Northern Blotting

Por:
Mariel Dionicio
Mariela Morales
Claudia Vazquez
Yaraví Posadas
Diego Vértiz
Northern blot (detección de secuencias
específicas de RNA)
● Proporciona información de la presencia de un transcrito de RNA
complementario a un gen clonado en una célula o en un tejido
determinado.
● Se utiliza para examinar patrones de expresión génica en tejidos
embrionarios y adultos.
● Puede utilizarse para detectar cortes y empalmes alternativos del
mRNA, y para detectar múltiples tipos de transcritos provenientes de
un solo gen.
Extraccion del RNA
● Lisis celular y disrupción de la membrana

● Inhibición de la actividad ribonucleasa

● Desproteinización

● Recuperación del ARN intacto

Electroforesis
● Se separan los ARN de acuerdo con su tamaño, mediante electroforesis
en gel.
● La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una
corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas
según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
● Se usa la electroforesis en gel de agarosa
Transferencia a una membrana

a) Nitrocelulosa
• baja capacidad de unión de ácidos nucleicos (80 μg/ cc2)
• frágil
• carga negativa
b) Nylon
• mayor capacidad de unión (400-500 μg/cc2 )
• mayor resistencia
• carga neutra o positiva
Es necesario inmovilizar el RNA en la membrana
a) Horno de vacío
Aplicable sólo a membranas de nitrocelulosa
La membrana es tratada por 2 horas a 80 ºC. Al parecer el
RNA forma enlaces hidrofóbicos con la membrana.

b) Irradiación UV
Aplicable sólo a membranas de nylon
La exposición a la luz UV activa las bases T/U haciéndolas
altamente reactivas con los grupos amino de la superficie de la
membrana y formando enlaces covalentes. Aumenta la estabilidad y
permanencia de los ácidos nucleicos en la membrana
Generación de una sonda
Las sondas son fragmentos monocatenarios de DNA o RNA marcados con una
molécula reporter, que pueden ser enzimas, sustratos antigénicos,
radioisótopos, los que se pueden unirse con una alta especificidad a una
secuencia complementaria de ácido nucleico de cadena sencilla (diana), a fin de
hacer posible su posterior detección y de esta manera la identificación de la
secuencia de ARN de interés.
Hibridación
Se expone el filtro a una zona de ADN con marca radiactiva con la cuál se
produce una hibridación ya que dicha sonda es complementaria al ARN.

La cadena de mRNA que se quiere cuantificar se une con la sonda

complementaria se hibridizan de forma antiparalela, para forman una molécula
de doble cadena.

Esto se logra sumergiendo la membrana de fijación en un buffer que contiene

la sonda.
Visualización
•Captura de la radiación ionizante
por una emulsión
fotográfica
• La membrana es expuesta a un
film por tiempos variables
• El film es revelado y analizado