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Toxicologia Laboratorial
MÓDULO IV
Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para
este Programa de Educação Continuada. É proibida qualquer forma de comercialização do
mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores
descritos na Referência Consultada.
MÓDULO IV
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• Classificação por fase móvel e estacionária pode ser apresentada por
três categorias: cromatografia líquida, gasosa e com fluido supercrítico.
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Cromatografia gás-sólido G S Adsorção
(GSC)
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para amostras separadas devem ser sensíveis em função do processo de separação
sofrido durante a eluição 1 .
Normalmente, a amostra ou fase móvel contém uma espécie que não fica
retida, se não houver uma dessas espécies na amostra poderá ser adicionada para
auxiliar na identificação do pico. O tempo morto (tM) é o tempo que a espécie não-
retida demora para alcançar o detector.
N = L/H (4.1)
1
Entrar no site: http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromoper.html e ver
exemplos de colunas cromatográficas, e animação sobre a separação cromatográfica.
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eficiência de separação devido o tempo de eluição. No quadro 13 temos a descrição
de algumas variáveis que podem afetar a eficiência de uma coluna cromatográfica.
Variável Símbolo e
Unidades
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e da fase líquida estacionária como descrito na equação 4.3 sendo que esta
equação tem suas variáveis definidas no quadro 13.
H = A + B/u – Cu
DE
F Vazão
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L Comprimento de coluna empacotada
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padrão, e a razão entre as áreas do pico analito e do pico do padrão interno é tido
como parâmetro analítico. A largura do pico representa uma boa medida da
eficiência da coluna o que permite uma comparação entre colunas. Na figura 22 são
descritos os vários tipos de cromatografia, com seus critérios de classificação mais
usuais.
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CROMATOGRAFIA
Analítica: 2-5mm
Forma
Física
Líquido Fluido
Gás Supercrítico Líquido
Móvel
Fase
Sólido Fase
Fase Ligada
Fase Ligada
Fase Ligada
Ligada
Estacionária
Líquido
Líquido
Líquido
Sólido
Sólido
Sólido
Bio Afinidade
Troca Iônica
Exclusão
Fase
cromatografia
CCD CCD CP CGFL CGS CGL CSFL CSS CLL CLS CE CLFL CTI CB
Tipo de
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Quando a solução da amostra estiver em contato com um segundo sólido ou
fase líquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em diferentes graus,
de acordo com as diferenças de adsorção, intercâmbio de íons, partição, ou
tamanho. Estas diferenças permitem que os componentes da mistura se separem
usando estas diferenças para determinar o tempo de retenção dos solutos por meio
da coluna.
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Os sistemas de injeção mais comuns para a introdução de amostras de gás
são válvulas para amostragem e seringa. As amostras gasosas e líquidas podem ser
injetadas com uma seringa. Na forma mais usual a amostra é injetada primeiro em
uma câmara aquecida, onde se evapora antes de ser transferida para a coluna.
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Medidor de bolhas
de sabão
Controlador
Injetor
de vazão
Analisador
de dados
coluna
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4.1.2 – Detector por ionização de chama
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espécies de enxofre excitado (S2*) 2 em uma chama, ocorre o princípio de detecção.
Um tubo fotomultiplicador é usado para medir a emissão de quimiluminescência
característica dessas espécies.
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seletivamente halogênios contidos em compostos como pesticidas e bifenilas
policloradas. É seletivo na resposta, sendo muito sensível a moléculas que
contenham grupos funcionais eletronegativos como peróxidos, quinonas, entre
outros. Não é sensível a grupos funcionais como aminas, álcoois e hidrocarbonetos.
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enquanto que, hidrocarbonetos saturados são apolares e, os éteres, cetonas e
aldeídos são solutos de polaridade média. A polaridade da fase estacionária deve
combinar com a dos componentes da amostra a ser analisada (Quadro 15). Diversas
colunas comerciais já vêm com fases estacionárias com espessura variando entre
0,1 a 5 μm. O caráter e a capacidade de retenção de uma coluna estão ligados a
espessura do filme da fase estacionária.
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Em colunas empacotadas, o desempenho pode ser afetado pelo diâmetro e
uniformidade de partículas do recheio e pela carga da fase estacionária. Enquanto
que, nas colunas capilares, o diâmetro interno da coluna e a espessura do filme da
fase estacionária são importantes. Pois, quanto menor a espessura da coluna, mais
eficiente ela será. Porém, as colunas muito estreitas suportam pouca fase
estacionária, o que diminui a sua seletividade. As fases estacionárias são as
mesmas usadas para colunas empacotadas.
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• Computadores: pode se substituir o integrador por um computador,
desde que este tenha um dispositivo para converter o sinal elétrico em números que
possam ser armazenados em memória, e também é necessário dispor de programas
para fazer a análise do cromatograma digitalizado.
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conjuntos, o equipamento de CG/MS é útil para identificar centenas de componentes
que constituem sistemas naturais e biológicos. Por exemplo, podem caracterizar
componentes que dão sabor aos alimentos, identificar poluentes na água,
diagnósticos médicos baseados em compostos do ar expirado, entre outros.
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específicos na cromatografia líquida de alta eficiência que podem acarretar uma
menor eficiência nas análises realizadas por esse método.
Desse modo, sabe-se que o tamanho da partícula que faz parte da fase
estacionária é muito importante, pois a eficiência de uma coluna de CLAE aumenta
conforme o tamanho da partícula diminui. O alargamento de banda extracoluna
ocorre enquanto o soluto é carregado por meio de tubos abertos como os do sistema
de injeção, da região do detector e da tubulação de conexão dos vários
componentes do sistema. Este alargamento ocorre a partir da diferença de
velocidade do fluido entre as camadas de líquido junto à parede e as camadas do
centro do tubo.
Com isso, a parte central de uma banda do soluto se move com mais
rapidez do que a parte periférica e devido à difusão em líquidos, ser mais lenta, este
tipo de alargamento acaba sendo observável. Para que este problema seja
minimizado, costuma-se diminuir o raio dos componentes extracoluna para 2,5 mm
ou menos.
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interface
detector
Coluna
Solvente
seringa
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• Ser compatível com o detector que se deseja operar.
A mistura de solventes deve ser feita com líquidos que sejam miscíveis. Um
teste, com uma pequena quantidade da mistura, deverá ser realizado, para evitar o
desperdício. A compressibilidade afeta a exatidão absoluta das bombas e os seus
níveis de pulsação. A preparação da fase móvel é muito importante. O volume de
cada solvente deve ser medido numa proveta, separadamente. Devem ser
adicionados no frasco lentamente para evitar que a quantidade de gases dissolvidos
seja maior e assim, causa problemas no bombeamento. Todo o solvente utilizado na
cromatografia líquida deve ser filtrado com membranas de 0,2 a 0,45 μm de
porosidade, para evitar que obstrua o sistema e o danifique.
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sistema para resolver esse problema, pois o solvente pode ser tratado antes de ir
para o reservatório, passando-os por um filtro sob vácuo, por exemplo.
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se abrem e fecham de forma alternada, controlando o fluxo de solvente para dentro
e fora de um cilindro.
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Costumam ter cerca de 100.000 pratos/metro e apresentam a vantagem de
serem velozes com um consumo mínimo de solvente. Normalmente usam-se
colunas menores, pré-colunas, para reter partículas grandes que danificariam a
coluna. A composição química da amostra é que determina que tipo de fase
estacionária deva ser usado. O volume de amostra injetada na coluna dependerá da
quantidade do componente que se deseja analisar e da sensibilidade do detector em
uso.
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uniformes que são recobertas com filmes orgânicos que são química ou fisicamente
ligados à superfície.
Este tipo de detector limita seu uso a solutos que absorvam num
comprimento de onda, dentro dos que são possíveis. Quando o equipamento está
equipado com discos contendo vários filtros, estes podem detectar várias espécies,
enquanto eluem. Muitos equipamentos de CLAE vêm com detectores compostos por
um espectrofotômetro de varredura com redes ópticas, onde vários modos de
operação podem ser escolhidos. Os detectores espectrofotométricos ultravioleta de
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maior alcance são os equipamentos com arranjo de diodos, pois permitem a coleta
de dados de um espectro em apenas um segundo.
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Este aerossol é acelerado por um esguicho para a região do vácuo onde as
moléculas da fase móvel são bombeadas para fora. O computador armazena os
dados gerados por esse tipo de detector e os cromatogramas podem ser obtidos
tanto no momento da análise ou após a mesma.
3
Leitura adicional sobre forças intermoleculares disponível em:
http:www.qmc.ufsc.br/química/pages/especiais/revista_especiais_forcas_intermoleculares.html
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onde o índice de polaridade é uma medida numérica da polaridade relativa dos
solventes. O quadro 16 descreve os índices de polaridade, refração, ponto de
ebulição de alguns solventes. E pode-se observar que a água tem um índice de
polaridade superior a de outros solventes.
*temperatura em 25 °C.
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análise ou dependendo do caso, após a separação cromatográfica. Este tratamento
é recomendado quando se deseja reduzir a polaridade das espécies para que seja
possível usar a partição em vez da adsorção ou colunas de troca iônica, para
aumentar a resposta do detector, a sensibilidade e ainda, aumentar a resposta
seletiva do detector a certos componentes da amostra.
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cromatografia, podendo conter quantidades menores de metanol ou outro solvente
miscível em água.
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papel. Todavia, estão inclusos na cromatografia em camada delgada (CCD),
cromatografia de papel (CP) e eletrocromatografia. Cada uma utiliza uma camada
fina e plana de material que é auto-suportado ou que reveste uma superfície vítrea,
plástica ou metálica. O deslocamento da fase móvel pela fase estacionária ocorre
por ação da capilaridade, em alguns casos, auxiliado por potencial elétrico ou
gravitacional.
Este método de separação que pode ser definido como sendo a migração de
espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas
ou suspensas em um eletrólito, por meio do qual uma corrente elétrica é aplicada. É
empregada para separações analíticas complexas como em ânions, aminoácidos,
drogas, proteínas, e diversas outras espécies. É uma técnica muito eficiente para
separar macromoléculas o que é de interesse da indústria biotecnológica, e para a
biologia e bioquímica.
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por meio de um tubo capilar contendo solução tampão, ocorre um fluxo
eletroosmótico, onde o solvente migra em direção ao catado ou ao ânodo.
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Cuidados como estes e muitos outros que fazem parte das boas práticas
laboratoriais devem ser observados rigorosamente, se é pretendido executar um
trabalho com eficiência e reprodutibilidade.
No primeiro dia:
4
Os tampões e soluções citados neste método estão descritos no Anexo A.
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- coletar desta vez o sobrenadante, adicionar 4 mL solução NaL, adicionar
8mL isopropanol 100% e inverter os tubos para precipitar o DNA guardando no
freezer até o dia seguinte.
No segundo dia:
No terceiro dia:
Após estas etapas, a amostra deverá ser hidrolisada para ser posteriormente
analisada em HPLC/detecção eletroquímica, para se obter as curvas de calibração
para quantificação das amostras.
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- depois acrescentar: 10 µL glicina-acetato (0,2 M) pH 10, 40 µL PDE I
(0,062 U) e incubar por mais 1,5h a 37oC.
• Solução de dosagem;
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Para preparação precisa: dissolver o azul de coomassie em etanol 100%, e
após dissolver, adicionar o ácido fosfórico 85%, homogeneizar bem (por mais ou
menos 5 minutos). Depois acertar o volume com água miliQ.
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Ex: 20 μg .................5100 μL
0,00392 0,011 20
0,00784 0,188 40
0,01176 0,367 60
0,01568 0,575 80
0,9
0,8
m0,7
n0,6
5
90,5
50,4
x = -0,6756/ -(41,266)
x = 0,01637 µg/µL
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Para saber a quantidade de microssomos na amostra:
0,01637µg………………....….….1 µL
x.................................………5100 µL
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• Ressuspender o precipitado em tampão fosfato 0.1M/ EDTA 5 mM pH
7.4
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Esse método é muito utilizado na determinação do comportamento e na
composição de produtos manufaturados e também nos naturais.
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Na preparação de sólidos, definição e dissolução da amostra, operações
unitárias como a moagem se fazem necessárias e este procedimento pode ser
automatizado e realizado por pequenos robôs de laboratório. O sistema robótico é
controlado por um microprocessador que pode ser programado pelo usuário. Nessa
programação o robô pode ser instruído a trazer pequenas amostras ao laboratório
central para serem diluídas, filtradas, tratadas com reagentes, entre outros.
A instrução também pode ser para que as amostras sejam aquecidas, para
que sejam injetadas em uma coluna cromatográfica e também para coleta de frações
de uma coluna. Estes métodos auxiliam e agilizam os procedimentos com grande
demanda, principalmente nas rotinas onde diversas tarefas repetitivas são
necessárias.
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8 – Qual a importância do sistema de bombeamento de cromatografia líquida
de alta eficiência?
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4.7 - Anexo A – Soluções e Tampões
1M 342,3g 1.000 mL
0,32M x 1.000 mL
x = 109,54g 1.000 mL
1M 203,3g 1.000 mL
0,005M x 1.000 mL
x = 1,0165g 1.000 mL
1M 1211g 1.000 mL
0,010M x 1.000 mL
x = 1,211g 1.000 mL
1M 656,8g 1.000 mL
0,0001M x 1.000 mL
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x = 0,06568g 1.000 mL
5g em 500 mL
Tampão B
1M 1211g 1.000 mL
0,010M x 1.000 mL
x = 1,211g 1.000 mL
1M 372,2g 1.000 mL
0,005M x 1.000 mL
x = 1,861g 1.000 mL
1M 656,8g 1.000 mL
0,00015M x 1.000 mL
x = 0,09852g 1.000 mL
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RNAse em 1 mL de tampão acetato de sódio 10 mM em pH 5,2. Aquecer a
100 °C durante 15 minutos.
1M . vi = 10.10-3M . 100 mL
1M 149,89g 1.000 mL
7,6 M x 1.000 mL
x = 1139,164g 1.000 mL
1M 121,1g 1.000 mL
0,04 M x 1.000 mL
x = 4,844g 1.000 mL
1M 372,2g 1.000 mL
0,02M x 1.000 mL
x = 7,444g 1.000 mL
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Desferroxamina 0,3 mM (conta=regra de três)
1M 656,8g 1.000 mL
0,0003M x 1.000 mL
x = 0,197g 1.000 mL
1M 1211g 1.000 mL
0,010M x 1.000 mL
x = 1,211g 1.000 mL
1M 372,2g 1.000 mL
0,001M x 1.000 mL
x = 0,372g 1.000 mL
1M 656,8g 1.000 mL
0,0025M x 1.000 mL
x = 1,642g 1.000 mL
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4.8 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BONATO, P.S. Cromatografia Gasosa in: Collins, C.H.; Bonato, P.S; Braga, G.L.
“Introdução a Métodos Cromatográficos”. 6ª edição, Editora Unicamp, Campinas,
1995.
CASSARETT & DOULL, Toxicology – The basic Science of Poisons, 6a. edição,
McGraw-Hill, 2001.
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and 2’-deoxyadenosine adducts resulting from the reaction of tetrahydrofuran with
DNA bases. Chemical Research in Toxicology, v.19, 927 - 936, 2006.
MCNAIR, H.M.; MILLER, J.M. “Basic Gas Chromatography”. John Wiley & Sons,
New York, 1997.
National Toxicology Program (NTP). Fiscal Year 1998 Annual Plan. U.S.
Department of Health and Human Services. USA, 1999.
Pimenta, A.M.C. Os desafios do Proteoma, Ciência Hoje, vol. 32, nº 192, 2003.
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental.
5ª. edição, Ed. Artmed, Porto Alegre – RS, 2002.
STERNER, J. H., AND HODGE, H. C. (1949). Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 10, 93–96.
WHO, Principles and Methods for Evaluating the Toxicity of Chemicals, 1978.
-----------FIM DO CURSO!-----------
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