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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
I. DATOS GENERALES
Título del proyecto: “Efecto protector de las semillas de Theobroma cacao en modelo experimental
animal de Parkinson inducido por 6-hidroxipamina”
Duración: 2 meses
El mal de Parkinson constituye una de las principales causas de discapacidad en etapas posteriores
de la vida; la cual, ha llegado a afectar de un 2-3% a las personas mayores de 65 años e incluso hasta
el 10% a mayores de 80 años (1). Más aún, cuando esta población se incremente a 2000 millones
para el año 2050, siendo en la actualidad 600 millones aproximadamente según la OMS, existirá una
mayor preocupación por prevenir y curar estos males (2).
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falta de factores tróficos, y otros todavía desconocidos. Es posible que el estrés oxidativo contribuya
también a mal plegamiento de las proteínas. (8) Aunque la mayoría de los casos de la enfermedad
parecen ser esporádicos, hay formas genéticas de parkinsonismo (designado PARK1 través PARK13)
relacionadas con los genes nucleares y mitocondriales.
Durante muchos años ha sido bien reconocida la acción protectora de los flavonoides (polifenoles)
en la prevención y el desarrollo de diversas “patologías por estrés oxidativo” tales como la diabetes,
las enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares, el cáncer (9) y recientemente, asociado a
desórdenes neurodegenerativos como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, observándose
que el consumo de flavonoides produce una reducción del 40% del riesgo de padecer esta
enfermedad (10). Esta acción neuroprotectora de los flavonoides se basa en dos mecanismos
principales: el primero, en la capacidad de mantener la integridad y funcionalidad de las neuronas,
además de prevenir la oxidación neuronal e inhibir la peroxidación lipídica; y el segundo, en su
propiedad antiinflamatoria neuronal producto de la inhibición de la acción microgliar y de moléculas
pro-inflamatorias como la interleucina 1β (IL-1β) y el factor de necrosis tumoral- alfa (TNF-α) (11).
Si bien existen diversos alimentos con gran contenido de flavonoides como el vino, la manzana, el
té verde o el té negro, es el cacao (Theobroma cacao) el que posee el más alto contenido de
polifenoles y su poder reductor es equivalente al de una solución de 5, 80g de ácido ascórbico /100g
(12). Pueden distinguirse tres grupos principales de polifenoles en el cacao: catequinas o flavan-3-
oles (37%), antocianinas (4%) y proantocianidinas (58%), siendo las catequinas, las que poseen
mayor actividad antioxidante y dentro de éstas, la (-)epicatequina corresponde aproximadamente
el 35% del total de polifenoles presentes en el cacao. Es por esta propiedad antioxidante que se
postula una acción neuroprotectora del cacao y sus productos derivados además de sus múltiples
efectos beneficiosos en la salud humana (13, 14).
Estudios anteriores realizados en China, indican que los polifenoles contenidos en él te verde poseen
un efecto reductor de los trastornos neuroconductuales. Como ya se ha mencionado la Theobroma
cacao contiene altos valores de polifenoles, por encima de los contenidos en el té verde, por ende
se deduce que su acción es similar o mucho mayor que la de esta última (15). Por todo lo descrito
en líneas anteriores, podemos concluir que el Teobroma cacao posee un efecto neuroprotector
frente a la enfermedad de Parkinson.
Pregunta de investigación
¿Tiene el extracto etanólico de las semillas de Theobroma cacao efecto protector en modelo
experimental de Parkinson inducido con 6-hidroxidopamina en ratas machos Holtzman.
Hipótesis
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El extracto etanólico de las semillas de Theobroma cacao poseen un efecto protector en modelo
experimental de Parkinson inducido con 6-hidroxidopamina en ratas machos Holtzman.
Objetivos
i. Principal
Determinar que el extracto etanólico de las semillas de Theobroma cacao poseen un efecto
protector en modelo experimental de Parkinson inducido con 6-hidroxidopamina en ratas machos
Holtzman.
ii. Específicos
a. Clínicos: Determinar y comparar el número de rotaciones contralaterales al hemisferio
lesionado mediante el test de apomorfina en todos los grupos en los días 15 y 29 de la
intervención.
b. Bioquímico: Cuantificar y comparar los niveles de dopamina cerebral, mediante HPLC, en
todos los grupos al final de la intervención.
c. Anatomopatológica: Determinar el número de neuronas dopaminérgicas en la sustancia
negra, mediante la inmunohistoquímica para tirosina hidroxilasa, en todos los grupos al
final de la intervención.
Durante los últimos 150 años, el desarrollo socioeconómico y los avances sanitarios en los
tratamientos han permitido reducir grandemente la tasa de morbimortalidad por enfermedades
infectocontagiosas y por ende, la esperanza de vida, especialmente en los países industrializados,
ha llegado incluso a ser superior a los 75 años. Si bien éste es considerado un índice de mejoría de
la calidad de vida, no debemos olvidar que ante el aumento de la población de adultos mayores, las
enfermedades crónicas y degenerativas se van haciendo cada vez más prevalentes. Dentro de las
patologías degenerativas que se conocen, encontramos al mal del Parkinson, una enfermedad
progresiva y neurodegenerativa, que si bien no desencadena la muerte de las personas afectadas,
produce un deterioro grave de la calidad de vida de estos pacientes y de su entorno familiar y social,
además de generar grandes gastos y posibles efectos secundarios por la administración prolongada
del tratamiento antiparkinsoniano.
Por todo lo indicado anteriormente es que se ha visto la necesidad de indagar en no solo nuevas
formas de tratamiento, sino que mediante esta investigación intentamos contribuir a la búsqueda
de productos naturales beneficiosos para la prevención de este mal, como lo es la Theobroma cacao
o más conocida como “cacao”, semilla cuyo valor neuroprotector pretendemos demostrar.
III. METODOLOGÍA
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Población:
Tipo de muestra: Aleatorizado simple
Tamaño de muestra: 40 ratas macho Holtzman
Criterios de inclusión:
Ratas macho de edad aproximada 3 meses
Peso promedio de 250 Kg
Criterios de exclusión:
Ratas con alguna patología adyacente.
b. Cirugía estereotáxica
Se administrará intracranealmente la neurotoxina 6-OHDA a todos los grupos. Las ratas serán
anestesiadas con Ketaxyl® (0,25 ml/kg) asegurando un tiempo de trabajo de 1,5 horas. 4 μg de 6-
OHDA (Sigma- Aldrich) disuelta en 0.2mg/ml de ác. Ascórbico y 4 μl de solución salina se inyectaron
unilateralmente, con una frecuencia de 1μL/min, a través de una jeringa Hammilton, en la pars
compacta derecha de la sustancia negra. Las coordenadas que se usarán son bregma
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anteroposterior -5,0 mm, lateral 2,1mm y 7,7mm de profundidad desde la duramadre (Atlas de
Paxinos&Watson).
c. Test de Rotación
Se realizará a todos los grupos los días 15, un día antes de la cirugía y 29, postcirugía. Las ratas serán
puestas en recipientes circulares y permanecerán por 15 minutos para habituarse. Se contará el
número total de vueltas contralaterales durante los 30 minutos siguientes a la administración
subcutánea de apomorfina disuelta en metabisulfito de sodio al 0,5% (sc, 0.5 mg/kg). Las
rotaciones se definen como vueltas completas de 360° y resultan de la diferencia neta entre las dos
direcciones de giro.
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Operacionalización de variables
DIMENSIÓN ESCALA
DEFINICIÓN DEFINICIÓN TIPO DE CRITERIOS DE VALORES
VARIABLE DE LA DE INSTRUMENTO
CONCEPTUAL OPERACIONAL VARIABLE MEDICIÓN FINALES
VARIABLE MEDICIÓN
Media y
Cantidad total
desviación
de rotaciones no
Conducta estándar del
menor de 150
MACROSCÓPICA
de giro intenso porcentaje de
giros durante 45
NÚMERO DE en sentido Cuantitativa contactos de
minutos Razón Test de apomorfina contacto/minuto
ROTACIONES contralateral al discreta los grupos
(denervación
hemisferio controles y
nigro-estriatal
lesionado experimentales
mayor del 80 %.)
al finalizar el
(17)
tratamiento
Media del
número de
Parte de la
Numero de neuronas
sustancia negra
MICROSCÓPICA
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Media y
Contenido de desviación
dopamina en estándar de los
Concentración
muestras Prueba niveles de
BIOQUÍMICO
de FSH en
NIVELES DE estriatales Cuantitativa cromatográfica para dopamina de
sangre al Razón ng.g-1 proteína
DOPAMINA determinado continua medición de los grupos
finalizar el
por prueba dopamina controles y
tratamiento
cromatográfica experimentales
(HPLC). al finalizar el
tratamiento
EXTRACTO
Masa del
ETANÓLICO Theobroma
NUTRICIONAL
extracto …
DE SEMILLAS cacao procesado Cuantitativa Prueba estándar de
según peso de Razón mg/Kg
DE para la continua dilución para ETC
animal de
theobroma experimentación
experimentación
cacao (ETC)
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Análisis de datos
Evaluación estadística
Los resultados serán procesados por la prueba de Kruskall-Wallis para determinar diferencias entre
los grupos, y luego el test pos hoc de Dunn determinará entre qué grupos existe la diferencia. Para
ello, se empleará el paquete estadístico SPSS® Versión 20.0 y se considerará un valor de p < 0,05
para que sea significativo.
Consideraciones éticas
Se usará solamente la cantidad de ratas necesarias para poder lograr los objetivos planteados,
considerando siempre que este sea el menor número posible y siguiendo el esquema de otras
investigaciones experimentales acerca de este tema. Los animales a lo largo del tiempo que duró la
experimentación contaron con el cuidado apropiado respecto a su alimentación, manipulación y
acondicionamiento de su jaula. En el momento de la cirugía estereotáxica se administrará un
anestésico para evitar el dolor.
Presupuesto
BIENES COSTO(S/.)
Adaptación del Bioterio 580.00
Materiales de limpieza (escoba, recogedor, jabón 25.00
liquido, toalla, tachos, trapeador, etc)
Calefactor 75.00
Termohigrómetro y balanza 75.00
Material biológico (Ratas machos Holzman ) 400.00
Jaulas, Comederos, bebederos, viruta 180.00
Alimento (ratina) 200.00
Material de Laboratorio (guantes, mascarilla, etc) 120.00
Materiales químicos 1580.00
Material fitoquimico 100.00
Subtotal 3435.00
SERVICIOS COSTO(S/.)
Gastos de Fotografía 30.00
Movilidad 160.00
Llamadas telefónicas 100.00
Subtotal 290.00
TOTAL 3725.00
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Fuentes de financiamiento
El presente trabajo será financiado por los mismos estudiantes de medicina que realizarán el
proyecto con el apoyo de la Facultad de Medicina “San Fernando” y de los laboratorios de
Neurociencias de la facultad de Medicina de la UPCH.
Cronograma de actividades
Experimento X X X
Sacrificio X
Recursos:
Humano
Los autores del proyecto de investigación
Nuestro asesor, el Dr. Manuel Leiva Beraún
Profesores de apoyo: Dr. Jorge Arrollo
Personal técnico de la facultada de Medicina de “San Fernando”
Personal técnico de los laboratorios de Neurociencias de la facultada de Medicina de la UPCH
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Materiales
De trabajo:
20 jaulas (con bebedero y comedero cada uno)
2 cánulas
Agua ad libitum, ratina
Termohigrómetro, calefactor y balanza
De experimentación:
Biológicos (40 ratas macho Holtzman y Semillas de Theobroma cacao)
Fitoquímico (Extracto etanólico de semillas de Theobroma cacao)
Químicos (6-Hidroxidopamina (6-OHDA), Apomorfina, Dopamina hidrocloride y Anticuerpos
anti Tirosin Hidroxilasa (Anti TH))
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V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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