INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
METODOS DE ANALISIS

VERIFICACION DEL FUNCIONAMIENTO DE UN

ESPECTROFOTOMETRO

GRUPO: 5QV2
INTEGRANTES:
CHAVEZ RICO PABLO
Objetivos

 Evaluara el rendimiento instrumental de un espectrofotómetro

 Verificara la exactitud de escala de la longitud de onda, la presencia de radiación dispersa, el
ancho de banda, la exactitud fotométrica, la proporcionalidad de respuesta y el rendimiento global del
instrumento.

Fundamento

Cuando la luz de una apropiada longitud de onda atraviesa una cubeta que contiene una solución
colorida, parte de la luz es absorbida por la solución, el resto de la luz es trasmitida a través de la
muestra hasta el detector. La luz que llega al detector se conoce como trasmitancia, pero nuestro
equipo es capaz de transformarla a absorbancia. 1
Cada solución colorida tiene un espectro de absorción característico que se establece a partir de la
medición de la absorbencia a diferentes longitudes de onda. La longitud a la cual se analiza una
sustancia es generalmente (pero no siempre), aquella a la cual se obtiene la máxima absorbencia.
Por lo regular se selecciona aquella que dé la mayor sensibilidad y que más se aproxime a la ley
de Beer.

Tabla 1. Elaboracion de la curva de calibración del Sulfato de Niquel AL 20%

Longitud
SPECTRONIC
de onda D-LAB
9
(nm)
380 4 0.4
390 3 0.2
400 3 0.3
410 5 0.6
420 10 2.2
430 20 11.8
440 35 31.7
450 44 46.1
460 56 55.5
470 72 67.1
480 89 80.1
490 89 88.8
500 90 91.9
510 86 90.8
520 82 87.7
530 79 83.9
540 72 80
550 68 77.2
560 62 72.6
570 59 65.1
580 48 55.9
590 39 45.2
600 31 34.7
 Grafica 1. Verificación. Espectro de trasmisión del Sulfato de Niquel al 20%

100 100

90 90

80 80

70 70
2
60 60
Axis Title

50 50

40 40

30 30

20 20

10 10

0 0
0 100 200 300 400 500 600 700
Axis Title

SPECTRONIC 9 D-LAB

Tabla 1.1. Elaboracion de la curva de calibración del filtro de Didimio.

Longitud de
%T %T
onda (nm)
400 46 97.2
410 54 96.2
420 55 86.2
430 48 36.9
440 46 11.4
450 47 10.1
460 46 14.2
470 45 8.4
480 51 13
490 58 43.8
500 51 38.1
 510 29 5.5
520 39 5
530 36 2.5
540 54 42.4
550 66 77.9
560 56 71.2
570 26 3.5
580 8 1.1
590 9 1.2 3
600 20 4

Grafica 1.1. verificación. Espectro de trasmisión del filtro de Didimio

100 100

90 90

80 80

70 70

60 60
%T

50 50

40 40

30 30

20 20

10 10

0 0
0 100 200 300 400 500 600 700
Longitud de onda (nm)

SPECTRONIC 9 D-LAB
 Tabla 2. Espectro de absorción del filtro de Didimio.

Longitud de
%T
onda (nm)
400 98.2
410 97.5
420 86.7
430 34.5
440 9.7
450 10.3 4
460 13.6
470 8
480 12.8
490 47
500 39
510 5
520 3.4
530 2.1
540 44.3
550 79.4
560 68.1
570 0.9
580 0.1
590 0.2

Grafica 2. Espectro de trasmisión del filtro de Didimio

100
90
80
70
60
%T

50
40
30
20
10
0
0 100 200 300 400 500 600 700
Longitud de onda (nm)
Discusión:

Obtuvimos los espectros de trasmisión característicos del filtro de Didimio y de una solución de
sulfato de níquel. En la grafica perteneciente a el espectro de absorción para el filtro de Didimio,
obtuvimos picos a 420, 490 y 550 nm y valles a 440, 470 y 510. Esto demuestra que nuestro
espectrofotómetro tiene una escala exacta y que las determinaciones que se realicen en ese equipo
van a ser confiables ya que con esto nos aseguramos que al ajustarlo a la longitud de onda deseada,
el equipo realmente selecciona esa longitud de onda.

Tabla 3. Espectro de transmisión de la solución de Sulfato de Niquel al 20%. 5

Longitud de
%T
onda (nm)
380 0.3
390 0.1
400 0.1
410 0.3
420 2.2
430 12.8
440 33.7
450 47.5
460 57
470 68.2
480 81.5
490 90.6
500 93.4
510 92.2
520 88.7
530 84.6
540 80.6
550 78
560 72.6
570 64.9
580 55.1
590 43.5
 Grafica 3. Espectro de transmisión de la solución de sulfato de níquel al 20%

100
90
80
70
60
%T

50
40
6
30
20
10
0
0 100 200 300 400 500 600 700
Longitud de onda (nm)

Discusión:

En la grafica tenemos el espectro de trasmisión característico de la solución de sulfato de níquel, en

ella podemos observar que obtenemos un pico máximo de trasmisión a 500 nm, la escala de la
longitud de onda es muy exacta ya que se registran valores desde la primera lectura a 380 nm y
valores hasta la última a 590 nm y el intervalo en la escala es muy grande. Ambos métodos son muy
efectivos para determinar la exactitud de la escala de la longitud de onda, pero el filtro de Didimio es
muy costoso y no todos los equipos tienen la ranura para este tipo de filtros especiales por lo que no
lo hace un método muy rentable, sin en cambio el sulfato de níquel es mucho más barato y de fácil
manejo, por lo que es mucho más eficiente este método, tanto por confiabilidad como por costos.

Tabla 4. Proporcionalidad entre A y λ para el sulfato de níquel

Longitud de
Absorbancia
onda (nm)
530 0.075
540 0.095
550 0.111
560 0.141
570 0.19
 Grafica 3. Proporcionalidad entre A y λ para el sulfato de níquel

0.2
0.18 y = 0.0028x - 1.3956
R² = 0.9471
0.16
0.14
Absorbancia

0.12
0.1
0.08
0.06 7
0.04
0.02
0
525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575
Longitud de onda (nm)

Discusión:

En la grafica en la cual graficamos la absorbancia obtenida contra la longitud de onda a la cual fue
medida, observamos que existe proporcionalidad fotométrica, ya que se obtiene una grafica lineal
y a pesar de esto, la R nos indica lo contrario, pues no una proporcionalidad a pesar de que el valor
se acerca mucho al esperado. Por lo que podemos decir que la proporcionalidad es mínimo al leer
el sulfato de níquel a diferentes longitudes de onda.

Tabla 5. Exactitud fotométrica. Metodo del Sufato de Niquel al 20%

Longitud de onda/
400 nm 500 nm
Parámetro

Absorbancia esperada 1.7 0.1

Tolerancia aceptada 1.615-1.785 0.095-0.105

Absorbancia medida
2.91 0.033
 Tabla 5. Intervalo dinámico lineal de la concentración.

Concentración
Tubo de A400
NiSO4·6H2O
a a' (M) Serie a Serie b
1 1' 0 0 0
2 2' 0.0095 0.161 0.046
3 3' 0.0285 0.134 0.14

4 4' 0.0665 0.307 0.309 8

5 5' 0.1045 0.488 0.493

6 6' 0.1425 0.668 0.674

7 7' 0.152 0.715 0.718

8 8' 0.171 0.817 0.816

9 9' 0.1805 0.846 0.854

10 10' 0.19 0.896 0.898

Discusión
Con base en todo lo anterior sabemos que no hay presencia de luz extraña en nuestro
espectrofotómetro, ya que la escala de la longitud de onda seleccionado, pertenece a la longitud
de onda a la cual se registran nuestras lecturas de %T, si existiera la presencia de este tipo de luz,
la escala se modificaría y obtendríamos valores por debajo de los esperados.

Conclusión

 Nuestro espectrofotómetro esta en optimas condiciones para leer la absorbancia y

trasmitancia de diferentes muestras.
 No hay presencia de luz dispersa.
Preguntas extra
Señale dos causas que originan:
a) Luz extraña
Abertura de la compuerta para muestra.
Filtración de luz al interior de espectrofotómetro por algún sitio no detectado.
b) Cambio en el ancho de banda
Baja intensidad de la luz de la lámpara por su deterioro.
Mal estado del mecanismo de selección de ancho de banda.
c) Alteración de la respuesta relativa o rendimiento instrumental 9
Muestra muy pequeña y presencia del efecto menisco.
Variaciones de voltaje.

Bibliografía

 Skoog. Principios de Análisis Instrumental. Ed. Mac Graw Hill. 2002. Pp.182, 201.
 http://www.frlp.utn.edu.ar/materias/qcasis/mostracion2.html
 https://www.espectrometria.com/