Introducción

El espectrofotómetro constituye una herramienta fundamental en el laboratorio. Más del

90% de las determinaciones que se realizan en la Química Clínica tienen como paso final
la lectura de una absorbencia o una transmitancia. En general, son equipos muy
especializados y costosos, y su conservación depende en gran medida de la forma de
instalación y utilización. El medio ambiente que los rodea y la calidad de los servicios de
electricidad constituyen factores de primordial importancia, para que los equipos puedan
prestar los servicios de acuerdo con las especificaciones para los que fueron fabricados.

La revisión del rendimiento de los espectrofotómetros es indispensable en el control de

la calidad. Para llevar a cabo este tipo de comprobaciones es común el empleo de
soluciones estándar cuyas propiedades espectrales han sido estudiadas
cuidadosamente. El correcto desempeño de los espectrofotómetros es entonces
determinante de la calidad analítica de los resultados que emite el laboratorio.

Objetivos
- Verificar el correcto funcionamiento de los espectrofotómetros por medio de la
evaluación de tres características: calibración, sensibilidad y linealidad.

Fundamento
El espectrofotómetro está constituido por cinco componentes: lámpara o fuente luminosa,
selector de longitud de onda, celda para alojar la muestra, detector de radiación, y
amplificador de señal con medidor o registrador.
La espectrofotometría es una técnica ampliamente utilizada en los laboratorios para el
análisis cuantitativo de numerosos compuestos, debido principalmente a su sencillez
operativa y a la rapidez en el análisis. La concentración de una sustancia puede ser
calculada a partir de la cantidad de luz absorbida por una muestra, en el rango del
espectro del ultravioleta (UV) y visible (Vis) aplicando la ley de Lambert-Beer.
 Método

INICIO INICIO

Verificación de linealidad
Verificación de calibración y usando K2Cr2O7
sensibilidad usando CoCl2

Realizar diluciones de 11 tubos de ensaye

empleando agua destilada y K2Cr2O7.
Adicionar agua destilada a una celda de lectura
y ajustar a cero de A con una λ = 450nm.
Leer cada dilución a λ = 500 nm ajustando a
cero con agua destilada.

Colocar sol. CoCl2 en una celda de

lectura y registrar A. Construir curva tipo colocando A (eje y)
contra concentración (eje x).

Leer la solución de 460 – 550 nm Calcular factor de calibración (Factor =

en intervalos de 10 nanómetros. 106/A106). Multiplicar por absorbencias de
cada punto para obtener sus concentraciones.

Trazar gráfica de A (eje y) contra λ (eje x). Graficar.

observar la λ a la que se obtiene la A máx.

Calcular %E para cada punto y comparar con lo

FIN esperado.

Construir gráfica de %E de cada punto,

colocando %E (eje y) contra concentración de
dicromato (eje x).

FIN
 Resultados
Bitácora de resultados Fecha: 19/09/2018
Resultados y observaciones
Tabla 1. Resultados obtenidos de calibración, sensibilidad y linealidad de las secciones
2 y 3.
Equipo Espectro λ A %E ¿Calibrado? ¿Sensibilidad? r r corregida m Linealidad
máx.
Lilia y DLAB 2 510 0.552 10.4 Sí Inaceptable 0.9984 0.9999 1.47 No
Ada
Jesús y DLAB 2 510 0.534 7.8 Sí Inaceptable 0.9952 0.9952 0.6819 No
Ulises
José y Único 1 510 0.584 16.8 Sí Inaceptable 0.9990 0.9990 0.9137 Si
Kim
Pablo y Dinámica 510 0.582 16.4 Sí Inaceptable 0.9981 0.9981 1.1048 No
Miguel
Juan y Genesis 510 0.560 12 Sí Inaceptable 0.999 0.9966 0.9226 Si
Jorge 10
Fer, Genesis 510 0.540 8 Sí Inaceptable 0.9991 0.9991 1.001 Si
Pepe y 12
Adri
Eli y Genesis 510 0.515 3 Sí Aceptable 0.9977 No la No la No la
Jukari 11 reportaron reportaron reportaron

Espectrofotómetro: UV-VIS Marca: Único 1

Codificación del usuario: No se verificó
Unidades: Longitud de onda en anómetros (nm)
Condiciones físicas del aparato: En buenas condiciones

Tipo de celda utilizada: Celda de lectura Reactivo utilizado: cloruro de cobalto (CoCl2)
Solución utilizada: Cloruro de cobalto (CoCl2) al 2.2% en ácido clorhídrico al 1%
Vol. seleccionado: 5mL
Ajuste del instrumento: A cero de absorbancia con agua destilada (blanco)
Intervalo de λ: 450 - 550 nm
 Verificación de la calibración y sensibilidad
Tabla 2. Lecturas de absorbancia obtenidas de CoCl2 a diferentes longitudes de onda.
Longitud de la onda (nm) A
450 0.336
460 0.364
470 0.419
480 0.462
490 0.502
500 0.559
510 0.584
520 0.563
530 0.492
540 0.380
550 0.273

0.7

0.6

0.5
Absorbancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0
400 450 500 550 600
Longitud de onda (nm)

Fig. 1.- Espectro de absorción obtenido a partir de los valores de absorbancia del CoCl2 a diferentes
longitudes de onda.

λ mínima seleccionada: 450 nm λ máxima seleccionada: 550 nm

Escriba sus observaciones:
El pico máximo de absorción se encuentra a una longitud de onda de 510 nm, es decir,
presenta el mismo pico máximo que el espectro de absorción reportado para el CoCl2.
Solución utilizada: Dicromato de potasio (K2Cr2O7), 530 mg/dL
Longitud de onda: 500 nm
Ajuste del espectrofotómetro: A cero de absorbancia con agua destilada (blanco)

Verificación de la linealidad
Tabla 3. Resultados de linealidad utilizando K2Cr2O7.
Concentraciones Absorbencia (500 Concentraciones % de error
teóricas mg/dL nm) calculadas mg/dL
26.5 0.149 43.7 64.90
53 0.257 75.46 42.37
106 0.361 105.99 -9.43x10-3
159 0.578 169.71 6.73
212 0.717 210.52 -0.69
265 0.869 255.15 -3.71
318 1.015 298.02 -6.28
371 1.234 362.32 -2.33
424 1.394 409.30 -3.46
477 1.528 448.65 -5.94
530 1.736 509.72 -3.82

2
1.8
1.6
Absorbencia a 500 nm

1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 100 200 300 400 500 600
Concentración teórica de K2Cr2O7

Fig. 2.- Curva de calibración de K2Cr2O7 con concentraciones teóricas.

 600

500
Concentración experimental

400

300

200

100

0
0 100 200 300 400 500 600
Concentración teórica

Fig. 3.- Gráfica de linealidad.

65

55

45

35
% Error

25

15

-5 0 100 200 300 400 500

-15
Concentración experimental de K2Cr2O7

Fig. 4.- Porcentaje de error obtenido en la verificación de linealidad con K2Cr2O7 del espectrofotómetro
Único 1.

Solución con la que se hicieron las diluciones: Dicromato de potasio 530 mg/dL y agua
destilada.
Factor de calibración utilizado: 293.62
Formula para calcular la concentración de las diluciones:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑥 𝐴 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

Cálculos realizados:
- Para el Factor de calibración
106
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 =
A 106

106
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 =
0.361

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 = 293.62

- Para la concentración de las diluciones. (Ej. para la primera dilución)

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑥 𝐴 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 293.62 𝑥 0.149
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 43.74

Escriba sus observaciones:

Discusión
Verificación de sensibilidad y calibración
Está reportado que el espectro de absorción del CoCl2 presenta un pico máximo a una
longitud de onda de 510 nm con 0.5 de absorbancia. De acuerdo con la Fig. 1 observamos
que se presenta este pico característico por lo que podemos afirmar que el
espectrofotómetro Único 1 está calibrado. Por otra parte, en la Tabla 2 se reporta que la
absorbancia a esa longitud de onda es de 0.584 (mayor al valor teórico) además de un
%E de 16.8; con estos datos confirmamos que la sensibilidad del equipo es inaceptable.
Verificación de linealidad
Mediante la curva de calibración (Fig. 2) se obtuvieron las concentraciones de las
diluciones realizadas, que posteriormente fueron graficadas contra las concentraciones
teóricas (Fig. 3). En esta grafica se obtiene el valor del coeficiente de correlación, siendo
este de 0.9990. Al ser un valor cercano a 1 significa que existe linealidad.
En los porcentajes de error (ver Tabla 3) 6 de las 11 concentraciones leídas superan el
intervalo de +/- 5% permitido, lo que puede indicar la presencia de errores por defecto y
por exceso, es decir, el analista no está midiendo el volumen correcto con las pipetas.
Sin embargo, también debe tomarse en cuenta que el espectrofotómetro no cuenta con
una sensibilidad adecuada, es decir, no detecta correctamente entre cambios de
concentración.

Conclusiones
- El espectrofotómetro Único 1 está calibrado y tiene linealidad.
- No se recomienda el uso del espectrofotómetro Único 1 por su baja sensibilidad y
alto porcentaje de error.

Preguntas extra
1. Espectro de absorción de otra sustancia.

2. Límites de error de los espectrofotómetros verificados en la práctica.

Referencias
- Dharan M., (2002). Control de calidad en los laboratorios clínicos. Editorial
Reverté. España. pp. 146-152.
- Dosal María Antonia, Introducción a la metrología química curvas de calibración
en los métodos analíticos, (2008). Disponible en:
“http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CURVASDECALIBRACION_23498.p
df” (Consulta: 26/2018).