Elucigene® CF-EU2v1

Guía del software de análisis

Fabricado por:
Gen-Probe Life Sciences Ltd.
Heron House
Oaks Business Park
Crewe Road
Wythenshawe
Manchester
M23 9HZ

Para ventas, servicio al cliente y asistencia técnica:

T: +49 (0) 6122 7076451
F: +49 (0) 6122 7076155
E: eucustomerservice@hologic.com
E: eutechnicalsupport@hologic.com

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 1 de 40

Análisis GeneMapper

Introducción
La sección siguiente describe los procedimientos de los resultados del análisis de
muestras Elucigene CF-EU2v1 usando los paquetes de software GeneMapper de
Applied Biosystems (versión 3.7 o superior).

Proceso de análisis
El proceso para el análisis de muestras se resume en el diagrama de flujo siguiente.

Ejecutar las muestras amplificadas en el analizador genético

Abrir el software GeneMapper

Añadir los archivos FSA de las muestras al proyecto

Establecer el método de análisis y el

estándar de tamaño con respecto a CF-EU2v1

Seleccionar los paneles de mezcla adecuados

Ejecutar el análisis de las muestras

Guardar el proyecto

Seleccionar la muestra y abrir la ventana Plot (Gráfico)

Revisar los datos de trazas y

genotipos

Puntuar los genotipos de las muestras

Imprimir las trazas de las muestras Elucigene CF-EU2v1

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 2 de 40

GeneMapper
Abra el archivo del programa GeneMapper e importe los archivos FSA requeridos
haciendo clic en el botón ( ) ‘add samples to project’ (añadir muestras al proyecto).

Navegue a la carpeta del ciclo deseado usando el árbol de carpetas en el lado izquierdo
de la ventana. Seleccione la carpeta y haga clic en el botón ‘Add to List >>’ (Añadir a la
lista >>). La carpeta del ciclo aparecerá ahora en la ventana Samples To Add (muestras
para añadir). Haga doble clic en el icono de la carpeta del ciclo en esta ventana para ver
los archivos FSA individuales que se van a importar (figura 1).

Figura 1: Las muestras se han añadido a la lista y están listas para añadirse al
proyecto.

Las muestras se añaden entonces haciendo clic en el botón ‘añadir’.

Importación de la configuración del análisis CF-EU2v1 de GeneMapper al

GeneMapper Manager
Es necesario importar la configuración de CF-EU2v1 para GeneMapper. Este proceso se
controla a través de la interfaz de ‘GeneMapper Manager’.
La configuración GeneMapper de CF-EU2v1 está disponible en el sitio web de
Gen-Probe: www.gen-probe.com. Ésta se debe descargar en la carpeta adecuada en el
sistema del usuario.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 3 de 40

1. Abra el programa GeneMapper Manager haciendo clic en el icono (figuras 2
y 3).

Figura 2: Abrir GeneMapper Manager

Figura 3: Interfaz de GeneMapper Manager.

2. Seleccione la ficha ‘Analysis Methods’ (Métodos de análisis) y luego haga clic en

el botón Import (Importar).
3. Navegue a los archivos de configuración del análisis CFEU2: 3130 o 3500, e
importe los archivos requeridos (figura 4).

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 4 de 40

 Figura 4: Importación de métodos de análisis.

4. Repita el proceso seleccionando la ficha adecuada e importando los archivos

correspondientes para:
● Table Settings (Ajustes de la tabla)
● Plot Settings (Ajustes del gráfico)
● Size Standards (Estándares de tamaño)
Nota: No es necesario importar archivos para: Cluster Plot Settings (Ajustes de gráficos
de grupos), Matrices (Matrices), SNP Sets (Conjuntos SNP) y Report Settings
(Ajustes de informes).

Importación de los ajustes del panel CF-EU2v1 en el administrador de

paneles
Es necesario importar los ajustes del panel CF-EU2v1 para GeneMapper.
Este proceso se controla a través de la interfaz del ‘Panel Manager’ (Administrador de
paneles).

1. Abra el programa del administrador de paneles de GeneMapper haciendo clic en el

icono .
2. Haga clic en ‘Panel Manager’ (Administrador de paneles) en la ventana de
navegación de la izquierda. El administrador de paneles aparecerá ahora resaltado
en azul.
3. Seleccione ‘File/Import Panels’ (Archivo/Importar paneles). Navegue al archivo del
panel CFEU2 entre los archivos ‘GeneMapper Panels’ .txt (archivos de texto de
los paneles de GeneMapper), e impórtelo (figura 5).
4. Haga clic en el panel ‘CFEU2’ en la ventana de navegación de la izquierda. El panel
CF-EU2v1 aparecerá ahora resaltado en azul.
5. Seleccione ‘File/Import Bin Set’ (Archivo/Importar juego de «bines»). Navegue al
archivo del «bin» CFEU2 entre los archivos ‘GeneMapper Bins’ .txt (archivos de
texto de los «bines» de GeneMapper) (figura 6).
6. Haga clic en ‘Apply’ (Aplicar) y luego en ‘OK’ (Aceptar).

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 5 de 40

 Figura 5: Importación del archivo del panel CFEU2

Figura 6: Importación del archivo del juego de «bines» CFEU2

Modificación del archivo de parámetros del análisis

Puede que sea necesario modificar los ‘Analysis Ranges’ (Rangos del análisis)
predeterminados en la configuración del análisis CF-EU2v1 para tener en cuenta las
condiciones en el transcurso del ciclo. El rango mínimo del análisis dependerá del capilar
y del polímero usados durante la recogida de datos.
Para ver la configuración del análisis actual:
1. Abra ‘GeneMapper Manager’.
2. Seleccione la ficha ‘Analysis Methods’ (Métodos de análisis). El archivo CF-EU2v1
importado figurará en la lista como ‘CFEU2 Analysis Method’ (Método de análisis
CFEU2).
3. Haga clic en ‘CFEU2 Analysis Method’ (Método de análisis CFEU2). La fila
aparecerá ahora resaltada.
4. Haga clic en el botón ‘Open’ (Abrir) y seleccione la ficha ‘Peak Detector’ (Detector
de picos) (figura 7).

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 6 de 40

De forma predeterminada, los rangos del análisis se establecen para empezar en 1600 y
terminar en 8000.

Figura 7: Rangos del análisis (resaltado)

Para encontrar el rango de análisis correcto para su laboratorio:

1. Desde la ventana principal de GeneMapper, haga doble clic en la carpeta del ciclo
importado para ver la lista de archivos FSA que contiene.
2. Seleccione un archivo FSA.
3. Al hacerse clic en la ficha ‘Raw data’ (Datos sin procesar), aparece el
electroferograma de los datos sin procesar.
4. Valiéndose del pico 100 pb GS600v2 LIZ (naranja) como guía, decídase por un
punto de datos que sea aproximadamente 100 puntos de datos más pequeño
(figura 8).

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 7 de 40

 Figura 8: Búsqueda del rango mínimo usando datos sin procesar de la muestra

5. Asegúrese de que el rango de análisis máximo deje un margen para unos 100
puntos de datos después del pico 600 pb GS600v2 LIZ.
6. Introduzca los nuevos valores en el archivo de análisis CF-EU2v1 (acceda a él
según se ha descrito anteriormente).
Puede que sea necesario modificar los ‘Peak Amplitude Thresholds’ (Umbrales de
amplitud de los picos) dependiendo de la concentración de la muestra. Muestras muy
concentradas tendrán un alto nivel de ruido de fondo que podría interferir con el análisis.
Para evitar esto, puede aumentarse el umbral de amplitud de los picos. Por ejemplo, el
colorante verde puede establecerse en 100 en lugar de en 50. De nuevo, esto se hace
en la ficha ‘Peak Detector’ (Detector de picos) en el ‘CFEU2 Analysis method’ (Método
de análisis CFEU2) (figura 7).

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 8 de 40

Análisis y genotipado de archivos CF-EU2v1 importados
1. En la ventana principal de GeneMapper, seleccione ‘CFEU2 Table Settings’
(Ajustes de la tabla CFEU2) (figura 9).

Figura 9: Utilice el menú desplegable para seleccionar los ajustes

de la tabla CFEU2

2. En la ventana principal de GeneMapper, seleccione la primera celda bajo ‘Analysis

Method’ (Método de análisis) y seleccione el método de análisis adecuado del
menú desplegable: CFEU2_3130 o CFEU2_3500. Repita el proceso para el
estándar de tamaño seleccionando ‘CFEU2 size standard’ (estándar de tamaño
CFEU2) del menú desplegable.
3. Seleccione el panel ‘CFEU2’ para cada muestra (figura 10). Para la mezcla A,
seleccione el subpanel que contiene la mezcla A, y para la mezcla B seleccione el
subpanel que contiene la mezcla B.
4. Haga clic en para iniciar el análisis de la muestra.

Figura 10: Selección de los ajustes del panel CFEU2

Revisión de los datos de trazas y genotipos de CF-EU2v1

1. Seleccione ‘Edit/Sort’ (Editar/Ordenar). Ordene las muestras por ‘Sample Name’

(Nombre de la muestra) y haga clic en ‘OK’ (Aceptar).

2. Haga clic en para ‘Display Plots’ (Mostrar gráficos).

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 9 de 40

3. Utilice el menú desplegable para seleccionar los ajustes del gráfico de CF-EU2v1
adecuados:

Para ver la mezcla A con datos poli T seleccione: ‘CFEU2 Plot PT-on’ (Gráfico
CFEU2 con PT activado)

Para ver la mezcla A sin datos poli T seleccione: ‘CFEU2 Plot PT-off’ (Gráfico
CFEU2 con PT desactivado)

Figura 11: Utilice el menú desplegable para seleccionar los ajustes

del gráfico de CFEU2

4. La ventana del gráfico mostrará los datos de las trazas de la muestra (figura 12).
5. Se recomienda que la ventana del gráfico tenga la opción ‘Single click editing’
(Modificación con un clic) activada. Para hacer esto, seleccione ‘Alleles/set click
editing’ (Alelos/definir modificación con clic) y compruebe que esta opción está
marcada.

Figura 12: Ventana del gráfico de la muestra mostrando los datos de las trazas
etiquetadas

Elucigene CF-EU2v1: mezcla A

Elucigene CF-EU2v1: mezcla B

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 10 de 40

Puntuación de picos de diagnóstico
Cada individuo tiene dos copias del gen CFTR. Cuando estas copias poseen la misma
secuencia para cualquier alelo dado, el individuo se describe como homocigoto respecto
a este sitio. Cuando las secuencias de las copias son distintas para un alelo dado, el
individuo se describe como heterocigoto (figura 13).
La mezcla A (mutante) determina si un individuo es portador de una mutación y esto
viene indicado por la presencia de un pico azul. La mezcla mutante contiene también
iniciadores del alelo F508del normal, por lo que esta mezcla puede determinar si un
individuo es normal (pico verde solamente), homocigoto (pico azul solamente) o
heterocigoto (picos azul y verde) respecto a F508del.
Si se observa cualquier otra mutación, la muestra puede amplificarse con la mezcla B
(WT) para determinar el estado homocigoto o heterocigoto. La presencia de un pico
verde para el alelo en cuestión en la mezcla WT indica que el individuo es heterocigoto y
la ausencia de un pico verde indica que el individuo es homocigoto para la mutación en
cuestión.

Figura 13: Ejemplos de individuos a) normales, b) heterocigotos y c) homocigotos con

respecto al alelo 711+1G>T
A B C

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 11 de 40

Un individuo portador de dos mutaciones diferentes se denomina heterocigoto
compuesto (figura 14).

Figura 14: Ejemplos de muestras heterocigotas compuestas. A) G85E/D1152H

B) F508del/E60X
A

Se incluyen dos marcadores STR hipervariables (rojos) en ambas muestras. Esto

permite la comparación entre la muestra amplificada con la mezcla mutante y la muestra
amplificada con la mezcla WT para reducir la posibilidad de confundir la muestra
(figura 15). La ausencia de estos marcadores STR indica una muestra fallida. La
presencia de los marcadores STR a ufr muy bajas indica una muestra débil que debería
analizarse con cuidado.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 12 de 40

Figura 15: Gráficos de la mezcla A y de la mezcla B mostrando los dos marcadores STR
para un individuo

Los marcadores STR hipervariables pueden ocultarse desactivando los datos del
colorante rojo en la ventana del gráfico. La desactivación de los datos de los colorantes
azul y verde facilita la visualización de los marcadores STR.

Designación de los marcadores de GeneMapper

Al ver datos de trazas analizadas en GeneMapper, los picos de diagnóstico en la mezcla
A se etiquetarán con el nombre y el número del marcador. Los picos de diagnóstico en la
mezcla B se etiquetarán únicamente con el número del marcador.
Los datos del pico para un marcador detectado etiquetado pueden verse con más detalle
situando el cursor del ratón encima de la etiqueta del marcador de interés; al hacer esto,
aparecerá el nombre del marcador, el tamaño del pico y la altura del pico en la parte
inferior de la ventana de gráficos de la muestra.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 13 de 40

La correlación entre los números de los marcadores y los marcadores se indica a
continuación.
Marcadores detectados
Rango de tamaño
N.º del
Marcador en pb de producto
marcador
(datos 3130/POP7)
01 R347H 110.5-116.5
02 R347P 117-123
03 2789+5 G>A 124-130
04 3120+1 G>A 132.5-138.5
05 711+1 G>T 141.5-147.5
06 R334W 147.5-154
07 I507del 156-162.5
08 F508del 163-169
09 3849+10kb C>T 172-178
10 1677delTA 180-188.5
11 1078delT 193-199
12 V520F 206-211.5
13 L206W 215-220
14 W1282X 224.5-230.5
15 R560T 234.5-240.5
16 2347delG 242-246
17 Q890X 250-252
18 R553X 255.5-261.5
19 G551D 265-267
20 S549R(T>G) 267.5-269.5
21 S549N 275-280
22 M1101K 282-288
23 G542X 289-295.5
24 3905insT 297-303.5
25 Y1092X(C>A) 308-314
26 S1251N 315-321
27 444delA 323-326
28 1811+1.6kb A>G 332-338
29 1717-1 G>A 341.5-347.5
30 R117H 349-355
31 R117C 357-360
32 N1303K 360-366.5
33 Y122X 367-373
34 394delTT 377-383
35 G85E 384-390
36 R1066C 391-397
37 1898+1 G>A 398.5-404.5
38 W846X 406-411
39 2184delA 413-418
40 D1152H 423-429
41 CFTRdel2_3 433-439
42 P67L 439.5-445.5
43 2143delT 446-450.5
44 E60X 453.5-460.5
45 3659delC 461-465.5
46 3272 470-476
47 621+1G 485.5-491.5
48 A455E 496-503
49 R1162X 506-512
50 R1158X 516.5-524.5
5T* IVS8-5T 110-130
7T IVS8-7T 140-160
9T IVS8-9T 175-195

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 14 de 40

* tamaños del alelo 5T

Rango de tamaño en
Marcador pb de producto
POP7/3130
5T (9) 117,25 – 118,75
5T (10) 119,25 – 120,75
5T (11) 121,25 – 122,75
5T (12) 123,25 – 124,75
5T (13) 125,25 – 126,75

Nota: Los rangos de tamaño para cada marcador podrían variar debido al instrumento y
al polímero utilizados.

Marcador dI507del de CF-EU2v1

Debido al locus de la deleción de I507 en el gen CFTR, es posible detectar la presencia
de este marcador a través de un desplazamiento de 3 pares de base (pb) en el tamaño
del pico F508del, así como de un pico específico mutante I507del.

En los casos en que un único alelo mutante I507del esté presente, el pico mutante
I507del se observará como un pico azul a 159 pb aproximadamente. Se observará la
presencia de un pico natural (WT, wild type) para F508del, pero a la mitad
aproximadamente de la altura del pico que normalmente se asocia con un genotipo
natural homocigoto; esto se ve como un pico verde a unos 167 pb. Se observará también
un pico verde adicional a unos 164 pb (figura 16).

Figura 16: Muestra heterocigota I507del

Una muestra I507del/F508del dará lugar a un pico WT F508del verde desplazado, a

aproximadamente 164 pb (3 pb menos de lo normal), un pico mutante F508del azul a
166 pb y un pico mutante I507del azul a unos 159 pb.

Una muestra I507del/I507del dará lugar a un pico azul a aproximadamente 159 pb y a un

único pico verde a aproximadamente 164 pb (3 pb más pequeño que el pico F508del
normal observado cuando I507del no está presente).

Debe hacerse notar que la presencia de una mutación F508del impide la acción del
iniciador I507 WT. Por consiguiente, un individuo que sea homocigoto para
F508del, no tendrá un pico I507 WT en la mezcla WT y un individuo que sea
heterocigoto para F508del tendrá un pico I507 WT de altura reducida en la
mezcla WT.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 15 de 40

Marcadores poli-T
Elucigene CF-EU2v1 contiene iniciadores ARMS fluorescentes etiquetados con NED
(amarillo) para la detección de las variantes IVS8-5T, IVS8-7T y IVS8-9T. La información
de los poli-T para una muestra puede determinarse haciendo visibles los datos del
colorante amarillo dentro de la configuración CF-EU2v1 de GeneMapper. El usuario
puede por consiguiente elegir ver estos datos según estime necesario dentro del
procedimiento de prueba del laboratorio.

Nota: No hay iniciadores poli-T en la mezcla B, por lo que los productos se visualizarán
únicamente en muestras de la mezcla A.

Análisis de los poli-T

Los ejemplos siguientes de GeneMapper muestran morfologías de picos que son
características de las regiones de variantes IVS8 analizadas.

Ejemplo 1: Muestra IVS8-5T / IVS8-9T

El ejemplo a continuación muestra el resultado de la mezcla A tal como se observa
utilizando los ajustes del gráfico ‘CFEU2 Plot PT-on’ (gráfico CFEU2 PT-activado).

La supresión de la información de los colores verde y azul en los ajustes del gráfico para
una misma muestra permite ver claramente el marcador poli-T, que se ilustra a
continuación.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 16 de 40

Ejemplo 2: Muestra IVS8-7T / IVS8-7T

Ejemplo 3: Muestra IVS8-7T / IVS8-7T (variabilidad de las repeticiones de TG)

Los dos picos se deben a la heterocigocidad de la región de las repeticiones de TG, que
está dentro de nuestro amplicón. Este efecto podría también observarse con muestras
homocigotas 5T y 9T. Por lo tanto, es posible determinar el número de repeticiones de
TG dentro de cada variante de politimidina IVS8.

Ejemplo 4: Muestra IVS8-9T / IVS8-9T

Aviso importante
Bajo ciertas condiciones del ensayo, es posible que artefactos observables de los
colorantes interfieran con el análisis sistemático. Es importante que el usuario tenga en
cuenta la posibilidad de interferencia para garantizar el análisis correcto de los datos.

Los artefactos etiquetados de los colorantes pueden observarse como pequeños picos
azules o verdes. Estos artefactos de los colorantes tienen por lo general un tamaño de
menos de 100 pb y normalmente no interfieren con el análisis de los datos. Bajo
condiciones normales, estos picos de artefactos son insignificantes en relación con los
picos verdaderos del amplicón y no causan ningún problema con el análisis. Sin
embargo, cuando la cantidad de amplicón cargada es pequeña, quizá debido al DNA
genómico limitador, los picos de los artefactos de colorantes aparecen relativamente más
grandes, siendo posible analizarlos como picos verdaderos del amplicón.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 17 de 40

Análisis GeneMarker

Introducción
La sección siguiente describe los procedimientos para los resultados del análisis de
muestras Elucigene CF-EU2v1 usando el paquete de software GeneMarker, versión 1.95
de SoftGenetics.

Proceso de análisis
El proceso para el análisis de muestras se describe en el diagrama de flujo que se
muestra a continuación.

Ejecutar las muestras amplificadas en el analizador genético

Abrir el software GeneMarker

Añadir los archivos FSA de las muestras al proyecto

Seleccionar el panel CF-EU2v1 y la

configuración de análisis adecuados

Ejecutar el análisis de las muestras

Seleccionar la aplicación:
ARMS/Comparative Analysis
(ARMS/Análisis comparativo)

Seleccionar “Mutant + Wild-type”

(Mutante + Natural) o “Mutant Only”
(Mutante solamente)

Seleccionar Print (Imprimir)

Seleccionar Preview (Vista previa)

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 18 de 40

Adición de archivos de muestras a GeneMarker
Abra el archivo del programa GeneMarker, y cuando se le pida, seleccione ‘Open Data’
(Abrir datos). Aparecerá el cuadro Open Data Files (Abrir archivos de datos).
Haga clic en el botón ‘Add’ (Añadir). Aparecerá el cuadro de diálogo Open (Abrir).
Navegue al directorio que contiene los archivos de datos sin procesar
● Seleccione todos los archivos mediante CTRL+A o utilice las teclas CTRL y/o
SHIFT (MAYÚS) para seleccionar muestras individuales
● Haga clic en el botón Open (Abrir) en el cuadro de diálogo Open (Abrir)
Los archivos seleccionados aparecerán en el campo Data File List (Lista de archivos de
datos) (figura 1).
Haga clic en el botón OK (Aceptar) en el cuadro Open Data Files (Abrir archivos de
datos) y las muestras se transferirán al GeneMarker.
El software abrirá entonces automáticamente la ventana Raw Data Analysis (Análisis de
datos sin procesar) (figura 2).

Figura 1: Muestras añadidas a la lista de archivos de datos.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 19 de 40

 Figura 2: Ventana de análisis de datos sin procesar

Árbol de muestras Imagen de gel sintética Traza de datos sin procesar

Procesamiento de datos
Una vez cargados en GeneMarker, los archivos de datos sin procesar están listos para
procesarse. El paso de procesamiento consiste en la aplicación de un estándar de
tamaño, la filtración de los picos de ruido y la comparación con un panel alélico conocido
si se desea.
GeneMarker combina todos estos pasos en una simple herramienta denominada Run
Wizard (Asistente de ciclos) (figura 3). Para acceder al Run Wizard (Asistente de ciclos),
simplemente haga clic en el icono para ejecutar el proyecto en la barra de herramientas
principal.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 20 de 40

 Figura 3: Ventana Run Wizard – Template Selection
(Asistente de ciclos – Selección de plantillas)

Ventana Run Wizard – Template Selection (Asistente de ciclos – Selección de

plantillas)
Cree una plantilla CF-EU2v1 y seleccione los ajustes adecuados de Size Standard
(Estándar de tamaño), Standard Colour (Color estándar) y Analysis type (Tipo de
análisis) (como se ilustra en la figura 3).
Seleccione el panel adecuado dependiendo de la plataforma que se estén utilizando. ej.,
CF-EU2v1_POP7. Estos están disponibles en el sitio web Gen-Probe: www.gen-
probe.com. Ésta se debe descargar en la carpeta adecuada en el sistema del usuario.

Haga clic en ‘Next’ (Siguiente) para continuar.

Run Wizard – Data Process (Asistente de ciclos – Proceso de datos)

La ventana Data Process (Proceso de datos) de Run Wizard (Asistente de ciclos) permite
al usuario seleccionar los parámetros de filtración de picos.
Asegúrese de que los ajustes se seleccionen tal como se ilustra en la figura 4 siguiente.
Haga clic en ‘Next’ (Siguiente) para continuar.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 21 de 40

Figura 4: Ventana Run Wizard – Data Process (Asistente de ciclos – Proceso de datos)

NOTA: Para 3500 datos aumente el valor de Min Intensity (Intensidad mínima)
a 300.

Run Wizard – Additional settings (Asistente de ciclos – Ajustes adicionales)

La realización del análisis CF-EU2v1 no requiere ajustes adicionales.
Haga clic en ‘OK’ (Aceptar) para continuar.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 22 de 40

 Figura 5: Run Wizard – Additional Settings (Asistente de ciclos – Ajustes adicionales)

Cuadro Data Processing (Procesamiento de datos)

Después de hacer clic en OK (Aceptar) en el cuadro Run Wizard - Additional Settings
(Asistente de ciclos – Ajustes adicionales), aparece el cuadro Data Processing
(Procesamiento de datos) (figura 6). Los datos sin procesar se procesan y se mide su
tamaño, luego se aplican los parámetros de filtración, y se aplica el panel CF-EU2v1
seleccionado.
Haga clic en ‘OK’ (Aceptar) en el cuadro Data Processing (Procesamiento de datos)
cuando el análisis haya terminado.

Figura 6: Cuadro Data Processing (Procesamiento de datos)

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 23 de 40

Ventana principal de análisis
La ventana principal de análisis (figura 7) de GeneMarker presenta un diseño intuitivo.
Este diseño incluye:
● ‘The sample files list’ (La lista de archivos de muestra): en el lado izquierdo de
la ventana.
● ‘The Synthetic Gel Image’ (La imagen de gel sintética): en la parte superior de
la ventana.
● ‘Data Electropherograms’ (Los electroferogramas de datos): debajo de la
imagen de gel.
● ‘A Report Table’ (La tabla del informe): en el lado derecho de la ventana.
En esta ventana es importante comprobar que se ha asignado el nombre correcto a
todos los picos pertinentes en cada perfil.
Haga doble clic en cada una de las muestras del árbol de archivos de muestras en el
lado izquierdo de la pantalla. Haga clic con el botón derecho en cada pico en cuestión y
elija una de las opciones del cuadro de diálogo (p. ej., editar o eliminar alelo, confirmar o
anular confirmación) según corresponda.
Donde no se haya identificado un pico por estar debajo del umbral, se puede asignar un
alelo manualmente. Seleccione el marcador adecuado del cuadro desplegable ‘Marker’
(Marcador); con la tecla Mayús pulsada, haga clic con el botón derecho en el pico en
cuestión; haga clic en ‘Insert Allele’ (Insertar alelo) y luego en ‘OK’ (Aceptar). Cuando
se analicen conjuntamente datos de las mezclas A y B, es importante garantizar que
todos los picos STR se han identificado.
Una vez finalizado este proceso para todas las muestras, puede realizarse la siguiente
fase del análisis.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 24 de 40

 Figura 7: Ventana principal de análisis

Árbol de archivos Imagen de gel Tabla de

Electroferograma
de muestras sintética informe

Análisis de mutante solamente (mezcla A)

Desde la ventana principal de análisis, seleccione la opción de menú desplegable
‘Applications’ (Aplicaciones) en la parte superior de la pantalla.
Seleccione ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análisis comparativo) seguido de
‘Mutant Only’ (Mutante solamente). En el cuadro de diálogo ‘ARMS/Comparative Print
Settings’ (Ajustes de impresión ARMS/comparativo), seleccione ‘Poly-T Analysis’
(Análisis poli-T) si este análisis se desea (figura 8).
Haga clic en ‘Preview’ (Vista previa) en el cuadro de diálogo ‘ARMS/Comparative Print
Settings’ (Ajustes de impresión ARMS/comparativo) para ver el informe Elucigene
CF-EU2v1 mutante solamente (mezcla A) (figura 11). Desde esta ventana, el usuario
puede revisar e imprimir el informe de cada muestra.
Haga clic en ‘OK’ (Aceptar) en el cuadro de diálogo ‘ARMS/Comparative Print
Settings’ (Ajustes de impresión ARMS/comparativo) para imprimir el informe Elucigene
CF-EU2v1 mutante solamente (mezcla A) (figura 11) sin revisarlo.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 25 de 40

 Figura 8: Cuadro ARMS/Comparative Print Settings (Ajustes de impresión
ARMS/comparativo) para mutante solamente

Vista previa del informe Elucigene CF-EU2v1

Informe mutante solamente (mezcla A)
Haga clic en ‘Preview’ (Vista previa) en el cuadro de diálogo ‘ARMS/Comparative Print
Settings’ (Ajustes de impresión ARMS/comparativo) para ver el informe Elucigene
CF-EU2v1 mezcla A (figura 11). Desde esta ventana, el usuario puede revisar e imprimir
el informe de cada muestra.
Figura 11: Ventana del informe CF-EU2v1 mutante solamente (mezcla A)

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 26 de 40

El informe Elucigene CF-EU2v1 incluye las características siguientes:
● ‘Report Header’ (Encabezado del informe): contiene información sobre el
análisis, el proyecto, la muestra y los parámetros.
● ‘Signature Box’ (Cuadro para la firma): espacio para que los revisores del
informe introduzcan la fecha y sus iniciales.
● ‘Electropherogram’ (Electroferograma): parecido a la ventana
ARMS/Comparative analysis (ARMS/Análisis comparativo), muestra los
colores de todos los colorantes de la traza de la muestra.
● ‘Report Table’ (Tabla del informe): la tabla principal muestra todas las
mutaciones analizadas con este kit. La presencia o ausencia de una mutación
se indica mediante 1 ó 0. Tenga en cuenta que el estado de cigocidad total
solo puede notificarse para el locus F508 cuando se está analizando la mezcla
A solamente. La segunda tabla muestra el estado poli-T de la muestra si dicha
función se ha seleccionado.

Análisis de la mezcla mutante + natural (A y B)

Desde la ventana principal de análisis, seleccione la opción de menú desplegable ‘Tools’
(Herramientas) de la parte superior de la pantalla seguida de ‘File Name Group Tool’
(Herramienta de grupos de nombres de archivo). Se abrirá la pantalla ‘File Name Group
Editor’ (Editor de grupos de nombres de archivo). En el cuadro ‘Compare by Section’
(Comparar por sección), escriba el número de la columna en la que aparece el nombre
de la muestra. En el cuadro ‘Match to Identifier by Section’ (Emparejar a identificador
por sección), escriba el número de la columna en la que aparece el tipo de la mezcla,
esto es, A o B. En el cuadro ‘Control Identifier’ (Identificador de control), escriba ‘A’.
Haga clic en el botón ‘Match’ (Emparejar) y las muestras emparejadas aparecerán en el
lado derecho del cuadro de diálogo (figura 9).

Figura 9: Pantalla File Name Group Editor (Editor de grupos de nombres de archivos)

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 27 de 40

Guarde el grupo emparejado en una carpeta adecuada haciendo clic en el icono en la
parte superior de la sección ‘Matched Groups’ (Grupos emparejados).
Desde la ventana principal de análisis, seleccione la opción de menú desplegable
‘Applications’ (Aplicaciones) de la parte superior de la pantalla.
Seleccione ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análisis comparativo) seguido de
‘Mutant + Wildtype’ (Mutante + Natural). En el cuadro ‘ARMS/Comparative Analysis’
(ARMS/Análisis comparativo), primero seleccione el ‘Group File’ (Archivo de grupo)
relevante, luego seleccione ‘Poly-T Analysis’ (Análisis poli-T) si este análisis se desea
y/o ‘STR Check’ (Comprobación STR) (figura 10a). Luego haga clic en ‘OK’ (Aceptar)
para abrir la ventana ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análisis comparativo)
(figura 10b).

Figura 10a: Cuadro ARMS/Comparative Analysis Settings

(Ajustes de ARMS/Análisis comparativo)

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 28 de 40

 Figura 10b: Ventana ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análisis comparativo)

Archivos Histograma de Tabla de

Electroferogramas
agrupados diferencias informe

Vista previa del informe Elucigene CF-EU2v1

Informe Mutante + Natural (mezcla A + B)
Haga clic en el icono de impresión en la ventana ‘ARMS/Comparative Analysis’
(ARMS/Análisis comparativo). Seleccione ‘Poly-T Analysis’ (Análisis poli-T) si este
análisis se desea y/o ‘STR Check’ (Comprobación STR) (figura 12a). Haga clic en
‘Preview’ (Vista previa) para ver el informe Elucigene CF-EU2v1 A + B (figura 12b).
Desde esta ventana, el usuario puede revisar e imprimir el informe de cada muestra.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 29 de 40

 Figura 12a: Cuadro ARMS/Comparative Print Settings
(Ajustes de impresión ARMS/comparativo)

Figura 12b: Ventana del informe CF-EU2v1 Mutante + Natural (mezcla A + B)

El informe Elucigene CF-EU2v1 incluye las características siguientes:

● ‘Report Header’ (Encabezado del informe): contiene información sobre el
análisis, el proyecto, la muestra y los parámetros.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 30 de 40

 ● ‘Signature Box’ (Cuadro para la firma): espacio para que los revisores del
informe introduzcan la fecha y sus iniciales. Se proporciona una columna de
control adicional para las iniciales de los revisores.
● ‘Electropherogram’ (Electroferograma): parecido a la ventana ARMS/
Comparative analysis (ARMS/Análisis comparativo), muestra los colores de
todos los colorantes de la traza de la muestra.
● ‘Report Tables’ (Tablas de informes): la tabla principal muestra todas las
mutaciones analizadas con este kit. El estado homocigoto o heterocigoto se
indica por el número de alelos naturales o mutantes notificado para cada locus.
La segunda tabla muestra el estado poli-T de la muestra si dicha función se ha
seleccionado.
● ‘Trace Comparison Histogram’ (Histograma comparativo de trazas):
GeneMarker calcula las diferencias alélicas entre las trazas de las mezclas
A y B, y las representa en un histograma situado debajo de los
electroferogramas de la muestra.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 31 de 40

Etiquetas de los picos
Las etiquetas de los picos se muestran con códigos de color de acuerdo con la calidad
del emparejamiento entre el pico detectado y los «bines» del panel observados. En el
electroferograma, los marcadores son barras grises horizontales y el centro de los picos
está marcado con una barra gris vertical.
Los picos que caen fuera de los marcadores o «bines» del panel se marcan en rojo para
indicar que están “fuera de escala” (OL, Off Ladder).
Nota: Las varianzas en el tipo de polímero y el estándar de tamaño del aparato podrían
requerir la optimización de los «bines» de los marcadores para adaptar el software a las
condiciones de ciclos que se estén utilizando. Puede encontrarse más información sobre
cómo modificar los «bines» del panel en el manual de GeneMarker suministrado con el
software.

Puntuación de picos de diagnóstico

Cada individuo tiene dos copias del gen CFTR. Cuando estas copias poseen la misma
secuencia para cualquier alelo dado, el individuo se describe como homocigoto respecto
a este sitio. Cuando las secuencias de las copias son distintas para un alelo dado, el
individuo se describe como heterocigoto (figura 13).
La mezcla A (mutante) determina si un individuo es portador de una mutación y esto
viene indicado por la presencia de un pico azul. La mezcla mutante contiene también
iniciadores del alelo F508del normal, por lo que esta mezcla puede determinar si un
individuo es normal (pico verde solamente), homocigoto (pico azul solamente) o
heterocigoto (picos azul y verde) respecto a F508del.
Si se observa cualquier otra mutación, la muestra puede amplificarse con la mezcla B
(WT) para determinar el estado homocigoto o heterocigoto. La presencia de un pico
verde para el alelo en cuestión en la mezcla WT indica que el individuo es heterocigoto y
la ausencia de un pico verde indica que el individuo es homocigoto para la mutación en
cuestión.
Figura 13: Ejemplos de individuos a) normales, b) heterocigotos y c) homocigotos con
respecto al alelo 711+1G>T
A B C

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 32 de 40

Un individuo portador de dos mutaciones diferentes se denomina heterocigoto
compuesto (figura 14).
Figura 14: Ejemplos de muestras heterocigotas compuestas. A) W1282X/S1251N
B) F508del/R560T
A

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 33 de 40

B

Se incluyen dos marcadores STR hipervariables (rojos) en ambas muestras. Esto

permite la comparación entre la muestra amplificada con la mezcla mutante y la muestra
amplificada con la mezcla WT para reducir la posibilidad de confundir la muestra
(figura 15). La ausencia de estos marcadores STR indica una muestra fallida. La
presencia de los marcadores STR a ufr muy bajas indica una muestra débil que debería
analizarse con cuidado.
Figura 15: Gráficos de la mezcla A y de la mezcla B mostrando los dos marcadores STR
para un individuo

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 34 de 40

Los marcadores STR hipervariables pueden ocultarse deseleccionando la opción ‘STR
Check’ (Comprobación STR) en el cuadro ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Ajustes
de impresión ARMS/comparativo) si se está analizando la mezcla A solamente o en el
cuadro ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análisis comparativo) si se está
analizando la mezcla A y B. La presentación de los datos de los colorantes rojos solo en
la ventana ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análisis comparativo) facilita la
visualización de los marcadores STR.

Designación de los marcadores de GeneMarker

Cuando se ven los datos de las trazas analizadas en GeneMarker, la etiqueta de los
picos de diagnóstico en la mezcla A mostrará el nombre del marcador. Los picos de
diagnóstico en la mezcla B se etiquetarán solo con el número del marcador y el sufijo
‘WT’ (wild-type, natural) cuando se visualicen únicamente con el colorante verde.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 35 de 40

La correlación entre los números de los marcadores y los marcadores se indica a
continuación.
Marcadores detectados

Rango de tamaño
N.º del
Marcador en pb de producto
marcador
(datos 3130/POP7)
01 R347H 110.5-116.5
02 R347P 117-123
03 2789+5 G>A 124-130
04 3120+1 G>A 132.5-138.5
05 711+1 G>T 141.5-147.5
06 R334W 147.5-154
07 I507del 156-162.5
08 F508del 163-169
09 3849+10kb C>T 172-178
10 1677delTA 180-188.5
11 1078delT 193-199
12 V520F 206-211.5
13 L206W 215-220
14 W1282X 224.5-230.5
15 R560T 234.5-240.5
16 2347delG 242-246
17 Q890X 250-252
18 R553X 255.5-261.5
19 G551D 265-267
20 S549R(T>G) 267.5-269.5
21 S549N 275-280
22 M1101K 282-288
23 G542X 289-295.5
24 3905insT 297-303.5
25 Y1092X(C>A) 308-314
26 S1251N 315-321
27 444delA 323-326
28 1811+1.6kb A>G 332-338
29 1717-1 G>A 341.5-347.5
30 R117H 349-355
31 R117C 357-360
32 N1303K 360-366.5
33 Y122X 367-373
34 394delTT 377-383
35 G85E 384-390
36 R1066C 391-397
37 1898+1 G>A 398.5-404.5
38 W846X 406-411
39 2184delA 413-418
40 D1152H 423-429
41 CFTRdel2_3 433-439
42 P67L 439.5-445.5
43 2143delT 446-450.5
44 E60X 453.5-460.5
45 3659delC 461-465.5
46 3272 470-476
47 621+1G 485.5-491.5
48 A455E 496-503
49 R1162X 506-512
50 R1158X 516.5-524.5
5T* IVS8-5T 110-130
7T IVS8-7T 140-160
9T IVS8-9T 175-195

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 36 de 40

* tamaños del alelo 5T

Rango de tamaño en
Marcador pb de producto
POP7/3130
5T (9) 117,25 – 118,75
5T (10) 119,25 – 120,75
5T (11) 121,25 – 122,75
5T (12) 123,25 – 124,75
5T (13) 125,25 – 126,75
Nota: Los rangos de tamaño para cada marcador podrían variar debido al instrumento y
al polímero utilizados.

Marcador dI507del de CF-EU2v1

Debido al locus de la deleción de I507 en el gen CFTR, es posible detectar la presencia
de este marcador a través de un desplazamiento de 3 pares de base (pb) en el tamaño
del pico F508del, así como de un pico específico mutante I507del.

En los casos en que un único alelo mutante I507del esté presente, el pico mutante
I507del se observará como un pico azul a 159 pb aproximadamente. Se observará la
presencia de un pico natural (WT, wild type) para F508del, pero a la mitad
aproximadamente de la altura del pico que normalmente se asocia con un genotipo
natural homocigoto; esto se ve como un pico verde a unos 167 pb. Se observará también
un pico verde adicional a unos 164 pb (figura 16).

Figura 16: Muestra heterocigota I507del

Una muestra I507del/F508del dará lugar a un pico WT F508del verde desplazado, a

aproximadamente 164 pb (3 pb menos de lo normal), un pico mutante F508del azul a
166 pb y un pico mutante I507del azul a unos 159 pb.

Una muestra I507del/I507del dará lugar a un pico azul a aproximadamente 159 pb y a un

único pico verde a aproximadamente 164 pb (3 pb más pequeño que el pico F508del
normal observado cuando I507del no está presente).

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 37 de 40

Debe hacerse notar que la presencia de una mutación F508del impide la acción del
iniciador I507 WT. Por consiguiente, un individuo que sea homocigoto para
F508del, no tendrá un pico I507 WT en la mezcla WT y un individuo que sea
heterocigoto para F508del tendrá un pico I507 WT de altura reducida en la
mezcla WT.

Marcadores poli-T
Elucigene CF-EU2v1 contiene iniciadores ARMS™ fluorescentes etiquetados con NED
(amarillo) para la detección de las variantes IVS8-5T, IVS8-7T y IVS8-9T. La información
de los poli-T para una muestra puede determinarse activando la visualización de los
datos del colorante amarillo dentro de la ventana principal de análisis de GeneMarker
(figura 7). Los marcadores poli-T pueden ocultarse deseleccionando la opción ‘Poly-T
Analysis’ (Análisis de poli-T) en el cuadro ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Ajustes
de impresión ARMS/comparativo) si se está analizando la mezcla A solamente o en el
cuadro ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análisis comparativo) si se está
analizando la mezcla A y B. El usuario puede por consiguiente elegir ver estos datos
según estime necesario dentro del procedimiento de prueba del laboratorio.

Nota: No hay ningún iniciador poli-T en la mezcla B, por lo que los productos solamente
se visualizarán en las muestras de la mezcla A.

Análisis de los poli-T

Los siguientes ejemplos de GeneMarker muestran morfologías de picos características
de las regiones de las variantes IVS8 analizadas.

El ejemplo siguiente muestra el resultado de la mezcla A según se observa cuando se ha

seleccionado el ‘Poly-T Analysis’ (Análisis poli-T) en el cuadro de diálogo
‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Ajustes de impresión ARMS/comparativo) cuando
se está analizando la mezcla A solamente.

Ejemplo 1: Muestra IVS8-5T / IVS8-7T

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 38 de 40

Ejemplo 2: Muestra IVS8-7T / IVS8-7T

Ejemplo 3: Muestra IVS8-7T / IVS8-7T (variabilidad de las repeticiones de TG)

Los dos picos se deben a la heterocigocidad de la región de las repeticiones de TG, que
está dentro de nuestro amplicón. Este efecto podría también observarse con muestras
homocigotas 5T y 9T. Por lo tanto, es posible determinar el número de repeticiones de
TG dentro de cada variante de politimidina IVS8.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 39 de 40

Ejemplo 4: Muestra I VS8-9T / IVS8-9T

Aviso importante
Bajo ciertas condiciones del ensayo, es posible que artefactos observables de los
colorantes interfieran con el análisis sistemático. Es importante que el usuario tenga en
cuenta la posibilidad de interferencia para garantizar el análisis correcto de los datos.

Los artefactos etiquetados de los colorantes pueden observarse como pequeños picos
azules o verdes. Estos artefactos de los colorantes tienen por lo general un tamaño de
menos de 100 pb y normalmente no interfieren con el análisis de los datos. Bajo
condiciones normales, estos picos de artefactos son insignificantes en relación con los
picos verdaderos del amplicón y no causan ningún problema con el análisis. Sin
embargo, cuando la cantidad de amplicón cargada es pequeña, quizá debido al DNA
genómico limitador, los picos de los artefactos de colorantes aparecen relativamente más
grandes, siendo posible analizarlos como picos verdaderos del amplicón.

ELUCIGENE es una marca comercial de Gen-Probe Life Sciences Ltd.

ARMS es una marca comercial de AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP es una marca
comercial de Qiagen GmbH. GENEMARKER es una marca comercial de SoftGenetics
Corporation. GENEMAPPER, VIC, NED, POP-7, HI-DI y PET son marcas comerciales
de Life Technologies Corporation.

AVISO AL COMPRADOR: LICENCIA LIMITADA

Los polinucleótidos etiquetados con los colorantes VIC, NED y PET, así como su uso,
podrían estar cubiertos por una o más de las patentes propiedad de Applied
Biosystems, LLC. El precio de compra de este producto incluye derechos limitados, no
transferibles, bajo determinadas reclamaciones de ciertas patentes propiedad de Applied
Biosystems, LLC para usar solo esta cantidad del producto únicamente para actividades
del comprador en detección de dianas dentro del campo del diagnóstico humano. No se
transfieren otros derechos. Si desea información adicional sobre la compra de licencias
en referencia a los colorantes anteriormente mencionados, póngase en contacto con el
director de licencias en la dirección siguiente: Director of Licensing, Applied Biosystems,
850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EE.UU.

Copyright © 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd.

CF2EUGSES Rev.10/2013 Página 40 de 40