Departament de Medicina

Facultat de Medicina
Universitat de Lleida

ESTUDIO DE LA APOPTOSIS Y PROLIFERACIÓN CELULAR

EN LOS LINFOMAS NO HODGKINIANOS. VALOR

DIAGNOSTICO Y PRONOSTICO.

Tesis realizada por:

Josep Macià i Virgili
para optar al grado de
Doctor en Medicina y
Cirugía
Lleida, 1996.
 ie
n Lleida
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Departament de Medicina
Facultat de Medicina
Universitat de Lleida

ESTUDIO DE LA APOPTOSIS Y PROLIFERACIÓN CELULAR

EN LOS LINFOMAS NO HODGKINIANOS. VALOR

DIAGNOSTICO Y PRONOSTICO.

ii
x/

Tesis realizada por:

Josep Macià i Virgili
para optar al grado de
Doctor en Medicina y
Cirugía
Lleida, 1996.
"... las células están programadas para suicidarse

y necesitan señales de las otras células del

entorno para sobrevivir..."

A Begoña, David, Elena y Ignasi

Agradecimientos.

- A los Directores de esta Tesis Dr. Elias Campo y en especial al Dr. Xavi
Gómez , con quien comencé la investigación en esta área y cuya ayuda ha
resultado imprescindible para realizar esta tesis.

- A la Universidad de Lleida bajo cuyos auspicios y soporte económico, ha

sido posible realizar este trabajo.

- A todas las personas que trabajan en el Servicio de Hematologia y

Hemoterapia, del Hospital Universitario Arnau de Vilanova, por su paciencia y
constante ayuda.

- A todo el Servicio de Anatomia Patológica del Hospital Universitario Amau de

Vilanova por su colaboración y soporte incondicional.

- A la Sección de Proteínas del Servicio de Análisis Clínicos del Hospital

Universitario Arnau de Vilanova por su cooperación en el tema de marcadores
tumorales.

- A mi amigo Jaume Roca Vallespí por sus consejos y estímulos.

 INDICE

1-Introducción 1
1.1.- Los linfomas no Hodgkinianos 1
1.1.1.- Clasificación histológica de los LNH 2
1.1.2.-Factores pronósticos en LNH 6
1.1.2.1.- Factores pronósticos directamente
relacionados con el linfoma 7
1.1.2.2.- Factores relacionados con el huésped 11
1.1.2.3.- Factores relacionados con el tratamiento 11
1.2.-Apoptosis 11
1.2.1.-Cambios metabólicos durante la apoptosis 14
1.2.2.-Proliferación y apoptosis 15
1.3.-Oncogenes 16
1.3.1.-Protooncogenes con ganancia de función 17
1.3.2.-Genes supresores de tumores 18
1.3.3.- Genes reguladores de muerte celular programada 18
1.3.4.- Mecanismos de transformación 19
1.4.-Citometríadeflujo 20
1.4.1- Características generales de los citómetros de flujo 22
1.4.2.- Procesamiento de las muestras 25
1.4.3.- Fluorocromos y procesamiento de datos 26
1.4.4.- Estudio del contenido en ADN y fases
del ciclo celular por citometría de flujo 27
1.4.5.- Estudio de la aneuploidía y del ciclo celular 28
1.5.- Técnicas inmunocitquímicas del estudio
de la muerte y proliferación celular 30
1.5.1- Técnicas inmunológicas: Introducción 30
1.5.2.- Estudio de la proliferación celular Introducción 30
16.- Estudio del contenido en AON y de la
proliferación celular en linfoma 31
2.-Hipótesis y objetivos 34
 2.1.-Hipótesis 34
2.2.-Objetivos 34
3.- Material y métodos 37
3.1- Pacientes y variables de estudio 37
3.2.- Métodos y técnicas 40
3.2.1.-CÍtometría de flujo 40
3.2.2.-Inmunohistoquímica 45
4.-Resultados 49
4.1.- Estadística descriptiva univariante 49
4.1.1.- Edad y sexo 49
4.1.2.-Performance (ECOG) 49
4.1.3.-Síntomas B 50
4.1.4.-Estadio de Ann-Arbor... 50
4.1.5.-Localización del tumor primario 50
4.1.6.- Tamaño mayor de la tumoración 51
4.1.7.- Grado histológico de malignidad 51
4.1.8.-Inmunofenotipodeltumor 51
4.1.9.- LDH sérica, beta-2-microglobulina
sérica y alfa-TNF sérico 52
4.1.10.-Apoptosis 52
4.1.11.- Porcentaje de células en fase S 53
4.1.12.- Contenido en ADN 53
4.1.13.-Indices pronósticos 54
4.1.13.1- IPI edad dependiente 54
4.1.13.2.- IPI edad independiente 54
4.1.14.-Tipo de tratamiento 54
4.1.15.-Tolerancia al tratamiento 55
4.1.16.- Respuesta al tratamiento 55
4.1.17.-Recaída 56
4.1.18.- Seguimiento y supervivencia 56
4.2.- Estadística analítica bivariante 57
4.2.1.- Apoptosis y presentación clínica del LNH 57
4.2.2.- Proliferación y presentación clínica del LNH 59
 iii

4.2.3.- Apoptosis, proliferación celular y masa tumoral 61

4.2.4.- ApoptosJs, proliferación tumoral y otros
marcadores tumorales en LNH 61
4.2.5.- Apoptosis, proliferación e
Indice Pronostico Internacional 61
4.2.6.-Apoptosis y evolución de la enfermedad 62
4.2.7.- Proliferación celular y evolución de la enfermedad 63
4.2.8.- Estudio de la relación entre si de las diferentes
variables clínico-patológicas y evolución de la enfermedad 63
4.2.9.- Relación entre origen del tumor, respuesta
al tratamiento y recaída 64
4.2.10.- Estudio estadístico Divariante de otras variables 65
4.3.- Estudio de series temporales: tiempo libre de
enfermedad y tiempo de supervivencia 66
4.3.1.- Estudio de supervivencia Divariante 66
4.3.2.- Tiempo libre de enfermedad 69
4.4.-Análisis estadístico multivariante 71
4.4.1.- Estudio de la distribución de apoptosis en
relación con grado histológico y origen del tumor 71
4.4.2.- Distribución del porcentaje de fase S en
relación con tipo histológico y origen del tumor 71
4.4.3.- Distribución de apoptosis en relación con el
grado histológico y la respuesta al tratamiento 71
4.4.4.- Relación de la fase S con la respuesta al
tratamiento en los distintos tipos histológicos 72
4.4.5.- Estudio de la relación entre los valores de
apoptosis y proliferación con los Estadios de Ann-Arbor
en función del grado histológico 72
4.4.6.- Relación entre apoptosis y fase S 73
4.4.7.- Supervivencia y tiempo libre de
enfermedad, estudio multivariante 73
4.4.8.- Predicción de la respuesta al tratamiento 76
4.4.9.- Ausencia de apoptosis y tiempo libre de enfermedad 78
 iv

5.-Discusión 79
5.1.- Consideraciones previas sobre la serie 79
5.2.- Consideraciones sobre el estudio del contenido de ADN 80
5.3.- Consideraciones de la apoptosis 81
5.4.- Apoptosis y grado histológico de malignidad 81
5.5.-Apoptosis y localización de origen del tumor 82
5.6.- Proliferación celular y grado histológico 82
5.7.- Proliferación celular y localización de origen del tumor 83
5.8.- Apoptosis y fase S dentro del mismo tipo
histológico según localización de origen del tumor 83
5.9.- Apoptosis y proliferación celular en relación
con el tipo histológico 84
5.10.- Apoptosis y proliferación celular en relación con
el origen de localización del tumor 85
5.11.-Marcadorestumorales en LNH:a-TNF 88
5.12.- Apoptosis y proliferación celular en relación con
respuesta al tratamiento 89
5.13.- Resistencia a la apoptosis como mecanismo
general de "drug resistance" 90
5.14.-Binomio fase S-apoptosis 92
5.15.-Supervivencia y apoptosis 92
5.16.- Predicción de respuesta al tratamiento 93
6.-Resumen 94
7.-Conclusiones 97
8.-Anexo I: hoja de recogida de datos 99
9.- Anexo II: fotografías 101
10.- Anexo III: histogramas de ADN 105
11.-Anexo IV: base de datos 108
12.-Bibliografía 115
 1.-INTRODUCCIÓN.

1.1.- Linfornas no Hodgkinianos.

Los linfomas no Hodgkinianos (LNH) son una compleja proliferación

neoplásica a partir del tejido linfoide y que a diferencia de la enfermedad de
Hodgkin, referida a una sola entidad, agrupan a más de una docena de
procesos. Sin embargo, entre los LNH se puede constatar cada vez más que
cada uno tienen particularidades clínicas y biológicas que les confieren
personalidad. Esto es fruto de los avances en el conocimiento, sobre todo del
comportamiento celular, en estas enfermedades y que en los últimos 20 años
han forzado cambios en su terminología y clasificación, lo cual a su vez puede
afectar cualquier estudio y/o análisis1 a realizar tanto desde el punto de vista de
epidemiología, como de vigilancia o en definitiva de los resultados finales de
pronóstico y/o tratamiento.
La explosión de la inmunología desarrolla desde 1962 la disociación de
respuesta inmunológica entre células B y T, y llega al completo reconocimiento
del gen de una inmunoglobulina por recombinación en 19782. Estos avances,
en esta década y media, confieren a los síndromes linfoproliferativos una
inesperada heterogeneidad al realizar inmunofenotipaje. Con el paso del
tiempo, el descubrimiento de nuevos antígenos (Ags), identificados como
moléculas con funciones importantes, va añadiendo más diversificación. Los
avances en la citogenètica, la hibridación y la aplicación de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación de algunos oncogenes
importantes, como el Bcl-2 en los LNH foliculares, va añadiendo complejidad a
los diferentes subtipos de LNH.
El National Cáncer Institute (NCI), ha publicado recientemente la
incidencia de LNH, en un periodo de tiempo que va desde 1973 hasta 1988,
encontrando un significativo incremento, cercano al 50%, en el diagnóstico de la
enfermedad. El tipo que con más frecuencia se diagnosticó, acercándose al
30% de todos los LNH, corresponde al LNH difuso de célula grande1.

\f-A-
 El incremento en LNH de alto grado de malignidad como el
inmunoblástico y el de célula pequeña no hendida en la década de los 80,
corresponde sin duda a la aparición del síndrome de inmunodeficiencia
adquirida. Globalmente se atribuye como factores que incrementan el riesgo de
padecer LNH la exposición de agentes ambientales (herbicidas y colorantes)
pero no se ha podido identificar el grado de contribución.
Por otra parte, llama poderosamente la atención el incremento que se
encuentra en la incidencia del llamado LNH extranodal que constituye un 26%
de todos los LNH registrados entre 1983 a 1987 por el NCI1, atribuyéndose a
que con los nuevos métodos de identificación inmunológicos y genética
probablemente se reclasifican como neoplasias monoclonales de estirpe B
procesos extranodales que hubieran sido catalogados como seudolinfomas.

1.1.1.- Clasificación histológica en los LNH.

La primera clasificación importante de los LNH corresponde a
Rappaport3 en 1966, quién basándose en el origen celular de la neoplasia, su
morfología, tamaño así como en la arquitectura nodular o difusa del ganglio, los
subdividia en cinco tipos histológicos: linfocitos bien diferenciados, pobremente
diferenciados, mixto linfocítico-histiocítico, histiocítico e indiferenciado (ver Tabla
I). Esta clasificación ha sido ampliamente utilizada y confirmada por múltiples
estudios clínico patológicos4 así como ha sido probada su significación
pronostica y terapéutica durante un periodo de unos 15 años5. Sin embargo, la
clasificación de Rappaport tiene dos inconvenientes importantes: por una parte
el llamado "linfoma histiocítico" ya que su posterior caracterización inmunológica
muestra un origen linfoide, y por otra, algunos subgrupos de LNH no pueden
ser incluidos en la clasificación como sucede con el linfoma de Burkitt, el
linfoblástico y algunos linfomas T cutáneos.

Tabla I: Clasificación de Rappaport

Patrón nodular o difuso
Linfocítico bien diferenciado
Linfocítico pobremente diferenciado
Mixto
Histiocítico
Indiferenciado
 Tabla II: Clasificación de Kiel.
bajo grado
inmunofenotipo B ¡nmunofenotipo T
LLC LLC
Leucemia Prolifocítica Crónica Leucèmia Prolifocítica Crònica
Tricoleucemia Micosis Fungoide
Sezary
Linfoplasmocítico Lennert
(citoide)
Inmunocitoma
Plasmocítico Angioinmunoblastico
(AILD)
Centroblástico-centrocítico LNH de la zona T
Centrocítico Pleomórfico
(célula pequeña)
Alto grado
inmunofenotipo B inmunofenotipo T
Centroblástico Pleomórfico
Inmunoblástico Inmunoblástico
Anaplasico KÌ-1+ Anaplásico KÍ-1+
Burkitt
Linfoblástico Linfoblástico

Desde 1974 hasta 1982, con la descripción de nuevas entidades

clinicopatológicas y con el auge en el conocimiento del sistema inmune y su
relación con la proliferación linfoide aparecen diversas clasificaciones. Algunas
son propuestas basadas sólo en criterios morfológicos como la clasificación de
Dorfman6, mientras otras intentan conjugar tanto criterios morfológicos como
inmunológicos como es la de Lukes-Collins7 y la primera de Lennert8, también
conocida como clasificación de Kiel. En esta clasificación se incluyen algunas
entidades como la leucosis linfática crónica, así como el inmunocitoma,
separando el (inforna de Burkitt y el (inforna linfoblástico que adquieren entidad
propia. A diferencia de las clasificaciones más morfológicas, aquí no se
concede protagonismo al tipo "arquitectónico" que adquiere la infiltración de
nodular o difuso. Posteriormente en 1988 se realiza una revisión y puesta al día
de esta clasificación9, separando el inmunofenotipo B y T, y siendo el resto de
criterios predominantemente morfológicos; y aflora una nueva entidad el linfoma
anaplásico KÍ-1+ incluido tanto en el inmunofenotipo B como en el T, como
puede observarse en la Tabla II.
 Tabla III: Clasificación de la Working Formulation
Bajo
A.- Linfocito pequeño (LLC, plasmocitoide))
B.- Folicular predominio centrocito
C.- Folicular mixto (centrocito pequeño y grande)

Intermedio
D.- Folicular predominio célula grande
E.- Centrocítico difuso.
F.- Difuso mixto (célula pequeña y grande.)
G.- Difuso célula grande (hendida y no hendida)

Alto grado
H.- Inmunoblástico.
I.- Linfoblástico.
J.- Burkitt.

Miscelánea
Compuesto
Micosis fungoide
Histiocítico
Plasmocitoma extramedular
Inclasificable

Otros

Finalmente es conveniente reseñar que bajo los auspicios del NCI y

mediante un estudio internacional conducido entre cuatro centros de referencia,
se intenta agrupar 1175 casos de LNH en base a datos clínicos e histológicos.
Los expertos proponen una clasificación10 simple y uniformemente aceptada y
conocida como "Working Formulation for Clinical Usage" (WF) (ver tabla III). Su
extensión y aceptación fue muy importante tanto en Estados Unidos como en
Europa siendo incluso, hoy por hoy, la utilizada para comunicaciones científicas
internacionales. Sin embargo, también presenta algunas dificultades como por
ejemplo el encaje de algunas entidades de célula T frecuentes en algunas
áreas geográficas como el Japón, así como definir la posición exacta dentro de
la clasificación de la WF de algunas entidades más recientemente descritas.
Pero sobre todo el aumento en los conocimientos de la implicación de algunos
oncogenes bien definidos en algunos linfoproliferativos no queda recogido en
esta clasificación y motiva desconfort sobre todo en los anatomopatólogos para
poder clasificar con más precisión estas entidades. Como fruto de esta
situación nace la llamada clasificación REAL11.

Tabla IV: Clasificación REAL

Neoplasia célula B.
Precursor de célula B.
- Leucemia Linfoma B linfoblástico precursor
B periféricas.
- LLC/Leucemia prolinfocítica/Linfoma linfocito pequeño
- Linfoplasmocitoide(inmunocitoma)
- Células del manto.
- Centrofolicular
- Zona B marginal
- Extranodal (bajo grado MALT)
- Nodal (células B monocitoides)
- Esplénico de la zona marginal (linfocitos vellosos)
- Tricoleucemia.
- Plasmocitoma/mieloma.
- Difuso célula grande (Subtipo: Mediastinico primario
de célula B grande)
- Burkitt.
- LNH Alto grado de célula B tipo Burkitt-like.

Neoplasias de células T y Natural Killer.

Precursor de célula T.
- Leucemia/Linfoma Linfoblástico T
Precursor
T periféricos y NK.
- LLC/Prolinfocítica T
- Leucemia linfocitos granulares.
- Micosis Fungoide/Sezary.
- Linfomas T periféricos ( Subtipos: Paniculititis subcutánea
y linfoma to T- hepatoesplénico)
- Angioinmunoblástico T
- Angiocéntrico.
- Intestinal célula T (enteropatía)
- Linfoma leucemia célula T adulto (HTLV-I+)
- Anaplásico célula grande (T y nulo)
- Anaplásico, Hodgkin-like

Esta nueva propuesta de clasificación "The Revised European-

American Classification of Lymphoid Neoplasms" no contiene ningún criterio
clínico pronóstico y solamente incorpora el listado de diagnósticos de
enfermedades linfoproliferativas reconocidas en un orden lógico y con la
suficiente flexibilidad para que quepan las distintas entidades. Los criterios
 6

seguidos para realizarla son: datos clínicos, morfología, inmunofenotipo y

genotipo. También se contemplan algunas entidades "nodales" y "extranodales"
tal y como se muestra en la Tabla IV.
Esta nueva clasificación aceptada por anatomopatólogos no parece
que vaya a gozar del favor desde el punto de vista clínico, después sobre todo
de tener hábito en el manejo de la WF, en base de la cual se obtiene una
información pronostica estimable para establecer una estrategia terapéutica.
Por todo ello quizás sea prudente esperar para poder hacer una valoración
definitiva de esta reciente clasificación.

1.1.2.- Factores pronósticos en LNH.

Dadas las particularidades de esta enfermedad, que sugieren
entidades distintas y con diferentes grados de agresividad clínica, parece
razonable adecuar a los mismos la actitud terapéutica. Además, la aparición de
nuevos tratamientos con intención curativa de la enfermedad hacen crecer los
esfuerzos para poder vaticinar con la máxima precisión cuál será la evolución
de la enfermedad en cada caso. En definitiva, existe una preocupación
creciente por investigar los factores pronósticos en el momento del diagnóstico
y con los elementos clínicos y biológicos disponibles en ese momento.
El primer problema es la gran cantidad de parámetros a los que se les
ha atribuido valor pronóstico y por tanto es preciso realizar un cribaje para
seleccionar aquellos que realmente puedan tener relevancia. Así por ejemplo, el
nivel de albúmina en suero, la hipercalcemia o la presencia de anemia severa al
diagnóstico no resultan relevantes desde el punto de vista de pronosticar
evolución posterior en series amplias de enfermos afectos de LNH12. Por el
contrario, en pacientes con LNH de grado intermedio o alto de malignidad tiene
significación la edad, el valor en suero de la ß-2-microglobulina y posteriormente
la respuesta inicial al tratamiento12. Sin embargo, al intentar agrupar los distintos
parámetros pronósticos pre-tratamiento parece razonable hacerlo de la
siguiente manera: parámetros relacionados con la enfermedad propiamente
dicha, parámetros dependientes del huésped y de la enfermedad y su habilidad
para tolerar el tratamiento, y parámetros relacionados específicamente con el
tratamiento a administrar.
 1.1.2.1.- Factores pronósticos directamente relacionados con el
(inforna: Parece claro en este sentido que es importante la "cantidad de tumor"
en el momento del diagnóstico. Desde hace más de una década la manera de
calcular este aspecto es la aplicación de los estadios de Ann-Arbor diseñados
para enfermedad de Hodgkin13. En este contexto se diseñan estrategias de
tratamiento para valorar su evolución posterior14. Pronto se observa que en un
grupo de enfermos clasificados como de grado intermedio de malignidad el
estadiaje de Ann-Arbor discrimina pobremente entre estadios III y IV12. Además
existen otros problemas añadidos: por una parte, la presencia de "bulky" tumor,
valorado como tumor medido con un diámetro superior a 7 o 10 cm según los
grupos, es un claro factor adverso, muy probablemente por la dificultad de
penetración de la quimioterapia; por otra, la presencia de afectación de áreas
extranodales tiene también connotaciones negativas.. En base a estos dos
aspectos, una institución como MD Anderson construye su propio modelo
pronóstico basado en la carga tumoral por "áreas extensas" de enfermedad15.
Consideran un área extensa aquella nodal o extranodal de diámetro superior a
7 cm y la presencia de afectaciones extranodales y el número de áreas
afectadas. Establecen tres grados de carga tumoral baja alta e intermedia que
se correlaciona con la supervivencia.
Sin embargo el manejo con todos estos parámetros no siempre resulta
en series históricas de llamados LNH indiferenciades o histiocíticos16 o bien en
los LNH de bajo grado o cuando se contempla la localización extranodal17.
La confirmación reciente del esquema terapéutico CHOP18 como una
de las mejores alternativas de tratamiento en los LNH de intermedio y alto grado
de malignidad y la aparición de resultados positivos19 con la utilización de
estrategias que incluyen trasplante de médula ósea, impulsan un esfuerzo final
a la búsqueda de un modelo internacional pronóstico que permita predecir el
porcentaje de respuesta con el tratamiento de elección a cinco años. Así
aparece el IPI, índice pronóstico internacional para el LNH en base a 3273
pacientes con LNH de grado alto e intermedio de malignidad, recogidos antes
de recibir tratamiento20'21. Para constituir dicho índice se han tomado aquellas
variables clínicas y biológicas que han resultado significativas para el
pronóstico:
- Edad: la edad superior a 60 años marca una inflexión en el pronóstico.
- Estadio clínico-patológico: solo resultan significativos los estadios agrupados
como "precoces" agrupando estadio l-ll y "avanzados" agrupando III y IV.
- El performance: medido al diagnóstico por el ECOG agrupando un buen
"performance estatus" como O y 1 vs los demás, es decir igual o superior a 2.
- El valor de LDH: expresado como ratio entre el valor del paciente dividido por
el valor normal máximo, estableciendo el corte en un ratio igual o inferior a uno.
- El número de localizaciones extranodales cuyo corte es una o menos
localizaciones extranodales vs más de una localization.
Con todo ello se establece una puntuación que es: entre O a 1 Bajo
riesgo; 2 riesgo bajo-intermedio; 3 riesgo alto-intermedio y de 4 a 5 Alto riesgo.
En cualquier caso en esta extensa revisión retrospectiva estos grupos de riesgo
establecen claramente el límite deseado de predicción de supervivencia inferior
al 50% con el tratamiento estándar y por tanto permite seleccionar candidatos a
terapia alternativa.
En algunos trabajos posteriores se enfatiza el valor de la LDH en la
significación pronostica porque al parecer se correlaciona tanto con la masa
tumoral como con el grado de proliferación tumoral22. Aunque Shipp21 insinúa
que este modelo aplicado a grado alto e intermedio de malignidad también
puede ser aplicado a bajo grado, y es en un trabajo posterior23 donde se
demuestra perfectamente aplicable el mismo modelo descrito anteriormente,
con lo cual resulta para la totalidad de los LNH. El poder incluir a los bajos
grados tiene un valor añadido al aparecer también nuevas estrategias para su
tratamiento24'25.
En cualquier caso no hay que olvidar otros parámetros biológicos que
aislados se les ha encontrado significación predicava. Así, el hecho que
inicialmente esté o no invadida la médula ósea y aparezca una leucocitosis
superior al 20000, para algunos autores confiere una corta supervivencia26.
Por otra parte, en el modelo del IPI no se pudo incluir, por insuficiente
número de pacientes20, el valor de un marcador clásico en linfoproliferativos
como es la ß-2-microglobulina, al que se imputa la más estrecha correlación con
la masa tumoral12. Aunque hay que tener presente la interferencia que puede
suponer la insuficiencia renal y el hecho de que puede no normalizarse con la
remisión completa del proceso (RC) e incrementarse discretamente con la
recidiva12, se ha constatado, en la determinación al diagnóstico, una muy buena
correlación con la LDH e incluso con un nuevo y prometedor marcador tumoral,
como puede ser el valor de a-TNF en suero27.
Desde ensayos iniciales estudiando el valor de la ß-2-microglobulina en
el manejo de los linfoproliferativos28 han discurrido un número muy elevado de
estudios demostrando su valor pronóstico29, de tal manera que ha permitido
incluso establecer un modelo basándose en el valor inicial de LDH y ß-2-
microglobulina30, llegándose a realizar valoraciones tras 10 años de
supervivencia31.
Directamente relacionado con el tumor, por no decir exclusivamente,
están tanto su capacidad proliferativa como algunas alteraciones
cromosómicas12 que regulan el crecimiento tumoral. En definitiva se trata de
valorar la cinética celular tumoral en el momento del diagnóstico y ver que
correlación puede tener con la supervivencia o incluso con la respuesta
esperable al tratamiento. Utilizando el Ki-67 como marcador de Ag nuclear de
proliferación, algunos autores encuentran que en LNH difuso de célula grande,
valores superiores al 60% de Ki-67 es un factor estadísticamente significativo e
independiente, de mal pronóstico aunque no predice respuesta al tratamiento32.
Por otra parte el estudio del ciclo celular pone de manifiesto que el tiempo de
transición entre las diferentes fases del mismo es muy variable entre los
distintos subgrupos de tipos histológicos de LNH33.
Otros grupos también han confirmado el valor pronóstico de la
cuantificación del Ki-67 aunque interpretan el 80% como un alto índice de
proliferación y encuentran en estos tan sólo un 18% de supervivencia al cabo
de un año34.
Por otra parte, el estudio del contenido en DNA, sobretodo la
proporción de células tumorales en fase S también muestra una buena
correlación con el tipo histológico y con la supervivencia. Es interesante
constatar que en los LNH de célula B parece claro que un 4,5% o menos de
fase S significa una mayor supervivencia, pero el conjunto de células T, no
neoplásicas, también juegan un papel y si su fase S es superior al 14,5% se ha
publicado35 una mejor supervivencia.
 10

Otra experiencia en un grupo de 490 pacientes la fase S se

correlaciona de forma excelente con el grado histológico y con la supervivencia,
incluso con significación independiente del IPI, excepto si los pacientes reciben
tratamiento poliquimioterápico, como si este modificara las expectativas de
supervivencia36.
Últimamente se ha realizado un esfuerzo importante en la búsqueda de
alteraciones cromosómicas que por una parte pudieran tipificar algún tipo de
LNH y por otra tuviera significación pronostica.
Así por ejemplo, queda bien establecido que en más de un 75% de los
LNH tipo folicular presentan la t(14; 18)(q32; q21) aunque no se puede
correlacionar con ningún tipo de resultados clínicos37. Aunque en algunos
casos, que pueden a llegar a suponer un 10% de los LNH foliculares, la
presencia de roturas cromosómicas (más de 6) y metafases anormales tienen
una supervivencia más acortada y alteraciones 6q23-26 o 17p se correlacionan
con transformación a tipos histológicos más agresivos, no existen datos
contundentes sobre su valor pronóstico.
En el punto de ruptura de la t(14; 18) existe un protooncogen
denominado Bcl-2, que se encuentra en mitocondrias y parece alargar la
supervivencia de la célula por bloquear la muerte celular programada o
apoptosis. Se ha estudiado muy extensamente el reordenamiento Bcl-2 en
diferentes neoplasias hematologicas38 y especialmente en el LNH. Es
interesante constatar aquí un hallazgo bastante reciente en relación con el Bcl-2
y es que la frecuencia de la traslocación aumenta con la edad de forma que en
bazos de individuos de más de 61 años puede llegar a ser 40 veces más
frecuente y 13 veces si se estudia en sangre periférica39.
También se ha encontrado, en la presencia o ausencia del Ag HLA-DR
de los leucocitos de pacientes afectos de LNH, un valor prédictive40.
Aunque la proliferación celular del LNH ha sido exhaustivamente
estudiada y para algunos tiene un papel muy importante en la valoración de la
enfermedad41 existen actitudes críticas42 al respecto. Nuestro grupo43, en
estudios previos, ha encontrado una buena correlación, del estudio
retrospectivo en material parafinado, tanto con los tipos histológicos como con
la supervivencia, tanto por estudio de fase S por citometría de flujo, como por
 11

estudio inmunohistoquímico de Ki-67. Igualmente y en la misma serie44 al

estudiar otro Ag de proliferación como es el PCNA con el Ac monoclonal PC10
se correlaciona bien con los otros marcadores de proliferación.
De forma relativamente reciente, adquiere interés el estudio de la
apoptosis y su correlación con la proliferación celular y su valor pronóstico45,
que encuentran como adverso cuando existe un aumento significativo. También
parece bien establecido que el mecanismo por el cual el Bcl-2 reprime la
apoptosis en las células linfomatosas se produce por un mecanismo de
regulación del calcio en el retículo endoplásmico46.
1.1.2.2.- Factores relacionados con el huésped: en el momento del
debut de la enfermedad tiene una importancia extraordinaria establecer el
"performance status" con alguna escala objetiva ya que parece jugar un papel
decisivo en el pronóstico incluso mayor que la presencia o ausencia de
síntomas B12.
En relación con los síntomas constitucionales parece razonable que
tenga distinto valor pronóstico la presencia de uno, dos o los tres síntomas.
1.1.2.3.- Factores relacionados con el tratamiento: como ya se ha
mencionado antes, esquemas terapéuticos que incluyan doxorrubicina como es
el tradicional CHOP siguen siendo el mejor tratamiento para el LNH18. Las otras
estrategias son más tóxicas y con resultados muy similares.
Seguramente sea un concepto más importante que el propio
tratamiento, la tolerancia/intolerancia del paciente al mismo y sobre todo el
poder utilizar las dosis óptimas de sus fármacos pudiendo esquivar sus efectos
adversos.

1.2.-Apoptosis.

Las formas avanzadas de vida no serían posibles sin un mecanismo

que elimine las células individuales que ya no son necesarias, o que funcionan
de manera anormal. Esta eliminación fisiológica, por tanto en ausencia de
procesos patológicos como puede ser un proceso inflamatorio, se conoce como
 12

muerte celular programada o apoptosis y se produce de forma estructuralmente

definida47.
La regulación defectuosa de la muerte celular programada puede
desempeñar un papel en la etiología del cáncer, el SIDA, las enfermedades
autoinmunes e las enfermedades degenerativas del sistema nervioso central48.
La muerte celular puede ocurrir de dos maneras distintas: o bien por un
mecanismo de necrosis o mediante el denominado de apoptosis49*51.
Recientemente se ha podido reconocer que la muerte celular mediada
por linfocitos T citotóxicos y por los natural killer muestra hallazgos de ambas
formas de muerte celular.
La necrosis seria una forma patológica o accidental de producirse la
muerte celular y ocurre cuando ésta es expuesta a una variación muy extrema
de sus condiciones fiisiológicas como pueden ser una severa hipoxia o
hipertermia, que producen una lesión de la membrana celular, semejante a la
que en ciertas condiciones patológicas pueden suceder como la acción litica del
complemento o la de ciertos virus. El proceso comenzaría por la imposibilidad
de la célula a mantener su homeostasis en relación con el exterior, sobre todo
en lo que hace referencia al agua y los iones. Así se producirá un cambio de
forma, con hinchazón de toda la célula y de algunas organelas intracelulares,
especialmente las mitocondrias. Todo ello conduce a la rotura de la membrana
celular vertiéndose al exterior los contenidos intracitoplasmáticos incluidos
enzimas tisosómicos, lo que a su vez conduce a una extensa lesión tisular y una
intensa respuesta inflamatoria. Durante todo este proceso es necesario recalcar
que el núcleo y especialmente el patrón de cromatina nuclear se encuentra
perfectamente preservado.
Sin embargo en la apoptosis, la muerte celular ocurre bajo condiciones
fisiológicas, participando la propia célula de forma activa y por ello la
denominación de "suicidio" celular"49. Este fenómeno lo podemos encontrar
durante el recambio celular en la homeostasis de tejidos, en el mantenimiento
de la tolerancia inmunológica, en la embriogénesis, en el desarrollo del sistema
nervioso y en la atrofia de tejido dependiente del sistema endocrino.
Actualmente se reconoce que la gran mayoría de muerte celular
fisiológica se produce por este mecanismo, del que se han producido avances
 13

importantes en relativamente poco tiempo, para conocer los mecanismos más

básicos de su funcionamiento. Así conocemos que al menos dos genes pueden
estar implicados en ello como son el Bcl-2 y el enzima convertidor de la
interleukina 1ß.
A partir del conocimiento de estos mecanismos, la investigación se
centra en conocer mejor el papel de la apoptosis dentro del tejido tumoral y su
influencia vs la capacidad de proliferación en el resultado final en el enfermo
como podría ser el pronostico de la enfermedad o como desarrollar nuevos
tratamientos. De las misma forma, se puede aplicar a enfermedades
neurodegenerativas, SIDA y entidades autoinmunes y/o inflamatorias.
Las células que se encuentran en proceso de apoptosis muestran unos
cambios característicos tanto morfológicos47 como bioquímicos49'52. Estos
hallazgos incluyen la agregación de la cromatina nuclear, condensación y
división tanto nuclear como citoplásmica con envoltura la de la membrana
citoplásmica intacta dando lugar a unas vesículas identificables
49
morfológicamente y por microscopía electrónica como cuerpos apoptoicos que
contienen ribosomas, mitocondrias intactas y material nuclear. In vivo este
material es rápidamente reconocido y fagocitado por los macrófagos del tejido
adyacente53. La eficiencia del mecanismo es tal que en la desaparición de las
células apoptoicas no hay respuesta inflamatoria. In vitro los cuerpos
apoptoicos sufren finalmente una lisis por lo que entonces se trataría de una
"necrosis secundaria" (Tabla V).
Desde el punto de vista bioquímico, el fenómeno más importante es la
degradación del DNA genómico, sin otro cambio ni siquiera en la permeabillidad
de la membrana celular. Es una fragmentación prelítica del DNA. Dicho proceso
requiere energía con movilización de Ca++ y Mg++ dependientes de una
endonucleasa54.
Por electroforesis en gel de agarosa se puede distinguir un patrón de
subunidades de 180 bp.
La citotoxicidad mediada por células, se puede llevar a cabo tanto por
un mecanismo apoptoico, poniendo en marcha la célula efectora sobre la diana
una fragmentación prelítica del DNA, como por un mecanismo puramente litico
mediante moléculas como la "perforina" produciendo "poros" a nivel de la
 14

membrana, siendo los dos mecanismos no excluyentes e incluso

compleméntanos.

Tabla V: necrosis y apoptosis

Cambios morfológicos
Pérdida integridad membrana Membrana íntegra.
Floculación de cromatina nuclear Agregación cromatina nuclear
Hinchamiento celular y organelas Condensación y división celular
Lisis completa celular Formación de cuerpos apoptoicos
Desintegración de organelas celulares Las organelas quedan intactas
Cambios bioquímicos
No regulación homeostasis iónica Puesta en marcha proceso con actividad
enzimàtica.
No requiere energía, (proceso pasivo que Requiere energía ATP-dependiente
prosigue a 4°C) (proceso activo que se detiene a 4°C.)
Digestión de DNA desordenada. Fragmentación de DNA mono y
oligonucleosómica.
Fragmentación DNA postlítica. (evento Fragmentación prelítica. (evento precoz en
tardío en muerte celular) la muerte celular).

Significación fisiológica.
Muerte de células en grupos Muerte células individual
Provocado por alteraciones no fisiológicas Inducido por estímulos fisiológicos.
Respuesta inflamatoria significativa No respuesta inflamatoria.

Este enzima rompe el DNA en puntos localizados entre unidades

nucleosomales generando fragmentos mono y oligonucleosomales.

1.2.1.- Cambios metabólicos durante la apoptosis.

La puesta en marcha de la apoptosis puede estar generada también
por estímulos patológicos. De hecho los agentes capaces de producir necrosis
celular son capaces también de inducir apoptosis. Cabe interpretar entonces la
apoptosis como una respuesta celular coordinada a estímulos nocivos que no
son inmediatamente letales.
 15

Entre los factores capaces de inducir apoptosis55 los más importantes

son: glucocorticoides, factor de necrosis tumoral (TNF), factor transformador de
crecimiento ß (TGF-ß), proteína HIV gp 120 y el ligando APO-1/FAS.
En la mayoría de tipos celulares el inicio de la apoptosis se traduce en
un aumento del calcio ionizado intracitoplasmático. Este activaría enzimas
latentes como la endonucleasa nuclear que invariablemente fija ADN y que
induciría la rotura del mismo en secuencias determinadas, sin duda el inicio de
los cambios que se producirán en la apoptosis. Así mismo otras enzimas como
una transglutaminasa que se une a proteínas del citoplasma, o la calpaína
capaz de degradar el citoesqueleto.
La apoptosis suele necesitar energía en forma de ATP. La síntesis
activa de ARN y proteínas depende del tipo de célula y del estimulo apoptoico
que la desencadena.
Así, en los linfocitos, los agentes que inhiben la síntesis proteica y el
ARN suelen bloquear la apoptosis, mientras los mismos compuestos la
aumentan en los neutrófilos y en algunas líneas celulares leucémicas56

1.2.2.- Proliferación y apoptosis.

Sabemos que la proliferación celular está relacionada con el
crecimiento de un tejido y más concretamente con el de un tumor. No sólo
guarda está lógica relación sino que además se ha demostrado su relación con
la agresividad de la enfermedad tumoral y por tanto con su pronóstico. En los
LNH ya se demostró que en el momento del diagnóstico, el tejido parafinado,
estudiado por citometría de flujo en cuanto a contenido DNA, así como tanto por
ciento de fase S de las células tumorales, se correlaciona con el tipo histológico
y pronóstico de la enfermedad.
En algunos estudios experimentales de carcinogénesis se describe que
la capacidad de crecimiento de un tumor respondería a una formula en los
siguientes términos:

Crecimiento Tumoral = (Indice proliferación) - (Apoptosis)

 16

La aplicación de esta sencilla formula al tejido tumoral en el momento

del diagnóstico, añade a la información morfológica y al inmunofenotipaje, en
definitiva a un diagnóstico anatomopatológico estático y limitado a la pieza en
este momento una dimensión de previsión de crecimiento. Esta información
adicional y para caracterizar un tumor podría ser muy útil.
De todas formas una célula tumoral puede dividirse más lentamente
incluso que las células normales, es decir tener un índice de proliferación bajo,
pero el tumor sigue creciendo debido al período prolongado de vida de dichas
células que sería debido a una alteración de la apoptosis. De lo cual se
desprende que la apoptosis es un método eficiente de evitar la transformación
maligna porque elimina las células con lesiones genéticas47.
En este sentido resulta paradójico que el mismo oncogen corno el c-
myc que estimula la división celular también induce la apoptosis.

1.3.-Oncogenes.

A principio de la década de los 70 se conocía que algunos virus tenían

la capacidad de introducir a las células animales, ciertos genes, que
provocarían una transformación en las mismas con capacidad proliferativa. En
1976, Bishop y Varmus descubren un gen vírico, que induce tumores en pollos,
idéntico a un gen normal presente en células humanas. Estos genes normales
susceptibles de transformarse en oncogenes, reciben la denominación de
protooncogenes.
El paso de protooncogén a oncogen puede ser debido a una mutación
o bien a una expresión aumentada de alguna oncoproteína. Se conocen unos
70 protooncogenes de los cuales unos 20 se han encontrado en retrovirus.
Aunque la función fisiológica de estos protooncogenes no es bien conocida su
elevada conservación a lo largo de la evolución sugiere un papel importante en
el crecimiento y diferenciación celular.
La transformación neoplásica no parece el resultado de un defecto o
alteración única sino más bien el resultado de varios trastornos y a diferentes
 17

niveles. De esta manera es conveniente distinguir diferentes tipos de

protooncogenes.

1.3.1.- Protooncogenes con ganancia de función.

Las oncoproteínas codificadas por estos genes tienen acciones
bioquímicas bien conocidas como la fosforilación de los residuos de serina,
treonina o tirosina o la interacción con proteínas G (se unen a nucleótidos de
guanina). Las dos suceden en el citoplasma de la célula y tienen mucho que ver
con la transducción de señales al núcleo. Un ejemplo característico son los
genes de los factores de crecimiento o sus receptores57.
Además de las acciones bioquímicas descritas también pueden
interaccionar con factores de transcripción. Los oncogenes más representativos
de este grupo son:
- Ras. Incluye toda una familia de genes como H-ras-1, K-ras-2, N-ras que
codifican una serie de oncoproteínas llamadas p-21 por su tamaño (de 21 kD) y
que están muy relacionadas con las proteínas G interviniendo en la transmisión
de señales desde la membrana al núcleo. La transformación en oncogen es por
la mutación puntual en alguna zona crítica (codones 12, 13 y 61) que altera su
función normal. Los tumores relacionados son: el carcinoma de colon, pulmón,
páncreas, vías urinarias, tiroides, melanoma y leucemias agudas.
- MYC, c-myc. Se encuentra en el cromosoma 8 y codifica un factor nuclear de
transcripción de 62 kD, que interviene en la división celular. La traslocación
recíproca con un fragmento del cromosoma 14 en un punto cercano a un
promotor de una de las cadenas de inmunoglobulinas, es un hallazgo constante
en los LNH de Burkitt de estirpe B. También puede reconocerse en carcinomas
gástricos, de mama, de vejiga urinaria, de cuello uterino o de pulmón de células
pequeñas.
- abl. Este gen se encuentra en una zona frágil del cromosoma 9, pudiendo
romperse y trastocase el fragmento distal a un lugar del cromosoma 22 que
contiene el gen ber (breakpoint cluster region) dando lugar al conocido
cromosoma Philadelphia, implicada en la leucemia mieloide crónica.
 18

1.3.2.- Genes supresores de tumores.

Son un conjunto de oncogenes que su función es proteger de las
proliferación tumoral por este motivo también reciben la denominación de
antioncogenes. Siguen un patrón de herencia recesivo con lo que es necesaria
la alteración de ambas copias de alelos para que se produzca la desregulación.
Los más conocidos son:
- rb. Fue el primero que se descubrió, ubicado en el cromosoma 13 codifica una
proteína nuclear de 110 kD que se fosforila progresivamente a medida que el
ciclo celular se acerca a la fase S. Se relaciona con el retinoblastoma.
- p53. Se localiza en el cromosoma 17 codifica un factor de 53 kD formado por
393 aminoácidos y su función sería promover la estabilidad genética al igual
que la rb tenderían a mantener las células en fase de reposo evitando su
entrada en fase proliferativa. Es el más frecuentemente encontrado implicado
en procesos neoplásicos.
- p16. Se encuentra en el cromosoma 9 codificando una proteína de 148
aminoácidos, idéntica a un inhibidor previamente bien identificado la CDK4. La
proteína p16 se une a la CDK4 y probablemente también a la CDK6 inhibiendo
la progresión del ciclo celular a fase G1.
- APC. Relacionado con la poliposis adenomatosa familiar y una variedad de
esta, el síndrome de Gardner, localizado en el cromosoma 5.
- DCC. Gen asociado al carcinoma colorrectal (Deleted in Colorectal Carcinoma)
se encuentra en el cromosoma 18. Su expresión presente en la mayoría de
células normales está ausente en el 90% de las líneas celulares de carcinomas
de colon estudiadas.
- BRCA1. Implicado en susceptibilidad al cáncer de mama se localiza en el
cromosoma 17 y su inactivación se halla en carcinomas de mama de incidencia
familiar.

1.3.3.- Genes reguladores de muerte celular programada.

Al igual que hemos encontrado oncogenes ganadores de función y
antioncogenes, también encontramos un grupo de oncogenes que inhiben y
otros que estimulan la apoptosis.
 19

1.- Inhibidores de la apoptosis: Bcl-2. Normalmente se encuentra en el

cromosoma 18 y cuando es trastocado al 14 cerca de un gen promotor de las
inmunoglobulinas lo que produce un aumento en su función. La traslocación
14; 18 se encuentra en el 85% de los LNH foliculares. Este gen no induce
proliferación celular sino que previene la muerte programada. En relación con
este gen se ha descrito el bcl-1 presente en muchos casos de leucemia linfática
crónica y el gen bax que codifica una proteína que compite con la acción de
Bcl-2 pudiendo formar homodímeros y heterodímeros tipos Bcl-2/Bcl-2,Bcl-2/bax
y bax/bax que en definitiva marcarán la susceptibilidad celular para la
apoptosis.
2.- Estimuladores de la apoptosis: p53 y Fas:
- p53. Se ha descrito que en ocasiones este gen puede comportarse
como inductor de apoptosis y de hecho la perdida de función de p53 puede
inhibir la apoptosis y promover el desarrollo de tumores.
- Fas. La unión del receptor Fas a su ligando (FasL) es una señal
inductora de apoptosis. Este receptor es una molécula de superficie relacionada
con el TNF que se encuentra en diversos tipos celulares, pero el FasL se
expresa en las células T activadas y su malfuncionamiento causa síndrome
linfoproliferativo y trastornos autoinmunes.

1.3.4.- Mecanismos de transformación.

Las causas que producen desregulación de cualquiera de los
protooncogenes que se han mencionado puedes ser múltiples58.
- Traslocación: Como está bien establecido se produce primero una rotura y
posteriormente recombinación de fragmentos cromosómicos en sitios próximos
a un promotor que aumenta su expresión. Un ejemplo típico sería la
traslocación del gen c-abl del cromosoma 9 a la región ber del cromosoma 22
que se encuentra en la leucemia mieloide crónica.
- Amplificación. En este caso se produce un aumento del número de copias de
un protooncogén normal. Así en el neuroblastoma las células malignas pueden
llegar a tener cientos de copias del gen N-myc.
 20

- Mutación puntual. La mutación de un sólo nucleótido puede dar lugar a una

oncoproteína que escapa a los mecanismos de regulación y acabar
transformando una célula como se ha constatado en la familia ras.
- Inserción vinca (transducción). Es la inserción de un protooncogén cerca de un
promotor celular que aumenta su expresión. Por ejemplo, sería el caso del
hepatocarcinoma asociado al virus de la hepatitis B.
Por otra parte e independientemente de los mecanismos antes
mencionados se ha descrito que la longitud del telómero, en los extremos
cromosómicos, son tanto más largos en cuanto potencial de división tiene la
célula. De forma que cada vez que se divide pierde un trozo de telómero hasta
que su ausencia no hace posible nuevas divisiones. Excepto si la célula posee
un mecanismo que restituya el fragmento telomérico perdido. El enzima
responsable de ésto es la telomerasa.
Este mecanismo de restitución se encuentra en precursores
hematopoyéticos y en células cancerosas.

1.4.- Citometria de flujo.

La técnica de la citometría de flujo fue desarrollada, en la década de

los años sesenta, en los Estados Unidos y Alemania como un avance
importante en la investigación de la biología celular59. Pero es desde hace
aproximadamente 10 años en que los recientes avances en inmunología,
oncología y hematopatología, con el advenimiento de la tecnología de los
anticuerpos monoclonales60, han permitido la aplicación de la citometría de flujo
a la investigación biomédica, tanto a nivel básico como clínico, de un modo
generalizado.
Se define como citómetro de flujo al aparato que es capaz de medir
componentes y propiedades de células y organelas celulares (partículas
biológicas) que fluyen en una suspensión celular. Los sorters tienen las mismas
prestaciones y posibilidades que los citómetros de flujo, pero con la capacidad
adicional de separar partículas selectivamente de la suspensión líquida59.
 21

Los principios básicos de la citometría de flujo son sencillos61. Es

esencial disponer de una suspensión celular de modo que la dificultad para
obtenerla es un factor limitante para el empleo de la técnica. La posibilidad de
conseguir una suspensión celular individualizada varía con el tejido: la sangre y
la médula ósea no necesitan casi procesamiento, el tejido linfoide precisa de
una mínima disgregación mediante machacado, filtrado o pases por una jeringa
con agujas de decreciente calibre, mientras que la mayor parte de los tejidos
epiteliales y otros tumores sólidos necesitan una disgregación cuidadosa,
usualmente con técnicas enzimáticas, seguidas de filtrado. Los tejidos pueden
ser disgregados y teñidos en fresco o después de estar almacenados en
congelación; también pueden ser recuperados a partir de bloques de parafina.
Las células o partículas (núcleos, organelas, cromosomas) son unidas
a colorantes específicos fluorescentes que son capaces de excitarse con una
fuente luminosa de alta energía.
La suspensión celular convenientemente procesada y teñida se inyecta
en la cámara de flujo del citómetro de flujo que está hidrodinámicamente
enfocada para que las células pasen individualmente una detrás de la otra en
"fila india" a través de un punto en que éstas interaccionan físicamente con un
haz de luz monocromática dispersando la luz en todas las direcciones. La luz
dispersada hacia adelante (llamada forward scatter a 0 grados) está
relacionada con el tamaño de la célula. La que lo está a 90 grados del grado de
refracción (denominada light scatter a 90 grados) está relacionada con la
estructura interna y la complejidad citoplasmàtica.
La excitación de los fluorocromos ocurre en el punto de interacción de
la célula y el haz lumínico dando como resultado la emisión de una luz de
longitud de onda diferente a la inicial. Esta luz es recogida a 90 grados, siendo
dirigidas las longitudes de onda seleccionadas mediante espejos (dicroicos)
adecuados a detectores fotomultiplicadores, mientras que las longitudes de
onda no deseadas son bloqueadas por filtros ópticos. Si se dispone de
múltiples fuentes de luz más, de un fluorocromo puede ser unido a las células
permitiendo, de este modo, medidas fluorescentes simultáneas de varios
parámetros en una sola célula.
 22

Las señales eléctricas analógicas son convertidas en señales digitales

y son procesadas por un ordenador con el objeto de generar histogramas
correlacionando los parámetros deseados y efectuar el análisis de los mismos.
Si se requiere una separación celular, entonces las propiedades de las
células a ser seleccionadas son programadas en el computador. La partícula
después de ser analizada abandona la cámara de flujo laminar y, en ese
momento, por acción de las vibraciones de un cristal piezoeléctrico el flujo se
rompe en gotitas. Si la gota contiene una célula de las características deseadas
y programadas es cargada positiva o negativamente y posteriormente desviada
por un campo electromagnético entre dos placas de alto voltaje a colectores
que permiten una posterior investigación de sus propiedades. A este proceso
de separación en el citómetro de flujo, en atención de las características
fluorescentes de las células, se le conoce con el nombre de "sorting".
Las ventajas que proporciona la citometría de flujo frente a otros
métodos que trabajan con fluorocromos incluyen: objetividad, elevada
sensibilidad y velocidad de análisis, posibilidad de realizar mediciones
simultáneas sobre una sola célula y separación celular en los sorters. Las
desventajas y limitaciones son los altos costes de instrumentación y la
incapacidad de visualizar las células que estamos analizando.

1.4.1.- Características generales de los citómetros de flujo.

Para la lectura, por citometría de flujo, las células son teñidas con
fluorocromos que se unen específicamente a uno o varios constituyentes
celulares. Las células son inyectadas en un flujo liquido laminar y pasan, una a
una, por un punto de medida iluminado con luz de alta intensidad (láser). Cada
célula, en el punto de interacción, produce una señal fluorescente que es de
intensidad proporcional a su contenido en fluorocromo. Uno o varios detectores
recogen la fluorescencia emitida y transforman la señal a pulsos eléctricos.
También se recoge la luz dispersada por la célula que es función del tamaño,
forma y estructura de la misma62.
A diferencia de otras técnicas, el citómetro de flujo mide características
celulares individuales de un gran número de células (no una media de los
 23

resultados) y además permite medir características de poblaciones en muestras

heterogéneas63.
El sistema óptico:
El sistema óptico está constituido por la fuente de iluminación (que
puede ser un láser o una lámpara de arco voltaico), los filtros necesarios para
discriminar la señal lumínica y llevarla al detector adecuado y, por último, los
fotodetectores que se encargan de recoger la luz.
Los instrumentos basados en una fuente de iluminación láser tienen
una configuración ortogonal, es decir, que en ellos son perpendiculares los ejes
de iluminación, detección y paso de muestra. El láser por acción de lentes tiene
una sección elíptica y la intensidad de la luz decrece hacia la periferia de forma
gaussiana. Su grosor se considera hasta que su intensidad ha disminuido del
centro del haz al valor 1/e2, el cual es aproximadamente 100 um de ancho64. La
fluorescencia se recoge a 90 grados por lentes de alta apertura numérica.
Recoge del 5 al 10% de la fluorescencia emitida, pero con un espejo de diseño
especial se puede llegar a recoger hasta el 90%. Por la lente que recoge la
señal fluorescente también se recoge la señal de la luz dispersada a 90 grados
(right angle scatter) que es llevada, mediante espejos, a su detector específico
y que es función de la refractariedad y estructura celular. Entre la lente
colectora y los fotodetectores se debe situar una placa con un agujero (pinhole)
para aumentar la relación señal/ruido. Existe un detector para la luz dispersada
hacia adelante o dispersión frontal de la luz (low angle scatter), que es función
del tamaño celular65.
La cámara de flujo puede ser cerrada o abierta según la lectura se
realice en el seno de la cámara o una vez el líquido ha abandonado Las
cámaras cerradas producen menos señal de ruido que cuando la lectura es en
aire.
Se usan filtros ópticos para eliminar y separar la luz recogida y que, en
definitiva, son los responsables de la especificidad de la lectura de los
fotodetectores. En citometría de flujo se emplean los filtros coloreados o de
absorción que se usan como filtros de paso largo o "long pass" y que se
caracterizan porque absorben la luz de determinada longitud de onda. También
se emplean los filtros de interferencia o dicroicos que reflejan la luz que tiene
 24

una longitud de onda superior o inferior a la que dejan pasar66. Los filtros son
los que seleccionan la longitud de onda que llega a cada fotodetector.
La luz producida por la fuente de iluminación, después de interaccionar
con las partículas en la cámara de flujo, excita la fluorescencia de los
fluorocromos unidos a ella y es dispersada. Esta es recogida por la lente
colectora y mediante los filtros ópticos de la bancada óptica es llevada a los
fotodetectores. Existen dos tipos de detectores de la luz: los fotomultiplicadores
y los fotodetectores diodos o de estado-sólido64.
Los fotomultiplicadores se usan generalmente para la detección de la
señal de fluorescencia y luz dispersada a 90 grados. Tienen una buena relación
señal/ruido, aunque se eficiencia cuántica es baja.
Los fotodetectores diodos se usan para detectar la dispersión frontal
de la luz. Son muy resistentes y eficientes para señales fuertes, pero tienen una
baja relación señal/ruido, lo que los hace poco útiles para señales débiles.
Sistema hidráulico y electrónico:
Constituyen los componentes hidráulicos de los citómetros de flujo: la
cámara de flujo, y el sistema de presión y de inyección de la muestra
Las cámaras de flujo son muy diferentes según sea la fuente de
iluminación de aparato. Los citómetros con fuente de iluminación láser utilizan
modificaciones del diseño de la cámara de flujo descrita por Crosland y Taylor.
Hay dos tipos: las cerradas y las abiertas (detección en "chorro en aire").
El sistema de presión y de inyección de la muestra se encarga de
adquirir la muestra e inyectaría junto con el fluido de arrastre en la cámara de
flujo. Es muy importante que la velocidad de inyección de la suspensión celular
sea constante, si bien, la velocidad óptima depende de la aplicación, y las
presiones estables. Hay dos sistemas fundamentales: por presión en la que se
crea una presión en el tubo de la muestra que obliga a que ésta fluya hacia la
cámara de flujo o por inyección isovolumétrica por jeringa en la que la muestra
es aspirada por una jeringa que después la inyecta en la cámara de flujo64.
Componente electrónico:
Cuando la luz incide en los fotodetectores se produce una respuesta
de los mismos en forma de señal eléctrica. Los pulsos detectados por los
fotodetectores pasan a un amplificador y, después, son convertidos de señal
 25

analógica a digital (ADC). Se puede efectuar amplificaciones lineales a 256

canales (8 bits), 1024 canales (10 bits) o logarítmicas (3 o 4 décadas)67.
Existe la posibilidad de seleccionar un umbral de señal de modo que
las señales inferiores al umbral sean deshechadas. Además, se pueden crear
regiones selectivas de adquisición en que pueden ser evaluadas determinadas
señales producidas por células que se encuentren dentro de rangos
predeterminados de otras señales68. Después del procesamiento informático de
la señal se obtienen histogramas mono o biparamétricos63.
Los datos obtenidos con la lectura por citometría de flujo pueden ser
guardados en forma de histograma o como bases de datos en las que se
registra en forma de lista para cada evento la señal producida para cada
parámetro evaluado. A esta última forma de almacenar los datos se le
denomina modo lista o "list mode".

1.4.2.- Procesamiento de las muestras.

Debido a las especiales características de los citómetros de flujo la
muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensión monodispersa.
Hay muestras como la sangre periférica, médula ósea o otros fluidos biológicos
que precisan de un mínimo procesamiento; en cambio los tumores sólidos o las
muestras parafinadas necesitan de una disgregación más o menos intensa
(mecánica, enzimàtica, etc.). En función de la muestra biológica que deseemos
teñir y analizar por citometría se aplican protocolos diferentes69. En ocasiones,
puede ser conveniente o necesario enriquecer la concentración celular en la
muestra antes de su procesamiento por citometría ya sea para obtener una
concentración celular adecuada para la incubación con los reactivos o para
acelerar el proceso de sorting.
Disgregación de material parafinado:
Generalmente, son procedimientos basados en el método desarrollado
por Hedley en 198370'71. Se ha constatado que sirven para gran cantidad de
tejidos y para muestras archivadas con más de 10 años de antigüedad. De un
10 a un 15% de los casos se obtienen coeficientes de variación superiores al
10% que no permiten el análisis del ciclo celular.
 26

Se obtienen histogramas casi idénticos si el tumor es procesado en

fresco o después de parafinización lo que indica que no hay pérdida celular
selectiva durante el procesamiento, además, los índices de ADN son casi
idénticos y sólo se advierte una disminución del porcentaje de aneuploidías en
tumores con índices de ADN muy bajos (por el aumento del coeficiente de
variación de los picos)72; la existencia de falsas aneuploidías es excepcional73.
Se pueden procesar y estudiar las muestras con patrones internos de ploidía
(hematíes de pollo) o células no tumorales74'75, pero en los tumores suele
quedar algo de población normal residual que sirve de control de diploidia.
Para analizar los histogramas de ADN obtenidos partir de muestras
parafinadas o frescas hace falta el uso de software especial que permita la
discriminación de ruido continuo por núcleos cortados y una aproximación
matemática para el cálculo de las fases, puesto que el histograma
monoparamétrico que se obtiene presenta superposición entre las fases GOG1
y S, y entre S y G2M76^°.

1.4.3.- Fluorocromos y procesamiento de datos.

Los fluorocromos ofrecen un método sensible para obtener información
acerca de la estructura, función y vitalidad de las células. En función del
flurocromo empleado o del anticuerpo al que esté conjugado el aparato mide
una u otras característica celular. Los citómetros producen una gran cantidad de
información que puede ser guardada en forma de histogramas (histogramas
monoparamétricos de 256 o 1024 canales, histogramas biparamétricos de 64 x
64 = 4096 puntos) o en "modo lista" (list mode) que consiste en guardar toda la
información obtenida para cada evento, de modo, que se pueden modificar las
regiones de análisis y reconstruir los histogramas en función de nuevos
parámetros de selección, así como, enviar y reanalizar la información con
ordenadores extemos al citómetro de flujo81'82. Para evitar interpretaciones
subjetivas y aprovechar al máximo la información obtenida es necesario la
ayuda informática y usar pruebas matemáticas estadísticas.
Los datos univariantes suelen ser representados como un histograma
monoparamétrico. Un método rápido y sencillo de interpretación es la
 27

observación del histograma y la ayuda del soporte informático del citómetro

para calcular el porcentaje de eventos en regiones seleccionadas82.
La transformación o uso de escalas logarítmicas es útil en caso de que
la señal sea muy amplia o se halle muy dispersa puesto que agrupa los canales
de señal alta y permite diferenciar igualmente el control negativo.
En algunos casos, por la dificultad de interpretación de los datos y la
elevada información que contienen, es necesario aplicar modelos matemáticos.
En ellos se emplean conversiones matemáticas de los histogramas y sus datos
a curvas o ecuaciones y se usan en el análisis de las distribuciones de ADN y
modelos de cinética celular83.
La representación de dos parámetros se realiza mediante histogramas
biparamétrícos con dos ejes y el número de eventos se representa como
densidad de puntos, colores, o líneas isométricas.
En el análisis multiparamétrico, la principal dificultad es la limitación
humana de poder manejar cómodamente y de forma comprensible información
relativa a más de tres variables simultáneamente. Se necesitan modelos
matemáticos de componentes principales, agrupación y clasificación para
analizar la compleja información84. La información se representa en forma de
múltiples histogramas mono/biparamétricos, cubos tridimensionales85 y matrices
de datos.

1.4.4.- Estudio del contenido en ADN y fases del ciclo celular por
citometría de flujo.
La medición del ADN ha sido una de las primeras y más empleadas
aplicaciones de la citometría de flujo61'86. Las células malignas, en algunos
tumores humanos, poseen frecuentemente alteraciones en el contenido de su
ADN que pueden ser detectadas por citometría de flujo. El estudio del contenido
en ADN y de las fases del ciclo celular son útiles para el estudio de la biología
celular y han demostrado tener una relación diagnóstica y pronostica en
determinadas neoplasias humanas62'68'69.
Se dispone de muchos fluorocromos que se unen específicamente a
las bases del ADN. La señal fluorescente es proporcional a la unión del
fluorocromo al ácido nucleico que es de tipo estequiométrico.
 28

Los fluorocromos que se usan para la Quantification de ADN por

citometría de flujo se clasifican en función de su mecanismo de unión. Los
intercalantes, como el bromuro de etidio, yoduro de propidio y naranja de
acridina, se unen al material genético de doble cadena intercalándose entre las
dos bases; los de unión preferente a las bases adenina-timina, como DAPI, DIPI
y Hoescht y; por último, los de unión preferente a las bases citosina-guanina,
como la mitramicina, olivomicina, y cromomicina Aß.

1.4.5.- Estudio de la aneuploidía de ADN y del ciclo celular.

En el ciclo celular se distinguen varias fases: la fase de reposo (GO),
fase de síntesis proteica (G1a), síntesis de ARN (Gib), síntesis de material
genético o ADN (fase S), de nuevo síntesis de proteínas (G2) y, por último,
división celular (M)87. Según el tipo y función de la célula, ésta tiene más o
menos actividad proliferativa y el ciclo puede variar según diversas condiciones:
fármacos, radiaciones, etc.
Técnicas para medir ía síntesis de ADN; estudio del ciclo celular la
intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de fluorocromo que es
proporcional a la cantidad de ADN de la célula88. Hay cierta variation entre el
resultado teórico y el obtenido debido a la variación biológica en la tinción y en
la lectura, por ello, se define el coeficiente de variación (CV) que nos da una
idea de la semejanza de los resultados obtenidos a la realidad y que hace
necesario el empleo de programas informáticos para discriminar correctamente
el porcentaje de células en cada una de las fases del ciclo celular.
A partir del histograma monoparamétrico de los canales de
fluorescencia del cromóforo que se ha unido al ADN, para calcular la fase S se
pueden emplear varios métodos informáticos: rectangular, lineal, polinomial,
Gauss89. Se puede hacer doble mareaje con yoduro de propidio y la técnica de
la bromodeoxiuridina-antibromodeoxiuridina para conocer la síntesis real y el
tiempo de duplicación90.
Detección de aneuploidía: el término aneuploidía, por citometría de
flujo, significa la presencia de una población con un contenido en ADN diferente
a un control de células semejantes y en igual fase del ciclo celular88. El termino
de aneuploidía citométrica no es semejante al de aneuploidía citogenètica y la
 29

ausencia de aneuploidía por citometría de flujo no excluye presencia de

alteraciones citogenéticas que no conlleven a un aumento del la cantidad total
de ADN (traslocaciones balanceadas, etc.)91.
Se define como Indice de ADN (ID) al cociente entre la moda del pico
GOG1 de la población problema y la moda del pico GOG1 del control (en %). A
partir de ahí, se define la siguiente terminología: diploide si ID igual 1,
aneuploide si ID diferente de 1, hiperploide si ID superior a 1, hipoploide si ID
inferior a 1, poliploide si ID es igual a 1.5, 2, 2.5, etc. y haploide si ID es igual a
0.569.
Un problema importante en la lectura de algunas muestras es la
discriminación de dobletes que interfieren y aumentan, artefactualmente, la fase
de mitosis. La solución se debe buscar en el procedimiento técnico, en criterios
de standardización y en soluciones citométricas del análisis de la señal92. Hay
citómetros que pueden mediante la señal de la altura, anchura y área del pico
de fluorescencia discriminar entre células en G2M y dos células unidas en
GOG1.
Se define como criterio de aneuploidía la presencia de dos picos en
canales diferentes de fluorescencia con dos poblaciones en la muestra88. Se
acepta que el coeficiente de variación de la población aneuploide suele ser
mayor que la euploide, de modo, que si se obtiene un histograma con dos picos
y desconocemos cuál de ellos es el diploide se aceptará que se está ante la
presencia de una población hiperploide o se escogerá como aneuploide el pico
con un mayor coeficiente de variación. Ante un histograma dudoso se puede
buscar la presencia de células en la región de G2M de la población problema
dudosamente aneuploide, la existencia de proporcionalidad entre las fases de
los ciclos celulares o comprobar la existencia de aneuploidía con diferentes
técnicas.
Con una buena técnica y el citómetro en condiciones óptimas se
pueden conseguir coeficientes de variación que permitan separar grupos de
células con índices de ADN de 0,95 a 1,05; en su defecto al menos de 0,9 a
1,1, aunque, generalmente, se obtienen mejores histogramas con muestras
frescas que parafinadas.
 30

1.5.- Técnicas inmunocitoquímicas del estudio de la muerte y

proliferación celular.

1.5.1.-Técnicas inmunológicas: Introducción.

Las técnicas inmunológicas tienen como objeto la detección,
identificación y Idealización de componentes celulares mediante el
reconocimiento de la reacción entre éstos y los anticuerpos (Acs) monoclonales
o policlonales correspondientes, formando el complejo Ag-Ac en el lugar de la
reacción93.
Esta unión, en las técnicas inmunocitoquímicas, se visualiza por medio
de una reacción citoquímica enzimàtica94"101. Aprovechando la especificidad de
las reacciones inmunes y la formación del complejo Ag-Ac existen otras
técnicas que evidencian la reacción mediante marcadores no enzimáticos98"102
(fluorocromos, metales electrodensos, isótopos radiactivos, biotina, haptenos).

1.5.2.- Estudio de la proliferación celular: Introducción.

En el ciclo celular se distinguen varías fases: la fase de reposo (GO),
fase de síntesis de proteínas y ARN (G1), fase de síntesis de material genético
(fase S), nueva fase de síntesis de proteínas y preparación a la división (fase
G2) y, por último, división celular (fase M). Según el tipo y función de la célula,
ésta tiene más o menos actividad y proliferación103.
Para el estudio de la proliferación celular se pueden emplear métodos
morfológicos o inmunológicos. Los métodos inmunocitoquímicos para estudiar
la proliferación celular se basan en el uso de Acs que identifican Ags que
aparecen o incrementan su expresión durante todas o algunas fases del ciclo
celular y que no se encuentran presentes en células fuera de ciclo (en fase
GO)104. No todos los Acs miden el mismo componente del ciclo celular, sino que
varía según el Ac empleado y el Ag contra el cual van dirigidos. Generalmente,
las técnicas inmunocitoquímicas van a ofrecer información estática acerca del
estado de proliferación de las células tumorales o no tumorales, pero no
proporcionan información de la velocidad a que tiene lugar el ciclo celular y por
lo tanto de la velocidad de proliferación105.
 31

Alguno de los métodos que se pueden utilizar para analizar la actividad

proliferativa de una población celular son los siguientes: contaje de figuras de
mitosis, mareaje con timidina tritiada, bromodeoxiuridina, Ki-67, Ag nuclear de
proliferación celular (PCNA), alfa ADN polimerasa, p105, Ag-NOR.

1.6.- Estudio del contenido en ADN y de la proliferación

celular en (inforna.

El término genérico de linfoma se refiere a un grupo heterogéneo de

neoplasias que tienen su origen en los linfocitos de los ganglios linfáticos o de
otras estructuras extraganglionares.
Los procesos incluidos en los LNH tienen un amplio espectro de
presentaciones clínicas, historia natural, pronóstico y respuesta al tratamiento,
puesto que bajo la misma denominación se engloban tanto neoplasias de
rápido crecimiento y elevada agresividad, como otras de curso evolutivo lento y
bien toleradas durante años.
La caracterización de los LNH se basa en la microscopía de luz. El
patólogo establece un diagnóstico en base a las características citomorfológicas
del tumor y éste diagnóstico es empleado para planificar el tratamiento y ofrecer
una opinión pronostica al enfermo.
Con objeto de implementar la información clínica y patológica
numerosos equipos han trabajado y trabajan en el reconocimiento de factores
pronósticos, clínicos y analíticos que discriminen, en el LNH, subgrupos con
diferente pronóstico o que puedan beneficiarse de procedimientos o
tratamientos específicos dentro grupos clínicamente o patológicamente
homogéneos. Otros grupos dirigen sus esfuerzos en proveer información
acerca de las características y comportamiento biológico de las células
neoplásicas linfomatosas. Así, los estudio inmunológicos, citométricos,
citogenéticos y de biología molecular pretender aportan datos que nos permitan
conocer mejor al LNH.
Los estudios sobre el contenido de ADN y la proliferación celular, ya
sea mediante citometría de flujo o de imagen o técnicas inmunocitoquímicas, de
 32

las células linfomatosas se enmarcan dentro de la investigación sobre la

biología celular en el LNH.
Mediante colorantes que se unen específicamente nucleicos la
citometría a los ácidos de flujo o de imagen nos puede proporcionar información
sobre el contenido de ADN y de las propiedades proliferativas de las células102.
Los métodos inmunológicos pueden ser empleados para estudiar la
proliferación celular mediante Acs que identifican Ags que aparecen o
aumentan su expresión en determinadas fases del ciclo celular104.
Los resultados citométricos obtenidos a partir de muestras frescas o
parafinadas son prácticamente idénticos en cuanto al índice de ADN y el
porcentaje de fases del ciclo celular y sólo se advierte una disminución en el
porcentaje de aneuploidías en tumores con índices de ADN muy cercanos a
1 ,Q0106. También ofrecen resultados comparables los análisis por citometría de
flujo de muestras de LNH obtenidas por biòpsia tísular o por punción y
aspiración percutánea de material neoplasia» por aguja fina107. Cuando la
cuantificación de ADN y estudio de la fase proliferativa no puede realizarse por
citometría de flujo una alternativa puede ser el empleo de técnicas de citometría
de imagen sobre cortes finos o improntas de muestras de LNH108.
Sin embargo, a pesar de la correlación entre los resultados entre las
diferentes muestras y métodos hay equipos que han evidenciado discrepancias
de resultados109 ya sea en función del método de obtención de la suspensión
celular110, lectura por el citómetro de flujo o análisis informático de las fases del
ciclo celular111.
Recientemente se ha celebrado una conferencia sobre el empleo de la
citometría de flujo para el estudio del ADN en neoplasias humanas106 en la que
se recomienda, en todos los estudio, indicar el método utilizado para la
obtención y tinción de la muestra, comprobar que la suspensión celular contiene
material representativo del tumor y emplear técnicas de calidad para el análisis
de los histogramas resultantes (técnicas de sustracción de agregados y núcleos
cortados, modelos informáticos de cuantificación de la fase S, etc.)112. Debido a
la posible variabilidad de los resultados entre los diferentes laboratorios también
se recomienda que cada centro realice estudios para establecer sus propios
rangos de normalidad112.
 33

Un histograma no aneuploide por citometría no excluye la presencia de

alteraciones citogenéticas puesto que es conocido que la citometría de flujo no
puede resolver ganancias o pérdidas muy pequeñas en material genético, así
como, es insensible a la presencia de traslocaciones balanceadas91. En los
LNH, varios estudios han demostrado discordancias entre el cariotipo y la
citometria de flujo113'114. En general, parece que la gran mayoria de los casos
aneuploides por citometría de flujo tienen cariotipos anómalos, mientras que
una proporción de entre un 50 a un 70% de los LNH citométricamente diploides
muestran cariotipos alterados siendo más elevada la proporción en las
muestras provenientes de tejido desparafinado que en las muestras de tejido
procesado en fresco114.
 34

2.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS.

2.1-Hipótesis.

1.- La muerte celular programada o apoptosis y la proliferación celular

de las células tumorales de los LNH, en el momento del diagnóstico, es distinto
en las diferentes entidades clínico-histológicas que conforman esta enfermedad
en lo que hace referencia a:
a) Distintos tipos histológicos: bajo, intermedio y alto grado de malignidad.
b) Distinto origen: nodal o extranodal.
2.- La apoptosis y proliferación celular tumoral de los LNH, presenta
relación con parámetros pronósticos clásicos y bien establecidos, obtenidos en
el momento del diagnóstico de la enfermedad, como son
a) Los parámetros que conforman el índice Pronóstico Internacional (IPI):
(Estadio Ann-Arbor, ECOG, masa tumoral, LDH).
b) Parámetros pronósticos independientes del IPI como: ß-2-microglobulina y a-
TNF, medidos en el suero en el momento del diagnóstico.
3.- La apoptosis y proliferación medidas en las células tumorales de
LNH, en el momento del diagnóstico, tiene valor pronóstico en grupos
homogéneos (mismo tipo histológico o mismo origen) y por tanto relación con :
a) Tipo de respuesta al tratamiento.
b) Tiempo de supervivencia, recaída y tiempo libre de enfermedad.
4.- La apoptosis no presenta relación lineal con la proliferación de las
células tumorales en el LNH. El fenómeno apoptosis*proliferación aporta
información pronostica independiente.

2.2.- Objetivos.

1.- Quantificar la proporción de células apoptóticas en las muestras

histológicas parafinadas a partir de los cuales se diagnóstico el LNH y estudiar
 35

si existen diferencias significativas entre los diferentes grupos histológicos de

malignidad. Medir la proporción de células apopléticas de las muestras y
estudiar si existen diferencias significativas entre los LNH de origen nodal y
extranodal.
2.- Estudiar el porcentaje de células en fase S del tejido parafínado s
partir del cual se diagnosticó el LNH y estudiar si existen diferencias
significativas entre los LNH de bajo grado, grado intermedio y alto grado; así
como analizar si existen diferencias significativas entre los LNH de origen nodal
y extranodal.
3.- Estudiar si existen diferencias significativas entre los valores de
apoptosis según los diferentes grupos pronósticos de proporciona el IPI, así
como con cada uno de los parámetros involucrados en su cálculo, y con la
dosificación de ß-2-microglobulina y a-TNF, medidos en el suero en el momento
del diagnóstico.
4.- Estudiar si existen diferencias significativas entre los valores de fase
S según los diferentes grupos pronósticos de proporciona el IPI, así como con
cada uno de los parámetros involucrados en su cálculo, y con la dosificación de
ß-2-microglobulina y a-TNF, medidos en el suero en el momento del
diagnóstico.
5.- Estudiar si la apoptosis, dentro de grupos clínicamente homogéneos
de LNH (grado histológico de malignidad u origen nodal/extranodal), se
comporta como un factor asociado a la respuesta al tratamiento, riesgo de
recaída o pronóstico de la enfermedad (tiempo libre de enfermedad y tiempo de
supervivencia).
6.- Estudiar si los resultados de la cuantificación del ADN, dentro de
grupos clínicamente homogéneos de LNH (grado histológico de malignidad u
origen nodal/extranodal), se comporta como un factor asociado a la respuesta
al tratamiento, riesgo de recaída o pronóstico de la enfermedad (tiempo libre de
enfermedad y tiempo de supervivencia).
7.- Estudiar si existe correlación entre la cuantificación de la apoptosis
y el porcentaje de células en fase S en los LNH en global y en grupos
homogéneos en cuanto a grado histológico u origen nodal o extranodal.
 36

8.- Estudiar si la interacción entre apoptosis y proliferación (fase S) se

comporta como un factor pronóstico independiente en cuanto a supervivencia.
 37

3.- MATERIAL Y MÉTODOS.

3.1.- Pacientes y variables de estudio.

Los pacientes incluidos en el estudio se han identificado a partir del

registro de enfermos del Servicio de Hematología y (-(emoterapia del Hospital
Universitario Arnau de Vilanova. El tiempo de estudio va desde 1975 a Junio de
1995. Cabe señalar, que sobre todo en los últimos 10 años, prácticamente la
totalidad de los pacientes con este diagnóstico han sido estudiados y tratados
en este Servicio por ser el único del área Sanitaria, donde existe el compromiso
de asumir toda la oncohematología de la misma.
La fuente de información para su inclusión se ha obtenido de un
registro codificado de diagnósticos que dispone el Servicio. Con dicha
información se elabora un listado de pacientes, con sus datos personales de
filiación y el número de Historia Clínica.
A partir de aquí se ha realizado una revisión de historias para
seleccionar aquellos pacientes para cuyo diagnóstico se realizó biòpsia de
tejido distinto del de médula ósea. Se realiza un nuevo listado de estos
pacientes anotando el número de bloque anatomopatológico. Mayoritariamente
corresponden al Servicio de Anatomía Patológica del propio Hospital también se
han estudiado biopsias que se habían realizado el diagnóstico en el Hospital
Santa María de Lleida.
Las condiciones mínimas indispensables para poderse incluir en el
estudio son disponer de bloque anatomopatológico suficiente para el estudio
que se propone y un mínimo de información clínica, tanto al diagnóstico, como
en su tratamiento y seguimiento.
Se elabora una hoja de recogida de datos con los siguientes apartados
y recogiendo siguientes variables (ver Anexo):
a) Filiación: Además del nombre y dos apellidos, número de Historia
clínica y número de bloque anatomopatológico, interesa fecha de diagnóstico y
revisión anatomopatológica, diagnóstico histológico, clasificación de la WF en
 38

bajo grado, grado intermedio y alto grado. También se recoge el

inmunofenotipaje en B, T y no B ni T.
Finalmente se recoge sexo en dos variables el y la edad, con
estratificación en = o < a 60 años y mayores de 60 años, puntuando estos
últimos directamente para el IPI edad dependiente.
b) Respuesta del paciente al tumor Se recoge si el paciente tiene o no
síntomas constitucionales y además cuantos tiene. Se valoran fiebre recurrente
de 38 a 38,3°C al diagnóstico, diaforesis nocturna y perdida de peso igual o
superior al 10% del peso corporal estimado. Con la información clínica de que
se dispone al diagnóstico ha valorado, siempre el mismo observador, la
performance según ECOG con O y 1 asintomáticos o síntomas sin cama
respectivamente, lo que corresponde a manejo ambulatorio y no puntúa para el
IPI mientras que con 2, 3 y 4 de ECOG que supone desde encarnamiento
inferior al 50%, igual o superior al 50% y encarnamiento del 100%
respectivamente lo cual supone un manejo no ambulatorio y puntúa para el IPI
tanto edad dependiente como edad independiente.
En los casos en que se dispone de aspirado medular con cuantificación
en % de serie roja, serie blanca y megacariocítica se recogen estos porcentajes
como reserva medular de estos pacientes independientemente de que se
encuentre o no afectada por su LNH.
c) Crecimiento tumoral y potencial invasivo: Se recoge la medida en
centímetros del tumor de mayor tamaño en todos los casos en que se dispone
tanto por la medida clínica, como de exploraciones complementarías sobre todo
radiológicas como cuando se especifica en la pieza anatomopatológica o
quirúrgica. Además se estratifican en tamaño inferior a 10 cm. y mayor de 10
cm. El estadio de Ann Arbor se ha dividido en dos grupos: estadios precoces
correspondientes a estadios I y II, y estadios avanzados correspondientes a
estadios III y IV, puntuando este último tanto para el índice pronóstico edad
dependiente como independiente.
Se especifican por otra parte los lugares de afectación extranodal
reseñando especialmente: médula ósea, tramo gastrointestinal, hígado, bazo,
pulmón, sistema nervioso central, etc. En caso de tener más de una localización
extranodal, se suma a la puntuación de pronostico edad dependiente.
 39

Dentro de este apartado se han incluido algunas dosificaciones

biológicas realizadas al diagnóstico siendo imprescindible como mínimo
disponer de LDH para poderse incluir en el estudio, además se incluye
dosificación en suero de p-2-microglobulina, tumor necrosis factor (TNF-a) y
ferritina expresándolo siempre en valores de laboratorio y el resultado definitivo
como ratio, cociente entre el valor obtenido del paciente y el limite superior de la
normalidad para nuestro laboratorio.
Al manejar una serie de enfermos de un periodo tan largo de tiempo,
los valores de referencia de nuestro laboratorio han sufrido modificaciones, por
lo que el ratio se ha obtenido con el valor del limite superior de normalidad en el
año que se practicó la determinación. El valor de ratio de LDH es estratifica en
igual o inferior a 1,2 y superior a 1,2 tal y como inicialmente el grupo de Shipp
encontró significativo aunque para el IPI se valora en 1. Los valores superiores
a 1,2 se puntúan en los dos índices pronósticos.
d) Respuesta y tolerancia al tratamiento: En primer lugar se recoge el
tipo de tratamiento empleado: poliquimioterapia, radioterapia o la combinación
de ambas, con las fechas de inicio y de terminación del mismo.
La tolerancia se valora desde el punto de vista clínico global, así como
la presencia de granulopenia, síndrome febril post-tratamiento y los efectos
tóxicos.
La respuesta se clasifica en:
- Remisión completa: desaparición de todos los síntomas con
normalización biológica y radiológica.
- Remisión parcial: desaparición de algunos síntomas o signos
biológicos o alteración radiológica pero con persistencia de alguno de ellos.
- No respuesta: la persistencia de los síntomas clínicos, biológicos y/o
radiológicos.
En caso de presentar recaída, reaparición tras remisión de nueva
sintomatologia, se recoge la fecha y sitio anatómico de la misma.
e) Supervivencia: En caso de que al cerrar el estudio, en junio de 1995
el paciente esté vivo se recoge la fecha de la última reevaluación, visita o
control realizado y en caso de muerte se ha recogido la fecha de la misma así
como la causa de muerte para valorar si lo es por el LNH o por otra causa.
 40

El tiempo de supervivencia, expresado en meses se ha contado desde

la fecha de inicio de tratamiento hasta la fecha de muerte o de la ùltima visita.
El tiempo libre de enfermedad, son los meses transcurridos desde
finalizar el tratamiento en remisión hasta fecha de recaída, muerte o última
visita.
El tiempo de seguimiento se contabiliza como meses transcurridos
desde la fecha de diagnóstico a fecha de muerte o última visita.

3.2.- Métodos y técnicas.

Con los bloques anatomopatológicos se realizan diferentes cortes. Uno

de 50 ^m para citometría de flujo y varios (tres) de 5 ^m de espesor en porta
para técnicas de inmunohistoquímica.

3.2.1.- Citometría de Flujo.

1.- Obtención y tinción de la suspensión nuclear a partir de muestra
parafinada:
a.- Obtener secciones de tejido tumoral parafinado de 50 um de grosor
mediante un microtomo adecuado.
b.- Identificar y desparafinar las secciones (1 o 2 secciones)
sumergiéndolas en tubos de cristal con 10 mililitros de xilol durante 10 minutos.
Decantar y repetir el paso con otros 10 mililitros de xilol. Decantar y eliminar los
restos de xilol con lavados con alcohol absoluto.
c.- Rehidratar sumergiendo sucesivamente las secciones en 5 mililitros
de:
• etanol 100%: durante 5 minutos
• etanol 95%: durante 5 minutos
• etanol 90%: durante 5 minutos
• etanol 70%: durante 5 minutos
• etanol 50%: durante 10 minutos
• agua destilada: durante un mínimo de 10 minutos.
 41

En este punto, si es necesario, se puede parar el procedimiento

durante 24 horas.
d.- Decantar el agua y disgregar las secciones mecánicamente con
ayuda de unas tijeras o bisturí.
e.- Incubar con 4 mililitros de una disolución de pepsina (Pepsin,
Sigma, P-7012) al 0,5% en cloruro sódico al 0,9% en agua destilada, el pH se
debe ajustar a 1,5. La incubación se realizará en baño a 37 grados y durante
30-45 minutos, realizando cada 10-15 minutos agitaciones con vórtex.
f.- Centrifugar 10 minutos a 2.000 r.p.m., decantar y resuspender con
suero fisiológico o PBS.
g.- Filtrar con una malla de nylon de 50 um de poro (Maisa) sobre
tubos. El filtrado se realiza para remover agregados celulares y tejido
insuficientemente disgregado que pudieran obstruir la cámara de flujo del
citómetro.
h.- Determinar la concentración de suspensión de núcleos. Ajustar a un
máximo de 20.000-30.000 células/ul.
i.- Centrifugar, decantar e incubar el botón con 2 mililitros de solución
de yoduro de propidio y RNAasa (DNA-prep Stain, Izasa-Coulter, PN 6604451).
Incubar a temperatura ambiente y en oscuro durante 30-45 minutos.
j.- Leer por el citómetro de flujo.
2.- Controles:
Se someten a igual procedimiento secciones de ganglio no tumoral;
sirven para determinar el canal de diploidia en el histograma de ADN y
comprobar la calidad del histograma obtenido. Además se emplean hematíes
de pollo como control adicional de ploidía (Chicken Erytrocyte Nuclei, Izasa-
Coulter, PN 6604453).
3.- Lectura de las muestras:
La lectura de las muestras desparafinadas, disgregadas y teñidas con
yoduro de propidio por el citómetro de flujo: durante el procesamiento anterior,
los núcleos han adquirido determinada cantidad de fluorocromo en proporción a
su contenido en ADN. Con el citómetro de flujo vamos a medir de una manera
rápida y objetiva la fluorescencia que emiten los núcleos. A partir de los
 42

histogramas obtenidos se realiza el análisis de ploidía y de las fases del ciclo

celular.
4.- Citómetro de flujo:
Se ha empleado un EPICS PROFILE I (Izasa-Coulter) implementado
con el paquete "Power Pack" (cuarto fotomultiplicador, histogramas logarítmicos
de cuatro décadas, discriminador de señal de pico), lo que equivale a convertir
el PROFILE I a PROFILE II (más otro fotomultiplicador).
Se ha creado un test específico para la lectura de las muestras de
LNH. Los valores, por defecto, del test son los siguientes:
• Volumen de muestra aspirada: 190 ul.
• Velocidad de inyección de la muestra: 10 ul/minuto (velocidad baja).
• Presión del fluido de arrastre: 7,50 psi.
• Potencia del láser: 15 mW.
• Voltajes de los fotomultiplicadores: SS: 400 V, FL3: 725 V.
• No hay compensación de color al trabajar con un única fluorescencia.
• Parámetros seleccionados: LSS, LFS, FL3P, FL3, LFL3 (dada la
configuración óptica del ettòmetro, la fluorescencia emitida por el yoduro de
propidio se recoge en el tercer fotomultiplicador).
• Ventanas de adquisición: No activadas; FL3: 102-1023, FL3P: 144-1023.
Resto: 0-1023.
• Ganancias: FL3 =1/2 FL3P. Resto: 1.
• Discríminadores: para FL3 en el canal 50.
• Parada a los 50.000 eventos.
• Regiones amorfas (bitmaps) de adquisición: FL3-FL3P: para discriminación
de dobletes. LSS-LFS: adquisición en función de tamaño y complejidad celular.
• Histograrnas: cuatro histogramas: 1 biparamétrico: LSS-LFS, 3
monoparamétricos: FL3 (uno sin bitmaps activados, otro activando bitmap de
LSS-LFS, y otro activando bitmap de LF3-FL3P. Histograma biparamétrico de
FL3 y LFS. para comprobar la calidad de la tinción (independencia del canal de
FL3 y tamaño nuclear).
• Almacén de los resultados en forma de histogramas y en modo lista en un
disquete.
 43

Los valores por defecto son modificables en función de la posición del

canal de ploidía del control (que se situará alrededor del canal 175-200 en un
histograma de 1024 canales), posición de las poblaciones en los citogramas y
velocidad de lectura de eventos (velocidad de paso de la muestra).
5.- Alineamiento del eliòmetro:
Antes de proceder a la lectura de las muestras, se ha realizado una
calibración, del alineamiento del sistema, con bolas fluorescentes de látex
(DNA-check, EPICS alignment fluorespheres for optical alignment of flow
cytometers, Izasa-Coulter, PN 6603488).
6.- Lectura por el citómetro de flujo:
Una vez teñidas las muestras, éstas son analizadas por citometría de
flujo mediante el tests definido. La adquisición de los datos se realiza tras 60
segundos de inicio de paso de muestra para que se estabilice el flujo. Se
adquieren un total de 50.000 eventos.
7.- Interpretación de los resultados de la lectura por citometría de flujo:
a.- Histogramas monoparamétricos del contenido en ADN: resultado de
la lectura por citometría de flujo de las muestras de LNH teñidas con yoduro de
propidio se obtienen histogramas monoparamétricos con la distribución de
fluorescencia proporcional al contenido en ADN de los núcleos analizados. Para
la correcta cuantificación de las fases GOG1, S y G2M se ha empleado un
programa informático específico para análisis del ciclo celular92 (MULTICYCLE,
Phoenix Flow Systems, 6414566) El programa, mediante procedimientos
matemáticos, es capaz de realizar la sustracción de la señal debida a núcleos
cortados y permite, en el casos de existir una población aneuploide, el cálculo
del índice de ADN y las fases del ciclo celular de las células normales y del de
las aneuploides.
En la lectura, por citometría de flujo, de las muestras: en el histograma
biparamétríco de dispersión frontal y lateral de luz se seleccionaron los eventos
correspondientes a núcleos celulares; y en el histograma biparamétríco de señal
fluorescente de pico y área los eventos correspondientes a células aisladas (no
dobletes ni agregados celulares). Los eventos que se encontraban en las dos
regiones de selección mencionadas se representaron en un histograma de
1024 canales de fluorescencia (contenido en ADN). En cualquier caso, se
 44

adquirió parte de la señal producida por núcleos cortados para una correcta
sustracción de señal producida por los mismos a lo largo de todo el histograma
por los modelos matemáticos del software de análisis.
8.- Análisis de los histogramas del contenido en ADN mediante el
programa informático:
a.- Selección de los histogramas.
b.- Identificación de la presencia de uno o más picos correspondientes
a células en fase GOG1. En caso de aparecer un solo pico se considera un
histograma diploide y si aparecen más de uno, un histograma con presencia de
aneuploidía (2 ciclos celulares)88. En el caso de aneuploidía se ha considerado
como pico diploide aquel más cercano al canal del control de referencia de
linfocitos normales88.
c.- Selección del modelo matemático para el cálculo del índice de ADN
y el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular (fase GOG1, fase S y
fase G2M). Modelo para el cálculo de la fase S: polinomial de un grado con
sustracción de núcleos cortados.
d.- El programa, por iteraciones múltiples hasta obtener los valores
mejor ajustados al histograma y con menor error, calcula: (1) en los histogramas
diploides el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular y (2) en los
histogramas con aneuploidía el índice de ADN y el porcentaje de células en
cada fase del ciclo celular para cada una de las poblaciones (diploide y
aneuploide).
9.- Variables del estudio por citometría de flujo:
a.- Estudio del contenido en ADN y fases del ciclo celular:
En cada caso, se han recogido las siguientes variables cuantitativas:
en caso de existir un único pico de fase GOG1: se considera una muestra
diploide y se recoge: (1) canal medio del pico GOG1, (2) CV del pico GOG1, (3)
porcentaje de células en fase GOG1, (4) porcentaje de células en fase S, (5)
canal medio del pico G2M, (6) CV del pico G2M y (7) porcentaje de células en
fase G2M; (8) el índice de ADN se considera de 1,00; en caso de existir dos o
más picos GOG1: se considera la presencia de aneuploidía y se recoge: (9)
canal medio del pico GOG1 diploide de referencia, (10) CV del pico GOG1
diploide, (11) porcentaje de células en fase GOG1 de la población diploide, (12)
 45

porcentaje de células en fase S de la población diploide, (13) canal medio del

pico G2M diploide, (14) CV del pico G2M diploide, (15) porcentaje de células en
fase G2M de la población diploide, (16) canai medio del pico GOG1 aneuploide,
(17) CV del pico GOG1 aneuploide, (18) porcentaje de células en fase GOG1 de
la población aneuploide, (19) porcentaje de células en fase S de la población
aneupfoide, (20) canai medio del pico G2M aneuploide, (21) CV del pico G2M
aneuploide, (22) porcentaje de células en fase G2M de la población aneuploide
y, por ùltimo, el (23) indice de ADN de la muestra aneuploide.

3.2.2.- Inmunohistoquimica.
Todas las muestras han sido procesadas para su inmunofenotipaje.
Unas 60 muestras correspondientes al período más antiguo deben ser
revisadas en cuanto a diagnóstico por dos patólogos para establecer
uniformidad, utilizando la WF y además se procesan para los mismos Acs
monoclonales y la misma técnica, para determinar su inmunofenotipaje B o T,
como el resto de la sene. Hay que señalar que en este grupo se realizó además
para un estudio anterior detección de PCNA.
1.- Apoptosis. Para el estudio de la apoptosis se realiza puesta a punto
de la técnica de Sgonc et al.115'116 aplicada a un corte histológico de 4-5 firn
sobre porta mediante el kit de "In Situ Cell Death Detection, AP "® Boehringer
Mannheim GmbH, Biochemica (cat.1684809), D-68298 Mannheim. Germany.
Principio técnico:
Se trata de detectar la muerte celular en un estadio muy precoz
mediante inmunohistoquímica, con análisis en microscopio óptico después de
reacción con un substrato. El parámetro que se analiza es la detección de
roturas de DNA en células fijadas y parafinadas.
Durante la apoptosis, antes de que se produzcan los cambios
morfológicos que permiten reconocer el fenómeno, se producen unas roturas en
el DNA genómico dando lugar tanto a fragmentos de DNA de bajo peso
molecular, mono y oligonucleosomas, como fragmentos de alto peso molecular,
dejando hebras rotas de DNA ("nicks"). Estas se pueden identificar marcando
los radicales libres 3'OH terminales, mediante una reacción enzimàtica, usando
la terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) la cual cataliza la polimerización
 46

los nucleótidos con terminales 3'OH, lo cual se describe como TÚNEL (TdT
mediated dUTP nick end labeling).
La fluoresceína incorporada se detecta por un Ac anti-fluoresceína,
fragmentos Fab, obtenidos de oveja y conjugados con fosfatasa alcalina.
Después de poner los tejidos en reacción con el substrato, las células teñidas
pueden ser leídas al microscopio óptico.
2.- Técnica. Procedemos a describir la técnica por pasos sucesivos:
a.- Desparafinado y rehidratación: Los cortes histológicos se someten a
T° de 60 °C durante 45 a 120 minutos. Posteriormente se someten a pases
sucesivos por cubetas con las siguientes mezclas y en este orden: xilol con 4
cambios de 7 minutos; etanol 100%, 3 cambios por cinco minutos; etanol 80%
por 5 minutos; etanol 70% por 5 minutos; etanol 50% por 5 minutos; agua
bidestilada, 3 lavados de 5 minutos. En cada cambio se agitan bien las
preparaciones para obtener un buen lavado. Las extensiones procesadas en B5
una vez finalizado este proceso deben sumergirse 2 minutos en solución de
iodo al 0,5% y otros dos minutos en solución de tiosulfato sódico al 5%, para
nuevamente lavar con agua destilada.
b.- Tratamiento enzimàtico: Se incuban los cortes con una solución de
proteinasa K, preparada con 20 ng/ml en 10 mM Tris/CIH, pH 7,4 a 8, durante
15 minutos a 37 °C. Acto seguido se realizan dos lavados con PBS de 5
minutos.
c.- Mareaje: Secar cuidadosamente el porta alrededor de donde se
encuentra el tejido o muestra a estudiar, dibujando un circulo a su alrededor con
pintura de uñas para evitar el derramamiento de reactivo.
Preparación del reactivo TÚNEL: sacar 100 \iL de la botellita del kit n° 2
para controles negativos, añadiendo al resto (450 \iL) las 50 \iL de la botella n°
1 y está listo para usar en 10 muestras y dos controles negativos. Su
preparación es inmediatamente antes de su uso y se conserva en frío hasta la
dispensación.
Se añaden 50 \iL del TÚNEL preparado a la muestra colocando enzima
un cubreobjeto para homogeneizar y evitar la evaporación del reactivo.
Se realiza una incubación en cámara húmeda a 37 °C durante 60
minutos y acto seguido se realiza lavado con PBS por tres veces. En este
 47

momento es susceptible de lectura con microscopía de fluorescencia para

observar si funciona el mareaje.
d.- Secundario y revelado: Secar cuidadosamente alrededor de la zona
de estudio y añadir 50 jiL de Converter-AP, incluido en el kit, cubriendo como
en el proceso anterior e incubando en cámara húmeda a 37°C durante 30
minutos. El reactivo Converter está listo para ser usado teniendo la precaución
de guardarlo a 4 °C una vez descongelado y no puede ser congelado de nuevo.
Al sacarlo de la cámara húmeda se lava 3 veces con PBS y acto
seguido se añade entre 50 a 100 \iL de solución de solución de substrato (Alk.
Phosphatase Chromogen Kit. Fast Red Tablets. BI0MEDIA 800-341-8787,
Foster City CA, USA), incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente,
nuevamente se realizan tres lavados con PBS y se procede a contrastar con
hematoxilina acuosa de Mayer's durante 20 segundos.
El montaje final se realiza con medio de montaje acuoso: Aquatex®
(Merck) y cubreobjeto.
Controles: En cada serie se realizan dos controles negativos de la
forma indicada en la técnica y un control positivo, para el que hemos utilizado
cortes de amígdala normal y todos se someten al mismo procedimiento.
Cuantificación al microscopio: La lectura se ha realizado en un
microscopio óptico Leitz, con un objetivo de inmersión en aceite de 100
aumentos, aprovechando la retícula para fotografía del ocular que mediante la
regla Ernst Leitz GmbH Wetzlar® mide un campo predeterminado de 0,09mm x
0,13mm o, lo que es lo mismo, una superficie real de 0,0117 mm2. En dicha
superficie se cuentan los núcleos correspondientes a tejido linfomatoso
negativos para apoptosis, teñidos de azul y los positivos, teñidos de rojo. Para
estos últimos, en caso de duda se valora la morfología que pueda corresponder
a célula en apoptosis. En ningún caso se valoraron tinciones citoplasmáticas o
de células ajenas a la proliferación linfomatosa.
Para realizar un barrido suficiente del tejido se fija como objetivo
realizar un contaje de al menos 15000 núcleos para cada extensión.
La expresión del resultado se realiza como n° de núcleos en apoptosis
por cada 1000 células linfomatosas. Todos los contajes han sido realizados y
cuantificados por el mismo observador, introduciendo como control interno 10
 48

extensiones al azar contadas por tres observadores para valorar la fiabilidad del
sistema.
 49

4.- RESULTADOS.

4.1.- Estadística descriptiva univariante.

4.1.1.- Edad y sexo: la edad media de los 139 pacientes estudiados es

de 62,28 años con una desviación estándar de 14,52 y un rango que va desde
un mínimo de 15 hasta un máximo de 87 años. En cuanto a la distribución por
sexos de los pacientes estudiados, resultaron 76 hombres (54,7%) y 63
mujeres (45,3%).

100|
D
A
D
80-
A
L

D 60-
I
A
G
N 40-
O
S
T
I 20-
C
O

76 63
hombre mujer

SEXO

4.1.2.- Performance (ECOG): de acuerdo con los distintos grados del

ECOG los pacientes estudiados se distribuyeron de la forma que muestra la
siguiente tabla:
Grado ECOG descripción Frecuencia Porcentaje. % acumulado
0 no síntomas 18 12.9 12.9
1 sínt. sin cama 52 37.4 50.4
2 cama<50% 40 28.8 79.1
3 cama=>50% 28 20.1 99.3
4 cama 100% 1 0.7 100
TOTAL 139 100
 50

A efectos de los estudios estadísticos posteriores se agruparon los

grados O y 1 como manejo ambulatorio y el resto (2,3 y4) como manejo no
ambulatorio.

4.1.3.- Síntomas B: la ausencia de síntomas B fue mayoritaria en

nuestra serie. No se objetivaron síntomas constitucionales en 88 pacientes, lo
que representa un 63,3% del total. También se recogió, en los casos que
presentaban sintomatologia constitucional, si presentaban uno, dos, o los tres
síntomas. La información se resume en la siguiente tabla:
Síntomas B Frecuencia % % acumulado
Ausencia 88 63.3 63.3
Un solo síntoma. 27 19.4 82.7
Dos síntomas. 21 15.1 97.8
Tres síntomas. 3 2.2 100
TOTAL 139 100
El estudio estadístico solamente se realizó en relación con la presencia
o ausencia de síntomas B.

4.1.4.- Estadio de Ann Arbor: la distribución de los pacientes de

nuestra serie de acuerdo con los estadios de Ann-Arbor resultó ser la siguiente:
Estadio Frecuencia % % acumulado
I 28 20.1 20.1
II 15 10.8 30.9
III 17 12.2 43.2
IV 79 56.8 100
TOTAL 139 100
Como puede observarse, un poco más de la mitad de los casos se
encontraron en estadio IV y un 69% corresponden a estadios avanzados
resultado de agrupar estadios III y IV.

4.1.5.- Localización de tumor primario: en cuanto a la localization

anatómica del tumor primario se realizó una estratificación entre localization
típicamente nodal y extranodal con la siguiente distribución: 81 pacientes
(58,3%) presentaban una localization nodal del LNH mientras que los 58
restantes (47,1%) presentan un origen extranodal del LNH:
 51

El número de loralizaciones extranodales afectadas,

independientemente de su afectación primaría, se expone en la siguiente tabla:
N° Loe. extranodales Frecuencia % % acumulado
0 20 14.4 14.4
1 54 38.8 53.2
2 37 26.6 79.9
3 21 15.1 95
4 5 3.6 98.6
5 2 1.4 100

4.1.6.- Tamaño mayor de la tumoración: el valor medio del tamaño

tumoral de los 138 pacientes de los cuales se ha podido obtener es de 7,64 cm.
El siguiente histograma muestra la distribución de los tamaños.

60

4O

20

Std Dev = 5,46

Mean - 7,6
N = 138,00
O.O 5,O 1O.O 15.O 2O.O 25.O 3O,0 35,O 40.O

TAMAÑO TUMOR MAYOR

4.1.7.- Grado histológico de malignidad: la distribución de nuestra

serie de acuerdo con los criterios de la Working- Formulation fue la siguiente:
Grado. Histológico Frecuencia % % acumulado
Bajo 47 33.8 33.8
Intermedio 55 39.6 73.4
Alto 37 26.6 - 100
TOTAL 139 100

4.1.8.- Inmunofenotipo del tumor: se pudo realizar inmunofenotipaje

en 130 muestras de los 139 pacientes; y de ellas, solamente se realizó
identificación de inmunofenotipo de las células neoplásicas B y T. En 3
muestras (2,3%) no se obtuvo mareaje ni B ni T. En el resto, la mayor parte de
los LNH fueron de tipo B (77 casos, 82,3%).

7ê
 52

4.1.9.- LDH sérica, beta-2-microglobulina sérica y a-TNF sérico: los

resultados se expresan como el cociente entre el valor del paciente y el valor
máximo de la normalidad para la técnica y el laboratorio en el momento de la
dosificación. La descripción de los resultados se muestran en la tabla siguiente:
media DS mínimo máximo casos
Ratio LDH 1,35 1,66 0,25 16,60 139
Ratio b-2-microglobulina 2,31 1,87 0,67 12,80 89
Ratio a-TNF 5,95 8,54 0,27 50,20 43

4.1.10.- Apoptosis: se ha realizado el contaje como proporción de

número de núcleos en apoptosis por cada mil núcleos. El contaje de los
controles negativos fue siempre de cero, el del control positivo en los centros
germinales fue de 29,56 por mil y en las zonas interfoliculares de 1,98 por mil,
(promedio de 15,77 por cada mil).
En la serie de 139 pacientes, se ha realizado el contaje global de
núcleos en apoptosis en la zona de tejido tumoral o infiltrado distinguible
morfológicamente. Se han contado de promedio 17717 núcleos por cada
extensión (rango desde 2137 a 35547) encontrando un valor medio de
apoptosis por extensión de 2,71. Se muestra un box-plot de los resultados:

4O

30-

20-

10-

-1Q
139
APO
 53

4.1.11.- Porcentaje de células en fase S: la distribución de los y los

estadísticos del porcentaje de células en fase S obtenidos por citometría de
flujo se describen a continuación:
Mean U,4737 Std Err ,7885 Min 1,1000 Skewness 1,5199
Median 8,5000 Variance 86,4115 Max 50,7000 S E Skew 2056
/

5% Trim io,6134 Std Dev 9,2958 Range 49,6000 Kurtosis 2,2657

IQR io,3000 S E Kurt t 4084

SOr-

SO-

4O-

30-

20-

1O-

O"

-1Q^
139

% CÉLULAS EN FASE S

4.1.12.- Contenido de ADN: los valores de los índices de ADN (ID)

obtenidos por citometría de flujo de las muestras parafinadas al diagnòstico de
la enfermedad reflejan que existe una alteración en el contenido de ADN en 26
casos, lo que representa un 18, 7%, mientras que los 113 casos restantes
(81,3%) no muestran aneuploidía de ADN por citometría de flujo.
120

1OO

eo

AO

2O
Std.D«v — .26
, , MMI-I — 1 .08
N - 138,00
1.00 1,'13 1,'2S -l'.3B 1."SO 1 '.03 l',7G 1 .*8S 2."OO

NDICE DE ADN
 54

4.1.13.- Indices pronósticos: en todos los casos se pudo realizar la

evaluación por el índice Pronóstico Internacional (IPI) para el LNH, tal y como se
ha referido anteriormente en la introducción y en material y métodos. Por una
parte se ha valorado el IPI edad dependiente y por otra el IPI edad
independiente.
4.1.13.1.- IPI edad dependiente: su distribución es la siguiente:
IPI Frecuencia. %.
0 11 7,9
1 28 20,1
2 28 20,1
3 26 18,7
4 33 23,7
5 13 9,4
TOTAL 139 100,0
Agrupando las puntuaciones de O y 1 como "Bajo Riesgo", las de 2
"Bajo Intermedio Riesgo", las de 3 como "Alto Intermedio Riesgo" y las de 4 y 5
como "Alto Riesgo", la distribución queda como sigue:
IPI Frecuencia. %
Bajo Riesgo 39 28,1
Bajo Interm. R. 28 20,1
Alto Interm. R. 26 18,7
Alto Riesgo 46 33,1
TOTAL 139 100,0
4.1.13.2.- IPI edad independiente: manejando el score que no tiene
en cuenta la edad como factor pronóstico, la distribución es la siguiente:
IPI Frecuencia %
Bajo Riesgo 27 19,4
Bajo Interm. R. 43 30,9
Alto Interm. R. 42 30,2
Alto Riesgo 27 19,4
TOTAL 139 100,0 "

4.1.14.- Tipo de tratamiento: una gran mayoría de pacientes (75,9%)

recibió tratamiento quimioterápico. De ellos, el 92% recibió un esquema tipo
CHOP. Existen dos casos que no recibieron ningún tratamiento y a efectos de
evaluación de tratamiento no se consideraron.
En la siguiente tabla se muestra el número de casos y el porcentaje de
casos en cada categoría de tipo de tratamiento.
 55

Tipo Tratamiento N° de casos % %Válido

Quimioterapia(Qx) 104 74,8 75,9
Radioterapia (Rtx) 11 7,9 8,0
QX+ Rtx 17 12,2 12,4
Cinjgia 5 3,6 3,6
No Tratamiento 2 1,4
TOTAL 139 100 100

4.1.15.- Tolerancia al tratamiento: se realizó una puntuación de

tolerancia tanto clínica como biològica al tratamiento. Así mismo se evaluó los
efectos adversos inmediatos clínicos y los derivados por la aparición de
granulopenia, como el síndrome febril. Se catalogó finalmente como "buena
tolerancia" la ausencia de todos ellos o al menos cuando no tenían repercusión
clínica (Ej. neutropenia moderada sin síndrome febril). De la totalidad de los
pacientes un 84,4% tuvieron una buena tolerancia del tratamiento.

4.1.16.- Respuesta al tratamiento: se catalogaron como "remisión

completa" (RC) cuando existe constatación de desaparición completa de la
sintomatologia y semiología con normalización de las alteraciones biológicas y
desaparición de los hallazgos radiológicos. Estos criterios se cumplían en 63
pacientes lo que supone una proporción de RC de 48,1%.
En un 39,7% solo se objetivó normalización en varios de los aspectos
dinico-biológicos mencionados, o bien en todos pero no de forma completa por
lo que se catalogaron como "remisión parcial" (RP).
La no mejoría en ningún aspecto o la progresión de la enfermedad se
evaluó como" no respuesta " (NR) que significó un 12,2%.
Tipo Respuesta. N° Casos % % Valido
RC 63 45,3 48,1
RP 52 37,4 39,7
NR 16 11,5 12,2
No évaluables 8 5,8
TOTAL 139 100 100

De 8 enfermos (5,8%) no se dispone de información suficiente para

evaluar la respuesta al tratamiento o no recibieron tratamiento.
 56

4.1.17.- Recaída: por definición sólo puede recaer aquel paciente que
alcanzó la remisión completa. En nuestra sene esto significa evaluar a 63
pacientes, de los cuales, 18 pacientes recidivan (28,5%). El resto de los
pacientes que alcanzaron la remisión completa, un 71,5%, no recidivaron de su
enfermedad durante el seguimiento.

4.1.18.- Seguimiento y supervivencia: el tiempo medio de

seguimiento fue de 33 meses, con un tiempo mínimo de medio mes y uno
máximo de 136 meses. Del total de pacientes incluidos en el estudio, 66
permanecían vivos el final de su período de seguimiento, 41 habían fallecido
por causa del LNH y 32 casos han sido considerados como retirados. El tiempo
medio de supervivencia fue de 83,87 meses y la mediana de 130 meses. El
tiempo libre de enfermedad de aquellos pacientes que entraron en remisión
completa tras el tratamiento se ha estudiado según pruebas para el análisis de
seríes temporales.

Survival Function
c
u ,»
m
,8-
S .7-
u
r
v
.6- ^^^
¡ .6« I
v ,4-
a
I ,3- *

,2-
.1.
OQ
(ï 20 -io GO ëo too rao 14O
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

1
Tiempo libre enfermedad

r^
C 1,0
u .S-
m
,&
S
u
r
,7-

.&
i
v
¡ ,&
v ,4'
a
I ,»

,2-
,1.
O
ó 10 20 so 4o do 6o
TIEMPO LIBRE DE ENF (MESES)
 57

4.2.- Estadística analítica bivaríante.

4.2.1.- Apoptosis y presentación clínica del LNH: la proporción de

células en apoptosis aumentó significativamente con el grado histológico de
malignidad.
Hemos encontrado un aumento significativamente estadístico de
células en apoptosis en los LNH de localization extranodal respecto a los de
origen nodal.
En nuestra serie, el numero de células apoptoicas en estadios
precoces (l-ll) es superior al de estadios avanzados (III-IV), sin embargo, la
diferencia no es estadísticamente significativa.
La cuantificación de células apoptoicas al diagnóstico, es
significativamente mayor en los pacientes que en el debut de la enfermedad
tenían peor performance. El performance se ha medido con el escore del
ECOG y se ha agrupado el grado O y 1 como manejo ambulatorio o poca
sintomatologia y los grados 2,3 y 4 como no ambulatorio o sintomatologia
invalidante.
proporción media de DS numero P
apoptosis de casos
Grado histológico
Bajo 1,99 4,40 47 0,0007
Intermedio 2,77 2,58 55
Alto 3,53 5,54 37
TOTAL 2,71 4,17 139
Localization
Nodal 1,97 3,60 81 < 0,0001
Extranodal 3,77 4,88 58
TOTAL 2,71 4,17. 139
Estadios
Precoces 2,99 2,82 43 0,0573
Avanzados 2,58 4,63 96
TOTAL 2,71 4,17 139
ECOG
Ambulatorio 2,03 2,44 70 0,0505
No ambulatorio 3,40 5,32 69
TOTAL 2,71 4,17 139
 58

Los siguientes gráficos muestran los resultados del estudios estadístico

anterior en lo que respecta a valores de apoptosis y grado histológico de
malignidad, localization del tumor, estadio y ECOG:

A
P
O
3O

2O

55 37
intermedio alto

GRADO HISTOLÓGICO DE MALIGNIDAD

40
A
P
O
tt
3O
•

2O

<t
1O

N- 81 sa
NODAL EXTRANODAL

LOCALIZACION TUMOR PRIMARIO

A «*
P
O
3O
.

2O

.
«»
*

I Mil II — I 1

N- ¿ 06
bajo (l-ll) alto (III-IV)

estadio codificado
 59

A *°
P
O
i1
30
«1

2O

4t

1O t

N- 70 eB
ambulatorio no ambulatorio

ECOG codificado

4.2.2.- Proliferación y presentación clínica del LNH: cuantificado el

grado de proliferación como el porcentaje de células linfomatosas en fase S,
dicho porcentaje crece significativamente con el aumento grado histológico de
malignidad.
Al igual que lo encontrado para la muerte celular programada, también
el porcentaje de células en fase S es superior en la localizador) de origen
extranodal que la nodal.
Por otra parte, el porcentaje de células en fase S no varia
significativamente (p=0,9035) entre los estadios precoces (11,7%) en relación
con estadios avanzados (11,4%).
En nuestra serie, la fase S no aumenta significativamente (p=0,1730)
en los pacientes con un performance malo (ECOG>2) al diagnóstico (12,3%) en
comparación con aquellos (ECOG <2) cuyo manejo era ambulatorio (10,6%).
Grado histol. n° casos media fase S DS P
Bajo grado 47 5,31 3,11 < 0,0001
Intermedio 55 12,50 " 8,51
Alto grado 37 17,78 10,87
TOTAL 139 11,47 9,30

Localization n° casos media fase S DS p

Nodal 81 10,55 9,47 0,0375
Extranodal 58 12.76 8,96
TOTAL 139 11,47 9,30

Los gráficos siguientes muestran los resultados del estudio estadístico:

 60

so-
C
E

U ex» 4»

A
S
«> 4»

«»
N
!i 4»

F ~
A
1t
s
E 2O>
S

) 0
N= 61 68
NODAL EXTRANOOAL

LOCALJZACION TUMOR PRIMARIO

eo
C "
L
U 60. 1 »
L
A
S
«* .»
E
N *
•
F "0-
A *
s
§ 20-

S
10-

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N= 70 œ
ambulatorio no ambulatorio

ECOG codificado

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1
N« 47 60 37
b«Jo Intermedio «Ito

GRADO HISTOLÓGICO DE MALIGNIDAD

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30 •
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•

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A
i-
S
. 10
-i I
) o.
N 4Í Bé
bvlo <l-ll> arto (III-IV)

estadio codificado
 61

4.2.3.- Apoptosis, proliferación celular y masa tumoral: la masa

tumoral se cuantificó por una parte como el nùmero de localizaciones
extranodales agrupadas en O ó 1 y en dos ó mas localizaciones y por otra como
el tamaño en cm del tumor mayor (medible bien por radiodiagnóstico o por
medida anatomopatológica; se agruparon en menores de 10 cm y mayores de
este tamaño). No se encontró relación significativamente estadística entre
muerte o proliferación tumoral con el número de afectaciones extranodales. En
lo que hace referencia a tamaño tumoral, solo se encontró relación significativa
entre la fase S con el tamaño tumoral, aunque el coeficiente de correlación de
Spearman fue sólo de 0,26 (r=0,26, n=138, p=0,002).

4.2.4.- Apoptosis, proliferación y otros marcadores tumorales en

LNH: el resultado del estudio estadístico de la relación entre el número de
células apoptoicas y la proporción de células en fase S con la ratio de LDH, a-
TNF y ß-2-microglobulina en suero en el momento del diagnóstico se muestra
en la siguiente tabla. En las casillas aparece el coeficiente de correlación y el
grado de significación:
LDH ß-2-micro. a-TNF Apoptosis FaseS
LDH 0,5002 0,4735 0,1528 0,2371
<0,001 0,001 0,073 0,005
ß-2-micro. 0,6257 0,0108 -0,0148
<0,001 0,920 0,891
a-TNF 0,1642 -0,2874
| 0,293 0,062
Apoptosis ,2260
0,007
FaseS

4.2.5.- Apoptosis, proliferación e índice Pronóstico Internacional: a

pesar de que la cuantificación de la apoptosis se correlaciona significativamente
con algunos de los componentes que integran el índice pronóstico internacional,
los diferentes grupos del IPI no presentan valores significativamente diferentes
de apoptosis.
 62

El porcentaje de células en fase S no crece significativamente

(p=0,2673) con los distintos grupos de riesgo: bajo riesgo (10,51%) bajo
intermedio (10,91%) alto intermedio (11,65%) y alto riesgo (13,03%).
4O
p
o
3O

1O

39 26
3 E 46
bajo bajo-tnt hit-alto alto
IPI edad indep. cod

C »I
E
i»
bL ~
A 40 »
S •

4» 4»

E 30 t»
N t» -
F 20
A
S
E 10
S
0,
i
- 39 28 26 46
bajo bejo-tnt Int-atto alto
) IPI edad indep. cod

4.2.6.- Apoptosis y evolución de la enfermedad: en cuanto a la

respuesta al tratamiento, hemos comparado solamente dos grupos, aquellos
que entraron en remisión completa (RC) y los que no consiguieron .la remisión
completa de su LNH (No RC) (bien fueran remisión parcial o no respondedores).
Se encontró un aumento significativo de la proporción de células apoptoicas en
aquellos pacientes que entraron en remisión completa con el tratamiento. La
proporción de células en apoptosis no muestra diferencias significativas
(p=0,1933) entre los pacientes que presentaron recidiva (2,44) y aquellos que
no la presentaron (3,80).
respuesta tto n° casos media apoptosis DS P
RC 63 3,42 4,85 0,0373
NoRC 68 2,07 3,53
TOTAL 131 2,71 4,17
 63

4.2.7.- Proliferación celular y evolución de la enfermedad: el

porcentaje de células en fase S resultó significativamente mayor en los
pacientes que entraron en remisión completa que en los que no la obtuvieron o
solo fue parcial. Además, no se encontró diferencias significativas (p=0,8971)
entre los porcentajes de células en fase S entre los que recayeron de su
enfermedad (12,95%) o aquellos que no presentaron recaída (14,20%).
Respuesta n° casos media fase S DS P
RC 63 13,84 11,10 0,0131
NoRC 68 8,79 6,06
TOTAL 131 11.47 9,30

Los siguientes gráficos muestran los resultados de la comparación de

los valores de apoptosis y fase S según la respuesta al tratamiento:
A *°
P
0
»
30
»

2O

ii
4 k
1»

N e3 6A
RC No RC

respuesta tto codificada

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S 8

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4k
E 30
N

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A
S
E 10

S Q.
K1 64)
N •

4 RC No RC

) r•espuesta tto codificada

4.2.8.- Estudio de la relación entre si de las diferentes variables

clínico-patológicas y la evolución de la enfermedad: aunque existe una
 64

cierta tendencia a que los LNH nodales sean predominantemente de bajo grado
y los extranodales de intermedio o alto grado, la diferencia entre las
proporciones no llega a ser significativamente diferente. En nuestra serie,
hemos encontrado un número significativamente mayor de pacientes con LNH
de origen nodal en estadios avanzados. No hemos encontrado diferencias
estadísticamente significativas entre las proporciones de pacientes que
consiguieron la remisión completa del LNH según el grado histológico, pero es
significativamente mayor el número de pacientes en estadios avanzados que no
alcanzaban la remisión completa. En cuanto a la recaídas también era mayor el
número de pacientes en estadios precoces que no recayeron de su LNH:
p=0,0556 Bajo grado G. Intermedio Alto grado Total
Nodal 34 28 19 81
Extranodal 13 27 18 58
Total 47 55 • 37 139
p=0,0007 Estadio precoz Estad, avanzado Total
Nodal 16 65 81
Extranodal 27 31 58
Total 43 96 139
p=0,1591 RC NoRC Total
Bajo grado 16 28 44
Intermedio 29 24 53
Alto grado 18 16 34
Total 63 68 131
p<0,0001 RC NoRC Total
Est. Precoz 33 8 41
Est. Avanzado 30 60 90
Total 63 68 131
p=0,0134 No Recaída Recaída Total
Est. Precoz 28 5 33
Est. Avanzado 17 13 30
Total 45 18 63

4.2.9.- Relación entre origen del tumor, respuesta al tratamiento y

recaída: se valoró si la diferencia en el origen del tumor, nodal versus
extranodal, tenía relación con la respuesta al tratamiento.
En el estudio estadístico, hemos encontrado que efectivamente los
LNH de origen extranodal obtenían de forma significativa más remisión
completa, es decir, que hay mayor proporción de pacientes que consiguen la
RC tras el tratamiento en los pacientes con LNH de origen extranodal.- Sin
 65

embargo no se encontró relación significativa entre origen del tumor y la

proporción de recaída tras respuesta al tratamiento.
P=0,0013 RC NoRC Total
Nodal 28 49 77
Extranodal 35 19 54
Total 63 68 131
p=0,2616 No Recaída Recaída Total
Nodal 18 10 28
Extranodal 27 8 35
Total 45 18 63

4.2.10.- Estudio estadístico bivariante de otras variables: en forma

de tabla resumimos los resultados que consideramos interesantes del estudio
Avariante de la asociación o relación entre algunas variables que describen la
presentación clínica del LNH y los valores, expresados en forma de ratio, de
LDH, beta-2-microglobulina y alfa-TNF. Los valores de alfa-TNF y beta-2-
microglobulina resultaron significativamente diferentes según el grupo de IPI,
tanto edad dependiente como edad independiente. En las comparaciones que
no aparecen no se encontró relación estadísticamente significativa.
LDH p<0,05 b-2-m p<0,05 a-TNF p<0,05
grado histológico
bajo 0,77 sí 1,84 2,08
intermedio 1,03 2,25 4,64
alto 1,10 1,80 1,58
síntomas B
ausencia 0,87 1,80 2,09
presencia NA NA NA
Idealización
nodal 1,07 2,04 3,23
extranodal 0,91 2,03 3,19
estadio
precoz (l-ll) 0,73 1,29 SÍ 1,11 SÍ
avanzado (III-IV) 1,25 2,84 5,31
respuesta a tto
RC 0,98 2,03 3,21
noRC NA NA NA
Recidiva
sí 1,20 3,23 Sí 6,95 Sí
no 0,89 1,77 2,27
 66

4.3.- Estudio de seríes temporales: tiempo libre de

enfermedad y tiempo de supervivencia.

4.3.1.- Los resultados del estudio de supervivencia bivariante se

muestran en las tablas siguientes. La supervivencia está medida en meses.
En la tabla se detalla el número de casos válidos para el análisis, la
supervivencia media y el intervalo de confianza estimado, el porcentaje de
sobrevivientes y el grado de significación de la prueba.
n° casos supervivencia %de 1C P
media sobrevivientes supervivencia
Origen. Localizador!
Nodal 81 77,64 67,90 68,4-103,5 0,3575
Extranodal 58 81,39 74,14 67,5-95,2
Grado
Bajo grado 47 98,91 87,23 83,4-114,3 0,0002
Intermedio 55 79.29 65,45 60,7-97.8
Arto grado 37 53,52 56,76 34,3-72,6
Grado
Bajo grado 47 98,91 87,23 83,4-114,3 0,0014
Int-alto grado 92 71,72 61,96 56,8-86,6
Estadios
Precoces 43 107,20 86,05 91,89-122,5 0,0039
Avanzados 96 72,28 63,54 57,5-87,0
ECOG
Ambulatorio 70 101,82 80 87,2-116,3 0,0057
No ambulator. 69 61,78 60,87 47,9-75,6
Respuesta al tratamiento
RC 63 101,55 82,54 87,6-115,4 0,0005
NoRC 68 63,63 57,35 45,7-81,4
IPI. Riesgo
Bajo 39 109,94 84,62 92,3-127,5 0,0002
Bajo-lnt. 28 91,91 82,14 76,8-107,2
Alto-lnt. 26 61,30 61,54 - 40,0-82,6
alto 46 41,73 56,52 29,2-54.1
IPI-no edad de endiente. Riesg0
Bajo 27 116,96 92,59 102,4-131,4 <0.001
Bajo-lnt. 43 105,34 81,40 87,6-123,0
Alto-lnt. 42 57,78 57,14 41,2-74,3
Alto 27 34,54 51,85 19,9-49,2

A continuación se presentan los gráficos de las curvas de

supervivencia de los grupos estudiados.
 67

Supervivència
1
C '°
u
m

li
.fi- "V^S^*i
r
,6-
V
i
I
:i •*
,2- LOCALIZACION TUMOR
• EXTRANODAL
OQ • NODAL
ï 20 4o éo eo ibo 120 1 IO
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

Supervivència
1
C -°
U %^—V
m
,8-
S
u \C*1-^.. i
r
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\
1\ •+ - ORADO HISTOLÓGICO
,2- • atto
-~ Intermedio
O.Q, o bajo
(5 20 4o éo éo too 120 14O
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

Supervivència
1
C -°
U
m "^ *
S
u
r
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.2- GRADOCOD
•" ínt-alto
o,u . • h»Jr>
C ¿o 4o éo éo ibo 120 140

TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

Supervivència
C '°
U <**•*_,
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S
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T '*
.2. estadio codificado
• alto (MI-IV)
O,Q t 0 h«jr> (I-M)
0 ¿o 4o éo eo 100 120 14O

1TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

 68

Supervivència
c 1·°
u
m *v*^
a
S
*•"»-,
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L
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r

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,6-
**--,.*-i.
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1 •+
1
,2- ECOG codificado
• no ambulatorio
O.Q, « ambulatorio
(D ¿o 4o éo ao 100 120 140

TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

Supervivència
1
C -°
U
m
S'^-x
,&•
S
ur V
v
i
,&

4
"X-, •l

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I
>2 respuesta tto codifi
l
• NoRC
O, Q ° RC
(D 2O 4O 6O 8O 1OO 12O 14O

TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

Supervivència
1
C '°
u n¿ *v
m
Q. Y¿ \

V^
S
U
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.&
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i
IPI edad indep. cod
a
I
•*

.2-
l •
'
alto
Int-atto
"- bajo-int
O.Q o bajo
C> 20 4O éO 8O 10O 120 1 to
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

Supervivencia
1
c -°
u
m
WV-, h
Ti \

V-
S
u
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v
i
1 •+ ^^L i IPIEXT
\ ~ 3,OO
,2- ~~ 2.OO
"•"" 1.OO
O.Q k • nn
C> 20 4o éo áo 100 12O 14O
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)
 69

En el estudio multivaríante, la supervivencia global en los LNH de

nuestra sene solo resultó correlacionarse significativamente con tres variables:
grado histológico de malignidad, respuesta al tratamiento y determinación de a-
TNF. Estos fueron los resultados resumidos en una tabla:
Variable P
Localization: N/EN 0,8106
Grado histológico <0,0001
Apoptosis 0,3413
Fase S 0,5856
Ploidía 0,3106
IPI 0,7156
LDH 0,9497
ß-microglobulina 0,3539
a-TNF 0,0488
Respuesta a Tto. 0,0004

4.3.2.- Tiempo libre de enfermedad en relación con las mismas

variables: el tiempo libre de enfermedad no resultó significativamente diferente
en relación con la localization, aunque la media del tiempo libre de enfermedad
en las localizaciones extranodales (83,7 meses) fue superior a los nodales (70,4
meses) (p=0,1466)
Tampoco resultó significativa su relación con los grados histológicos
(p=0,416) ni agrupando en bajo e intermedio+alto grado (p=0,329).
El resto del estudio se muestra en las siguientes tablas. El tiempo libre
de enfermedad está medido en meses:
Estadios n° casos Tiempo libre % libres de 1C P
enfermedad enfermedad TLE
Precoces 33 94,83 84,85 82,59-107,07 0,0084
Avanzados 30 54,41 56,67 34,76-74,07

IPI n° casos Tiempo libre % libres de 1C P

Riesgo enfermedad enfermedad TLE
Bajo 24 90,35 83,33 74,89-105,8 0,0082
Bajo-lnt. 16 82,06 75,00 58,51-105,6
Alto-lnt. 13 82,01 76,92 58,46-105,5
Alto 10 27,23 30,00 7,64-46,83

Los gráficos siguientes muestran los resultados del análisis estadístico

en cuanto el tiempo libre de enfermedad de los enfermos que obtuvieron la
 70

remisión completa del LNH hasta su recaída en función de algunas de las

variables estudiadas:
Tiempo libre de enfermedad
c 1·t*
U ,9.
L ¿i
i," i
i *....,

S *
* T_ •
r ,6-
v
ì .5-

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1 ,3-
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,2. LOCALIZACION TUMOR

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O.Q, o NODAL
(5 2O 4O 6O 8O 1ÖO 12O 14O
TIEMPO LIBRE DE ENF (MESES)

Tiempo libre de enfermedad

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*

.2. » estadio codificado

,1. "• alto (III-IV)
O.Q ,..,„ . 0 hj.jn (l-ll)
(S ¿o 4o éo áo 100 120 14O

TIEMPO LIBRE DE ENF (MESES)

Tiempo libre de enfermedad

:
1lD
C
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TI ,
S
ur
,&
V
i
a
1
•*

,2'

O,Q
Ci •¿o 4o
i éo éo 100 12O
~
1"40
IPIEXT
•
•
3.0O
2.OO
"•"' 1.0O
,00

TIEMPO LIBRE DE ENF (MESES)

 71

4.4.- Análisis estadístico multivariante.

4.4.1.- Estudio de la distribución de apoptosis en relación con

grado histológico y origen del tumor: en el análisis bivariante resultó
significativo el aumento de la proporción de células en apoptosis en los LNH de
origen extranodal respecto a los de origen nodal. Como se observa en la tabla,
el aumento significativo de células en apoptosis en los LNH de origen
extranodal se mantiene dentro de los LNH de bajo grado como de grado
intermedio; en los LNH de alto grado la cifra es superior pero no llega a ser
significativamente estadística.
todos los LNH LNH nodales LNH extranodales
n° Med D.std n° Med. D.std. n° Med. D.Std P
Bajo 47 2,111 4,527 34 1,729 4,961 13 3,130 3,036 0,001
ínter 55 2,765 2,615 28 2,108 2,060 27 3,447 2,977 0,025
Alto 37 3,433 5,723 19 2,218 2,521 18 4,800 7,816 0,083
Total 139 81 58

4.4.2.- Distribución del porcentaje de fase S en relación con tipo

histológico y origen del tumor: al comparar el porcentaje de fase S en cada
tipo histológico, en función del origen del tumor, este índice de proliferación
perdió la relación estadísticamente significacativa se obtuvo al realizar el
estudio bivariante.
todos los LNH LNH nodales LNH extranodales
n° Med D.std n° Med. D.std. n° Med. D.Std P
Bajo 47 5,223 2,791 34 5,300 2,969 13 5,020 2,357 0,642
ínter 55 12,06 8,300 28 11,69 8,371 27 12,45 8,373 0,500
Alto 37 17,67 10,97 19 18,89 12,58 18 16,29 9,04 0,987
Total 139 81 58

4.4.3.- Distribución de apoptosis en relación con el grado

histológico y la respuesta al tratamiento: se valoró si la apoptosis que resultó
significativamente superior en los pacientes que consiguieron la remisión
completa, también presentaba dicha significación en grupos homogéneos como
son los pacientes con LNH del mismo tipo histológico. Hemos encontrado que
dentro del mismo tipo histológico no resultó significativo el aumento de
 72

proporción de apoptosis que se observó en el análisis Divariante en los

pacientes que conseguían la remisión completa con el tratamiento.
todos los LNH LNH en RC LNH sin RC
n° Med D.std n° Med. D.std. n° Med. D.Std P
Bajo 44 2,111 4,527 16 2,644 3,696 28 1,807 4,979 0,378
ínter 53 2,76 2,615 29 3,316 2,954 24 2,100 1,999 0,062
Alto 34 3,433 5,723 18 4,263 7,618 16 2,499 2,128 0,836
Total 131 63 68

4.4.4.- Relación de la fase S con la respuesta al tratamiento en los

distintos tipos histológicos: en el estudio Divariante, la proporción de células
en fase S resultó significativamente mayor en los pacientes que entraban en
remisión completa con el tratamiento. Estudiando la relación con la respuesta al
tratamiento de este índice de proliferación en función del tipo histológico, se
encontró que sólo se hallaba una asociación significativa en los LNH de alto
grado de malignidad.
todos los LNH LNH en RC LNH sin RC
n° Med D.std n° Med. D.std. n° Med. D.Std P
Bajo 44 5,223 2,791 16 5,137 2,921 28 5,273 2,768 0,922
ínter 53 12,06 8,300 29 13,30 9,275 24 10,57 6,839 0,401
Alto 34 17,67 10,17 18 22,45 12,37 16 12,28 6,090 0,010
Total 131 63 68

4.4.5.- Estudio de la relación entre los valores de apoptosis y

proliferación con los Estadios de Ann-Arbor en función del grado
histológico: las siguientes tablas muestran el resultado del estudio estadístico.
todos los LNH LNH estadio Drecoz LNH estado avanzado
apo n° Med D.std n° Med. D.std. n° Med. D.Std P
Bajo 47 2,111 4,527 14 3,113 3,792 33' 1,520 4,607 0,047
ínter 55 2,765 2,615 18 2,512 1,531 37 2,901 2,973 0,699
Alto 37 3,433 5,723 11 3,637 3,129 26 3,483 6,343 0,415
Total 139 43 96

todos los LNH LNH estadio arecoz LNH estado avanzado

faseS n° Med D.std n° Med. D.std. n° Med. D.Std P
Bajo 47 5,22 2,79 14 5,05 3,58 33 5,41 2,94 0,529
ínter 55 12,06 8,30 18 13,42 9,63 37 12,04 8,01 0,693
Alto 37 17,67 10,97 11 17,36 11,82 26 17,95 10,68 0,803
Total 139 43 96
 73

4.4.6.- Relación entre apoptosis y fase S: en el estudio de regresión

múltiple resultó que apoptosis y fase S estaban relacionadas entre si de modo
significativo. Esta relación se presentaba en especial en los LNH de
localizaciones extranodales, y dentro de éstos en los extranodales de
intermedio y alto grado de malignidad. De todos modos, el coeficiente de
correlación siempre fue inferior al 0,5. Los resultados de muestran en la
siguiente tabla :
Relación entre apoptosis y fase S P
Todos los LNH 0,048
Localización nodal 0,973
Localization extranodal 0,019
Nodal y bajo grado 0,359
Nodal y grado intermedio o alto 0,990
Extranodal y bajo grado 0,216
Extranodal y grado intermedio o alto 0,025

4.4.7.- Supervivencia y tiempo libre de enfermedad estudio

multivaríante: en cuanto al tiempo libre de enfermedad no encontramos
relación significativa con ninguna de las variables incluidas en el estudio
multivaríante que fueron aquellas que presentaban asociación en el estudio
bivaríante.
En cuanto al tiempo de supervivencia los resultados más destacables
se muestran en las siguientes tablas; en ellas aparece el grado de significación
para el pronóstico vital de los enfermos con LNH según la variable de la fila en
función del subgrupo de la columna.
Todos los LNH Local. Nodal Local. Extranodal
Grado histol. < 0,00001 0,0037 0,0172
Locslización ns
Apoptosis ns ns ns (0,08)
Fase S ns ns ns
Respuesta Tto. 0,0004 ns 0,0018
ß-2-microglob. ns 0,0428 ns
a-TNF 0,0488 ns ns
Bajo Grado Grado Intermedio Alto grado
Localización ns ns ns
Apoptosis ns ns ns
Fase S ns ns ns
Respuesta Tto. ns 0,0107 0,0165
ß-2-microglob. ns ns ns
a-TNF ns ns ns
 74

Nodal Bajo Grado Nodal Grado Interni. Nodal Alto Grado

Apoptosis ns 0,0221 ns
FaseS ns ns ns
Respuesta Tto. ns ns ns
ß-2-microglob. ns ns ns
a-TNF ns ns ns
Extranodal Bajo Extranod Intermedio Extranodal Alto
Apoptosis ns ns ns
FaseS ns ns ns
Respuesta Tto. ns 0,0181 0,0212
ß-2-microglob. ns ns ns
a-TNF ns ns ns

A modo de resumen: lo que condicionó la supervivencia en nuestra

serie fue sobre todo el grado histológico de malignidad y también la respuesta
al tratamiento, otro hallazgo interesante resultó que la determinación del TNF al
diagnóstico presenta una relación significativa en cuanto a supervivencia en
esta serie. El tipo histológico mantuvo su significación en las localizaciones
nodal y extranodal mientras que la respuesta al tratamiento sólo se mantuvo
significativa en relación con la supervivencia en la localization extranodal y en
grados intermedios y altos de malignidad. En la localization extranodal el grado
de apoptosis tuvo tendencia a ser significativa en relación con la supervivencia,
mientras que en los nodales la determinación sérica de ß-2-microglobulina al
diagnóstico y la proporción de apoptosis en los nodales de grado intermedio de
malignidad condicionaban la supervivencia.
Los gráficos muestran el tipo de asociación pronostica de las variables
en los subgrupos estudiados:
LNH nodales
_ -i Ur
1 rv*-
C '
U
T ** ^""'^""1
m 8. -•1 »
S I
1
v.-
*• 1
u
r
,6-
• ^ *-i 1 »••••
r A\
V
1 :
grado malignidad
~;|alto
f * •"intermedio
0,O. baj
i !) 20 40 60 60 100 120 " 1¿io °
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)
 75

LNH extranodales
C • "• 1
u ,9- i t 1
m ' ».f.—
,8-
S ,7- ^ • ì
1
u
r
,6- '— ,
v
,5- 1
,4-
v .3-
I gracio malignidad
a
1
,2- T!^ Ito
• iritermedio
,1-
O.QL o hajo
0 1O 20 30 4O 50
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

LNH extranodales

r •i•^
C
u f <K
m ,8-
S
u ,6-
r
v

*
i .4-
v
a respuesta tto
,2- • ••• i
1 • NoRC
O,0, o RC
Ò 1"0 20 30 40 60
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

LNH de grado intermedio

t rr
C
u
i
••¿ *-Sj
m ,8-
S
u ,6-
r
y i----
,4-
v
a respuesta tto
,2-
1 * "•No RC
0,0. o RC
í) 20 40 60 00 100 120 " 1-40
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

LNH alto grado

C
u *• *~~"2j
m ,8- •• j^mmmmmm \

S
u ,6-
r
v
i ,4- m
v
a ,2- respuesta tto
1 "•No RC
0,0. 0 RC
0 10 2O
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)
 76

LNH extranodales grado intermedio

C
u
m ,8- * :
•
• *
s
u .6-
r
v
,4- v

v
a ,2- respuesta tto
1 • •••*
• NoRC
0 0 _L & o RC
(ï ÍO 20 30 40 50
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

LNH extranodales de alto grado

C
u ¿
m ,8-
1
S
u ,& ••

r 9
v :
,4- :
v •
a ,2- : • •• • •
1 • • NoRC
•
00 o RC
1J ÍO 20
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA (MESES)

4.4.8.- Predicción de la respuesta al tratamiento: mediante un

modelo de regresión logística hemos encontrado que en nuestra serie de
pacientes con LNH se puede predecir la respuesta al tratamiento, es decir si el
paciente no conseguirá la remisión completa del LNH con una sensibilidad del
70%, una especificidad del 82%. En nuestra sene el valor predictive positivo es
del 79% y el valor predictive negativo es del 75%. En el modelo la variable
localization extranodal vale 1 y la nodal O, el estadio avanzado vale 1 y el
precoz vale 0. El modelo es el siguiente:
1
% de no respuesta- 49 1 +e
1 + e~(°> ~ 0,84.%/areS +2,16. estadio - 0,17localiz)

La descripción detallada del modelo se expone a continuación

Total mrber of cases: 139 (Unweighted)
Nurber of selected cases: 139
Nutiber of unselected cases: O
Nunber of selected cases: 139
 77

Nutiber rejected because of missing data: 8

Nutber of cases included in the analysis: 131
Dependent Variable Encoding:
Original Interna]
Value Value
,00 0
1,00
Parameter
Value Freq Coding
GKADOCOD
bajo ,00 44 1,000
int-alto 2,00 87 -1,000
LOCALIZ
NODAL ,00 77 1,000
EXTRANODAL 1,00 54 -1,000
ESTADCCD
bajo (I-II) ,00 41 1,000
alto (III-IV) 1,00 90 -1,000

Dependent Variable.. RESPCOD respuesta tto codificada

Beginning Block Number 0. Initial Log Likelihood Function
-2 Log Likelihood 181,41368
* Constant is included in the model.

Classification Table for RESPCOD

Predicted
RC No RC Percent Correct
R l N
Observed H 1 h
PC I 44 I 19 I 69,84%

No RC N l 12 l 56 l 82,35%

Overall 76,34%

Variables in the Equation

Variable B S.E. Wald df Sig R Exp(B)
ESTADCOD(l) -1,0822 ,2471 19,1845 1 ,0000 -,3078 ,3388
EASES -,0843 ,0273 9,5191 1 ,0020 -,2036 ,9192
LOCALIZ(l) ,3849 ,2133 3,2544 1 ,0712 ,0832 1,4694
Constant ,4933 ,3588 1,8902 1 ,1692
Mxlel if Term Removed
Term Log Significance
Removed Likelihood -2 Log LR df of Log LR
 78

ESTMXXD -80,586 22,775 l ,0000

EASES -75,271 12,145 l ,0005
IXXaUZ -70,819 3,240 l ,0719
Variables not in the Equaticn
Residual Chi Square ,815 with 2 df Sig = ,6654
Variable Score df Sig R
APO ,8105 1 ,3680 ,0000
GRADOCOD(l) ,0045 1 ,9467 ,0000

4.4.9.- Ausencia de apoptosis y tiempo libre de enfermedad: 15

muestras de pacientes no mostraron ningún evento positivo para el mareaje de
apoptosis. La técnica fue revisada en todos estos casos para confirmar la
ausencia de problemas en el procedimiento.
De los pacientes que consiguieron la remisión completa de su
enfermedad tras el tratamiento:
a.- entre los pacientes con valores de apoptosis de cero, el 50% presentó
recidiva de la enfermedad con un tiempo medio esperado libre de enfermedad
de 4,19 a 19,4 meses
b.- entre los pacientes con cifras de apoptosis superiores a cero, sólo el 26%
presentó recidiva de la enfermedad con un tiempo libre esperado de 66,6 s 92,6
meses.
Esta diferencia resultó ser significativa con una p=0,0418. Es decir que
los LNH con apoptosis superior a cero en el momento del diagnóstico presentan
un menor porcentaje de recidivas tras el tratamiento y tienen un tiempo libre de
enfermedad más largo.
 79

5.- DISCUSIÓN.

5.1.- Consideraciones previas sobre la serie.

Los resultados se han obtenido sobre una serie de 139 pacientes

diagnosticados de LNH, cuyos datos demográficos, características clínicas y
tipos histológicos son similares a los publicados en otras seríes1"11.
En cuanto al origen de la localization primaria del tumor12'17, destaca
que en nuestra serie la localization primaría extranodal representa un 47,1% de
los casos mientras que la literatura refiere que en Estados Unidos la incidencia
de localization extranodal representa un 26% de los LNH1. Sin embargo, los
grupos de Europa reportan cifras que pueden alcanzar hasta un 50%17'117
En nuestra serie de pacientes además recogimos, según criterios
descritos en la literatura, factores pronósticos como el I PI20'21. También se
recogió información sobre otros que aunque no están incluidos en dicho índice
tienen reconocido valor, como son: la carga tumoral15, ß-2-microglobulina28"31 y
otros descritos recientemente como a-TNF27>118.
También se obtuvieron para la totalidad de LNH y en relación con la
supervivencia unos resultados reproducibles con los publicados por otros
autores.
La concordancia entre la presentación y el comportamiento clínico de
nuestra serie de pacientes con LNH con los datos publicados en otras series
confirma que la nuestra resultó representativa y tenía un comportamiento
pronóstico similar a las publicadas con anterioridad y de modo simultáneo por
otros grupos.
Por último, es de destacar que los pacientes incluidos han recibido un
tratamiento homogéneo, ya que un 88,3% fueron tratados con el mismo
esquema poliquimioterápico. Por otra parte, dicho tratamiento (esquema CHOP)
es la mejor alternativa quimioterápica actual para el LNH18. Así mismo, al valorar
la respuesta al tratamiento obtuvimos un 48,1% de pacientes con remisión
 80

completa; estos resultados son comparables a los obtenidos por otros

grupos18'19.

5.2.- Consideraciones sobre el estudio del contenido de ADN.

Mediante el estudio por citometría de flujo con colorantes que se unen

estequiométricamente al ADN obtuvimos información sobre el contenido en
ADN y el porcentaje de células en fase S. Se han procesado muestras
parafinadas de los bloques utilizados para el diagnóstico del LNH. Esta técnica
está aceptaba como un método válido y fiable para el estudio de la proliferación
celular que ha mostrado concordancia con procedimientos como la
incorporación de timidina trítiada y métodos inmunológicos que identifican Ags
asociados a proliferación celular. En este sentido nuestro grupo, empleando la
misma técnica sobre muestras parafinadas, ha descrito una buena correlación
de los índices de proliferación comparados con técnicas inmunohistoquimicas119
y la proporción de células en fase S cuantificadas por citometría de flujo.
Los índices de proliferación se han mostrado como un fuerte y
consistente factor pronóstico104'120. Sin embargo, la ploidía de ADN aunque se
correlaciona con el grado histológico121 es controvertido su valor pronóstico
independiente112. Además, en las técnicas de citometría con muestras
parafinadas el coeficiente de variación de los picos (en nuestra serie es de
4,9% de media) así como el rango de dicha variación (3,80-7,00) es conocido
que resulta sensiblemente mayor que en los estudios practicados en muestras
en fresco122. Las limitaciones técnicas del estudio de la ploidía de ADN sobre
muestras desparafinadas y la variación de los resultados suponen una fuente
de discordancia de resultados entre diferentes autores y series, por lo que la
ploidía de ADN no es utilizada en nuestra serie como indicador pronóstico. A
pesar de ello, el porcentaje de aneuploidía de ADN en nuestra serie es de un
18% de los casos, la cual es parecida a la encontrada por otros autores un
15%123.
 81

5.3.- Consideraciones de la apoptosis.

En cuanto al número de células en apoptosis marcadas por la técnica

TÚNEL, ya detallada en material y métodos, hay que destacar que nuestros
hallazgos en los controles positivos, considerados como tales los centros
germinales, es de 29,56 (expresado como el cociente de células en apoptosis
sobre el total de células valoradas). Este resultado es similar a los encontrados
por otros autores de un 3,26%, utilizando esta misma técnica123, y parecido al
de otros que realizaron la cuantificación por la identificación de cambios
morfológicos (cuerpos apoptoicos)124 y que resultó del 4,9%. La misma
coincidencia se encontró en el contaje de células en apoptosis en los controles
positivos de las zonas interfoliculares.

5.4.- Apoptosis y grado histológico de malignidad.

En nuestra serie el número de células en apoptosis expresados en

tantos por mil aumenta significativamente (p=0,0007) con los grados
histológicos de malignidad (Bajo grado: 1,99; Intermedio: 2,77; Alto grado:
3,53).
Los valores que obtuvimos en los LNH de bajo grado de malignidad
son similares a los resultados publicados para dicho tipo histológico123'124.
Además, se ha comunicado el hecho de que es significativamente menor el
contaje de apoptosis en los LNH foliculares que en los difusos125. Sin embargo,
nosotros no conocemos ninguna referencia de comparación de apoptosis en los
diferentes tipos histológicos.
Esta diferencia de los valores de apoptosis entre los distintos grados
de malignidad podría estar condicionada porque en los LNH de bajo grado hay
una disminución de apoptosis por una sobreexpresión de bcl-2, que
probablemente está implicada en la patogénesis de este tipo de LNH126.
Aunque en nuestra serie no realizamos estudio de bcl-2, en un trabajo reciente
 82

del grupo de Aftabuddin125 los autores no encontraron diferencias significativas

en la proporción de apoptosis entre casos bcl-2 positivos y negativos.

5.5.- Apoptosis y localizador) de origen del tumor.

Otro hallazgo muy interesante es que la cifra de apoptosis aumentaba

notablemente en los LNH de origen extranodal (3,77) en relación con la
localización nodal (1,97) (p<0,0001). De este hecho no hemos encontrado
ninguna referencia publicada por ningún otro grupo.
Podría pensarse que en nuestra serie, los LNH de localización
extranodal fueran de más alto grado de malignidad y el aumento de número de
apoptosis fuera por este motivo y no por la localización de origen. La
distribución de grados histológicos en cuanto al origen de la localización no
mostró significación estadística, es decir los extranodales no estaban formados
por tumores de más alto grado de malignidad, por lo que podríamos afirmar que
el aumento de apoptosis en la localización extranodal es un hecho
probablemente ligado sólo a la particularidad de dicha localización.
Como se ha sugerido127 que la apoptosis, a nivel individual celular,
depende entre el balance entre señales que promueven o suprimen el
crecimiento de las mismas, consideramos interesante, en nuestro estudio,
comprobar el comportamiento del crecimiento celular en relación con grado
histológico y localización.

5.6.- Proliferación celular y grado histológico.

El porcentaje de células en fase S aumentó significativamente

(<0,00001) con el aumento del grado de malignidad del LNH (bajo grado: 5,30%
; intermedio: 12,49% ; alto grado: 17,781).
Este hecho es similar a los descrito en numerosas
publicaciones42'43'107'1211122 y no solamente aplicando la Working Formulation sino
 83

también utilizando la clasificación de Kiel. Joensuu128 ha encontrado unos

resultados de células en fase S de un 4,8% para los LNH de bajo grado, 11%
para los de intermedio y de 16,1% para los de alto grado, que como se puede
observar, son muy parecidos a los nuestros.

5.7.- Proliferación celular y localization de origen del tumor.

En cuanto a la proliferación celular y localization del tumor, también

objetivamos un aumento significativo (p=0,037) del porcentaje de células en
fase S en los LNH de localization extranodal (12,76%) respecto a los de
localization nodal (10,55%). Al igual que sucedió con la apoptosis no hemos
encontrado referencias publicadas anteriormente que comparen el grado de
proliferation celular en los dos tipos de localization primaría en el LNH.

5.8.- Apoptosis y fase S dentro del mismo tipo histológico

según localization de origen del tumor.

Cuando realizamos el estudio multivaríante para ver cual era el

comportamiento de apoptosis y fase S, dentro del mismo tipo histológico según
fueran de localization nodal o extranodal, encontramos que seguía siendo
significativamente mayor (p=0,001) el número de apoptosis en los LNH de bajo
grado extranodal (3,13) que en su localization nodal (1,72), de igual forma
(p=0,025) en los LNH de grado histológico intermedio de origen extranodal
(3,44) que en nodal (2,10) y perdía la signification estadística en los LNH de
alto grado (p=0,083). De todos modos, en los LNH de alto grado la proporción
de células en apoptosis es mayor en la localization extranodal (4,80) que en la
nodal (2,21).
Los valores del porcentaje de células en fase S, sin embargo no,
mostraron diferencias significativas dentro del mismo tipo histológico según su
localization nodal o extranodal, siendo los resultados muy parecidos dentro de
 84

cada grupo histológico independientemente de la localization en las que debutó

el tumor. Estos hallazgos sugieren que el aumento de la apoptosis en la
localization extranodal es un fenómeno independiente del tipo histológico y
también lo es de la proliferación celular.
Analizando desde otra perspectiva estos comportamientos,
observamos que en la localization extranodal y para un mismo tipo histológico,
aunque no aumenta el porcentaje de células en fase S, aumenta el número de
células que entran en programa de suicidio celular. Si tenemos en cuenta que
el control del número de células cualquier tejido depende del balance entre
proliferación y muerte celular programada129, en la localization extranodal
queda claro que, al menos en este aspecto, el número de células tumorales
disminuiría con el incremento de apoptosis y por tanto este comportamiento
podría considerarse un factor pronóstico favorable.

5.9.- Apoptosis y proliferación celular en relación con el tipo

histológico.

Al intentar explicar los hallazgos de nuestra serie en base a los

conocimientos actuales sobre muerte celular programada, nos encontramos con
la necesidad de tener en cuenta los complejos mecanismos de la regulación de
los fenómenos de la muerte y proliferación celular. Así, al hecho de que
diversas señales pueden actuar suprimiendo o promoviendo la activación del
programa de muerte celular127, se añade que la misma señal puede tener
efectos opuestos en otros tipos celulares130. Esto puede dificultar
interpretaciones simplistas.
El aumento tanto de la apoptosis como de la proliferación en relación
con los tipos histológicos y la buena correlación encontrada con estos dos
parámetros para los distintos grados de malignidad, se puede explicar porque
en sus mecanismos, la proliferación y la muerte celular, están íntimamente
relacionados. Algunos autores sugieren que ambos procesos están acoplados
hasta el punto de considerar una apoptosis como una mitosis aberrante127. De
 85

hecho, los genes que juegan un papel en la regulación de la proliferación

celular como: p53, c-myc, Rb-1, E1A, cyclin D, c-fos y p34 pueden ser
requeridos para mediar en la respuesta apoptoica127. Incluso entre ellos existe
interpelación: así por ejemplo la activación del c-myc puede suponer un estímulo
a la proliferación celular o puesta en marcha de mecanismos de apoptosis en
función de una expresión de p53 disminuida ó aumentada respectivamente.
Esta relación se ha demostrado tanto de manera experimental131 como en un
patrón de comportamiento en vivo en pacientes con neoplasias hematológicas
(similar al del bcl-2)132. A partir de estos hechos se ha confirmado el valor
pronóstico de la sobreexpresión del c-myc en los LNH en relación con la
clasificación histológica de Kiel133. También desde hace tiempo es conocida la
asociación de sobreexpresión de bcl-2 y el relativamente peor pronostico en
LNH de célula grande134, recientemente confirmada en LNH histológicamente
más agresivos135.

5.10.- Apoptosis y proliferación celular en relación con el

origen de localización del tumor.

Otra cuestión de difícil interpretación es el comportamiento del

fenómeno de la muerte y proliferación celular en las localizaciones primarías
extranodales en nuestra sene.
Una hipótesis sobre los mecanismos de la apoptosis es el llamado
"control social"127. Según esta hipótesis las células estarían programadas para
suicidarse y necesitarían continuamente señales de ' las otras células del
entorno para poder sobrevivir. Muchos factores de supervivencia y sus
receptores son conocidos actualmente, pero no lo son los mecanismos de su
activación. En este sentido y para ayudar a elucidar sus bases bioquímicas, es
muy interesante el llamado modelo "cell-free" para la apoptosis136, dónde es
posible reproducir los fenómenos de la apoptosis de manera experimental y
manipularies. De hecho, la mayoría de células normales dependen de factores
ambientales específicos para mantener su viabilidad. Esta dependencia puede
 86

servir para prevenir la supervivencia de las células fuera de su sitio fisiológico.

Se considera que las células metastásicas de una amplia variedad de
neoplasias han sobrepasado estos mecanismos homeostáticos y han
desarrollado algún grado de independencia para los factores de
129
supervivencia . En este sentido, la localization extranodal podría seguir un
patrón de comportamiento parecido en el que seguramente la apoptosis
representaría un mecanismo protector del organismo frente unas células que
han adquirido unas alteraciones genéticas que las predispone para su
proliferación.
Para la confirmación de esta hipótesis, es interesante poder estudiar la
expresión del receptor "lymphocyte homing" (LHR) al que se le imputa uno de
los mecanismos de diseminación en el LNH137. Se han encontrando niveles
significativamente mayores de este receptor en estadios avanzados (III y IV)
que en estadios precoces (I y II) de LNH. Esto podría guardar relación con otro
hallazgo que hemos constatado y que también presenta difícil interpretación. Se
trata que el número de células en apoptosis presentaba una tendencia (p=0,05)
a ser mayor en los pacientes con estadios precoces que en los estadios
avanzados de la enfermedad.
Otra vía por la cual podría estudiarse la hipótesis sobre el peculiar
comportamiento de los LNH de origen extranodal podría ser observar la
expresión del Ag Fas como factor implicado en los programas de suicidio de las
células que lo expresan138, pero sobre todo por su implicación en los
mecanismos de selección negativa en los linfocitos T y, lo que es más
importante todavía, como Ag implicado en el mecanismo de inducción de
apoptosis por las células citotóxicas. También, muy recientemente, el Fas ha
sido detectado en células de línea B inmaduras como mecanismo de
139
apoptosis .
El Ag Fas, también denominado en algún momento APO-1, es una
proteína de membrana perteneciente a la familia de los receptores de tumor
necrosis factor (TNF) y del factor de crecimiento nervioso (NGF) y su estructura
bioquímica sugiere que, además de estar involucrado en los mecanismos de
apoptosis, es un receptor de alguna citoquina desconocida138.
 87

Esta familia de receptores de TNF, además del Fas, incluye receptores

para CD30, CD40, Ox40, CD27, NGRF, PV-T2, PV-A53R, 4-1BB y los TNF-RP,
TNFRI y TNF RII. Se trata de una familia de receptores peculiar por su habilidad
para inducir la muerte programada. Parece bien establecido que inducen
apoptosis por su unión con los ligandos: a-TNF, TNF y FasL140. Entre las
funciones atribuidas a esta familia de receptores podría estar la de la propiedad
de la recirculación (homing receptors)141.
Utilizando un Ac monoclonal de origen murino 7C11 (CD95) es posible
la detección del Ag APO-1/Fas y por tanto localizar las células que lo expresan.
Mediante dicho anticuerpo y por citometría de flujo, recientemente142 se ha
estudiado su expresión en células hematopoyéticas normales y malignas. El
APO-1/Fas se encuentra en el 40% de ios linfocitos T y B periféricos así como
en los monocitos, mientras que sólo se expresa en el 5% de células N K y
timocitos. No se detecta en granulocitos, eritrocitos y plaquetas. El
comportamiento es distinto en las células activadas ya que aproximadamente el
80-90% de éstas (B, T, timocitos y NK) expresan el Ag APO-1/Fas.
Se ha observado que las células T activadas y NK después de 3 horas
de exposición al anticuerpo monoclonal entran en programa de muerte celular.
Recientemente, Robertson y colaboradores han publicado su estudio
sobre la expresión del Ag APO-1/ Fas en enfermedades oncohematológicas.
Sólo en tres de 25 muestras de pacientes con LNH se expresaba este Ag. Esta
frecuencia es mucho menor para otras neoplasias hematológicas. Las células
malignas que lo expresan, al igual que las células activadas, entran en
apoptosis al reaccionar con el anticuerpo monoclonal.
La sobreexpresión de bcl-2, inhibe la apoptosis .inducida a través del
Ag APO-1/Fas. Los tres linfomas de la serie de Robertson que eran positivos
para el APO-1/Fas también poseían el gen quimérico bcl-2. Sin embargo, el
73% de los LNH que contienen dicho gen no expresan el Ag APO-1/Fas. Estos
datos sugieren por una parte que la sobreexpresión del bcl-2 no anularía
completamente la expresión in vivo de APO-1/Fas y por otra que el crecimiento
óptimo del tumor se produciría cuando la falta de función del APO-1/Fas se
complementa con la ganancia de la función bcl-2 en el desarrollo del LNH142. De
esta forma el gen que codifica la proteína APO-1/Fas puede ser considerado un
 88

nuevo tipo de gen supresor, porque la falta de su función interfiere con la

apoptosis y tiende a alargar la supervivencia tanto de los linfocitos activados
normales como de las células neoplásicas.

5.11.- Marcadores tumorales en LNH:a-TNF.

Dentro de los marcadores tumorales clásicos empleados en el

seguimiento de los LNH se han utilizado la determinación sérica de LDH y de la
ß-2-microglobulina, tanto en el momento del diagnóstico como a lo largo de su
evolución.
A nosotros nos pareció interesante analizar, en nuestra serie de
enfermos, el valor de la determinación sérica del a-TNF por su papel pronóstico
como marcador tumoral y por su posible relación con la apoptosis. Nuestro
grupo anteriormente ha descrito que la determinación de a-TNF en el suero, en
el momento del diagnóstico se comporta como un marcador tumoral y que
posee significación pronostica27'118'143.
Sólo a un número reducido de pacientes de nuestra serie (un total de
43) les pudimos realizar la determinación de TNF al diagnóstico. Ello se debe a
que se trata de un estudio prospectivo que se inició con posterioridad al
proyecto sobre muerte y proliferación celular en LNH y por la misma razón son
los de menor tiempo de seguimiento. A pesar de ello, hemos confirmado su
valor como marcador tumoral con una excelente correlación con las
determinaciones de LDH y de ß-2-microglobulina. Igualmente ratificamos su
valor pronóstico como factor independiente y hemos encontrado que presenta
relación con el IPI. Un hallazgo remarcable es su relación con la recidiva de la
enfermedad, en el sentido que a menores valores de TNF al diagnóstico, si
como respuesta al tratamiento consigue la remisión completa, menor posibilidad
de recidiva. Sin embargo, no hemos encontrado relación entre la determinación
sérica de a-TNF y la cuantificación de células en apoptosis y tampoco con el
porcentaje de células en fase S.
 89

5.12.- Apoptosis y proliferación celular en relación con

respuesta al tratamiento.

Uno de los hallazgos que consideramos más importantes fue la

relación entre proliferación y apoptosis con la respuesta al tratamiento. Tanto
uno como otro parámetro tuvieron valores significativamente (p=0,01 y p=0,03)
más altos en los pacientes que consiguieron remisión completa. Sin embargo, la
apoptosis no presentó relación estadísticamente significativa ni con la
predicción de recidiva ni con la supervivencia de los pacientes.
Todos estos hallazgos son parecidos con los encontrados muy
recientemente por Czader123 y colaboradores. En contraposición, Leoncini45
describe una asociación entre aumento de cuerpos apoptoicos y mayor
letalidad del proceso, por lo que sugiere que la apoptosis se comporta como un
factor pronóstico adverso. Lamentablemente, este grupo en su trabajo no ha
estudiado la relación entre apoptosis y respuesta al tratamiento.
En nuestra serie el tiempo de supervivencia presentaba relación
estadísticamente significativa con los índices pronósticos IPI y obviamente con
alguno de los distintos elementos que lo conforman como: estadio de Ann-
Arbor, performance al diagnóstico, etc.
Fue destacable, en relación con el estudio de supervivencia, el
hallazgo de una asociación significativa entre el tiempo de supervivencia y el
porcentaje de células en fase S, el tipo histológico (que estratifica a los
pacientes con LNH en tres grupos de supervivencia) y la respuesta al
tratamiento. Las tres variables mantuvieron su relación significativa en el
estudio multivariante.
Son varios los trabajos que al considerar el valor pronóstico de la
proliferación celular no encuentran asociación con la respuesta al tratamiento32
pero si en cuanto al tiempo de supervivencia32'34'36'120'144. En este sentido, son
interesantes los resultados publicados por Ffrench35. Este autor mediante un
doble mareaje en 76 pacientes no tratados afectos de LNH de célula B, estudia
el porcentaje de fase S, tanto en las células B malignas como en los linfocitos T
reactivos que les acompañan. Este grupo encuentra que la supervivencia de
estos enfermos es mayor si las células malignas tienen una fase S inferior al
 90

4,5% pero sobre todo si las células T reactivas, presentes en el tumor tienen
una fase S superior al 14,5%.
Unos valores en el porcentaje de fase S similares a los que nosotros
encontramos son referidos por Joensuu36 en una serie muy amplia de 490
pacientes. Dicho autor encuentra que la fracción de células en fase S se
correlaciona muy bien con los tipos histológicos del LNH. Pero cuando realiza el
análisis de supervivencia tiene que establecer dos grupos:
1.- aquellos que no se trataron ó solo recibieron tratamiento radioteràpico
(estadios precoces: I y II) en los que la proliferación guarda correlación con la
supervivencia (el punto de corte de fase S es 7,9%) incluso con valor pronóstico
independiente del I PI
2.- aquellos otros que recibieron combinaciones de poliquimioterapia que
incluían ciclofosfamida, vincrisul, prednisona y doxorrubicina (CHOP) en los que
la proporción de fase S no estaba asociada con el pronóstico.
En nuestra serie no ha sido posible realizar la distinción entre pacientes
tratados y no tratados porque la gran mayoría habían recibido tratamiento
poliquimioterápico tipo CHOP.

5.13.- Resistencia a la apoptosis como mecanismo general de

"drug resistance".

Un interés añadido al analizar el fenómeno de la apoptosis y la

proliferación celular tumoral, en relación con la respuesta al tratamiento
quimioterapia), está en la consideración de cuál es el mecanismo mediante el
que finalmente resulta destruida la célula tumoral por las drogas
antineoplásicas. Así como ya es sabido, el primer mecanismo por el cual los
agentes quimioterápicos inducen la muerte celular es a través de la creación de
aberraciones en la fisiología celular que posteriormente inducirá apoptosis. A
parte, algunos derivados de las purinas como la fludarabina y la 2-cloro-2-
deoxiadenosina actúan induciendo directamente la apoptosis en las células B
de la leucemia linfática crónica.
 91

También se ha podido demostrar que la sobreexpresión de bcl-2 o

genes relacionados con él, como bcl-x145, confieren resistencia frente a la
muerte celular en respuesta a fármacos como el Ara-C, metrotexate, vincrísul y
cisplatino. De tal manera, la sobreexpresión de bcl-2 corresponde "in vitro" a un
fenotipo de "multi-drug-resistance"129. Más recientemente se ha podido
constatar que en la leucosis linfática crónica B y en los LNH, las mutaciones del
gen p53 están asociadas con resistencia a drogas. Así mismo, se afirma que la
resistencia a la apoptosis tanto en la leucemia linfática crónica como en el LNH
puede representar un mecanismo general para el "multi-drug-resistance"146.
Algunas otras proteínas como el bax, que forma heterodímeros con el
bcl-2, junto con genes supresores de tumor como Rb y p16 regulan
indudablemente los mecanismos de apoptosis. Así, se conforma con el bcl-2 y
la mutación del p53 un conjunto de oncoproteínas que juegan un papel en las
vías de transducción de señales, mecanismo celular que a su vez es muy
importante en el fenómeno de la resistencia a drogas. De esta manera resulta
explicable el hallazgo de la significativa relación entre apoptosis y respuesta al
tratamiento. Resulta razonable que los pacientes que fueron más sensibles al
tratamiento y obtuvieron la remisión completa sean los que al diagnóstico tiene
mayor índice de muerte celular programada en el tejido tumoral. Desde esta
perspectiva, una reducción muy importante del número de células tumorales en
apoptosis en el momento del diagnóstico se correlaciona con peor respuesta al
tratamiento.
En nuestra serie seleccionamos aquellos casos en los que al
diagnóstico el contaje de células en apoptosis resultó de cero. Se trataba de 15
pacientes, lo que representa un 10,8% del total. Las 15 muestras
correspondientes fueron revisadas junto con los controles, para corroborar la
inexistencia de apoptosis. Incluso revisamos y confirmamos siguiendo la
publicación de Mundle147 que la técnica utilizada de TÚNEL para el mareaje de
apoptosis era la idónea para detectarla.

De entre estos pacientes con apoptosis de O que obtuvieron la remisión

completa tras el tratamiento, el 50% recidivaron con un rango de tiempo libre de
enfermedad de 4,19 a 19,4 meses. Mientras de todos los demás (con
 92

apoptos¡s>0 y remisión completa tras el tratamiento) sólo recidivaron un 26%

con un tiempo libre de enfermedad de 66,6 a 92,6 meses. Esta diferencia es
estadísticamente significativa (p=0,0418), de modo que los LNH con apoptosis
superior a cero en el momento del diagnóstico presentan un menor porcentaje
de recidivas tras el tratamiento y tienen un tiempo libre de enfermedad más
largo. Estos hechos sugieren que niveles muy bajos de apoptosis tienen
repercusión en el mantenimiento de respuesta al tratamiento, incluso cuando
inicialmente se obtuvo la remisión completa.

5.14.- Binomio fase S - apoptosis.

Nuestros resultados muestran que los fenómenos de la proliferación

celular y apoptosis están significativamente relacionados en el global de
pacientes con LNH y en algunos subgrupos. Sin embargo, en ningún caso los
índices de correlación fueron superiores a 0,5. A pesar del valor de la p (0,48),
los gráficos no muestran ninguna tendencia a la relación y los intervalos de
confianza de los valores de a y b en el modelo son tan amplios que
consideramos que la implicación clínica de esta asociación es prácticamente
nula.

5.15.- Supervivencia y apoptosis.

Aunque el número de células tumorales en apoptosis no resultó estar

relacionado de forma estadísticamente significativa con la supervivencia, en los
LNH de Idealización extranodal mostró tendencia a serio. Sin embargo, en
nuestra serie la supervivencia de los pacientes con LNH quedó condicionada
por la respuesta al tratamiento, aunque ésta a su vez ésta está influenciada por
la apoptosis y el grado de proliferación de las células tumorales.
 93

5.16.- Predicción de respuesta al tratamiento:

En nuestra sene ha sido posible construir un modelo que permite

predecir con una buena especificidad y sensibilidad la respuesta al tratamiento.
El modelo incorpora datos referentes al porcentaje de células en fase S, estadio
precoz o avanzado del LNH y localization nodal o extranodal del tumor. En esta
serie el modelo posee un valor predictive positivo y negativo superior al 75%.
Estos hallazgos apuntan hacia la posibilidad de realizar una estimación de la
probabilidad de conseguir la remisión completa con el tratamiento de un
paciente con LNH, para ello sólo es suficiente con disponer información clínica
de fácil obtención como es el estadio y la localization del tumor, y cuantificar el
porcentaje de células en fase S. La determinación sobre tejido desparafinado
de la proliferación celular es una técnica tediosa y larga, sin embargo, las
determinaciones sobre muestra fresca es una técnica sencilla y muy rápida
(aproximadamente media hora).
De todos modos, la aplicación de modelos de predicción evolutiva en
pacientes, consideramos debe ser considerada sólo como information adicional
a la cohorte de pruebas diagnósticas que se realizan en el estudio del paciente.
 94

6.- RESUMEN.

Los linfornas no Hodgkinianos (LNH) son una compleja proliferación

neoplásica a partir del tejido linfoide que agrupan a más de una docena de
procesos, pero dónde cada uno presenta particularidades clínicas y biológicas
que le confieren personalidad4. El estudio de nuevos factores que ayuden a la
comprensión de la enfermedad y que presenten relación con parámetros
diagnósticos y pronósticos en los pacientes con linfoma es una de los temas de
investigación en oncohematología al que numerosos grupos dedican sus
esfuerzos. Se ha sugerido que la proliferación y muerte celular en estos
procesos varía de un tipo a otro y que estos parámetros y su balance podrían
tener importantes implicaciones diagnósticas y pronosticas12.
El objetivo del presente trabajo es estudiar la muerte celular
programada o apoptosis y la proliferación celular de las células tumorales en ei
momento en que se realizó el diagnóstico de pacientes con linfoma y en grupos
homogéneos de los mismos, y analizar si existen diferencias entre las distintas
entidades clínico-histológicas, presentan relación con parámetros pronósticos
clásicos (estadio, ECOG, marcadores tumorales, Indice pronóstico
20121
Internacional) , y poseen valor pronóstico en cuanto tipo de respuesta al
tratamiento, tiempo de supervivencia, recaída y tiempo libre de enfermedad.
Hemos estudiado una serie de 139 pacientes diagnosticados de
linfoma no Hodgkiniano y que abarca un período de tiempo desde 1975 a 1995.
Los datos clínicos, histológicos y pronósticos de nuestro grupo de pacientes se
han obtenido del archivo de diagnósticos y de las historias clínicas del Servicio
de Hematología del Hospital Universitario Arnau de Vilanova y resultaron
similares a los de otras series publicadas. Los pacientes han recibido
tratamiento según criterios uniformes y en todos los que se indicó tratamiento
poliquimioterápico se administró siguiendo el esquema CHOP18.
De cada enfermos se ha elaborado una hoja de recogida de datos con
las siguientes variables: demográficas (número de historia, nombre, edad sexo),
presentación clínica (fecha de diagnóstico con tipo de diagnóstico histológico y
 95

clasificación del (inforna según la Working Formulation, afectación extranodal,

síntomas B, ECOG, tamaño del tumor y estadio) marcadores tumorales (LDH, ß-
2-microglobulina, TNF-a y ferritina; los valores se han expresado como ratio que
es el cociente entre el valor obtenido del paciente y el limite superior de la
normalidad para nuestro laboratorio según cada fecha), respuesta y tolerancia
al tratamiento (remisión) y pronóstico (tiempo libre de enfermedad y de
supervivencia). Además se ha cuantificado la proporción de células en
apoptosis y el porcentaje de células en fase S. El estudio de proliferación y
muerte celular se ha realizado sobre el tejido obtenido al diagnóstico y sobre el
cuál se realizó el diagnóstico anatomopatológico de linfoma y que como se ha
enunciado comportó: cuantificación de la proporción de células en apoptosis por
medio de una técnica de inmunohistoquímica basada en la reacción
TÚNEL115'116 y contaje del porcentaje de células en fase S mediante citometría
de flujo sobre una suspensión de células obtenidas de tejido
104 106
desparafinado ' .
Tanto la apoptosis como la fracción de proliferación fueron
significativamente superiores cuanto mayor fue el grado de malignidad
histológico del tumor. También ambas fueron significativamente superiores en
los linfomas que afectaban localizaciones extranodales que en los que tenían
afectación exclusivamente nodal.
En cada uno de los grupos de malignidad histológica de linfoma, la
apoptosis seguía siendo mayor en las muestras de pacientes con afectación
extranodal, sin embargo, esta circunstancia no se cumplía para la fase S. Ello
pone de manifiesto un comportamiento diferente del fenómeno de la apoptosis
en los tumores linfoides de localizador) extranodal, independiente del tipo
histológico y del grado de proliferación. La apoptosis representaría un
mecanismo defensivo del organismo frente a unas células con alteraciones
genéticas que están predispuestas a una proliferación anormal y que han
conseguido sobrepasar los mecanismos homeostáticos para anidar y mantener
su viabilidad fuera de sus lugares fisiológicos129. Se ha sugerido que la
apoptosis podría guardar relación con el "lymphocyte homing receptor" que es
un factor involucrado en la diseminación de los linfomas no Hodgkinianos137. El
"lymphocyte homing receptor" se encuentra disminuido en estadios precoces (I
 96

y il), donde también se encuentra un aumento significativo de la apoptosis. Un

tema interesante es el investigar el comportamiento del Ag APO-1/Fas,
implicado en los mecanismos de muerte celular programada y probablemente
relacionado con el receptor de recirculación o "lymphocyte homing receptor*141.
El valor de a-TNF, conocido inductor de apoptosis, determinados en
el suero en el momento del diagnóstico se correlacionó con las cifras de otros
marcadores tumorales en LNH como ß-2-microglobulina y LDH. Presenta
relación significativa con el índice Pronóstico Internacional como factor
independiente. Sin embargo, no se correlacionó con la proporción de células en
apoptosis en el momento del diagnóstico.
Hemos encontrado que valores altos de apoptosis y fase S se
relacionan con buena respuesta al tratamiento (objetivada por la obtención de
remisión completa), mientras que valores muy bajos de apoptosis condicionaron
un mayor porcentaje de recidivas y más precoces de modo significativamente
estadístico. Estos hallazgos podrían sugerir que la resistencia a la apoptosis
representa un mecanismo general para la expresión del fenómeno de
resistencia múltiple a drogas146.
Destacar que las cifras de apoptosis no presentaron relación
estadísticamente significativa con la supervivencia ni tampoco con el tiempo
libre de enfermedad para la globalidad de pacientes de nuestra serie de
linfoma. Sin embargo, tiene tendencia a presentar relación pronostica en cuanto
a supervivencia de los tumores con afectación extranodal al momento del
diagnóstico.
Por último, la supervivencia y el tiempo libre de enfermedad se
relacionaron con los tipos histológicos y con el índice Pronóstico Internacional.
Así mismo, la supervivencia se relacionó con el porcentaje de células en fase S
y sobre todo con una buena respuesta al tratamiento marcada por la obtención
de remisión completa. Los dos parámetros entre sí están significativamente
relacionados en la globalidad de los linfomas de nuestra serie, pero de modo
destacado en los que se presentaron con afectación extranodal.
 ie
n Lleida
Registre Generai

Departament de Medicina
Facultat de Medicina
Universitat de Lleida

ESTUDIO DE LA APOPTOSIS Y PROLIFERACIÓN CELULAR

EN LOS LINFOMAS NO HODGKINIANOS. VALOR

DIAGNOSTICO Y PRONOSTICO.

ii
x/

Tesis realizada por:

Josep Macià i Virgili
para optar al grado de
Doctor en Medicina y
Cirugía
Lleida, 1996.
 97

7.- CONCLUSIONES.

7.1.- La proporción de células en apoptosis aumenta con el grado de

malignidad del linfoma. Los linfomas de bajo grado poseen menor proporción de
células en apoptosis que los de grado intermedio, y éstos que los de alto grado.
Los linfomas extranodales presentan cifras superiores de apoptosis que los
linfomas de origen nodal.
7.2.- La proliferación celular tumoral, medida por el porcentaje de
células en fase S, es significativamente superior en los linfomas de grado
intermedio que en los de bajo grado, y en los de alto grado que en los de grado
intermedio. Los intervalos de confianza para cada grupo no presentan
entrecruzamiento. Los linfomas de localization extranodal tienen una
proliferación celular mayor que los de localization nodal.
7.3.- El aumento de la apoptosis en los linfomas de localization
extranodal es un fenómeno independiente del tipo histológico y de la
proliferation celular. En los linfomas de localization extranodal, y para un
mismo tipo histológico, el aumento de la proporción de células en apoptosis no
está relacionado con un aumento en el porcentaje de células en proliferation..
7.4.- Ni los valores de apoptosis ni el porcentaje de células en fase S
en el momento del diagnóstico se correlacionan con los índices pronósticos
utilizados habitualmente en los patientes con linfoma, como son el IPI y los
parámetros involucrados en su cálculo. Sin embargo, las afras de apoptosis
tienen tendencia a ser superiores en los estadios precoces de la enfermedad
(estadio I y II de Ann-Arbor).
7.5.- La determination sérica de a-TNF se comporta como un buen
marcador tumoral en los linfomas. Presenta una excelente correlation con los
marcadores clásicos de la enfermedad (LDH y ß-2-microglobulina) y posee valor
predictive de recidiva. Sin embargo, las cifras de TNF no guardan relation con
el fenómeno de muerte o proliferation celular.
7.6.- Tanto la cuantificación de la apoptosis como el porcentaje de fase
S de las muestras diagnósticas de linfoma son inferiores en los patientes que
 98

no alcanzaron la remisión completa tras el tratamiento. En aquellos pacientes

que alcanzaron la remisión completa, una disminución de la apoptosis se asocia
a un mayor porcentaje de recidivas y un menor tiempo libre de enfermedad. La
resistencia a la apoptosis podría ser un mecanismo de resistencia al
tratamiento.
7.7.- Las cifras de apoptosis en el momento del diagnóstico no se
correlacionan con la supervivencia de los pacientes afectos de linfoma. Sin
embargo, en los pacientes con linfomas de origen extranodal se aprecia una
tendencia a dicha asociación .
7.8.- La supervivencia de los pacientes afectos de linfoma se asocia
de modo significativamente estadístico con los valores del índice Pronóstico
Internacional, el tipo histológico, el porcentaje de células en fase S y la
respuesta al tratamiento (obtención de remisión completa).
7.9.- El estudio de la interacción entre la apoptosis y proliferación
celular no se comporta como un factor independiente predictor de
supervivencia. Sin embargo, la supervivencia de los pacientes con linfoma está
relacionada con la proporción de células en fase S y con la respuesta al
tratamiento. La apoptosis puede influir en la supervivencia de estos enfermos
por su relación con la respuesta al tratamiento en los linfomas.
7.10.- Un modelo que contempla, en el momento del diagnóstico, el
porcentaje de células en fase S, el estadio precoz o avanzado, y la localization
nodal o extranodal del tumor, permite predecir con buena sensibilidad,
especificidad y valores prédictives la respuesta al tratamiento (obtención de
remisión completa o remisión parcial/ausencia de respuesta).
 99

8.- ANEXO I: hoja de recogida de datos:

FACTORES PRONÓSTICOS LNH. ÍNDICE INTERNACIONAL*. NQ orden:

Nombre: NSHC: Bloque AP:

Fecha Dx: Dx HAV:|_Jno Fecha revisión:

CH ,
AP: tejido Grado:i_ bajo IMF: LJB
L_
~ medio QJ T
alto FI no

índice índice
interno edad-indpt
Sexo: (~~| hombre Edad: [U=<60 a.
r~|mujer CJ. 60 a. >n
»i i
Respuesta del paciente al tumor:

Síntomas B:d|no ECOG, PERFORMANCE:

Q si no síntomas ~-__^ I—i manejo
fiebre recurre 38-38, 3SC SÍnt sin cama"" 1—' ambulatorio
sudoración nocturna cama <50% --•
pérdida peso >10% ~~ cama =>50% ~^z> [~~] manejo no -— i—i
u >l—1
>
LJ
~cama 100%---" ~~ ambulatorio

Reserva medular: SR SB Megas

Crecimiento tumoral y potencial in vas ivo.

i
Tamaño tumor mayor: LJ<10cm Est adió An n Arbor: Ql-II
cm [^j>10cm

Lugares de afectación extranodal

na -^

n uraero
GIII-IV

total
n
LJ >n
>
LJf

MO
TGI
Hígado
Pulmón
_ SNC
[jBazo
nD DO-I
-.-11
-
>
>i—i
u

Dosificaciones biológicas:

LDH: Ratio: ^\— =<1 2

LJ ' n n
i i >n
1 ii
B-2-fn: RatioQ
'
TOTAL TOTAL
Alfa-TNF: RatioQ /alor/limlte superior

Rat io n p
^

Ferritina:

índices biológicos de prolife ración celui ar: 0-1 bajo 0 bajo

2 bajo int bajo int
3 alt int alt int
DNA: aneuploidía: lino
n sí
% fase S:
IDNAj^
irn 4-5 alto alto i
j
j
í
!
PCNA: % positividad

Ki-67: % positividad i

A predectlve model for agressive non Hodgkin's lymphoma. Shlpp et al. N Entjl J Med
 100

Respuesta y tolerancia al tratamiento:

Tipo de tratamiento: ¡ JPQX
JRTX
"PQX+RTX
Fecha inicio del Tto (en su defecto la del diagnostico) :

Fecha finalización del Tto (o en su derecto de evaluación a la fin del Tto)

Tolerancia al Tto: .—.

clínica: rjbuena biológica: granulopenia:L_jno ef. tóxicos: |Jno
j^Jmala I I si ["[si
sdme febril: PJ no
—I II s-*-
Respuesta al Tto inicial: _J RC (desaparición síntomas clínicos, normalización biológica y Rx)
I RP (desaparición algunos síntomas o alt biológica o Rx)
^JNo Respuesta

Recaida: no
si, con fecha:
fecha última reevaluación o visita:

:ia::|[ I| vivo
Supervivencia vi>
(muerto, con fecha:
fjmui por causa del linfoma: |_ |no

T de supervivencia (meses): desde inicio de Tto o Tecna de «uerte o ulti»a visita

T libre de enfermedad (meses): desde Tin de Tto a fecha de recaída, »uerle a úitipa visita

T de seguimiento (meses): flesde Tecna diagnostica a fecna de nuerte o ùltima visita.

Pospuesta biológica:

1/2 Tto Fin Tto

Total Ratio Total Ratio
LDH
B-2-m
Alfa-TNF
Ferritina
 101

9.-ANEXO II: fotografías.

A.- Controles de tinción de apoptosis.

Imágenes microscópicas de controles positivos y negativos para la determinación de
células en apoptosis. A la derecha se muestran x4 (arriba) y x10 (abajo) los controles
positivos; a la izquierda se muestran los negativos. Obsérvese la diferencia entre la
proporción de células en apoptosis de los centros germinales y la zona interfolicular.
 102

B.- Fotografías de células en apoptosis.

Arriba: ejemplo del resultado de la técnica ¡nmunocitoquímica para la detección de
apoptosis mediante la reacción TÚNEL. La célula con el núcleo positivo es una célula en
apoptosis. Obsérvese la buena discriminación entre el evento positivo y el resto de
células negativas para la tinción.
Abajo: en la foto inferior se observa otra célula en apoptosis (derecha) que se
discrimina muy bien del fondo rojizo. A la izquierda, junto a una célula en apoptosis se
observa un macròfago que aparece inespecíficamente como positivo y que no se ha
contado como evento en apoptosis.

I t
 103

C.- Apoptosis y (inforna.

Arriba: imagen de un LNH folicular en el que no se aprecian células en apoptosis.
Abajo: fotografía de detalle de un LNH con un elevado número de células en apoptosis.
 104

D.- Apoptosis y linfoma.

Arriba: fotografia de un LNH extranodal en el que se observa una célula positiva para
apoptosis en una vellosidad intestinal (derecha) y una fotografía del mismo tumor a bajo
aumento en la que se observa una infiltración linfomatosa manifiesta (izquierda).
Abajo: LNH ovarico con un alto número de células en apoptosis.
 105

10.- ANEXO III: histogramas de ADN.

A,- Histogramas de AND obtenidos por crtometría de flujo.

Arriba: Ejemplo de LNH diploide y bajo porcentaje de células en fase.
Abajo: En la foto inferior se muestra un detalle del ajuste del programa al histograma y
cómo se realiza el cálculo de las áreas y porcentajes de células en fase GOG1, S y G2M
1382.HSI FL3 83-2128
12DOO CVCLE

DATA

1OOOO
Itoan 61= 42.1
CU Gl « 3.6

8000 X 61 = 94.B

ttean 62= 82.7

6OOO
CU 62 = 3.7
x C2 * 1.7
<U
4OOO
X S =4.3

SODO
62/61 =1.965

33 64 SE 138 1BO 132 224 B56

Chi Sq.= 31.1
FL3

r
IBOO ™ «"•>••»» " "»-»» CQJ. CTCIE

I DATA
14OO
I
i Mean 61= 44.3
1200 Ol 61 = 2.9
i
OJ X 61 = 94.4
o
g 1000

Hean 62= 87.1

BOO
1 CU 62 = 2.5
1 X 62 = 1.2
g BOO

•
; ij|

X S =4.3
4OO
P
a!3

J 62/61 =1.967
EOO i
( Ì^
iff**'" IP y\
a
20 4O
m Vffi/ssJffiffitiffiififfl^S^y»^
BO BO
mm
1OO
,^T .
ISO 14O
Chi 8,.= 12.6
KL3
 106

B.- Histogramas de ADN. Muestras de (inforna.

Arriba y abajo: LNH con elevados índices de proliferación.

968.KSI FL3 85-4117

1OOQO CÏCLE

DATA

BDOD He«! 61= 43.8

CU 61 = 3.2
IH
<U x 61 = 67.B
X)
BDOD

Mean 62= 85.5

CU CZ = 3.5

4000 X GZ = 7.4
(U
ü
x S = 24.8

SODO
G2/G1 =1.964

32 64 SB las lEO 132 224 256

Chi Sq.= 12.6
KL3

8Z6.HST FL3 88-2811

56OD CELL CYCLE

MIA

4BOO
Hean 61= 47.6

CU 61 = 4.5
Ci 4OOO
X Gì = 68.8

3200
Mean 62= 93.1

CU C2 = 4.7
_, H400
X GZ = 4.4
QJ
ü
1BOD X S = 34.8

BOO Q2XG1 =1.955

3a 64 96 128 IBO 198 224 256

Chi Sq.= 68.1
FL3
 107

C.- Ejemplos de muestras de LNH con aneuploidia de ADN.

Amba: histograma con una muestra aneuploide.
Abajo: histograma con una muestra tetraploide.

34QQ .HST

Itoan 61= 43.3

CU 61 = 3.5
5600 , X 61 = 99.5
Hnn 62= 86.2
CU GZ = 3.4
48OO x 62 = .5
x S = .8
<ü
A 4OOO j G2/G1 =1.989
X Tot = 33.7

Z 3EOO MŒUPL. CVCLK

hean 61= 51.7
CU Gl = 3.4
24OO X 61 = 85.4
ü HCMMI 62=182.7
CU 62 = 3.4
1EOO ||
I?
X GZ = 1.4
GB x S = 13.2
BOO AH GZSG1 =1.986
X Tot
: jèji:
w
*
mB 66.3
D.I. ==1.193
o i¡
3B G4 96 128 1GO 133 356
FL3 Chi Sq.= 6.1

32QO 1134.HST rt3 85-134 DIPLOID CYCLE

Hran 61= 42.7

i , CU 61 = 4.1
aeOO J X 61 = 96.5
i ttoan 62= 84.1
i CU 62 = 4.1
24OD 1 7 XG2 7= .8
x S = 3.5
0)
A 200O G2/G1 =1.972
X Tot = 38.4

Z ftNEUPL. CVCLE
16OO 1
«—4
m
^
Hran 61= 88.8
CU Gl = 4.1
(U 12DO 1 X 61 = 81.7
ü Haan 62=173.1
BOO
•
ï CU G2 = 4.1
X GZ = 3 . 8
X S = 15.3
g
ïí GZ^Gl =1.968
4OO i
k
B X Tot = 69.6
D.I. =2.861
A
M
O 32 64 96 138 16O 193 224 356
FL3 Chi Sq.= 5.6
 108

11.- ANEXO IV: base de datos.

NUM nombre n°HC N" bloque AP fecha sexo edad origen grado IMF
diagnóstico LNH malignidad
1 ABIAA 258904 93.193 29.03.1993 mujer 71 NODAL medio B
2 ATYTr 154078 93.439 28.01.1993 hombre 68 NODAL alto T
3 AITYE 171468 94.3141 08.07.1994 mujer 41 NODAL bajo B
4 AABEP 264047 94.4350 15.01.1994 hambre 65 NODAL medio B
5 AAENT 253501 89.1213 02.05.1989 mujer 71 EXTRA bajo B
6 AAçAP 182813 85.2881 28.08.1985 mujer 64 NODAL bajo B
7 ANTAA 212237 91.1428 02.05.1991 hombre 82 EXTRA medio B
8 APAN 134492 94.4073/4074 13.09.1994 hombre 62 EXTRA alto B
9 APBON 137207 89.1918 25.07.1989 mujer 57 EXTRA bajo B
10 APETT 169803 86.1595 15.05.1986 mujer 64 NODAL medio B
11 BAVEP 205278 90.2021 09.08.1990 mujer 67 EXTRA alto T
12 BAPAE 346472 94.2611 08.06.1994 mujer 84 EXTRA medio B
13 BAPIO 195897 91.112 06.08.1991 mujer 51 NODAL bajo B
14 BATAA 217828 87.1423 09.07.1987 hombre 68 EXTRA medio B
15 BEAAM 263682 89.2772 15.11.1989 mujer 53 EXTRA medio B
16 BEAAM 258634 94.5520 22.12.1994 mujer 81 NODAL bajo noBnoT
17 BAYAE 207675 87.1430 15.07.1987 mujer 86 NODAL alto B
18 BEPNI 251396 89.8958 20.03.1989 hombre 79 EXTRA medio B
19 BETPA 252189 93.22522007 03.06.1993 hombre 67 EXTRA atto B
20 BAANX 64769 93.1111 22.11.1993 mujer 44 NODAL alto B
21 BON8O 147638 83.1942 18.08.1983 hombre 55 EXTRA medio B
22 BOPAA 251923 93.178 18.01.1993 hombre 50 NODAL medio B
23 BPANA 2892 91.2869 09.10.1991 mujer 58 NODAL medio B
24 XABEX 348511 94.3473 01.07.1994 mujer 62 NODAL bajo B
25 XAMAP 162213 94.3139 02.07.1994 nombre 69 EXTRA medio B
26 XAMTK 116059 94.1434 25.03.1994 hombre 66 EXTRA atto T
27 XANO 31982 92.319 15.12.1991 mujer 64 EXTRA bajo B
28,A XAITAE 157492 82.1524 15.07.1982 mujer 36 NODAL bajo B
28,B XAIÏAE 157492 92.2631 13.08.1992 mujer 47 NODAL atto B
29 XAIIEA 71150 75.84 14.02.1975 nombre 85 NODAL bajo B
30 MANYE 348249 94.E.1032 05.07.1994 hombre 52 NODAL medio B
31 XAPAE 345227 94.496 HP 02.05.1994 hombre 62 EXTRA atto B
32 XAEAN 88548 88.2952 15.11.1988 hombre 55 NODAL bajo B
33 XA2ES 139624 83.2128 01.09.1983 hombre 50 NODAL medio B
34 XA2OA 174909 89.449 03.03.1989 hombre 73 NODAL bajo B
35 XAETP 139137 93.4621 18.11.1993 hombre 72 EXTRA medio B
36 XATAA 161155 89.3037 11.12.1989 mujer 67 NODAL bajo B
37 XHAXO 49936 89.2388 28.09.1989 hombre 67 NODAL atto T
38 XINTO 177488 85.2444 29.07.1985 mujer 50 NODAL medio B
40 XONAO 151056 90.276 15.02.1990 mujer 66 EXTRA medio B
41 XOSX 54878 90.1312 31.05.1990 hombre 70 EXTRA bajo B
42 AEAP 1408 88.427 15.02.1988 mujer 63 NODAL bajo T
43 AIAZ 152214 83.2730 15.12.1983 hombre 46 NODAL bajo B
44 AIAZ 131681 86.1538 15.06.1986 hombre 30 NODAL atto T
45 ESniN 150918 84.3234 15.12.1984 mujer 69 NODAL bajo B
46 0>APO 317659 04.121992 mujer 75 NODAL bajo B
47 0>APPE 78376 93.2631 15.06.1993 hombre 63 EXTRA medio
48 0APPE 212474 92.3513/4128 15.11.1992 hombre 64 EXTRA medio
49 OAPPE 319310 93.219/3441 15.01.1993 hombre 73 EXTRA bajo B
50 «WE1SA 312018 92.2401 15.07.1992 mujer 54 NODAL medio B
51 «>EPNA 242882 93.3486/3489 20.08.1993 hombre 17 NODAL atto B
52 OAOPE 344728 94.2226 17.05.1994 mujer 59 EXTRA bajo B
53 4>PEE 188639 93.3132 14.07.1993 tambre 78 NODAL bajo B
 109

54 FAAAE 80752 91.3927 10.12.1991 mujer 69 NODAL alto B

55 FAPXI 187758 93.2509 18.06.1993 hombre 72 EXTRA alto B
56 FAPXl 127779 82.42 11.01.1982 mujer 74 NODAL atto B
57 FATEY 195657 86.1060 13.05.1986 hombre 77 EXTRA medio (

58 FOMEZ 135800 88.812 10.03.1988 mujer 28 EXTRA medio B

59 FONZA 235071 88.1235 18.05.1988 mujer 80 EXTRA atto T
60 FOPAI 333173 93.793 hp 15.09.1993 mujer 64 EXTRA medio noBnoT
61 FOPFY 106507 79.1872 17.10.1979 hombre 76 NODAL bajo B
62 FOYS 261185 94.2083 09.05.1994 mujer 74 NODAL bajo B
63 FPAXI 62224 89.3012 13.11.1989 hombre 60 EXTRA atto B
64 FYIY 131778 90.478 15.02.1990 hombre 81 EXTRA medio f

65 HAPO 13309 89.1273 15.03.1989 mujer S3 NODAL bajo B

66 HEPEA 221116 88.460 07.07.1988 hombre 52 EXTRA medio t

67 HEFNA 125613 81.2014 22.12.1981 mujer 64 NODAL medio t

68 HYFYE 53487 79,963 31.05.1979 mujer 43 NODAL medio B

70 IFAES 77467 76.532 15.10.1976 hombre 57 NODAL bajo B
71 IAAA 141944 92.3684 13.11.1992 hombre 43 EXTRA medio noBnoT
72 SOPAA 202725 86.2060 09.09.1986 hombre 65 NODAL medio B
73 8OçE 107509 92.741 hp 15.08.1992 mujer 73 NODAL medio B
74 AOHEZ 346492 94.3068 07.07.1994 hombre 64 NODAL medio T
75 AY0YE 207713 92.1947 01.06.1992 mujer 72 NODAL atto B
76 AAA4D 132803 88.1502 15.12.1988 hombre 58 EXTRA bajo T
77 AAOn 291549 91.2120 01.07.1991 hombre 77 NODAL medio T
79 AAOSA 347131 94.2719 01.07.1994 hombre 76 NODAL bajo T
81 MAPXO 138571 94.121 E 04.08.1994 mujer 73 NODAL medio B
82 MAPIN 20801 91.1374 31.05.1991 hombre 66 EXTRA atto T
83 MAPTI 85808 77.377/456 07.05.1977 hombre 40 NODAL alto T
84 MAPTI 222146 88.2011 07.07.1888 mujer 63 EXTRA medio B
85 MAPTI 34478 89.1042 25.04.1989 mujer 43 EXTRA medio B
86 MASSÓ 174079 85.515 01.05.1985 mujer 60 NODAL bajo B
87 MATOS 107489 85.134 11.01.1985 hombre 76 NODAL alto B
88 MAZAP 196529 86.1209 15.05.1986 mujer 71 NODAL bajo f

89 MENAE 217373 87.1480 09.07.1987 hombre 24 NODAL atto T

90 MffAç 106092 92.3134 24.09.1992 hombre 85 NODAL medio B
91 MOFA 254167 89.1395 15.05.1989 mujer 60 NODAL bajo B
92 MOAEP 328561 93.2474 14.06.1993 hombre 78 NODAL medio B
93 MOAIN 275359 91.19 04.01.1991 mujer 71 NODAL bajo T
94 MONXA 310446 92.2295 15.07.1992 hombre 87 NODAL atto B
0 NFfBO 171957 89.1438 02.06.1989 hombre 56 NODAL bajo B
96 NOPIA 160826 90.2681 25.10.1990 hombre 48 NODAL bajo B
97 OAMO 353554 94.449675181 15.10.1994 hombre 81 EXTRA medio B
98 OSSET 194480 86.1189 26.05.1986 hombre 15 EXTRA atto B
99 HA8AP 17684 94.847 18.07.1994 mujer 70 EXTRA bajo B
100 nAMIE 312269 92.2741 26.08.1992 hombre 59 EXTRA atto B
101 FÍANAç 211067 88.320 15.03.1987 hombre 69 NODAL atto B
102 IIASXY 30641 93.3624 29.09.1993 hombre 76 NODAL bajo B
103 DEPON 125580 81.2039 19.11.1981 hombre 71 NODAL atto B
104 IIAAP 161964 88.2444 21.10.1985 hombre 62 NODAL medio B
105.C nONXE 251979 92.1724 21.05.1992 mujer 43 NODAL medio B
108 ITYETO 180948 85.2521 05.08.1985 hombre 52 EXTRA bajo B
109 rmr 14737 90.2159 15.08.1990 mujer 59 NODAL bajo B
110 mrppo 158468 94.3495 18.08.1994 hombre 76 NODAL atto B
111 0YEIA 26598 84.1227/2085 04.08.1984 mujer 65 EXTRA atto B
112 0Y1AE 102821 91.1849 29.05.1991 hombre 76 NODAL medio B
113 PABAS 298846 91.3454 15.10.1991 mujer 74 EXTRA medio B
114 POXA 48804 86.2452 23.10.1986 lambre 54 EXTRA atto T
115 POE B 216293 85.2530 07.08.1985 mujer 58 NODAL medio T
116 POS X 266905 91.2605 15,08.1991 mujer 65 EXTRA alto B
117 POAAA 23311 94.4193 30.12.1993 mujer 62 EXTRA bajo T
118 SÀBAT 165130 93.3257/3258 15.08.1993 hombre 75 NODAL bajo B
119 SAAAA 265566 93.3795 27.09.1993 mujer 69 NODAL medio B
120 SANXH 94476 92.2696 05.08.1992 lotnbre 50 EXTRA bajo B
 110

121 SANTA 31912 94.3896 02.09.1994 hombre 70 NODAL medio B

123 EEBAZ 324267 93.1387 22.03.1993 mujer 33 NODAL alto T
124 ZEPPA 98153 85.186 18.01.1985 hombre 52 EXTRA alto B
125 ZEPPA 79329 76.650 14.10.1976 hombre 48 EXTRA medio B
126 LOAA 225156 89.1578 15.06.1989 hombre"1 79 EXTRA medio B
127 EOAAE 170383 94.602 01.02.1994 hombre 62 NODAL bajo B
128 EOAE 292241 91.3924 15.01.1992 mujer 67 EXTRA medio B
129 TEAAO 186140 86.2522 29.10.1986 mujer 46 NODAL medio B
130 TEPYE 4202 83.1039 22.04.1983 mujer 59 NODAL medio B
131 TOAO 167034 92.726 15.03.1992 hombre 74 EXTRA j alto T
132 TOPPE ! 252636 89.1292 15.05.1989 hombre 37 EXTRA medio B
133 A TPEIÏA 15195 77.172 15.01.1977 hombre 59 NODAL bajo B
134 TYPMO 221694 90.2679 25.10.1990 hombre 48 EXTRA bajo B
135 YTTE 149333 83.2502/2444 15.10.1983 mujer 65 NODAL medio
136 YTTE2 149333 88.2800 15.05.1988 mujer 65 EXTRA bajo
137 cAAAE 322578 93.1693 15.01.1993 mujer 71 EXTRA alto B
138 cIAAA 116242 88.91 15.07.1991 hombre 72 NODAL bajo B
139 çIAAA 212896 93.1675 17.05.1993 hombre 75 EXTRA medio B
140 çIAAA 7755 86.869 15.05.1986 mujer 55 NODAL alto B
141 çIAAA 99387 78.1912 05.01.1979 hombre 74 NODAL medio B
142 çIAAA 20758 94.4122 22.09.1994 hombre 33 EXTRA medio B
143 cIYZ 131704 94.623 20.06.1994 hombre 78 NODAL bajo B
144 •J'ESTE 70811 85.4117 15.12.1985 mujer 27 EXTRA alto B
145 ZAAAO 301507 92.1208 06.04.1992 mujer 82 NODAL bajo B

NUM N' ECOG tamario estadio n° zonas rat» ratio b- ratto rat» Indice %fase
síntB extranod LDH 2-m TNF ferr ADN S
1 uno IV 12,0 IV 2 3,06 1,62 4,81 1,90 9,90
2 uno II 1,5 IV 2 ,85 7,32 3,55 3,11 1,00 1,90
3 NO 0 4,0 1 0 ,50 ,73 ,44 ,05 1,00 4,90
4 uno II 7,0 IV 2 1,61 1,97 4,12 2,52 1,00 32,70
5 NO II 6,0 IV 3 ,90 4,63 ( ,20 1,00 2,60
6 dos II 12,0 IV 2 2,01 1,00 4,40
7 NO III 4,0 IV 2 3,62 3,66 9,30 ,49 1,00 5,20
8 dos III 12,0 II 2 ,90 1,00 27,70
9 NO I 1,0 1 1 ,58 1,40 ,42 1,00 1,90
10 dos II 3,5 III 0 ,82 1,00 7,80
11 NO 1 5,0 III 1 ,56 1,86 1,65 1,00 21,00
12 NO 1 3,0 II 1 ,60 1,40 1,05 .06 1,00 11,70
13 uno 1 4,0 IV 1 ,58 1,22 3,80 ,26 1,00 2,00
14 NO 1 3,5 II 1 ,74 1,00 9,00
15 NO II 5,0 IV 3 ,48 2,26 1,45 1,00 11,90
16 NO 1 11,0 1 1 ,89 1,73 ,71 1,00 1,10
17 NO 0 3,5 1 0 1,23 ,80 1,84 6,70
18 NO II 14,0 IV 3 1,29 7,53 .1,00 14,80
19 dos III 10,0 IV 3 ,83 1,70 2,30 1,32 LOO 23,60
20 NO 1 7,0 IV 1 ,80 ,95 ,82 ,09 1,00 50,70
21 uno II 9,0 IV 3 1,21 1,00 11,50
22 NO 0 4,0 II 1 ,90 1,30 ,90 ,62 1,00 8,90
23 NO 1 11,0 1 0 1,18 1,36 ,85 ,67 1,12 8,70
24 NO 1 4,0 1 0 ,50 1.33 1,10 ,18 1,00 2,40
25 NO 0 4,0 1 1 ,90 2,56 1,36 ,52 1,00 12,00
26 uno 1 7,0 II 1 1,31 2,42 3,63 4,99 1,17 28,70
27 NO II 1,5 II 2 ,68 2,19 1,15 1,00 5,90
28.A NO 1 20,0 IV 2 ,71 1,00 4,60
28,B NO III 20,0 IV 3 2,04 1,90 ,19 2,00 15,30
29 NO 0 2,0 IV 1 ,71 , , 1,00 2,00
30 NO 1 8,0 IV 2 ,48 ,88 1,00 2,70
31 NO 1 10,0 III 1 ,73 ,93 ,55 ,51 1,00 16,80
32 uno II 2,0 IV 4 ,72 3,55 1,70 1,00 5,30
33 NO 1 5,0 IV 1 ,63 1,00 4,30
34 NO II 3,0 IV 2 ,75 2,25 , ,79 1,00 13,50
35 NO 1 4,0 III 1 ,69 1,40 7,03 ,26 1,00 12,90
 111

36 uno III 24,0 II 1 2,28 ,72 t 2,48 1,00 10,10

37 dos II 12,0 IV 3 1,32 4,16 j f 1,00 17,00
38 uno 0 8,0 IV 1 ,51 t t f 1,00 4,60
40 uno III 4,0 I 1 ,54 1,63 . f 1,00 12,80
41 uno II 7,0 IV 2 ,43 2,46 t 2,46 1,00 6,90
42 NO III 2,5 IV 2 .55 1.10 t .55 1,00 4,60
43 NO 0 6,0 IV 2 2,02 ? t t 1,19 9,30
44 dos 1 8,0 III 2 1,29 1,44 ( f 2,00 13,10
45 NO 0 6,0 IV 2 ,57 . t 1,00 5,20
46 NO II 3,0 IV 2 ,83 2,20 16,40 ,61 1,00 2,80
47 NO 1 2$ II 1 j57 ,76 ,39 ,76 1,13 6,40
48 NO III 4,0 IV 2 1,10 12,80 ( ,48 1,00 7,10
49 NO 1 7,0 II 3 ,63 2,18 2,41 ,44 1,00 3,45
50 NO 1 4,0 IV 2 3,15 1,77 t ,20 1,00 9,60
51 NO 1 3,0 I 0 ,61 1.11 ,94 ,14 1,00 31,10
52 dos II 11,0 IV 2 ,82 .93 ,27 1,08 1,00 8,80
53 uno II 2,0 IV 2 1,52 1,84 18,82 ,51 1,00 2,20
54 dos III 11,0 IV 2 16,60 t 50,20 , 1T24 5,80
55 uno III 6,0 IV 2 ,ai 1,80 ( 1,14 1.00 24,60
56 uno II 12,0 IV 1 1,00 ( t ( 1,69 19,10
57 uno II 38,0 IV 2 ,35 ,76 . t 1,00 32,20
58 dos III 10,5 IV 3 1,50 1,90 ( 10,10 1,13 24,90
59 NO 1 8,0 IV 3 ,61 f ( t 1,79 13,80
60 NO II 5,0 1 1 1,09 4,06 6,73 .20 1,00 12,90
61 uno III 16,0 IV 2 1,14 t f 1,00 2,80
62 NO III 3,0 IV 2 ,80 1,93 7,71 ,31 1,92 8,50
63 tres II 11,0 IV 3 3,21 6,93 t 2.41 1,00 7,30
64 NO II 11,0 1 1 1,18 1,69 t ,60 1,00 4,10
65 NO 0 4,0 1 0 ,69 1,02 t ,13 1,00 4,00
66 uno III 9,0 111 2 .79 1,25 . ( 1,00 16,10
67 NO 1 12,0 II 0 ,51 t t t 1,14 7,40
68 uno III 6,0 III 1 6,91 t t t 1,00 20,10
70 dos III 9,0 IV 3 1,37 t f t 1,00 9,20
71 NO 1 13,0 1 1 ,56 ,96 f ,13 1,00 7,50
72 uno 1 7,0 IV 2 ,85 t ( t 1,00 3,60
73 NO 0 4,0 1 0 JL08 1,03 ,81 1,98 31,40
74 dos 1 8,0 III 1 1,18 2,40 ,96 1,00 16,40
75 NO II 2,0 IV 1 2,50 2,31 _, 1,20 1,00 6,50
76 NO III 15,0 1 1 j46 1.53 1,00 4,60
77 NO II 4,0 IV 2 2,36 6,10 , 4,95 1,00 2,00
79 NO ~i 0 2,5 III 0 ,82 4,20 6,52 .07 1,00 10JO
81 uno 1 3,0 IV 4 2,03 4,26 3,04 ,40 1,99 19,90
82 NO 0 5,0 1 1 L61 ,98 1.12 1,00 11,00
83 tres 1 4,0 IV 2 4,39 , 1,00 4,90
84 NO II 20,0 1 1 1,01 ,64 1,00 39,80
85 NO 1 5,0 1 1 ,60 ,85 t .01 1,00 7,70
86 NO 0 2,5 IV 1 ,77 , ( f 1,00 4,60
87 NO III 6,0 IV 1 ,76 1,00 15,40
88 dos II , IV 2 1,17 .49 2,00 6,90
89 dos II JLO II 0 1,39 É 1,00 9,90
90 NO 1 16,0 1 0 ,89 , 1,08 1,00 27,50
91 NO 1 12,0 IV 3 ,61 1,70 .04 1,00 8,20
92 uno II 4,0 III 1 ^39 2,78 17,14 1,67 1,00 6,30
93 dos II 2,0 IV 1 1,72 1,20 4,20
94 dos II 12,0 III 0 2,20 4,14 1,00 28,70
0 NO 1 3,0 IV 1 ,64 ,91 1,00 4,50
96 NO II 24,0 IV 2 ,29 1,54 , 3,41 1,00 3,20
97 NO 1 6,0 IV 2 ,95 1,86 3,75 1,44 1,12 9,30
98 NO III 10,0 IV 1 ,46 ( ,16 1,00 34,80
99 NO 1 3,0 IV 2 ,70 1,33 3,11 .18 1,00 1,80
100 NO II 11.0 ! 1 1,02 ,94 1,00 3,10
101 NO III 10,0 IV 5 ,86 1.20 2,00 25,70
102 NO 0 4,0 IV 3 ,63 1.14 6,21 .46 1,00 6,40
 112

103 uno II 3,0 IV 2 2,80 f t t 1,15 16,90

104 dos III 6,0 IV 5 1,85 ( f t 1,49 7,70
105.C NO 1 3,0 IV 2 ,57 1,55 ( ,02 ,00 8,80
108 NO II 6,0 1 1 ,25 , . ,38 ,13 4,20
109 NO 1 2^ IV 1 ,68 1,02 , .22 ,00 2,00
110 NO 1 6,0 II 0 ,58 1.06 ,55 ,11 .00 34r20
111 NO III 12,0 IV 1 3,22 ( t f ,14 13,30
112 NO II 11,0 IV 3 1,05 2,45 5,40 ,38 JO 5,90
113 uno III 15,0 IV 3 4,91 t , ( ,00 29,30
114 NO III 13J) IV 3 2,15 t f § ,00 14,60
115 NO 1 5,0 IH 0 ,55 t ( t ,00 18,70
116 uno II 15,0 1 1 4,91 1,83 t 1,14 ,00 8,30
117 NO 1 4,0 III 1 ,66 ( ( , 1,00 8,30
118 NO 1 7,0 IV 1 ,73 1,81 3,28 ,26 1,00 4,10
119 dos 1 4,0 III 0 1,11 1,99 12,27 .08 1,00 13,30
120 tres III ILO IV 3 1,07 2,15 t 2,25 1,00 6,60
121 dos 1 2.5 IV 3 2,10 3,90 ,94 4.18 1,00 11,20
123 NO 1 6,0 IV 1 2,09 2,18 3,01 , 1,00 31,70
124 uno 1 3,0 III 0 1,44 t f , 1,00 10,00
125 NO III 13,0 1 0 1,16 f t , 1,00 16,00
126 NO II 18,0 IV 3 1,08 1,99 . 2,33 1,00 4,90
127 dos 1 5,0 IV 1 1,07 2,29 2,56 ,06 1,00 7,10
128 NO 1 4,0 IV 1 1,33 2,31 9,85 f 1,00 3,40
129 NO II 6,0 III 1 1,74 , t f 1,00 11,90
130 dos 1 4,0 IV 1 ,62 1,00 7,80
131 NO 1 4,0 1 1 ,60 1.24 t ,44 1,00 5,50
132 NO 1 7,0 1 1 ,50 ,87 ( 1,12 1,16 10,60
133.A NO 1 3,0 1 0 L72 t t 1,00 5,50
134 NO 0 13,0 II 1 ,68 ,97 ,23 1,00 5,20
135 NO II 10,0 IV 4 ,70 ( t 1,00 6,70
136 NO 1 3,0 1 1 ,68 t 1,27 14,90
137 NO 0 15,0 IV 2 3,12 2,65 ,69 1,00 23,10
138 NO II 12,0 IV 3 ,72 5,06 16,70 2,25 1,00 3,50
139 NO 1 5,0 1 1 ,65 1,21 ,80 ,34 1,00 7,30
140 uno 1 5,5 III 0 1,31 ,67 ( ,23 1,00 11,30
141 dos III 10,0 IV 4 4,20 t ( t 1,00 18,50
142 uno III 6,0 IV 4 1,22 6,20 10,84 ,94 1,00 11,80
143 NO 0 3,0 IV 1 ,61 2,30 3,96 ,22 1,00 2,00
144 NO II 8,0 II 2 ,87 t f , 1,00 24,80
145 NO 0 13,0 II 1 ,55 t , , 1,00 2,60

NUM apoptosis tto resp. recalda estado tiempo TUE tiempo IPIint IPIext
tto al final superv seguido
1 ,9060 PQX RP ( RETIR 4,00 1,00 4,00 5,00 3,00
2 4,6498 FOX RP RETIR 2,00 ,25 3,00 4,00 2,00
3 ,0000 RTX RC NO VIVO 10,00 8,00 11,00 ,00 ,00
4 1,0564 PQX RP , VIVO 16,00 8,00 17,00 5,00 3,00
5 ,6066 Cirugía RC SI VIVO 73,00 58,00 74,00 4,00 2,00
6 ,8247 PQX RP , MUERT 11,00 1.00 13,00 5,00 3,00
7 2,9221 PQX RC SI VIVO 49,00 23,00 49,00 5,00 3,00
8 7,6125 Cirugía RETIR 1,00 1,00 1,00 3,00 1,00
9 9,8268 RTX RC NO VIVO 69,00 68,00 71,00 ,00 ,00
10 4,2346 PQX RP , MUERT 13,00 8,00 15,00 3,00 2,00
11 3,7555 PQX RP RETIR 3,00 1,00 3,00 2,00 1,00
12 4,0499 RTX RC NO VIVO 11,00 10,00 12,00 1,00 ,00
13 ,0000 PQX RP , RETIR 45,00 ,00 46,00 1,00 1,00
14 1,9350 PQX RC SI MUERT 19,00 5,00 20,00 1,00 ,00
15 1,0370 PQX RC NO VIVO 67,00 62,00 67,00 3,00 2,00
16 ,7664 RTX RC NO VIVO 5,00 4,00 6,00 1,00 ,00
17 ,4300 PQX RP ( MUERT 6,00 1,00 7,00 2,00 1,00
18 13,6107 PQX RC SI RETIR 54,00 45,00 55,00 5,00 3,00
19 4,7923 Cinigia RETIR ,50 ,50 ,50 4,00 2,00
20 ,0000 PQX RC SI VIVO 19,00 2,00 20,00 1,00 1,00
 113

21 ,0000 PQX RC SI MUERT 40,00 3,00 41,00 4,00 3,00

22 ,7281 PQX RP t VIVO 28,00 5,00 29,00 ,00 ,00
23 2,9658 RTX RC NO VIVO 43,00 40,00 43,00 ,00 ,00
24 ,3445 RTX RC NO VIVO 8,00 7,00 11,00 1,00 ,00
25 2,6050 PQX+RTX RC NO VIVO 9,00 8,00 11,00 1,00 ,00
26 1,0117 PQX RC NO VIVO 13,00 9,00 14,00 2,00 1.00
27 2,7526 PQX RP f VIVO 53,00 30,00 54,00 3,00 1,00
28,A ,0000 PQX RP t VIVO 108,00 7,00 109,00 2,00 1,00
28,B ,3780 PQX RP t MUERT 2,50 1,00 3,00 4,00 3,00
29 ,1663 ( , RETIR 61,00 ,00 61,00 2,00 1,00
30 2,7567 PQX RC SI VIVO 11,00 5,00 11,50 2,00 1,00
31 ,8034 PQX RC SI MUERT 7,50 3,00 8,00 2,00 1,00
32 ,2007 PQX RP t VIVO 76,00 60,00 76L00 3,00 2,00
33 ,0000 PQX RP J MUERT 44,00 20,00 51,00 1,00 1,00
34 ,9915 PQX RP f VIVO 67,00 62,00 74,00 4,00 2,00
35 1,9404 PQX RP t RETIR 12,00 6,00 13,00 2,00 1,00
36 1,4524 PQX NO f RETIR 3,00 ,00 4,00 3,00 2,00
37 ,0545 PQX RC SI MUERT 17,00 7,00 19,00 5,00 3,00
38 ,0000 PQX RP f RETIR 26,00 ,00 27,00 1,00 1,00
40 3,0468 PQX RC NO VIVO 62,00 57,00 64,00 2,00 1,00
41 ,5117 PQX RP t MUERT 21,00 15,00 21,00 4,00 2,00
42 ,2182 PQX RP f MUERT 76,00 45,00 76,00 4,00 2,00
43 ,4576 PQX RC NO VIVO 108,00 100,00 108,00 3,00 2,00
44 ,9469 PQX NO ( MUERT 10,00 ,00 14,00 3,00 2,00
45 ,1747 PQX RC NO RETIR 32,00 27,00 33,00 3,00 1,00
46 ,0000 PQX RP VIVO 31,00 14,00 32,00 4,00 2,00
47 2,3160 PQX+RTX RC NO VIVO 21,00 17,00 22,00 1,00 ,00
48 2,3241 PQX RP f MUERT 6,00 2,00 7,00 4,00 2,00
49 ,8433 PQX RP f VIVO 30,00 12,00 30,00 2,00 ,00
50 ,0000 PQX RP f VIVO 35,00 30,00 35,00 3,00 2,00
51 1,2038 PQX RC NO VIVO 22,00 19,00 23,00 ,00 ,00
52 1,6806 PQX RC NO VIVO 12,00 5,00 12,00 3,00 2,00
53 26,7895 PQX RP t , n
RETIR 6,00 ,00 6,00 5,00 3,00
54 1,4328 Cirugía t t
RETIR J» ,50 ,50 5,00 3,00
55 1,3601 PQX RC NO RETIR 9,00 4,00 9,00 4,00 2,00
56 4,8786 PQX+RTX NO ( MUERT 4,00 ,00 9,00 3,00 2,00
57 1,8308 PQX RC NO RETIR 87,00 82,00 88,00 4,00 2,00
58 8,6565 PQX+RTX RC NO VIVO 85,00 81,00 87,00 4,00 3,00
59 j1719 PQX NO f MUERT 6,00 ,00 6,00 3,00 1,00
60 2,3387 PQX+RTX RP f VIVO 20,00 15,00 21,00 2,00 1,00
61 ,4065 PQX t ( RETIR ,50 ,50 ,50 4,00 2,00
62 ,0000 PQX RP ( VIVO 13,00 7,00 13,00 4,00 2,00
63 ,7126 PQX NO RETIR 6,00 1,00 7,00 4,00 3,00
64 4,7734 PQX RC NO VIVO 62,00 56,00 64,00 2,00 1,00
65 10,7631 RTX RC NO VIVO 68,00 67,00 74,00 ,00 ,00
66 1,8734 PQX NO ( MUERT ,50 ,00 1,50 3,00 2,00
67 ,2116 PQX+RTX RC SI RETIR 128,00 103,00 129,00 1,00 ,00
68 1,9470 PQX RP t MUERT 25,00 1,00 26,00 3,00 3,00
70 ,0000 PQX RC SI MUERT 36,00 2,00 38,00 4,00 3,00
71 1,5296 PQX RC NO VIVO 30,00 25,00 31,00 ,00 ,00
72 jOOOO PQX NO , RETIR 25,00 ,00 25,00 3,00 1tOO
73 3,9900 PQX+RTX RC NO VIVO 32,00 28,00 34,00 1,00 ,00
74 2,7626 PQX RC NO VIVO 11,00 6,00 11,00 2,00 1,00
75 5,7222 PQX NO RETIR 1,00 ,50 2,50 4,00 3,00
76 7,0799 PQX RC NO VIVO 76,00 70,00 77,00 1,00 1,00
77 2,3005 PQX NO RETIR 4,00 ,00 4,50 5,00 3,00
79 1,1045 PQX RC NO VIVO 11,00 6,00 12,00 2,00 1,00
81 4,6206 PQX NO ( MUERT 8,50 ,00 9,00 4,00 2,00
82 7,6308 PQX RC NO VIVO 44,00 42,00 49,00 1,00 ,00
83 2,0815 PQX RP t RETIR 23,00 5,00 24,00 3,00 2,00
84 1,6787 PQX RC NO VIVO 81,00 65,00 83,00 2.00 IjOO
85 5,3879 PQX RC NO VIVO 72,00 71,00 74,00 ,00 00
86 ,1094 PQX RP VIVO 120,00 119,00 120,50 1,00 1,00
 114

87 1,8837 POX RP f MUERT 10,00 4,00 11,00 3,00 2,00

88 ,8508 POX RP ( RETIR 72,00 66,00 73,00 4,00 2,00
89 4,2184 PQX+RTX RC SI MUERT 9,00 ,50 9,00 2,00 2.00
90 ,9376 POX RC NO VIVO 32,00 26,00 33,00 1,00 ,00
91 ,7461 POX RP f VIVO 71,00 69,00 73,00 2,00 1,00
92 1,1698 PQX RC SI MUERT 11,00 2,50 11,50 4.00 3,00
93 3,3832 PQX NO RETIR 2,00 .00 3,00 4,00 3,00
94 ,0641 PQX RC NO VIVO 35,00 30,00 35,00 4,00 3,00
0 ,9131 PQX RP f VIVO 48,00 13,00 72,00 1,00 1,00
96 ,4417 PQX+RTX RP t RETIR 13,00 1,00 14,00 3,00 2,00
97 3,2571 PQX RC NO VIVO 6,00 2,00 7,00 3,00 1,00
98 32,5950 PQX RC NO VIVO 108,00 101,00 109,00 2,00 2,00
99 1,7344 PQX RP ( VIVO 9,00 7,00 10,00 3,00 1,00
100 ,0961 PQX+RTX RC NO VIVO 32,00 24,00 34,00 1,00 1,00
101 ,7868 PQX RC SI MUERT 17,00 6,00 17,00 4,00 2,00
102 ,1133 PQX RP w VIVO 20,00 15,00 21,00 3,00 1,00
103 ,8592 PQX NO t MUERT 2,00 ,00 2,00 5,00 3,00
104 2.2309 PQX RP t MUERT 33,00 12,00 37,00 5.00 3.00
105.C 3,8485 PQX RP VIVO 37,00 17,00 38,00 2,00 1,00
108 1,5742 PQX RC NO VIVO 114,00 110,00 118,00 1,00 1,00
109 1,3148 PQX RP t VIVO 54,00 20,00 57,00 1,00 1,00
110 ,0000 PQX RC NO VIVO 10,00 7,00 10,00 1,00 ,00
111 1,2795 PQX RP t MUERT 6,00 1,00 6,00 4,00 3,00
112 1,1652 PQX NO t MUERT 5,00 ,00 6,00 4,00 ZOO
113 4,4303 Cinigia t t MUERT .50 ,00 ,50 5,00 3,00
114 3,4853 PQX RC SI MUERT 18,00 8,00 18,00 4,00 3,00
115 5,2239 PQX+RTX RC SI MUERT 16,00 5,50 20,00 1,00 1,00
116 6,1422 PQX RP , MUERT 13,00 6,00 15,00 3,00 2,00
117 2,7741 RTX RP RETIR 13,00 3,00 23,00 2,00 1,00
118 ,0000 PQX RP , VIVO 22,00 20,00 22,00 2,00 1,00
119 2,3813 PQX RP MUERT 9,00 4,00 11,00 2,00 1,00
120 1,4566 PQX RP VIVO 32,00 28,00 32,50 3,00 2,00
121 ,9842 PQX RC NO VIVO 9,00 6,00 9,00 4,00 2,00
123 9,0074 PQX RC NO RETIR 10,00 6,00 11,00 2,00 2.00
124 1,1473 PQX NO t MUERT 8,00 .00 8,00 2,00 2,00
125 3,9372 PQX RP MUERT 43,00 2,00 49,00 1,00 1,00
126 8.9106 PQX+RTX RC NO RETIR 19,00 8.00 19.00 4,00 2,00
127 1,4157 PQX RP VIVO 16,00 12,00 16,00 2,00 1,00
128 2,0523 PQX RP t MUERT 24,00 , 24,00 3,00 2,00
129 8,9918 PQX RP t MUERT 14,00 2,00 15,00 3,00 3,00
130 ,4039 PQX RP MUERT 130,00 2,00 136,00 1,00 1,00
131 5,1073 RTX RC SI RETIR 32,00 3,00 32,00 1,00 ,00
132 2,7855 PQX+RTX RC NO VIVO 72,00 68,00 74,00 ,00 ,00
133.A 1,0756 RTX RC SI MUERT 22,00 2,00 25,00 ,00 ,00
134 6,7301 PQX+RTX RC NO VIVO 54,00 47,00 56,00 ,00 ,00
135 1,1210 PQX RP MUERT 28,00 4,00 28,00 4,00 2,00
136 .2559 f f , RETIR 18,00 18,00 18,00 1,00 ,00
137 4,9601 PQX+RTX NO , MUERT 6,00 ,00 6,00 4,00 2,00
138 ,7417 PQX NO MUERT 1,00 ,00 1.00 4,00 2,00
139 ,0000 PQX+RTX RC NO VIVO 25,00 21,00 25,00 1,00 .00
140 2,7685 PQX RC NO VIVO 109,00 106,00 109,00 2,00 2,00
141 1,5566 PQX f , RETIR 1.00 ,00 1,00 5,00 3,00
142 4,8355 PQX RC NO VIVO 9,00 4,00 10,00 4,00 3,00
143 ,0338 PQX RP , VIVO 11,00 8,00 11,00 2,00 1,00
144 6,5550 PQX+RTX RC NO VIVO 111,00 103,00 114,00 2,00 1,00
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