e incrementa la
retención del complejo cristal violeta-lugol, observándose en el microscopio de color violeta.(Rossi,
2017) Entre las bacterias gram positivas se encuentran ​Staphylococcus sp. ​y Bacillus sp. ​Ambas cepas,
al final de la tinción, se observaron de color azul-violeta. En el caso de los bacilos, estos pueden ser
gram positivos como los del género ​Clostridium o gram negativos como la familia Enterobacteriaceae,
por lo que no se puede generalizar. (Hernández, 2002)

A diferencia de las positivas, en las gram negativas, el decolorante extrae los lípidos de la membrana
externa de la pared celular, produciendo un aumento de permeabilidad y perdiendo el complejo
formado. (Rossi, 2017) Como ejemplo de ello es la bacteria ​Escherichia coli, q​ ue luego de la tinción,
se dio como resultado en la observación un color rosado.

La safranina es un contracolorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen
compuestos cargados negativamente logrando que las bacterias gram negativas se tiñen de color rosa.
En el caso de las gram positivas, estas no se tiñen debido a que su pared celular está saturada del
colorante cristal violeta impidiendo la entrada de safranina.(Soto, 2014)

Casi todos los microorganismos pueden ser detectados por este método a excepción de las clamidias
(parásitos intracelulares), los micoplasmas y ureaplasmas (que carecen de pared celular) y las
espiroquetas debido a su pequeño tamaño. A pesar de que este método sea muy efectivo, existen
muchas limitaciones para un resultado correcto. Si la prueba no se hizo correctamente dará un
resultado erróneo. Factores como una excesiva decoloración, haciendo que las bacterias gram
positivas se observen como gram negativas. (Cavallini ​et al)​

Además, otro factor que puede influir en que las bacterias gram positivas se observen parcial o
completamente rosadas, es la edad del cultivo. Las células viejas tienen a perder su capacidad de
retener el complejo cristal violeta-lugol y por lo tanto las bacterias se verán rosadas. Otro factor de
variabilidad podría ser las condiciones de estrés durante el cultivo, generando formas gram negativas
no viables, dentro de un cultivo de gram positivas. También se debe tener cuidado con los lavados
luego de realizarse el agregado de diferentes reactivos, ya que si se deja un exceso de agua en la
lámina, los reactivos de diluirán, en especial el yoduro (componente del lugol). Por lo tanto, aunque
esta práctica parece simple, su realización requiere de un alto grado de confiabilidad, técnica y
experiencia.(Cavallini ​et al​)

VII. CONCLUSIONES

● La tinción de gram (diferencial) facilita la diferencia de una bacteria gram positiva y

gram negativa realizando cada unos de los pasos fundamentales que nos facilitan
tener un buen resultado teniendo en cuenta que para que se de este tipo de tinción la
pared bacteriana de peptidoglucano de las bacterias juega un papel importante ya que
esta nos permite diferenciar el tipo de bacteria al momento de teñir la célula utilizadas
 en el laboratorio ya que en el momento de teñir su estructura gruesa o delgada de la
pared permite que la célula quede incolora o con color.

● Existen dos tipos pared celular en bacterias, que se diferencian en la tinción de gram
la gram positiva mono estratificada gruesa , gram negativa pluriestratificada y
delgada / multicapa.

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Bajo qué circunstancias la tinción diferencial de Gram podría resultar errática?

La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo, cuanto más
antigua sea la muestra, más riesgo de que la pared bacteriana se encuentre dañada.
El pH del medio también influye en la tinción pues se requiere que las células mantengan su carga
negativa para la interacción correcta con los colorantes, esto sucede a pH neutro o cercano al neutro.
A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya
que la reacción puede variar según la edad de las células ( cultivos viejos de bacterias gram positivas
pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al
decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se
tiñan como gram negativas).

2. ¿Qué efecto traería reemplazar el lugol con otro agente oxidante?

Ninguna ya que cumpliría la misma función de incrementa la afinidad del colorante primario con la
célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta- yodo sirve para
intensificar el color del tenido, así que no se produciría un efecto si el lugol es reemplazado por otro
agente oxidante.

3. ¿Es posible variar el colorante primario y contrastante obteniendo los mismos

resultados?

Se puede variar el colorante primario mientras sea básico para que tiña las células, en cuanto al
colorante de contraste sirve para poner de manifiesto las células gram negativas.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina; sin embargo, no es crucial
para la técnica. Entonces, sí se lograría reconocer el grupo al que pertenecen las bacterias, aunque se
cambien los colorantes.

4. ¿Cuál es la influencia del pH en la reacción de Gram?

El pH tiene un papel muy importante en la tinción de Gram, ya que las bacterias gram positivas
pueden parecer gram negativas si la acidez aumenta y las gram negativas pueden parecer gram
positivas pueden parecer gram negativas si la alcalinidad aumenta.
5. Liste cinco ejemplos de bacterias grampositivas y gramnegativas, señalando su
importancia.

a) Bacterias grampositivas:

● Staphylococcus aureus: B ​ acteria ampliamente distribuida en la población humana,

presente en la epidermis y que puede desencadenar patologías de amplio espectro,
desde conjuntivitis hasta neumonía.
● Enterococcus faecalis: B ​ acteria comensal que habita en el tracto intestinal de algunos
mamíferos y que tiene particular importancia biomédica por haber adquirido
inmunidad respecto a casi todos los antibióticos en uso. Mayormente causa
enfermedades intrahospitalarias.
● Streptococcus pyogenes: ​Con gran relevancia médica por ser uno de los patógenos
más comunes en humanos, son causantes de enfermedades supurativas y no
supurativas.
● Bacillus anthracis: ​Bacterias causantes de la enfermedad del “ántrax” o el síndrome
de la piel negra, patógena en el ganado y en humanos.
● Bacillus thuringiensis: B ​ acterias benéficas para el control de plagas en la agricultura,
poseen en su interior cristales con efecto insecticida.

b) Bacterias gramnegativas:

● Pseudomonas aeruginosa: P ​ atógeno oportunista en animales y plantas

inmunocomprometidos.
● Neisseria gonorrhoeae: ​Diplococo de importancia médica que causa la gonococia,
enfermedad de transmisión sexual en humanos.
● Chlamydia trachomatis: B ​ acteria intracelular obligada y patógena solo en humanos
que causan traucomas, ceguera, infecciones óculo genitales y neumonías.
● ​ acilo patógeno primario con importancia epidemiológica, causante
Yersinia pestis: B
de las pestes pulmonar y bubónica.
● Rhizobium leguminosarum: B ​ acteria benéfica para la agricultura, fijadora de
nitrógeno atmosférico en simbiosis con las plantas.

Fuente: Schlegel, H. G. y Zaborosch, G. (1997).

6. ¿Cuál es el principio de la tinción Gram y cómo se relaciona con el peptidoglucano?

La diferencia estructural entre la pared celular de las bacterias grampositivas y de las gramnegativas
es la causa de las reacciones con el colorante de Gram. En esta tinción se forma un complejo insoluble
entre el cristal violeta y el yodo en el interior de la célula. En las bacterias gram negativas este
complejo se extrae con el decolorante, mas no en las grampositivas. Esto se debe a que este tipo de
procariotas poseen una gruesa capa de peptidoglucano en su pared celular, mientras que en las
gramnegativas este polímero representa apenas una porción. Durante la tinción de Gram, la pared
celular grampositiva es deshidratada por el alcohol-cetona, que hace que los poros de las paredes se
cierren e impide así que se escape el complejo de yodo formado por acción del mordiente.
En bacterias gramnegativas, por el contrario, el decolorante penetra rápidamente a través de la
membrana externa rica en lípidos extrae el complejo cristal violeta-yodo de la célula. Madigan M.
Martinko J. Bender K. Buckley D. Stahl D. (2015). Se observa en la imagen cómo la cantidad de
peptidoglucano es fundamental para la retención de la coloración por parte del complejo yodado, este
se forma por la conformación de nuevos enlaces que se forman en la estructura molecular del
polímero utilizando al yodo de la sal de potasio como ion central y a los oxígenos provenientes de los
anillos piranósicos de la parte glucosídica como agentes ligandos; esta atracción electrostática da
origen a la coloración azulada.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Hernández-Chavarría, Francisco. (2002)​Fundamentos de epidemiología: El arte detectivesco

de la investigación epidemiológica. P ​ rimera edición. C​ osta Rica: Editorial Universidad
Estatal a Distancia.
- López Jácome L, Hernández Durán M, Colín Castro C, Ortega Peña S, Cerón González G,
Franco Cendejas R. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en
Discapacidad. [Internet]. 2014. [Citado 01 Set 2018]; 3(1):10-18. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
- Madigan M. Martinko J. Bender K. Buckley D. Stahl D. (2015). ​Brock. Biología de los
microorganismos.​ Decimocuarta edición. Madrid: Pearson Education
- Rodríguez, E.; Gamboa, M.; Hernández, F. & García, J. ​Bacteriología General: Principios y
prácticas de laboratorio.
- Rossi, Alejandro. ​Gram Britania.​ Argentina: CABA.
- Soto Flores, R. Coloración Gram. [Internet]. 2014. [Citado 08 Set 2018]. Disponible en:
http://coloraciondegram.blogspot.com/2014/05/fundamento-de-la-tincion-de-gram.html
- Tortora J. Gerard, Funke R. Berdell. (2007) ​Introducción a la microbiología.​ Novena edición.
Buenos Aires: Médica Panamericana.