PCR Y ELECTROFORESIS DE DNA EN E.

COLI

RESUMEN

La práctica se fundamentó en la realización de una PCR y posteriormente una electroforesis a las

muestras de ADN extraídas en prácticas anteriores, para ello primero se procedió a realizar el
(Cóctel) el cual contenía cada uno de los elementos a usar empezando entre ellos se encontraban
el buffer, los cebadores, dNTPs, enzimas, etc. Una vez preparado el coctel se dividió en 7 μL se le
adición los 3μL de ADN las muestras se llevaron al Termociclador y se ajustó con el número de
ciclos, temperatura y tiempos estipulado pro al guía de laboratorio. Luego de haber obtenido la
ampliación se procedió a la realización de la electroforesis donde primero se procedió a la
preparación de la cámara de electroforesis teniendo en cuenta como aspecto principal el equilibrio
de esta asegurándose de que no presentara ningún declive. Más adelante se realizaron cálculos
para la preparación del buffer y la matriz de gel donde se realizaron procesos de calentamiento
enfriamiento y disolución, para finalmente llevarla a la cámara de electroforesis donde se le
introdujo el peine para separar los posos para el ADN. Finalmente no se obtuvieron resultados
positivos debido a que las muestras corrieron sin mostrar el ADN contenido.

Palabras Claves: E. collí, buffer, electroforesis, cepa, ADN.

Abstract

The practice was based on the realization of a PCR and, later, an electrophoresis in the samples of
DNA extracted in previous practices, for it first proceeded to realize the (Cocktail) which contained
each one of the elements to use beginning between them they were the buffer, the primers,
dNTPs, enzymes, etc. Once the cocktail was prepared, it was divided into 7 μL and the 3 μL of DNA
was added, the samples were taken to the Thermal Cycler and adjusted according to the number of
cycles, temperature and times stipulated for the laboratory guide. After having obtained the
approval, the electrophoresis was carried out where the electrophoresis chamber was first prepared
taking into account the main aspect, the equilibrium of which assured that it did not show any
decline. Later, measurements were made for the preparation of the buffer and the gel matrix where
the electrophoresis process was carried out, where the comb was introduced to separate the sludge
for the DNA. Finally, no positive results were found because the samples ran without displaying the
contained DNA.

Keywords: E. coli, buffer, electrophoresis, strain, DNA.

INTRODUCCIÓN. Básicamente, se trata de replicar una y otra

La técnica de amplificación de ADN mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
es una técnica que consiste en la
amplificación in vitro de un fragmento de
ADN específico. Para llevar a cabo el
experimento de amplificación es necesario
conocer, al menos parcialmente, la secuencia
del fragmento a amplificar (un gen, una parte
de un gen, una región no codificadora,).
vez un mismo fragmento de ADN y, para ello,
debemos realizar in vitro lo que hacen las
células in vivo para replicar su ADN. [1]
Así, se trata de disponer en un tubo de
ensayo el ADN de la especie objeto de
estudio. Además, debemos añadir en dicho
tubo un par de oligonucleótidos que actúen
como cebadores para el ADN polimerasa. La
elección de estos oligonucleótidos
(cebadores o primers) es crucial dado que
han de delimitar la región a amplificar. En
concreto, deben ser complementarios a cada
uno de los extremos 3´ de la región a
amplificar.
La PCR es una técnica común y normalmente
indispensable en laboratorios de investigación
médica y biológica para una gran variedad de
aplicaciones. Entre ellas se incluyen
la clonación de ADN para la secuenciación,
la filogenia basada en ADN, el análisis
funcional de genes, el diagnóstico de
trastornos hereditarios, la identificación
de huellas genéticas (usada en
técnicas forenses y test de paternidad) y la
detección y diagnóstico de enfermedades
infecciosas.
El proceso de PCR por lo general consiste en
una serie de 20 a 35 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele
consistir en 2-3 pasos a diferentes
temperaturas. La PCR común se realiza con
ciclos que tienen tres pasos de temperatura.
Los pasos de ciclos a menudo están
precedidos por un choque térmico (llamado
"hold") a alta temperatura (> 90 °C), y
seguido por otro hold al final del proceso
para la extensión de producto final o el breve
almacenaje. Las temperaturas usadas y el
tiempo aplicado en cada ciclo dependen de
gran variedad de parámetros. Estos incluyen
la enzima usada para la síntesis de ADN, la
concentración de iones divalentes y de los
dNTP en la reacción, y la temperatura de
unión de los cebadores, así como la longitud
del ADN que se desea amplificar. [3]
Actualmente, casi todos los termocicladores
dan la opción de realizar la reacción de PCR
con la llamada " tapa caliente". Es decir, que
el sistema del termociclador aplicará calor a
la parte de arriba del vial que contiene la
mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios
que empezaron a usar los primeros aparatos
que se comercializaron y que no incluían este
sistema tenían que poner unas gotas de
aceite dentro del vial. El objetivo de este
procedimiento, al igual que el de la tapa
caliente, es evitar la condensación de la
muestra, ya que en el eppendorf se
encuentran dos fases: líquido y gas. Al
condensarse la muestra, perdemos volumen
de la mezcla. Sin embargo, calentando la
tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos
este proceso físico, conservando casi intacto
el volumen de la muestra.
La electroforesis es una técnica de separación
de moléculas en una mezcla por aplicación de
un campo eléctrico. Las moléculas disueltas
se desplazan o migran en un campo eléctrico
a una velocidad determinada por su relación
carga-masa. Por ejemplo, si dos moléculas
tienen masa y formas iguales, la de mayor
carga neta se desplazará más rápido hacia un
electrodo (Voet and Voet, 2006). Dado que
muchas proteínas o ácidos nucleicos de
tamaño y forma diferentes tienen relaciones
carga-masa casi idéntica, la electroforesis de
estas macromoléculas en solución se traduce
en muy escasa o nula separación. No
obstante, es posible lograr la separación de
proteínas y ácidos nucleicos mediante
electroforesis en distintos geles
(suspensiones semisólidas en agua) en lugar
de hacerlo en soluciones líquidas (Lodish,
2005). La separación electroforética de ADN
se suele efectuar en geles de agarosa. [1]
El objetivo de la práctica fue amplificar ADN
de E. coli utilizando cebadores específicos y
posteriormente realizar una electroforesis.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Reacción en cadena de la polimerasa o PCR
Para la realización de la PCR se llevaron a
cabo una serie de pasos que van de la mano
con unos componentes indispensables para
poder realizar dicha técnica primeramente se
utilizó una muestra de ADN la cual fue
extraída previamente de una sepa de E. coli
en concreto la Escherichiacoli Cepa K12
[ATCC ® 10798] del kit comercial Bacterial
Transformación Kit de Carolina, posterior a
esta se procedió a preparar el coctel de
soluciones que contenían Buffer de pcr 7 μL,
MgCl2 5,8 μL, Dnt 7μL, taq polimerasa 14 μL,
Cebadores con sus respectivas secuencias
Fd2: AGAGTTTGATCATGGCTCAG,
rP1:ACGGTTACCTTGTTACGACTT, estos
cebadores pertenecen a un grupo se
cebadores llamados universales porque
tienen la capacidad de amplificar el gen 16s
ribosomal con una capacidad de 1500 pb en
una amplia gama de bacterias entre las
cuales se encuentra E. coli también usamos
los cebadores Fme:
TATTGGTATGCGAAACTTCCG y Rme:
ACAGAAACTGATACTTATATAGCG los cuales
son usados en leishmania spp) para
amplificar la región espaciadora no transcrita
del miniexon1, luego se adiciono agua ultra
pura 2,8 μL, una vez mezclados todos los
componentes dio un volumen total de 50
microlitros de coctel de PCR, luego se le se
dividió en cantidades de 7 μL y se procedió
adicionarles 3 μL de la muestra de DNA
previamente obtenida.
Tabla 1. Preparación del coctel (cantidades).
Una vez se tiene todo listo es donde entra en
juego el termociclador que permite calentar y
enfriar los tubos de reacción para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la
reacción. Como he dicho cada etapa requiere
ciertas temperaturas para que el coctel de
sustancias anteriormente mencionado pueda
trabajar, estas etapas ocurren por ciclos,
cada ciclo consta de una temperatura en
específico a las cuales están asociadas ciertas
sustancias, una vez descrito el perfil de cómo
trabaja el termociclador se procedió a dejar
la muestra en el termociclador en unos tubos
eppendorf especiales los cuales tienen una
pared muy fina, lo que favorece una buena
conductividad térmica, permitiendo que se
alcance rápidamente el equilibrio térmico.
Cuando ya han trascurrido el tiempo
establecido según el protocolo.

C1 C2 V1 V2
Buffer PCR 10 X 1X 8 uL 80uL
dNTP mix 2 mM 0,2 mM 8 uL 80 uL
MgCl2 50 mM 3,7 mM 5,92 uL 80 uL
Cebador 1 2 mM 0,2 mM 8 uL 80 uL
Cebador 2 2 mM 0,2 mM 8 uL 80 uL
Taq 5 u/L 1u 1,6 uL 80 uL
polimerasa
H2O= 16,48
uL
Tabla 2. Protocolo a ingresar en el termociclador para cada etapa de la PCR.

Etapas N° de Ciclos Temperatura Tiempo

Desnaturalización inicial 1 94 °C 2 min

Desnaturalización 30 94 °C 15 seg

Alineación 30 52 °C 1 min

Extensión 30 72 °C 1 min

Extensión final 1 72 °C 5 min

Finalmente se obtuvo la ampliación resultante
el cual sería utilizado o llevado a realizar una
electroforesis. Más adelante para la
electroforesis se procedió a pesar 1.5 g de
agarosa y se diluyeron en 10 ml de tampón
Dejó enfriar por 20min. Una vez listo el gel,
se depositaron las muestras de la siguiente
manera: dos marcadores, controles
negativos y positivos, en el pozo #1 se le
adiciono los 4 cebadores (1, 2, Rme y Fme)
nuestro pozo fue el número 9, en total fueron
TBE 5X , posteriormente agregó el buffer
Green 3ml,luego se calentó hasta disolver la
agarosa ,luego se adiciono el SYBR safe
luego se depositó la agarosa en el molde ya
nivelado, junto con el peine insertado y se d
10 pozos. Para hacer la corrida se colocó la
tapa al instrumento (tanque de electroforesis)
y se trabajó a 100 voltios por 60 minutos.
Finalmente se llevó el molde a la cámara de
electroforesis que nos permitió visualizar las
bandas de ADN.

RESULTADOS Y DISCUSIONES.

Al finalizar el experimento de PCR y la electroforesis en el gel de agarosa se obtuvo el siguiente

resultado:

Fig1. Gel de electroforesis que muestra productos de PCR generados a partir de Escherichiacoli
Cepa K12 [ATCC ® 10798] del kit comercial Bacterial Transformation Kit de Carolina. (resultado
negativo)

Al observar los resultados obtenidos se puede Por otro lado, también se puede observar que
inferir que …… el control negativo amplifico por lo que se
asume que se contamino, se podría decir
entonces que hubo alguna clase de
contaminación por parte de los pozos
adyacentes, pero en mínimas cantidades, ya
que con poca cantidad de DNA molde se
obtendrá producto de amplificación, debido a
CONCLUSIONES
A partir de la realización de esta práctica se
puede concluir que se cumplieron los
objetivos propuestos aunque, no se obtuviera
la amplificación de ADN de E .coli mediante
una PCR y electroforesis.
Quedo claro también que hay que tener
mucho cuidado al momento de realizar las
pruebas ya que cualquier error cometido
puede alterar los resultados como se pudo
evidenciar que no ha haya una amplificación
en los pozos ya que sufrieron de una leve
contaminación.
Se demostró que los métodos de PCR y
electroforesis son eficaces en la amplificación
e identificación de muestras de DNA de un
gen específico no solo de E. Collí sino de una
amplia gama de organismos.
CUESTIONARIO
5.1 cuales son los diferentes tipos o
variantes de la técnica de PCR y
describa la diferencia o modificación a
la técnica inicial.
A continuación, algunas variantes
importantes del PCR.
PCR “anidada”:
Técnica muy sensible de PCR en la que el
producto de una amplificación es utilizado
como molde para realizar una segunda
amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada,
es decir, cuando tenemos el primer amplicón
se pueden unir los cebadores y se hace de
nuevo una amplificación dentro del amplicón
inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de
brindar alta sensibilidad y especificidad. La
especificidad aumenta porque como es
la alta sensibilidad de la PCR ; dado que en
cada ciclo se duplica la cantidad de DNA
correspondiente al fragmento a amplificar,
aunque exista poco molde inicial se generará
la cantidad suficiente para ser visualizada.[2]
amplificación de un amplicón obtenido
previamente, los cebadores sólo van a
hibridar en un sitio dentro de la molécula y el
resultado será una única banda. Así, evitamos
posibles hibridaciones inespecíficas de los
cebadores. La desventaja de esta técnica es
que no nos permite cuantificar la muestra.
PCR “larga”:
Denominada L-PCR (long PCR) o LA-
PCR (Longer and Accurate PCR, “PCR más
larga y exacta”), su objetivo es superar los
límites de la PCR convencional para amplificar
con fidelidad regiones diana de gran tamaño
(entre 5 y 40 kb). El principal factor limitante
es la ausencia de actividad correctora de
pruebas en la Taq polimerasa, por lo que se
añade una cantidad menor de otra enzima
con capacidad de corrección de pruebas (por
ejemplo, la Pfu, polimerasa de Pyrococcus
furiosus) para contrarrestar la carencia de
esta actividad y, al mismo tiempo, seguir
aprovechando la eficacia de elongación de la
polimerasa principal (Taq o similar).
PCR in situ:
La PCR in situ consiste en una reacción de
PCR en secciones histológicas o células,
donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificación. Es
realizada sobre preparaciones fijas en un
portaobjetos. En la técnica de PCR in situse
realiza una primera amplificación de ADN
blanco y luego detección mediante
hibridación in situ convencional con sondas
de ADN/ARN. De esta manera pueden
detectarse cantidades pequeñísimas de
genoma. Esta tecnología es de gran alcance
en la capacidad de amplificar específicamente
una población de secuencias de menor
representación.
PCR inversa:
Esta variante se emplea para clonar regiones
desconocidas de un ADN, situadas en
posición vecinal a secuencias diana
conocidas. Es decir, en lugar de amplificar la
región interna, flanqueada por los dos
cebadores (PCR convencional), se amplifica la
región externa, que flanquea a los cebadores.
Para ello es necesario cortar el ADN a ambos
lados de la región diana con una enzima de
restricción, de tal forma que los extremos
cohesivos resultantes puedan hibridar entre
sí, formando una molécula circular. Ésta es
cerrada por una ligasa y se realiza el PCR con
cebadores que hibridan con los extremos 5’
de la secuencia conocida, por lo que la
elongación se extenderá alrededor del círculo.
Se generan copias de un ADN lineal
delimitado, como en el ADN normal, por la
posición de ambos cebadores.
PCR con adaptadores:
También puede amplificarse una región de
ADN de secuencia desconocida ligando a sus
fragmentos de restricción unos adaptadores
oligonucleótidos sintéticos con extremos
cohesivos compatibles con los generados en
la muestra. A continuación, una vez
desnaturalizados, se añaden cebadores
específicos para las secuencias 3’ de los
adaptadores. Se amplifica así el conjunto de
adaptadores y secuencia diana, pero debe
señalarse que se amplifican por igual todos
los fragmentos de restricción presentes, no
uno sólo.
PCR asimétrica:
En este caso, se trata de generar copias de
hebra sencilla de un ADN. En la variante más
simple, se añaden cantidades muy diferentes
de ambos cebadores, de modo que tras los
primeros ciclos de PCR uno de ellos se agota
y, disponibles ya suficientes copias del ADN
diana, sólo una de sus hebras sigue
amplificándose gracias al cebador más
abundante.
PCR múltiple:
PCR en la cual se amplifica simultáneamente
más de una secuencia. Para ello, se
combinan dos o más pares de cebadores en
un mismo tubo, junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades
suficientes, para amplificar simultáneamente
varios segmentos de ADN. Ventajas:
información sobre varios locus en una sola
reacción, menor cantidad de molde para el
análisis, menor cantidad de reactivos, rápida
construcción de bases de
datos. Desventajas: para llevarla a cabo
adecuadamente y sin errores, se requiere de
una cuidadosa optimización del proceso.
RT-PCR:
Dado que el ARN usualmente es de una sola
hebra y es sensible al calor, es necesario
hacer una transcripción reversa (RT) antes de
iniciar la amplificación por PCR. La
transcripción reversa genera una copia de la
hebra de ARN, pero esta copia es ADN
complementario (CDNA o DNAc en inglés) el
cual es estable al calor y puede resistir la
metodología PCR.
Los pasos de la RT-PCR son:
1. Transcripción reversa: Unión del primer a
la secuencia de ARN objetivo.
2. Transcripción reversa: La polimerasa
rTth cataliza la extensión del primer mediante
la incorporación de nucleótidos
complementarios.
3. Fin de transcripción reversa, se obtiene la
hebra del cDNA complementario al ARN.
4. PCR.
El ARNm es copiado a cDNA (ADN
complementario) por la transcriptasa reversa
usando un primer dT (los primers al azar se
pueden también utilizar). En PCR en tiempo
real, se utiliza generalmente una
transcriptasa reversa que tenga una actividad
endo H. Esto elimina el mRNA permitiendo
que la segunda hebra de ADN sea formada.
Se adiciona una mezcla de PCR que incluya
una polimerasa termoestable (tal como la Taq
polimerasa), los primers específicos para el
gen de interés, los deoxinucleótidos y un
buffer conveniente.
Conversión de ARNm a cDNA por la enzima
transcriptasa inversa.
El cDNA se desnaturaliza a más de 90ºC
(~94ºC), las dos hebras se separan. A 50 o
60ºC los primers específicos se alinean con el
sitio complementario en cada cadena. Los
sitios de unión a los primers deben estar
separados 400 bases, pero generalmente se
encuentran a 100 bases de distancia
especialmente cuando se usa el PCR en
tiempo real A 72°C la polimerasa extiende el
DNA desde los primers. Se obtienen 4
cadenas de cDNA.
Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de
cDNA, los productos de reacción son
analizados usualmente por electroforesis en
gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de
etidio. Los geles de agarosa para analizar los
productos de cDNA de la RT-PCR no nos
permiten la cuantificación ya que el bromuro
de etidio es muy insensible y cuando una
banda es perceptible sobrepasa la etapa
logarítmica de amplificación.
El SYBR green fluorece brillantemente cuando
solo cuando se une a ADN de doble cadena
El bromuro de etidio es un colorante que se
une a la doble cadena de ADN intercalándose
entre los pares de bases. Emite luz
fluorescente cuando se irradia en la parte UV
del espectro. Sin embargo, la fluorescencia
no es muy brillante. Otros colorantes, como
el SYBR green, que son mucho más
fluorescentes que el bromuro de etidio, se
utilizan en el PCR en tiempo real.
PCR en tiempo real o PCR
cuantitativa (qPCR):
Reacción de PCR cuya principal característica
es que permite cuantificar la cantidad de ADN
o ARN presentes en la muestra original, o
para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de ADN específicas a
partir de su temperatura de fusión (también
denominado valor Tm, del inglés melting
temperature).
Se puede dividir en las técnicas basadas en
fluorocromos no específicos y en las técnicas
basadas en sondas específicas.
En las técnicas basadas en fluorocromos el
ADN, que ve multiplicada su cantidad con
cada ciclo, se une al fluorocromo
(generalmente SYBR Green) produciendo
fluorescencia que es medida por el
termociclador apto para PCR en tiempo real.
Permite cuantificar sólo una secuencia por
reacción pero tiene la ventaja de utilizar
cebadores normales para su realización. Es
mucho más económica que la que usa sondas
específicas.
Las técnicas basadas en sondas específicas
utilizan una sonda unida a dos fluorocromos
que hibrida en la zona intermedia entre el
cebador directo (forward) y el inverso
(reverse); cuando la sonda está intacta,
presenta una transferencia energética de
fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha
FRET no se produce cuando la sonda está
dañada y los dos fluorocromos están
distantes, producto de la actividad 5'-3'
exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto
permite monitorizar el cambio del patrón de
fluorescencia y deducir el nivel de
amplificación del gen.
La mayoría de estos inconvenientes se han
solucionado con la introducción de la PCR
realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina
cualquier proceso post-PCR puesto que
monitoriza la progresión de la amplificación
en el momento en que ocurre. A diferencia de
la PCR convencional (en punto final), que
mide la acumulación del ADN al final de un
número predeterminado de ciclos, con Q-PCR
esto se hace durante el proceso de
amplificación usando fluorescencia, de forma
que su aumento es proporcional a la cantidad
de ADN formada. El proceso se puede
automatizar fácilmente usando un sistema
que realice la amplificación (termociclador) y
que a su vez sea capaz de leer fluorescencia.
Existe una amplia oferta de aparatos en el
mercado. La mayoría pueden trabajar con las
diversas opciones de marcado fluorescente y
son "abiertos", es decir, permiten programar
las condiciones de amplificación y lectura de
forma que su uso no queda limitado a unos
reactivos determinados.
MODIFICACIONES:
Han surgido numerosas modificaciones
derivadas del método básico inicial, con el
propósito de mejorar el rendimiento o la
especificidad, adaptarse a muestras
particulares, amplificar moléculas de ARN en
lugar de ADN, producir cadenas de hebra
sencilla… Por ejemplo, una modificación muy
común en la actualidad
(denominada “comienzo en caliente”, hot star
PCR) consiste en privar a la mezcla de
reacción de alguno de sus componentes
(frecuentemente la polimerasa) hasta que se
haya alcanzado una temperatura superior a la
de templado. De este modo, se evita la
elongación de cebadores asociados
inicialmente con poco rigor (a secuencias de
homología parcial con la diana) y, como
resultado, se aumenta mucho la especificidad
de la amplificación.
5.2 En la práctica, la PCR puede fallar
por varias razones, pero normalmente
es debido a su sensibilidad a la
contaminación, que a veces provoca la
amplificación de ADN “falso”. ¿Qué
técnicas o procesos se han desarrollado
para optimizar la PCR?
La contaminación con ADNs extraños puede
solucionarse con protocolos y procedimientos
que separen las reacciones pre-PCR de los
contaminantes potenciales del ADN. Esto
normalmente implica la separación espacial
de las áreas de realización de la PCR de las
de análisis o purificación de los productos de
PCR, y la limpieza exhaustiva de la superficie
de trabajo entre la realización de una PCR y
la siguiente. Las técnicas de diseño de
primers son importantes en la mejora de la
obtención de productos de PCR y en evitar la
formación de productos falsos, y el uso de
componentes alternativos para los buffers o
las enzimas polimerasas pueden ayudar en la
amplificación de regiones de ADN largas o, de
cualquier otra forma, problemáticas.
5.3 En que consiste la PCR en tiempo
real (Q-PCR).
La PCR en tiempo real, los procesos de
amplificación y detección se producen de
manera simultánea en el mismo vial cerrado,
sin necesidad de ninguna acción posterior.
Además, mediante detección por
fluorescencia se puede medir durante la
amplificación la cantidad de ADN sintetizado
en cada momento, ya que la emisión de
fluorescencia producida en la reacción es
proporcional a la cantidad de ADN formado.
Esto permite conocer y registrar en todo
momento la cinética de la reacción de
amplificación. Los termocicladores para llevar
a cabo la PCR a tiempo real incorporan un
lector de fluorescencia y están diseñados
para poder medir, en cualquier momento, la
fluorescencia emitida en cada uno de los
viales donde se realice la amplificación. Los
sistemas de detección por fluorescencia
empleados en la PCR a tiempo real pueden
ser de dos tipos: agentes intercalantes y
sondas específicas marcadas con
fluorocromos, diseñadas, como veremos más
adelante, de manera especial.
Reacción de PCR cuya principal característica
es que permite cuantificar la cantidad de ADN
o ARN presentes en la muestra original, o
para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de DNA específicas a
partir de su temperatura de fusión (también
denominado valor Tm, del inglés melting
temperatura). Se puede dividir en las técnicas
basadas en fluorocromos no específicos y en
técnicas basadas en sondas específicas.
5.4 ¿Cuáles son las principales Clonamiento de Genes: La PCR es
aplicaciones en la actualidad de esta habitualmente usada para amplificar un
técnica y en que campos? determinado gen o un mRNA
(representado por un cDNA), que puede
Huella digital genética: Es una técnica
introducirse en un vector y luego en un
forense que permite identificar a una
organismo, que al duplicarse también
persona comparando su DNA con el de
duplicará el gen que nos interesa. Así
una muestra obtenida, por ejemplo, de la
podemos tener una cantidad suficiente de
escena de un crimen. Como la muestra
un gen o cDNA, por ejemplo, para
puede ser muy escasa, la PCR permite
secuenciarlo o producir a gran escala la
aumentar la cantidad de DNA
proteína que este gen codifica.
amplificando ciertos segmentos Mutagénesis: Con variaciones en la
polimórficos (variables en la población),
secuencia de los partidores, se puede
para luego separarlos mediante
producir un segmento de DNA que
electroforesis, lo que se conoce como
presente diferencia en una o más bases
DNA fingerprint o huella digital.
respecto al DNA original. Así se puede
Test de Paternidad: Amplificando por
alterar una proteína para estudiar o
PCR fragmentos polimórficos de DNA de
anular su función. Esta mutación puede
la madre, del niño y de él o los presuntos
ser en un sitio determinado de un gen
padres, y separándolo mediante
(sitio dirigida) o en un lugar al azar de un
electroforesis, se puede visualizar una gen o genoma.
serie de segmentos que tiene el niño, que
Análisis de DNA antiguo: Con la PCR
debe compartir con la madre y padre se puede analizar DNA que tiene miles de
biológicos.
años de antigüedad, lo que ha permitido
Detección de Enfermedades
estudiar muestras obtenidas desde
Hereditarias: Cada gen en estudio
momias y de restos de animales extintos,
puede ser amplificado fácilmente por
como algunos ejemplos.
PCR, con los partidores adecuados, y
Genotipificacion de polimorfismos:
luego ser secuenciado, para así
Mediante el uso de la PCR se puede
determinar si un individuo porta alguna
determinar el genotipo de un individuo
mutación que explica la presencia de una
para un polimorfismo dado, como un
enfermedad o su aparición en el futuro, microsatélite o un SNP (single nucleotide
la que puede ser heredada a sus hijos.
polymorphism). En este último caso
Comparación de la expresión génica:
necesitamos dos partidores para un
Al introducir una modificación en la PCR
mismo extremo del segmento, los cuales
clásica se puede estimar la cantidad de
varían en sólo una base en el extremo 3,
mRNA de un gen determinado en ciertas
lo que generará una amplificación alelo-
condiciones experimentales. Al extraer el
específica, de acuerdo al alelo del SNP
RNA total de una célula y con el uso de la
que tenga el individuo en estudio. Estos
transcriptasa inversa, se puede producir
polimorfismos son muy útiles para
un DNA complementario (cDNA) de todos
estudios poblacionales y para relacionar
los mRNA o de alguno en particular. Con
un gen o una región cromosómica con
este cDNA se puede hacer una PCR para una enfermedad, ya sea mediante
amplificarlo y facilitar su cuantificación.
estudios de asociación o ligamiento.
Esto se conoce como RT-PCR y permite
estimar cuanto se expresa uno o varios
genes en una célula en una condición de
REFERENCIAS
cultivo determinada.
[1]https://assets.thermofisher.com/TFSAssets
/LSG/manuals/MAN0013008_GeneRuler_100b
p_Plus_DNALadder_50ug_UG.pdf

[2] Higuchi, R.; Fockler, C.; Dollinger, G.;

Watson, R. 1993. Kinetic PCR analysis:
realtime monitoring of DNA amplification
reactions. Bio/Technology 11: 1026-1030.

[3] Simpson, C.G.; Sinibaldi, R.; Brown,

J.W.S. 1992. Rapid analysis of plant gene
expression by a novel reverse transcriptase-
PCR method. PlantJournal 2: 835-836