Cromatografia líquida de alta

eficiência
(CLAE ou HPLC)

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

Cromatografia líquida de Emprega uma fase móvel líquida e uma

alta eficiência (CLAE) fase estacionária muito finamente
dividida.

Altas pressões de bombeamento são

requeridas para se obter vazões razoáveis

Colunas fechadas contendo

uma FE finamente dividida
(d.i. entre de 4 a 6 µm)

1
 Aplicações da CLAE de acordo com a polaridade das espécies

Fonte: SKOOG et. al. Fundamentos de Química Analítica. 8ª ed., 2006

Um cromatógrafo líquido é composto basicamente por:

Reservatório de FM

Bomba

Injetor (manual)

Detector
Coluna
4

www.agilent.com

2
 Um cromatógrafo líquido é composto basicamente por:

Reservatório de FM

Módulo de controle

Desgaseificador

Bomba

Injetor

Coluna

Detector
HPLC Agilent 1100 Series
HPLC Agilent 1200 Series 5

http://www.team-cag.com/

Reservatórios de Fase Móvel e Solventes

O reservatório consiste em frascos, geralmente de vidro,
onde são colocados o solvente ou a mistura de solventes que
será usada como FM.

Solventes de alta pureza → evitar a degradação da coluna por impurezas e
minimizar o sinal de fundo do detector causado por contaminantes.

Pequenas partículas podem obstruir os tubos conectores ou

contaminar a bomba → filtros de 20 ou 40 µm na entrada do
reservatório.

Gases dissolvidos nos solventes produzem bolhas na coluna, causando um

alargamento de banda, além de afetar o funcionamento do detector →
desgaseificar a FM:
 Banho de ultrassom: a desgaseificação é feita separadamente do sistema
cromatográfico.
 Passagem contínua pelo reservatório de FM de um gás inerte (He) não solúvel
em FM que carreia os gases dissolvidos (sparging)
6
 Módulo de desgaseificação entre o reservatório e a bomba: a FM passa por
membrana permeável e os gases são eliminados por vácuo

3
 Sistemas de Bombeamento

A bomba tem a função de enviar um fluxo contínuo e reprodutível de FM à
coluna. Requisitos para uma bomba de cromatografia líquida:
 Gerar pressões de 0,1 a 350 bar;
 Vazão contínua sem pulsos ou, se pulsando, utilizar amortecedor de pulsos;
 Vazões reprodutíveis na faixa de 0,1 a 10 mL/min;
 Resistência à corrosão por uma grande variedade de solventes.

Há três tipos principais de bomba:

Bomba de seringa: Acionada por rosca.

☺ Saída livre de pulsação e fácil controle
de vazão ;
 Pequena capacidade (250 mL) e
inconvenientes na troca do solvente.
7

Bomba recíproca: consiste em uma

câmara pequena que é preenchida e
esvaziada pela movimentação de ida e
vinda de um pistão.
☺ Alta pressão de saída (até 10.000 psi),
compatível com eluição por gradiente e
vazões constantes
 Produz um fluxo pulsado que deve ser
atenuado posteriormente.

Bomba pneumática: consiste em um reservatório

maleável de solvente inserido em um vaso que pode
ser pressurizado por um gás comprimido.
☺ É simples, de baixo custo e livre de pulsação;
 Capacidade e pressão de saída limitadas;
 Vazões dependentes da viscosidade do solvente;
8
 Incompatível com eluição por gradiente.
Fonte: Collins et. al. Fundamentos de cromatografia. 2007.
SKOOG et. al. Fundamentos de Química Analítica. 8ª ed., 2006.

4
 Sistema de Injeção da Amostra

Injeção manual ou automática com auto-amostradores.

Válvula de injeção com alça de amostragem intercambiável → é possível a
escolha do volume da amostra (10 – 5000uL)
Seringa Seringa

Para o descarte Para o descarte

Alça de amostragem
Alça de amostragem Alça de amostragem
Para coluna Para coluna Entrada do solvente
Entrada do solvente
Posição de carregamento Posição de injeção

Fonte: Agilent 1200 Infinity Series Supplies (www.agilent.com/chem/LC)

HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

Colunas

As colunas cromatográficas são geralmente
construídas de tubos de aço inoxidável com
comprimento de 5 a 30 cm e diâmetro interno entre
1 e 5 mm.

Coluna de guarda ou pré-coluna:

Uma pequena pré-coluna contendo a
mesma FE da coluna é colocada antes da
entrada da coluna de CLAE para evitar
que a coluna analítica seja contaminada
por partículas ou por solutos que se
adsorvem irreverssivelmente → ☺
aumenta o tempo de vida útil da coluna
analítica.

10

Fonte: www.allcrom.com.br
www.agilent.com.br

5
 Colunas

Os recheios das colunas apresentam partículas de diâmetros entre 3 e 10 µm

→ fornecem entre 40.000 e 60.000 pratos/m.

A eficiência de uma coluna empacotada aumenta à medida que o tamanho das
partículas da FE diminui → partículas pequenas reduzem a altura do prato:

 Proporcionam o fluxo mais uniforme

através da coluna → reduz o termo
referente aos caminhos múltiplos (A) na
equação de van Deemter;
 Quanto menor a partícula, menor a
distância que o soluto deve difundir nas
fases móvel e estacionária → diminui o
termo de tempo de equilíbrio finita (C) na
equação de van Deemter.

B
H = A + + (C FE + C FM )u x 11
ux

Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

Colunas

O tipo mais comum de recheio para a cromatografia líquida é preparado a
partir de partículas de sílica microporosa:
 A sílica nua pode ser utilizada como FE → cromatografia por adsorção;
 A sílica é usada como suporte, o qual é recoberto com filmes orgânicos
quimicamente ligados à sua superfície → cromatografia por partição.

Exemplo da reação de ligação covalente do filme orgânico com a sílica:

FE protegida por
A ligação Si-O-SiR grupos isobutil:
hidrolisa em pH<2: ligação Si-O-Si
Faixa util 2 < pH < 8 menos acessível
ao ataque pelo
H3O+
Superfície da sílica

Fases polares comuns Fases apolares comuns

12

Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

6
 O processo de eluição

Em cromatografia de adsorção,
moléculas do solvente competem com as
moléculas de soluto por sítios ativos na FE.

Uma série eluotrópica classifica os
solventes pelas suas capacidades relativas
para deslocar solutos a partir de um dado
adsorvente.

Quanto maior for a força eluente, mais
rapidamente os solutos serão eluídos da
coluna.

Série eluotrópica
e comprimentos de
onda no UV para
solventes usados na
cromatografia de
adsorção sobre sílica
13

Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª

ed. Editora LTC, 2010.

Cromatografia líquida de fase normal: FE polar e FM menos polar. Um

solvente mais polar tem maior força eluente (o analito elui mais rapidamente).

Cromatografia líquida de fase reversa: FE apolar ou fracamente polar e FM

mais polar. Um solvente mais apolar tem maior força eluente.
90% B 80% B 70% B FM: A: tampão aquoso pH 3,5
60% B
B: acetonitrila

(1) álcool benzílico;

(2) fenol;
50% B (3) 3,4-dimetoxiacetofenona;
(4) benzoína;
(5) benzoato de etilo;
(6) tolueno;
(7) 2,6-dimethoxitoluene;
(8) o-metoxibifenila.

40% B 35% B

14

Separação isocrática por HPLC de uma mistura de compostos aromáticos a 1,0 mL/min em uma
coluna Hypersil ODS (C18 em 5µm de sílica) de 0,46 x 25 cm. FM: tampão aquoso pH 3,5 (A)
e acetonitrila (B). OBS: a notação "90% de B" no primeiro cromatograma significa 10% v/v de
A e 90% v/v de B. Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

7
Eluição isocrática : a composição da FM permanece constante durante a eluição.
A FM é composta por um único solvente ou por uma mistura de solventes, cuja
composição é constante → Menor custo, simples, repetitividade das análises.
Ex:FM: ACN:H2O na proporção 70:30 (v/v)
Eluição por gradiente: a composição da FM é alterada continuamente ou em uma
série de etapas a fim de aumentar a força eluente da FM → Útil para eluir solutos
fortemente retidos e quando a amostra consiste de um mistura de compostos com
características químicas variadas (logo diferem bastante na retenção)→
geralmente melhora a eficiência da separação e menor tempo de análise.

Eluição por gradiente da mesma

mistura de compostos aromáticos do
slide anterior aplicando a mesma
coluna, fluxo de FM e solventes. O
traço superior representa o perfil do
gradiente segmentado (porque 15 ele é
dividido em vários segmentos
diferentes)
Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

Detecção

Um detector ideal deve:
 Ser sensível a baixas concentrações das substâncias analisadas;
 Fornecer uma resposta linear;
 Ser insensível à alterações da temperatura e da composição do solvente.
 Apresentar um volume morto pequeno de forma a minimizar o alargamento de
banda extra coluna.
Detector UV
UV--Vis

Os detectores mais amplamente empregados em
cromatografia líquida são baseados na absorção da radiação
ultravioleta ou visível → muitos solutos absorvem radiação
nesta região.
☺ Ampla faixa linear (até cinco ordens de grandeza da
concentração de soluto) e compatíveis com eluição por
gradiente empregando solventes que não absorvem.

No caso de espécies que não absorvem → Pode-se realizar uma derivatização
(ligação ao analito de um grupo que abosrve – cromóforo).
 Múltiplos comprimentos de onda (VWD): monitora até cinco comprimentos de
16
onda ao mesmo tempo.
 Arranjos de fotodiodos (DAD): registram um espectro completo à medida que o
analito deixa a coluna. Fonte: SKOOG et. al. Fundamentos de Química Analítica. 8ª ed., 2006

8
 Detector de fluorescência

Detectores de fluorescência excitam o eluato com um laser e medem a

fluorescência emitida.
☺ Alta sensibilidade (LD: 0,001 a 0,01 ng);
☺ Compatível com eluição por gradiente;
 Respondem somente aos poucos que analitos que fluorescem→ seletivo.

No caso de espécies que não fluorescem → Pode-se realizar uma
derivatização (ligação de um grupo fluorescente ao analito).

Detector de índice de refração

Baseado na mudança de índice de refração da fase móvel causada pela
passagem das moléculas do analito.
☺ É sensível a praticamente todos os tipos de soluto → resposta
praticamente universal para todos os tipos de solutos, incluindo aqueles com
baixa absorção na região UV. 17

 Sensibilidade limitada (LD: 100 a 1000 ng);

Detectores eletroquímicos

É sensível a analitos que podem ser oxidados ou reduzidos.
☺ Seletivos
☺ Alta sensibilidade (LD: 0,01 a 1 ng);
 Incompatível com eluição por gradiente

CLAE acoplada à espectrometria de massas (LC-

(LC-MS)

Alta seletividade, uma vez que picos não-resolvidos podem ser isolados
monitorando-se somente um valor de massa selecionado.

A técnica de CL-MS pode fornecer uma impressão digital de um eluato em
particular em vez de recorrer ao tempo de eluição, como na CLAE
convencional.

Informação qualitativa e quantitativa.

18

9
 Aplicações

Determinação de inúmeras espécies em diferentes matrizes, como

por exemplo, farmacêuticas (antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos), produtos alimentícios (adoçantes artificiais, corantes,
antioxidantes, aflotoxinas, aditivos, proteínas, carboidratos),
ambientais (pesticidas, HPAs, herbicidas, fenóis, bifenilas policloradas
(PCBs)), forense (drogas, venenos, álcool no sangue, narcóticos),
dentre outras.

A quantificação se dá com base na área dos picos empregando
métodos de calibração:
• Curva de calibração externa
• Curva de calibração por padronização interna
• Curva de calibração por adição de padrão

19

Cromatografia a gás
(CG ou GC)

10
 Cromatografia a gás (CG )

Cromatografia a gás Emprega uma fase móvel gasosa e uma fase

estacionária líquida ou sólida.

A CG pode ser aplicada

às espécies
relativamente voláteis e O analito gasoso é transportado através da
estáveis termicamente coluna por uma fase móvel gasosa, chamado de
a temperaturas de até gás de arraste. A FM não interage com as
poucas centenas ºC moléculas do analito→ somente transporta o
analito através da coluna
Cromatografia gás-líquido (CGL): A fase estacionária é um líquido não
volátil ligada ao interior da coluna ou a um suporte sólido fino →
Amplamente empregada em todas as áreas da ciência
Cromatografia gás-sólido (CGS): A fase estacionária é um sólido que
retém os analitos por adsorção → Aplicação limitada devido à retenção
semipermanente de moléculas polares e efeito de cauda nos picos →
Permite a separação de gases de baixa massa molecular, como 21 os
componentes do ar, sulfeto de hidrogênio, monóxido de carbono e óxido de
nitrogênio.

Cromatografia a gás (CG)

“A amostra líquida volátil ou gasosa é introduzida dentro de um injetor aquecido,
através de um septo de borracha, vaporizando rapidamente. O vapor é arrastado
através da coluna por um gás de arraste. Os analitos são separados de acordo com
suas propriedades e da FE e fluem pelo detector, cuja resposta é apresentada em
um computador.”
Injetor

Regulador
de vazão

Computador
Coluna

Detector

Gás de arraste Forno

(FM)
A coluna deve estar T detector > T coluna →
A escolha do gás de arraste suficientemente aquecida para para que os analitos
22
depende do detector e do proporcionar uma pressão de permaneçam no
que se deseja para eficiência vapor que possibilite a eluição estado gasoso.
e velocidade de separação. dos analitos num tempo razoável

11
 GC/MS marca SHIMADZU (GCMS-
(GCMS-QP2010 plus
plus)) com injetor
automático PALM

23

Gás de arraste

As impurezas no gás de arraste podem degradar a fase estacionária → gás
de arraste com alta pureza (>99,999%)

Aconselhável o uso de filtros purificadores para eliminar traços de O2, H2O

e compostos orgânicos.

He é o gás de arraste mais comum → é compatível

com a maioria dos detectores.

Para um detector de ionização de chama, N2
He, H2 e N2
fornece menores LD.

H2 → Separações mais rápidas, porém pode reagir
com compostos insaturados nas superfícies metálicas.

He e H2 em vazões elevadas → melhor resolução que
o N2

Curvas de van Deemter para cromatografia a

gás do n-C17H36 a 175 ºC, usando N 2, He, ou
uma H2 em uma coluna de 0,25 mm de
24
diâmetro interno x 25 m de comprimento e
parede recoberta com fase estacionária OV-
101
Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

12
 Colunas capilares

Colunas capilares → construídas de sílica fundida

(SiO2) e revestidos com poliimida (plástico capaz de
suportar 350ºC) → estreitas e longas → comprimento de
15 a 100 m e diâmetro interno entre 0,1 e 0,53 mm.

Fonte: www.agilent.com.br

Espessura da FE entre 0,1 e 5 µm

↓Espessura → ↑Número de pratos →
↑Resolução → ↓Tempo de retenção →
↓Capacidade de amostra.

Coluna capilar com parede Coluna capilar com Coluna capilar com
recoberta (WCOT) suporte recoberto (SCOT) camada porosa (PLOT)

FE estacionária líquida na FE líquida revestindo suporte FE sólida sobre a parede

parede interior da coluna sólido ligado à parede interior interna da coluna
da coluna
25

Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

Efeito do comprimento da coluna na resolução

Quando o comprimento da coluna dobra, N  α   K '2 

Resolução =   
a resolução da coluna aumenta 2 4  α − 1   1 − K 'médio 
L
H =
N

Condição: Coluna de parede recoberta DB-1, 0,32 mm de diâmetro interno, 0,25 µm 26 de

espessura de filme, temperatura na coluna: 40 ºC, gás de arraste: He a uma velocidade
linear de 38 cm/s
Fonte: HARRIS, D.C. Quantitative Chemical Analysis. 8ª ed. Editora LTC, 2010.

13
 “Semelhante dissolve semelhante”
Fase Estacionária Polaridade T máxima (ºC) Aplicações
Esteróides, PCBs,
Polidimetilsiloxano Apolar 350 hidrocarbonetos aromáticos,
polinucleares.
Éteres metílicos de ácidos
5% fenil-
Apolar 350 graxos, alcalóides, drogas,
polidimetilsiloxano
compostos halogenados
50% fenil- Polaridade Drogas, esteróides, glicóis,
250
polidimetilsiloxano intermediária pesticidas
Ácidos livres, glicóis,
Polietileno glicol Polar 250 alcoóis, éteres, óleos
essenciais,
50% cianopropil- Polaridade Ácidos livres, álcoóis, ácidos
240
polidimetilsiloxano intermediária graxos poliinsaturados

Exemplo de FE sólidas:
Alumina: cromatografia de adsorção →
hidrocarbonetos; 27
 Peneiras moleculares: exclusão
molecular → H2O, H2, O2, N2, CO2, CH4.
Polidimetilsiloxano

Colunas empacotadas ou recheadas

Colunas empacotadas → contêm partículas finas de um sólido (diatomita ou
Teflon) que é empregado como FE ou como suporte recoberto com FE líquida
não-volátil.

São de aço inox ou vidro com comprimento de 1 a 5 m e
diâmetro interno entre 3 e 6 mm.

São aplicadas em separações preparativas ou para
separar gases que não apresentam boa retenção.
http://www.restek.com/

Se comparadas com as colunas empacotadas, as colunas capilares apresentam:

☺ Maior resolução;
☺ Menor tempo de análise;
28
☺ Maior sensibilidade;
 Menor capacidade de amostra.

14
 Injeção da Amostra – Modo com divisão de fluxo (Split
Split))

Modo de Injeção Split → com

divisão de fluxo → somente parte
Fluxo de purga
da amostra é introduzida na
Fluxo total do septo coluna (cerca de 0,2-2%)

Para amostras com alta
concentração (analito corresponde
a mais que 0,1% da amostra).
Liner

Tinjetor é elevada (cerca de
350ºC).
Válvula split aberta
Fluxo split

Fluxo da coluna
29

Injeção da Amostra – Modo sem divisão de fluxo (Splitless

Splitless))

Fluxo total Fluxo de purga

do septo

Modo de Injeção Splitless → sem

divisão de fluxo → toda a amostra é
Liner
introduzida na coluna.

Para amostras com baixa
Válvula split fechada
concentração → análise de traços
(analito corresponde a menos que
0,01% da amostra).

Tinjetor não é tão elevada (aprox.
220ºC).
Fluxo da coluna 30

15
 Injeção da Amostra – On Column

Fluxo total Fluxo de purga

do septo

A amostra é introduzida
diretamente na coluna.
Liner
Para amostras termicamente
instáveis .
Válvula split fechada
A injeção é realizada a frio.

Fluxo da coluna 31

Temperatura da coluna

A temperatura da coluna é uma

variável importante que deve ser
controlada para se obter boa precisão
nos tempos de retenção → a coluna
encontra-se abrigada em um forno
termostatizado.

A temperatura da coluna depende do ponto de ebulição da amostra e da

separação desejada → uma temperatura igual ou ligeiramente superior ao PE
médio da amostra proporciona tempos de eluição razoáveis (2 a 30 min).

Cromatografia gasosa isotérmica: A temperatura permanece constante durante a

análise.

Cromatografia gasosa com programação de temperatura: A temperatura da

coluna é aumentada (continuamente ou em etapas) durante a análise → Para 32 as
amostras com uma ampla faixa de ponto de ebulição → diminui os tempos de
retenção dos últimos componentes a serem eluídos e torna os picos mais finos.

16
 Efeito da temperatura na cromatografia a gás

Isotérmico a 45ºC

Isotérmico a 145ºC

Programação: 30ºC a 180ºC

33
Fonte: SKOOG et. al. Fundamentos de Química
Analítica. 8ª ed., 2006

Detecção

Um detector ideal para CG apresenta as seguintes características:

 Sensibilidade adequada.
 Boa estabilidade e reprodutibilidade.
 Resposta linear aos solutos que se estenda a várias ordens de grandeza.
 Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400ºC.
 Um tempo de resposta curto e independente da vazão.
 Uma alta confiabilidade e facilidade de uso.
 Não deve destruir a amostra.

Mas não existe um

detector que preencha
todos os pré-requisitos...

34

17
 Detector de condutividade térmica (TCD)

A condutividade térmica mede a capacidade de

uma substância de transportar calor de uma região
quente para uma região fria .

Monitora a condutividade térmica do gás de

arraste → Quando um analito emerge da coluna, a
condutividade do gás de arraste diminui.

As condutividades térmicas do He e H2 são aproximadamente seis a dez

vezes maiores que da maioria dos compostos orgânicos → pequenas
quantidades de espécies orgânicas proporcionam um decréscimo na
condutividade térmica do efluente da coluna.

☺ Universal → Responde a todos os analitos → Responde à espécies orgânicas

e inorgânicas;

☺ Ampla faixa linear (105);

☺ Não-destrutivo → permite que os solutos sejam coletados após a detecção.

35

 Baixa sensibilidade.

Detector de ionização de chama (FID)

Monitora a corrente gerada por íons resultantes da queima de compostos
orgânicos em uma chama de ar/hidrogênio.

Quando moléculas da amostra atingem o detector, são queimadas na chama
de ar/hidrogênio produzindo íons que são coletados por um eletrodo. A
detecção envolve o monitoramento da corrente produzida pela coleta desses
íons.

Responde ao número de átomos de carbono → sensível à massa em vez da
concentração
☺ Alta sensibilidade;
☺ Ampla faixa linear (107);
☺ Robusto e de fácil operação;
☺ Sensível à maioria dos hidrocarbonetos;
 Grupos funcionais como carbonila, álcool, halogênicos e amínicos produzem
poucos ou nenhum íon na chama.
 Insensível a gases não combustíveis como H2O, CO2, SO2 e NOx.
36
 Destrutivo.

18
 Detector de captura de elétrons (ECD)

Quando o gás de arraste atinge o detector ele é ionizado por partículas beta
emitidas por uma fonte de 63Ni, sendo coletados por um anodo, gerando uma
corrente que é monitorada. Quando moléculas do analito, com alta afinidade
por elétrons, atingem o detector, elas capturam os elétrons, resultando numa
diminuição da corrente.
☺ Alta sensibilidade;
☺ Responde seletivamente aos compostos orgânicos halogenados (pesticidas e
bifenilas policloradas), peróxidos, grupos nitro (nitrilas, nitratos),
organometálicos;
 Faixa linear (102);

37

Espectrômetro de massas (MS)

O efluente do CG passa para a entrada do espectrômetro de massas, no

qual as moléculas de gás são fragmentadas, ionizadas, analisadas e
detectadas.

Produzem fragmentos →
quebra as ligações químicas O analisador serve para
das moléculas da amostra. selecionar os íons de acordo
com seus valores m/z

38

O espectro de massas é extremamente sensivel e fornece informações
qualitativa e quantitativa.

19
 Quantificação

A quantificação se dá com base na área dos picos empregando

métodos de calibração:
• Curva de calibração externa
• Curva de calibração por padronização interna: A maior precisão em
análises quantitativas → as incertezas introduzidas pela injeção da
amostra, vazão e variações nas condições da coluna são minimizadas.
• Curva de calibração por adição de padrão

39

20