INTRODUCCIÓN A BIOREACTORES

Cinemática del crecimiento celular

Cinemática del crecimiento celular
El uso de células vivas para la producción de productos químicos crece
anualmente con ritmos asombrosos.
Tanto microorganismos (bacterias, hongos, algas) como células
humanas, vegetales o animales se utilizan para la producción varios
productos químicos, como por ejemplo insulina, antibióticos, bio-
surfactantes.
Son responsables también de la producción de alcohol vía
fermentación, producción de quesos, vinos, champagne, etc. También
los procesos biológicos son muy usados en el tratamiento de residuos y
efluentes.
CLASIFICACIÓN DE LOS ORGANISMOS VIVOS
Los virus son un grupo de partículas no
vivientes que están íntimamente relacionadas
con los organismos vivos.

No tienen estructura celular y no pueden llevar

a cabo tareas metabólicas, de reproducción u
otro tipo de actividad. Los virus son parásitos
que necesitan infectar células vivas para
convertirse en activos y reproducirse.

Son utilizados como vectores de transfección

para dotar a las células con nuevas
características de interés.
PRINCIPALES TIPOS DE MICROORGANISMOS
Microorganismo es el término que comúnmente se utiliza
para describir una célula única libre. Esta definición hace
que dentro de los microorganismos se encuentren tanto
las células procariotas como los organismos unicelulares
de las eucariotas.

Bacterias
Las bacterias tienen tres formas generales:
esférica,
bastón y
espiral.
Estructura de la célula bacteriana
Componentes celulares
Las bacterias tienen una capa en alguna medida "desorganizada" que está
compuesta por polisacáridos y es conocida como cápsula. Tienen también
una pared rígida y una membrana que encapsula el citoplasma donde
ocurren las reacciones. El núcleo contiene los componentes genéticos de la
célula. La mayoría de las bacterias pueden moverse y lo hacen con el
flagelo.

El tamaño de las bacterias depende de la etapa de crecimiento en la que se

encuentren. Una célula que no ha tenido nutrientes suficientes puede ser tan
chica como 0.2 μm de diámetro. Sin embargo las bacterias de laboratorio
tienen un diámetro que oscila entre 0.5 y 1.0 μm, mientras que las del tipo
bastón son de 0.5 x 3 μm.
Clasificación Bacteriana
Las bacterias se clasifican en las aeróbicas (que necesitan oxígeno para
vivir) y las anaerobias (que crecen sólo en ausencia de oxígeno).

Algunas bacterias son capaces de formar endoesporas (esporas dentro de la

célula). Las bacterias pasan a este estado cuando las condiciones de
crecimiento le son muy adversas, es una técnica de supervivencia.

Cuando las condiciones de crecimiento mejoran, vuelven al estado

vegetativo.

Las esporas son muy resistentes al calor y no son muy fáciles de destruir con
radiación o agentes químicos.
Hongos
Los hongos, que no se pueden mover, pueden
utilizar material orgánico e inorgánico para
crecer. Entre los hongos más conocidos cabe
mencionar: las levaduras, moho y hongos
comestibles.

Respecto a las bacterias los hongos son menos

numerosos, crecen a velocidades relativamente
más lentas, y los procesos metabólicos que
pueden desarrollar son más restringidos.
Suelen ser más tolerantes a los medios ácidos
pero más sensitivos al contenido de humedad.
 LA CÉLULA
BACTERIANA

Composición química
de las células
 Composición
elemental de
biomasa de
microorganismos

Si queremos que la población bacteriana crezca en un

determinado medio, deberemos dar nutrientes al sistema que
respeten las fórmulas promedio de las bacterias. Los elementos
traza son también necesarios, por esta razón suele agregarse al
medio de cultivo extracto de levadura (levaduras muertas que
contienen todos los elementos que garantizan el crecimiento
celular)
Tiempo de duplicación
El tiempo que tardan en formarse 2 células
de una célula común se llama tiempo de
generación, pero como coincide con el
tiempo en que se duplica el número de
células se denomina también tiempo de
duplicación. Este tiempo varía
significativamente según la especie
bacteriana y según las condiciones del
medio de cultivo.
Tiempo de duplicación
 Fases de
crecimiento en
microorganismos
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO Y LA
BIODEGRADACIÓN
Nutrientes
Los nutrientes deben estar disponibles de acuerdo a las necesidades de
crecimiento de las células. Sin embargo, la presencia de nutrientes en cantidad
adecuada no es suficiente, los nutrientes deben estar también en un estado
adecuado para su asimilación.

Los medios de cultivo pueden ser medios sintéticos o complejos. Los medios
sintéticos son aquellos que tienen una composición química bien definida. Los
medios complejos contienen materiales de composición no definida (por ejemplo,
cuando se le agrega extracto de levadura al medio de cultivo).
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO Y LA
BIODEGRADACIÓN
PH
El PH afecta en forma muy significativa la actividad microbiana. Cada organismo
tiene un rango de PH dentro del cual es posible el crecimiento y normalmente
posee un PH óptimo muy bien definido. La mayoría de los ambientes naturales
tienen valores de PH de 5.9 y los organismos con PH equivalentes son los
habituales. Sólo unas pocas especies pueden crecer con un PH inferior a 2 o
mayor a 10. Los que crecen a PH bajos se llaman acidófilos.
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO Y LA
BIODEGRADACIÓN

Los hongos, como grupo, tienden a ser más tolerantes al ácido que las
bacterias.

Algunos microorganismos posee PH óptimos de 10-11 y se conocen como

alcalófilos. Debe quedar claro que independientemente de las condiciones
extremas en que vivan los microorganismos (PH del ambiente extracelular),
el PH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad, con el objeto
de impedir la destrucción de macromoléculas internas.
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO
Y LA BIODEGRADACIÓN
Temperatura
La temperatura es uno de los factores
ambientales más importantes que afectan al
crecimiento y a la supervivencia de los
microorganismos. Las especies bacterianas
crecen generalmente bien en rangos
estrechos de temperatura. Las bacterias
mesófilas crecen bien entre 15 y 45°C,
siendo el rango óptimo entre 25 y 35 °C. Las
psycrófilas se desarrollan adecuadamente
debajo de los 20°C. Las termófilas tienen
un buen desarrollo entre 45 y 65 °C.
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO
Y LA BIODEGRADACIÓN
Como regla del pulgar por cada aumento de 10°C, la velocidad de
biotransformación aumenta cerca de 2 veces.

Esta aproximación es sólo válida hasta una determinada temperatura arriba

de la cual la velocidad comienza a decrecer.

Los aumentos de temperatura en una primera etapa permiten alcanzar

mayores velocidades de degradación debido a un aumento de la actividad
microbiana, un aumento de la solubilidad de los nutrientes en agua, entre
otras razones.

En general a temperaturas mayores que 40 °C el crecimiento de bacterias

decae debido a la desnaturalización de enzimas y proteínas. A temperaturas
cercanas a los 0°C, el crecimiento se detiene.
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO
Y LA BIODEGRADACIÓN

Disponibilidad de agua
El agua es el componente principal de las células, por lo tanto un
suministro de agua adecuado es indispensable para lograr el
mantenimiento y crecimiento microbiano.

También el agua es el medio de transporte de los sustratos (o

contaminantes) hacia el interior de las células, y también el transporte
de los compuestos que se producen dentro de la célula y que son
devueltos al medio de cultivo. Sin agua la actividad microbiana no es
posible.
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO
Y LA BIODEGRADACIÓN

Otros factores vinculados a los sustratos

La estructura y origen de los sustratos (o reactivos) tienen un impacto

decisivo en la capacidad de los microorganismos de sobrevivir y en el
cumplimiento de la función que se desea. Cuando alguno de los sustratos
presenta una baja solubilidad en agua, se encuentra poco biodisponible
para los microorganismos y la reacción bioquímica se verá “demorada” por
un problema de transferencia de masa.

La concentración de los compuestos (tanto reactivos como productos)

también es muy importante, por ejemplo altas concentraciones de un
compuesto pueden ser tóxicas e inhibir el crecimiento de las bacterias.
Métodos para medir el crecimiento de bacterias
Cuando una pequeña cantidad de células vivas es adicionada en una solución
líquida que contiene los nutrientes esenciales, y que se encuentra a una
temperatura y un PH adecuado, las células crecerán. Existen diferentes
métodos experimentales para medir y monitorear los procesos de crecimiento.

El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en

función de:

• aumento de masa del cultivo

• aumento del número de células

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén

en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes
aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).
MEDIDA DE MASA CELULAR
MÉTODOS DIRECTOS
En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1) Determinación del peso húmedo:

• se tara un tubo de centrífuga

• se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante
• se determina el peso del sedimento

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya

cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa,
intensidad del empaquetamiento, etc.
MEDIDA DE MASA CELULAR
MÉTODOS DIRECTOS

2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca

antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante.

Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de

peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes

errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas
habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.
MEDIDA DE MASA CELULAR
MÉTODOS DIRECTOS
Determinación del nitrógeno total:
técnica de micro-Kjeldahl.
MEDIDA DE MASA CELULAR
MÉTODOS DIRECTOS

Determinación de un componente
característico: peptidoglucano, ADN, ARN,
proteínas, ATP, clorofilas en organismos
fotosintéticos, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias

para las que otros métodos más fáciles dan
errores debido a que forman grumos no
dispersables, crecen en filamentos, etc. Se
emplean en determinaciones de crecimientos
en ambientes naturales.
MEDIDA DE MASA CELULAR
MÉTODOS INDIRECTOS

1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por

unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico
(QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.
MEDIDA DE MASA CELULAR
MÉTODOS INDIRECTOS (Método turbidimétrico)
El método consiste en hacer incidir con una luz (monocromática con una
dada longitud de onda ) a la suspensión de microorganismos en el medio
líquido. Se mide la luz transmitida a través de la suspensión, la que es
proporcional a la concentración de biomasa. Esta técnica tiene como
principal inconveniente, la imposibilidad de distinguir entre células vivas o
muertas o entre células y otro tipo de material particulado. Sin embargo, es
una técnica que puede ser utilizada on-line para mediciones continuas.
 MEDIDA DE NÚMERO DE CELULAS
MÉTODOS DIRECTOS
Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una
graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

excavación con 0.02 mm de profundidad

área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes
cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.
O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).
Cámara de recuento de Petroff-Hauser

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del
microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas
(normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de
células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido.

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml).

Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy
pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas
previamente, con una mezcla de alcohol y agua.
MEDIDA DE NÚMERO DE CELULAS
MÉTODOS DIRECTOS

Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se

hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar,
entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que
por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p. ej.,
bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un
dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el
tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño
detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al
paso de la partícula).

Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente

libres de partículas extrañas (las pequeñas serían
contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores
pueden obturar el orificio del aparato).
MEDIDA DE NÚMERO DE CELULAS
MÉTODOS INDIRECTOS
Método de conteo de colonias
Para medir el crecimiento celular mediante el método
de conteo de colonias se utiliza un medio de agar
conteniendo los nutrientes para lograr el crecimiento
de las bacterias. Un pequeño volumen del medio de
cultivo diluido es esparcido sobre el agar en una caja
de Petri. Estas placas son incubadas en condiciones
adecuadas, en la caja de Petri se forman colonias que
son fácilmente contadas a simple vista. Se asume que
cada colonia ha sido formada por una única célula del
medio de cultivo original. Las células son entonces
medidas como unidades formadoras de colonia – UFC
(colony-forming units, CFU). La suposición que una
colonia es formada por una única célula bacteriana
puede subestimar la densidad de población. Al efecto
de minimizar esta subestimación, una serie de
diluciones debe ser usada.
MEDIDA DE NÚMERO DE CELULAS
MÉTODOS INDIRECTOS
Recuento sobre filtros: Se usa para
suspensiones diluidas de bacterias. Se
hace pasar un gran volumen de
suspensión a través de una membrana de
nitrocelulosa o de nylon estériles (con un
diámetro de poro que retiene las bacterias
pero permite el tránsito de sustancias).
Posteriormente, el filtro se deposita sobre
la superficie de un medio de cultivo sólido.
Las colonias se forman sobre el filtro a
partir de las células retenidas. Dichas
colonias se cuentan, deduciéndose la
concentración original de viables en
función del volumen de suspensión que
se hizo pasar por el filtro.
 CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)

Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen

constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por
unidad de tiempo de masa celular, no de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y
similar en cada caso:

DM/M = DN/N = D[ADN]/[ADN] = D[proteínas]/[proteínas] = ... = K

Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una
reacción autocatalítica de primer orden:

velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente}

También se puede decir que el no de células, la masa celular u otros componentes se duplican en un
mismo lapso de tiempo determinado.
 CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)

Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado.

Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes

celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera: aquel en el
que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en
la unidad de tiempo.

Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (m), que es

característico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.