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1. OBJETO
Esta norma específica los métodos horizontales para el recuento de estafilococos
coagulasa positiva en productos destinado al consumo humano o para la
alimentación de animales, mediante el recuento de colonias obtenidas en medio
sólido medio Baird-Parker o medio plasma de conejo fibrinógeno como medio
alternativo véase el anexo B (Informativo)] después de incubación aeróbica a 36 °C
± 2 ºC.
2- REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la
aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica
únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última
edición del documento normativo referenciado (incluida cualquier corrección).
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de esta norma se aplican los siguientes términos y definiciones:
4 PRINCIPIO
5.2 DILUYENTE
Véanse las NTC 4491-1, NTC 4491-2. NTC 4491-3, NTC 44914 y la norma
específica relacionada con el producto a examinar.
5.3 MEDIO BAIRD-PARKER
BAIRD-PARKER
Se puede usar medios de cultivo comercialmente disponibles. En tal caso, deben
seguirse cuidadosamente las instrucciones del fabricante.
5.3.1.2 Preparación
- Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua
hasta ebullición.
- Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización sea de 7.2 ±
0,2 a 25°C.
5.3.2 Soluciones
5-3.2-1 Solución de telurito de potasio
5.3.2.1.1 Composición
5.3.2.1.2 Preparación
- Se disuelve el telurito de potasio en el agua calentando lentamente hasta
disolución completa.
- El sólido debe ser soluble. Si se presenta material blanco insoluble, se
descarta el reactivo,
- Se esteriliza por filtración usando membranas con tamaño de poro de 0,22
µn.
- La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3°C ± 0,2
°C.
- Se descarta la solución si se forma un precipitado blanco.
Se usan huevos de gallina con las cáscaras intactas que tengan menos de siete
días. Se lavan los huevos con un cepillo en detergente líquido. Se enjuagan con
agua corriente, luego se desinfectan sumergiéndolos en etanol al 95 % (V/V)
durante 30 s o etanol al 70 % durante 1 h y se secan. Empleando procedimientos
asépticos, se rompe cada huevo y se separa la yema de la clara. Se colocan las
yemas en una probeta estéril para su medición y se añaden 4 partes por volumen
de agua estéril y/o solución salina al 0.85 %. Se transfiere asépticamente a un
matraz estéril y se mezcla vigorosamente.
5.3.2.3.2 Preparación
- Se disuelve la sulfametazina en la solución de hidróxido de sodio.
- Se completa hasta 100 ml con agua.
- Se esteriliza por filtración usando membranas con un tamaño de poro de 0.22
µm.
- La solución
solución puede ser almacenada como máximo
máximo por un mes a 3°C±
3°C± 2°C.
5.3.3.2 Preparación
- Se funde el medio, luego,
luego, se enfría a 45°C± 2°C, mediante el baño maría.
- Se adiciona, bajo condiciones asépticas, las otras dos soluciones (si se
sospecha que especies de Proteus están en la muestra de ensayo) la
solución de sulfametazina (Véase numeral 5.3.2.3). siendo previamente
calentadas en el baño de maría a 45°C± 1°C.
- se mezcla bien después de cada adición.
Antes del
del uso para
para eliminar la condensación,
condensación, se deben dejar
dejar las cajas,
cajas, con las
tapas sueltas en un área aséptica.
5.4.2 Preparación
- Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua
por ebullición.
- Si es necesario, se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización
sea de 7.4 ± 2 a 25 °C.
- Se transfiere el medio en cantidades de 5 ml a tubos de ensayo o frascos
(Véase el numeral 8.5) de capacidad apropiada
- Se esteriliza el medio por 15 min a 121 °C.
7. MUESTREO
Es importante que el laboratorio reciba una muestra representativa y adecuada para
su correspondiente análisis y que no haya sufrido daños o cambios durante el
transporte o el almacenamiento.
El muestreo no hace parte del método especificado en esta norma. Debe verse la
norma específica para el producto en cuestión. Si no hay norma específica, se
recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
9. PROCEDIMIENTO
9.1 PORCIÓN DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES
Véase la NTC 4491-1, NTC 4491-2. NTC 4491-3. NTC 4491-4 y la norma específica
para el producto en cuestión.
Si se inoculó 1.0 ml sobre tres cajas (véase el numeral 9.2.2), considerarlas como
una sola en todos los recuentos subsecuentes y procedimientos de confirmación.
Para el recuento se toman solo aquellas cajas (véase la Nota 2 del numeral 9.4.1.1)
que contengan entre 20 y 200 colonias típicas, atípicas, o ambas, en dos diluciones
sucesivas. Para confirmación, (véase el numeral 9.5), se selecciona un número
dado A (véase el numeral 10.1.1) (en general de 3 colonias a 5 colonias típicas, si
solo hay colonas típicas, o de 3 a 5 colonias atípicas, si solo hay colonas atípicas,
o de 3 a 5 colonias típicas y de 3 a 5 colonias atípicas si están presentes ambas, de
cada caja).
a) colonias negras brillantes con o sin un estrecho borde blanco: la zona clara está
ausente o ligeramente visible y el halo opalescente está ausente o es apenas
visible;
NOTA 3 Otras
Otras colonias son el resto de colonias que pueden estar presentes en la
placa y que no muestran la apariencia típica, consideradas como la flora de fondo.
Las bacterias pertenecientes
perteneciente s a otros generes diferentes al staphylococos pueden
dar colonias con una apariencia similar a los estafilococos. El examen microscópico
con tinción de Gram antes de la confirmación, facilitara la diferenciación de otros
géneros.
Como control negativo, para cada lote de plasma, se adicionan 0.1 ml de caldo
infusión cerebro-corazón (véase el numeral 5.4) a la cantidad recomendada de
plasma de conejo (véase el numeral 5.5) y se incuba sin inoculación. Para validar la
prueba, el pasma de control no debe mostrar ningún signo de coagulación.
= _____x +_____x
En donde
Ac = es el número
número de colonias
colonias típicas sometidas a la prueba coagulasa
coagulasa
(Véase el numeral 9.5)
Anc = es el número
número de colonias
colonias atípicas
atípicas sometidas
sometidas a la prueba
prueba coagulasa
coagulasa
(Véase el numeral 9.5);
Para aquellas cajas que contienen como máximo 200 colonias, con 100 colonias
típicas y/o atípicas en dos diluciones sucesivas, se calcula el número de
estafilococos coagulasa-positiva para cada caja como se especifica en el numeral
10.1.1 se calcula, como un promedio ponderado de dos diluciones sucesivas, el
número N de estafilococos coagulasa-positiva presentes en la porción de muestra,
usando la siguiente ecuación:
∑
=
(1 + 0,1
0,1 2)
2)
En donde
10.1.3 Ejemplo
El recuento para un producto después de incubación con 0.1 ml de producto dio los
siguientes resultados:
- . de 65 colonias, 5 colonias
colonias fueron seleccionadas
seleccionadas y todas las 5 fueron
coagulasa positiva, dando a = 65:
-
65+51+3+7
= = 57 272
(0.2
0.22 x 10 − 2)
∑
=
2
En donde
∑
=
2
en donde
11. PRESICION
11.1 GENERALIDADES
Por tanto estos estimadores se utilizan en esta parte de la NTC 4779 (ISO 6888)
11.2 REPETIBILIDAD
11.2.1 Limite de repetibilidad
La diferencia absoluta entre los resultados (transformados a log 10) de dos análisis
individuales (número de estafilococos coagulasa-positiva por gramo o por mililitro),
o Ia proporción entre el mayor y el menor de los dos resultados del anális is en escala
normal, obtenidos utilizando el mismo método sobre idéntico material de análisis por
el mismo analista, utilizando los mismos aparatos dentro del intervalo de tiempo lo
más corto posible, no sobrepasará el límite de repetibilidad (r) en más del 5% de los
casos.
r = 1.9 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados
del análisis, en escala normal).
r = 1.55 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados
del análisis, en escala normal).
11.3 REPRODUCIBILIDAD
log10), o
R = 2.7 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados
del análisis, en escala normal).
log10), o
R = 2.4 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados
del análisis, en escala normal).
ANEXO A
(Informativo)
Tabla A.1. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de queso
Límite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de 10gw 0,50 0,17 0,33
(en log1o UFC/g)
Tabla A.2. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de carne
Límite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de 10gw 0,25 0,25 0,22
(en log1o UFC/g)
Desviación estándar de la reproducibilidad, sr (en log 10 UFC/g) 0,11 0,10 0,11
materiales de referencia
Muestra/Nivel de contaminación (capsula que contiene unas 5
000 UFC
Número de laboratorios que proporcionaron resultados 23
ANEXO B
(Informativo)
MEDIO DE CULTIVO ALTERNO
B.2.2 Soluciones
B.2.2.1 Solución de telurito de potasio
Prepararla solución de telurito de potasio como se indica en el numeral 5.3.2.1.
B.2.2.2 Solución de fibrinógeno bovino
B.2.2.2.1 Composición
Fibrinógeno bovino 5ga7g
Agua destilada
destilada o desionizada
desionizada 100 ml
Dependiendo de la pureza del fibrinógeno bovino.
B.2.2.2.2 Preparación
Bajo condiciones asépticas, se disuelve el fibrinógeno bovino en el agua justo
antes de su uso.
B.2.2.3.2 Preparación
Operando bajo condiciones asépticas, disolver los componentes en el agua justo
antes de su uso.
B.2.3 Medio completo
B.2.3.1 Composición
Medio base 90 ml
solución de telurito de potasio 0,25ml
solución fibrinógeno bovino 7,5 ml
Solución de plasma de conejo e inhibidor de tripsina 2,5 ml
B.2.3.2 Preparación
Fundir el medio, luego enfriarlo a 48 °C ± 1 °C en un baño de maría (véase el
numeral 6.4).
ADVERTENCIA
ADVERTENCIA Si Si se consigue
consigue comercialme
comercialmente
nte solución
solución de plasma
plasma de fibrinógeno
bovino/plasma de conejo, se deben seguir con mucho cuidado las indicaciones del
fabricante para la preparación de esta solución y del medio completo (en particular
la temperatura del medio base) de lo contrario, el medio puede perder
completamente su actividad.
Debido a que el agar plasma de conejo fibrinógeno está basado en una reacción
de coagulasa, no es necesario confirmar esta actividad.
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ANEXO C
(Informativo)
Se incluyeron las
2. REFERENCIAS 2. REFERENCIAS referencias normativas
NORMATIVAS NORMATIVAS para la preparación de las
muestras para ensayo,
NTC 4491-1, NTC 4491:1998, suspensiones iniciales y
Microbiología de Microbiología de diluciones decimales que
alimentos y de alimentos alimentos y de alimentos reemplazaron la NTC
para animales. para animales. 4491, que han sido
Preparación de muestras Preparación de muestras adoptadas por el comité
para ensayo, para ensayo, técnico.
suspensiones iniciales y suspensiones iniciales y
diluciones decimales diluciones decimales
para los análisis para los análisis
microbiológicos. Parte 1: microbiológicos. Parte 1:
Reglas generales para la Reglas generales para la
preparación de la preparación de la
suspensión inicial y de suspensión inicial y de
diluciones decimales. diluciones decimales.
(ISO 6887-1). (ISO/DIS 6887).
NTC 4491-3,
Microbiología de
alimentos y de alimentos
para animales.
Preparación de muestras
para ensayo,
suspensiones iniciales y
diluciones decimales
para los análisis
microbiológicos. Parte 3:
RegIas específicas para
preparación de muestras
de pescado y productos
de la pesca. (ISO 6887-
3).
NTC 4491-4,
Microbiología de
alimentos y de alimentos
para animales.
Preparación de muestras
para ensayo,
suspensiones iniciales y
diluciones decimales
para los análisis
microbiológicos. Parte 4:
RegIas específicas para
la preparación de
productos deferentes de
leche, productos lácteos,
carne, productos
cárnicos, pescado y
productos de la pesca.
(ISO 6887-4).
NTC 4092, Microbiología
de alimentos y de
alimentos para animales.
Requisitos generales
para el examen
microbiológico. (ISO
7218).
NOTA La determinación
de S. aureus puede
realizarse también por
los siguientes métodos:
siembra en membranas
hidrofóbicas. PCR u otro
método búsqueda.
Servir inmediatamente
en las cajas de Petri.
BIBLIOGRAFIA
[2] ISO 5725-2 - Accuracy (Trueness and Precision) 01 Measurement Methods and
Results. Part 2: Basic Method for the Determination Repeatability and
Reproducibility of Standard Measurement Method.
[3] ISO 16140 - Microbiology of Food and Animal Feeding stuffs. Protocol for the
Validation of Alternative Methods.
[4] DE BUYSER, M.L., LOMBARD, B., SHULTEN, S.M., lN’r VELO, P.R.,
SCOTTER, S.L., ROLLIER, R., LAHELLEC, C. Validation of EN ISO Standard
Methods 6888 Part I and Part 2:1999, Enumeration of Coagulase-Positive
Staphylococci
Staphylococci in Foods. Int. Food Microbiol…83(2), 2003, pp. 185 -194.
[6] BECKERS H.L. et al. Evaluation of a Pour-Plate System with Rabbit Plasma-
Bovine Fibrino gen Agar for the Enumeration of Staphylococcus Aureus in Food.
Can. J. Microbio!., 30, 1984, pp 470-474.