Técnica de electroforesis y PCR en extractos de DNA de muestras de

Argopecten purpuratus y Pisum sativum

Jhon Zumaeta*, Esteban Caycho, Bryan Huaman, Ana Saldarriaga,

Gary Flores

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú, Casilla Postal 11-
058, Lima 11, Perú.

Resumen
En esta práctica de laboratorio se realizó dos herramientas básicas y fundamentales para el análisis
biomolecular: PCR y electroforesis en gel de agarosa. Se trabajó con las muestras de DNA extraídas
y caracterizadas en las prácticas anteriores de Pisum sativum y Argopecten purpuratus, para
amplificar una secuencia específica se utilizó un marcador mitocondrial 16S (Sbr-H forward y Sba-
L reverse), fue necesario analizar las temperaturas óptimas para la eficiencia de la PCR; así mismo
la docente encargada amplificó las muestras de las tres mesas de laboratorio con marcadores para
eucariotas 16S, procariotas 16S, los cuales fueron sometidos a análisis electroforetico, se usó como
marcador principal el MassRuler Low Range DNA Ladder.
Palabras claves: Electroforesis, PCR, Gel, agarosa, 16s, ADN
Abstract
In this laboratory experience, two basic and fundamental techniques for biomolecular analysis are
performed: PCR and agarose gel electrophoresis. These methods were carried out with the DNA
samples extracted and characterized in previous laboratory experiences of Pisum sativum and
Argopecten purpuratus. To amplify a specific sequence a 16S mitochondrial marker (Sbr-H forward
and Sba-L reverse) was used. It was also necessary to analyze the optimum temperatures for the PCR
efficiency. Our teacher amplified the samples of the three laboratory groups with markers for
eukaryotes 16S, prokaryotes 16S, which were subjected to electrophoretic analysis, the MassRuler
Low Range DNA Ladder was used as the main marker for accurate quantification and sizing of DNA
fragments on the agarose gel.
Keywords: Electrophoresis; PCR; Gel; Agarose; DNA
Presentado: 7 de octubre del 2018 se moverán a través de una matriz de agarosa
en un campo eléctrico hacia el polo positivo.
Introducción
Los ácidos nucleicos más cortos podrán
La electroforesis en gel de agarosa separa los migrar a través de la matriz más rápido que los
fragmentos de ADN según su tamaño. La más grandes durante un período de tiempo
separación de los ácidos nucleicos en función determinado. Dependiendo del porcentaje de
de su tamaño es necesaria para muchas agarosa utilizada para hacer el gel, el rango de
prácticas comunes de laboratorio. La separación lineal variará.
separación de los ácidos nucleicos mediante Esta técnica tiene muchas aplicaciones. En
electroforesis en gel de agarosa funciona general, puede analizar los fragmentos de
mediante el aprovechamiento de la carga ADN que resultan de una digestión
negativa del esqueleto de fosfato de los ácidos enzimática de una pieza más grande de ADN
nucleicos. Las moléculas de ADN y ARN para visualizar los fragmentos y determinar el
tienen una carga neta negativa distribuida tamaño de los fragmentos. Además de su
uniformemente en toda su longitud, por lo que utilidad en las técnicas de investigación, la
electroforesis en gel de agarosa es una técnica
forense común y se utiliza en la toma de
huellas dactilares de ADN.
La técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), inventada en 1985 por
Kary B. Mullis, permitió a los científicos
hacer millones de copias de una muestra muy
pequeña de ADN. Este ha sido un gran avance
en el mundo científico y, con el tiempo, la
técnica ha evolucionado más allá de los
límites de su diseño inicial simple y ha abierto
vías increíbles para los investigadores. Se han
hecho muchas mejoras a la técnica básica y se
han desarrollado muchas adaptaciones,
incluyendo PCR de transcripción inversa (RT-
PCR), PCR cuantitativa en tiempo real
(qPCR), qPCR de transcripción inversa (RT-
qPCR) y PCR digital (dPCR).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utiliza la síntesis enzimática in vitro para
amplificar secuencias de ADN específicas. La
amplificación por PCR puede producir
aproximadamente 100 mil millones de copias
de una molécula de ADN en unas pocas horas.
Este método ha revolucionado la
investigación en ciencias biológicas y
medicina, y ha influido en la criminología y el
derecho. Varios descubrimientos científicos
importantes, incluida la purificación del ADN
polimerasa y la elucidación del mecanismo de
replicación del ADN, fueron esenciales para
el desarrollo de la tecnología de PCR actual.
En 1993, Kary Mullis recibió el Premio Nobel
por el descubrimiento de la PCR.
Dos avances significativos han permitido que
la PCR se convierta en la tecnología que es
hoy en día: la polimerasa Taq y el
termociclador.
En 1986, los científicos de Cetus aislaron la
polimerasa Taq de Thermus aquaticus, una
bacteria que se encuentra en aguas termales.
Debido a que Taq podía soportar altas
temperaturas, eliminó la necesidad de
intervención humana durante la reacción,
simplificando y acortando el proceso. Sin una
enzima resistente al calor como la polimerasa
Taq, la PCR no podría usarse a gran escala, ya
que el proceso hubiera sido demasiado
engorroso.
Antes de Taq, se utilizó el ADN polimerasa de
E. coli, una enzima que no podía soportar un
calentamiento y enfriamiento rápidos, en la
segunda etapa de la PCR. Usando E. Coli, la
polimerasa se reemplazó manualmente en
cada paso de la reacción a medida que se
degradaba por el calor.
En 1987, Perkin Elmer, otra compañía de
biotecnología con sede en Estados Unidos,
lanzó un termociclador, un instrumento que
está programado para regular la temperatura
de una reacción, calentando o enfriando las
muestras según sea necesario. Una vez más,
este avance minimiza la interacción humana
en la reacción, lo que lleva a un proceso
elegante, eficiente y optimizado.
Gracias a su extraordinaria versatilidad, hoy
en día, la PCR se está utilizando en diversos
campos, como la ciencia forense, los estudios
ambientales, la tecnología de alimentos y la
medicina de diagnóstico. El avance masivo a
lo largo de los años en nuestra comprensión
del genoma de los humanos y varias otras
especies no hubiera sido posible sin la técnica
notable y simple llamada PCR.
árboles. También se utilizó para la captura
de insectos de vuelo rápido, como
mariposas, avispas y libélulas. Se movió
con la mayor velocidad posible la red
hacia el insecto e inmediatamente se giró
la red para evitar que salga.
MATERIALES Y METODOS
AMPLIFICACION DEL DNA MEDIANTE
PCR
Las muestras de ADN animal y vegetal
utilizadas en esta práctica fueron las obtenidas
a partir de las muestras de Argopecten
purpuratus y Pisum sativum provenientes de
la práctica de ‘‘Extracción de ADN’’
realizada a comienzos del curso, y los datos de
su caracterización los provenientes de la un marcador de tamaño molecular
segunda practica del mismo. (MassRuler™ Low Range DNA Ladder,
Para la preparación del master mix con el cual ready-to-use, 60.8 ng/µL).
se procederá a amplificar estas dos muestras, En la corrida electroforética, se conectaron los
fue necesario calcular los volúmenes de cables de la fuente de poder (Standard Power
reacción y del kit de PCR a utilizar. Los Pack Biometra P25 con función de
componentes de esta mezcla fueron cronometro) a la cámara electroforética y se
adquiridos del laboratorio de Thermo Fisher realizó la corrida a 95V por 30 minutos. Se
Scientific. Estos volúmenes fueron entonces apagó la fuente poder, se retiró el gel y se
medidos con exactitud gracias a las tres colocó el mismo en un transiluminador para la
micropipetas provistas por el laboratorio observación de las bandas. El resultado fue
(Nichipet EXII 0.5-10 µl 00-NPX2-10, fotografiado y agregado a este artículo.
Micropipeta Axygen 20- 200 µl AP-200 y
Nichipet EXII 10-100 µl 00-NPX2-100). Esta
mezcla se agregó entonces al DNA molde en
otro tubo, y fueron llevados al termociclador.
La amplificación del DNA se realizó en el
termociclador Eppendorf®, Mastercycle
Personal, 5332 000.014 (European) en el cual
se dio 35 ciclos. Con temperaturas y tiempos
de 94ºC y 35s para la denaturacion, 50ºC y 40s
para el annealing, 72ºC y 75s para la
extensión.

ANALISIS ELECTROFORÉTICO DEL

DNA
Se pesó 0.5 gr de agarosa (Agarose for
analytical nucleic acid electrophoresis. CAS
9012-36-6, pH (10 g/l, H₂O, 50 °C) neutral)
para preparar el gel de agarosa. Este polvo fue
luego diluido en buffer TBE 0.5x. Esta mezcla
se calentó y agitó para su completa disolución.
Como siguiente paso, se le agrego el
compuesto de tinción GelRed (Loading Dye
with Stain for nucleic acid gels, 1mL (6x),
C756P63, Labforce, Thomas Scientific) y se
vertió en una bandeja de corrida. Los peines
fueron colocados dentro del gel hasta que
gelificó. Luego de esto, se retiraron los peines.
La cámara electroforética fue preparada,
agregando buffer TBE 0.5x hasta que el gel de
agarosa este sumergido en él.
Para cargar el DNA, se mezcló en un pedazo
de parafilm 1 µl del buffer de carga y 4 µl del
DNA a evaluar, esta mezcla fue entonces
agregada a cada uno de los pocillos del gel, de
acuerdo a la Tabla 6 de resultados. Se agregó
también, en el primer y último pocillo del gel
 Resultados
APLIFICACION DEL DNA MEDIANTE PCR

Estado de las muestras problema: Caracterización de la extracción de ADN por análisis

espectrofotométrico

MUESTRA Concentración ng/µL A260/280

ADN Animal 204.5 1.79
ADN Vegetal 163.0 1.52
Tabla 1. Resultados de las muestras de ADN, extraídas de Argopectum purpuratus (muestra
animal) y Pisum sativum (muestra vegetal). Estas muestras fueron caracterizadas mediante
análisis espectrofotométrico a diferentes longitudes de onda por los integrantes del grupo. Las
concentraciones alcanzadas son suficiente para seguir con la experimentación. Los valores
obtenidos en la proporción A260/280 para el grado de pureza arrojan la existencia de proteínas
contaminantes en las muestras, al ser estas menores que 1.8

Concentración
MUESTRA A260/280 A260/230
ng/µL
ADN Animal 204.9 2.0 1.1
ADN Vegetal 187.3 1.7 0.7
Tabla 2. Resultados de las muestras de ADN, extraídas de Argopectum purpuratus (muestra
animal) y Pisum sativum (muestra vegetal). Estas muestras fueron caracterizadas mediante el
uso de un nanodrop provisto por la profesora responsable de la práctica. Los valores de
concentración obtenidos aquí son similares a los conseguidos por el grupo, lo que les da validez.
Los valores obtenidos en la proporción A260/280 para el grado de pureza, en cambio, arrojan
la existencia de más proteínas contaminantes en las muestras, al ser estas mucho menores que
lo calculado por el grupo.

Parámetros a considerar para establecer el tiempo y temperatura del ciclo de PCR a utilizar
Pasos Parámetros
Según la longitud de la muestra de DNA que contiene a la
Denaturación inicial
secuencia que se amplificará.
Según la longitud del segmento a amplificar y la proporción de
Denaturación
G+C que contenga la cadena.
Según la secuencia y longitud de los primers a utilizar
Annealing
(Temperatura de melting)
Según las necesidades de la DNA polimerasa a utilizar y de la
Extensión
longitud del fragmento de DNA a amplificar.
Tabla 3. Características a considerar para cada uno de los ciclos de PCR que se van a
realizar.
Preparación del master mix (MM)
DNA Molde (Template):
DNA Animal DNA Vegetal

𝑛𝑔 𝑛𝑔
𝐶𝐼 = 204,9 𝐶𝐼 = 163,0
µ𝐿 µ𝐿
𝑛𝑔 𝑛𝑔
𝐶𝐹 = 50 𝐶𝐹 = 50
µ𝐿 µ𝐿
𝑉𝐼 = ? 𝑉𝐼 = ?
𝑉𝐹 = 50 µ𝐿 𝑉𝐹 = 50 µ𝐿

𝑛𝑔 𝑛𝑔 𝑛𝑔 𝑛𝑔
204,9 × 𝑉𝐼 = 50 × 50 µ𝐿 163,0 × 𝑉𝐼 = 50 × 50 µ𝐿
µ𝐿 µ𝐿 µ𝐿 µ𝐿
𝑉𝐼 = 12,20µ𝐿 𝑉𝐼 = 13,35µ𝐿 ≅ 13,4µ𝐿
𝑉𝐻20 = 37,8µ𝐿 𝑉𝐻20 = 36,6µ𝐿
Volumen para 1 Volumen para 5
Rx CCi CCf
rx rx
Buffer PCR 10x 1x 1.5 µL 7.5 µL
dNTPs 10 mM 200 µM 0.3 µL 1.5 µL
Primer F: 16Sar 10 µM 0.1 µM 0.15 µL 0.75 µL
Primer R: 16Sbr 10 µM 0.1 µM 0.15 µL 0.75 µL
MgCl2
Taq Pol 1U 0.15 µL 0.75 µL
DNA template 50 ng/µL 1 µL 5 μL
H2O 11.75 µL 58.75 µL
Volúmen de reacción 15 µL 70 µL
Tabla 4. Cantidades y concentraciones para preparar el Master Mix, asumiendo que como producto
final se requiere un volumen de 15 µL. Al necesitar solución para 4 reacciones, se consideró un
volumen para 5, debido a lo siguiente: 1 control negativo, 1 control positivo, 2 muestras de DNA por
analizar y 1 reacción adicional debido al error que se puede producir al pipetear.
Amplificación de ADN

Para establecer el ciclo de PCR, se disociará para convertirse en una sola

necesita identificar las temperaturas de
¨melting¨ (Tm) de los primers forward y
reverse, esto se puede conocer con ayuda
de páginas web tales como
ThermoFisher. El Tm es la temperatura a
la cual la mitad del dúplex de ADN se
hebra, esto indica la estabilidad del
dúplex.
Aquí, se deben ingresar los datos tales
como: Clase de DNA polimerasa, el
método de entrada, las secuencias de
primer y la concentración de los mismos.

En la parte anterior, se muestran los pasos a seguir para trabajar con la página web
calculadora de temperatura de melting. En la inferior, los resultados que se utilizaran para
el PCR.
 Pasos Temperatura Tiempo # ciclos
Denaturación inicial Tº de preservación hasta 94ºC 1 ciclo
Denaturación 94ºC 35s
Annealing 50ºC (44.6ºC con Tmcalculator) 40s 35 ciclos
Extensión 72ºC 75s
Extensión Final 72ºC hasta Tº de preservación 1 ciclo
Tabla 5. Temperaturas y tiempos de cada uno de los pasos que conforman el PCR.

ANALISIS ELECTROFORÉTICO DEL DNA

Se obtuvieron los siguientes resultados, representados en la siguiente imagen:

Mesa Mesa Mesa

Ladd 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Ladd

Imagen 1. Resultado de la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Se evaluó la calidad de

las extracciones animales y vegetales, presencia de amplificados y presencia de DNA
procariota.

Posillo 1 2 3 4 5 6
Secuencia ADN target PCR 16 S eucariota PCR 16 S procariota
Muestra Animal Vegetal Vegetal Animal Animal Vegetal
Tabla 6. Orden de las muestras depositadas en los pocillos del gel de agarosa al 3%

Discusión prosigue a analizar cada componente y

requerimientos necesarios de la
- Amplificación del DNA mediante
amplificación para poder obtener
PCR
nociones acerca de los resultados que se
La modalidad de PCR que se realizó en obtendrían.
laboratorio es la convencional. Por ello se
Las cadenas moldes en las que se trabajará
son los DNA mitocondriales, dado que las
muestras de donde se extrajo el material
genético corresponden a eucariontes:
Argopecten purpuratus (concha de
abanico) y Pisum sativum (alverja). Estas
cadenas moldes tienen ventaja sobre el
DNA nuclear pues son más numerosas
(cada mitocondria posee múltiples
cadenas), la estructura de la cadena es más
estable ya que posee forma circular, y el
tamaño en pares de bases es ligeramente
pequeño en comparación con el DNA
(1)
nuclear (aprox. 16kb) . Las muestras
extraídas fueron sometidas a U/reacción de PCR, y su velocidad de
caracterización tanto por el docente
encargado como por el grupo de trabajo tal
como se describen en la tabla 01, los
resultados muestran que el grado de
pureza, representado por el cociente entre
las absorbancias a 260 y 280 nm, están
cercanos a al intervalo 1.8-2 donde se
representa que las muestras están poco
contaminados con restos proteicos, a
excepción de nuestro cálculo con el grado
de pureza del DNA vegetal que representa
ligeramente contaminado, mientras que
los datos de concentraciones aproximadas
entre las dos caracterizaciones guardan
más relación (más en la muestra de DNA
animal). Por ello es que con los datos
realizados por la docente encargada se
sometieron a diluir las muestras tal que se
obtiene el DNA template a 50 ηg/μl
realizados en la tabla 02. Pero al comparar
las relaciones entre las absorbancias de
260nm/230nm, las muestras obtienen un
cociente de 1.1 en la muestra animal y 0.7
en la muestra vegetal, que al ser menor de
1.5, se asume que las muestras están
contaminadas con sales, carbohidratos, y
solventes orgánicos (2)
La enzima utilizada: Taq ADN
polimerasa, debido a que fue aislada de
Thermophilus aquaticus, es la que
polimeriza la nueva cadena de DNA
soportando elevadas temperatura; donde
la concentración requerida es de 1 a 2.5
polimerizar es de 1000nt/minuto con una
tasa de error de 4 en 1000 bases
incorporadas. Los sustratos que usará la
enzima son los dNTPs, estos están en
forma trifosfatada necesaria para la
conservación e su estabilidad y
contribución de energía para formar el
enlace fosfodiéster, que según la literatura
se debe adicionar en concentraciones
óptimas (50 a 200 μM) para evitar
incorporaciones erróneas o insuficientes.
La ADN polimerasa necesita de un
cofactor como el Mg++ para optimizar su
función amplificadora, cuya
concentración debe oscilar entre 1.0 y 2.5
mM. La reacción de la ADN polimerasa
empieza con desde un nucleótido con
extremo 3´ libre, por lo cual requiere de
una secuencia iniciadora que son los
primers, estos son los oligonucleótidos
que delimitan los extremos de lo que se
desea amplificar y son específicos ya que
guardan complementariedad con la
cadena molde, se tiene dos tipos de
primers: el sentido o forward y el
antisentido o reverse, según la literatura
estos deben estar presenten en una
concentración de 0.3 a 1μM/reacción; y
debe realizarse la reacción en un solución
amortiguadora, la solución que se usa está
compuesta de Tris-HCl y otras sales (KCl
y MgCl2), donde proporciona el pH
óptimo (8.4), los nucleótidos libres se
ionizan y la función de la Tag ADN
polimerasa mejora en las concentraciones
de sales adecuadas (3). Estos puntos fueron
tomados para poder calcular los
volúmenes necesarios para la preparación
del master mix (Tabla 03). Se asume que
15μL de volumen era para una PCR, pero
se prepararon 4 adicionales para no perder
muestra.
Para llevar a cabo los ciclos de PCR a
temperaturas y tiempos específicos, estos
son evaluados según la temepratura de
melting de cada primer usado, el forward:
16Sar-L y reverse: 16Sbr-H, primers
descritos por Palumbi (1991), los cuales se
calcula la temperatura de melting en
Termofisher,com obteniendo así 49.6°C y
60.4°C respectivamente, esto nos indica
que hay una diferencia mayor a 5°C, lo
cual no es recomendado, además, la
calculadora de la página nos indica que la
temperatura de anneling no debe ser
menor a los 45°C.(4)
Antes de poner los volúmenes en el
termociclador, se analizan los parámetros
de cada etapa que se realiza en un ciclo de
PCR. Durante el primer paso, se realiza la
denaturacion inicial de las cadenas molde,
paso que solo se realiza por única vez en
el primer ciclo, esto es porque las cadenas
con las cuales se trabaja (mtDNA) son
circulares y poseen gran estabilidad,
también a ello se suma la longitud de la
cadena; por ello es que en esa etapa es
necesaria por aproximadamente 5 minutos
dejar la muestra a 95° C, tiempo suficiente
para denaturalizar y romper las estructuras
secundarias obteniendo así mayor
porcentaje de ssDNA. Luego los pasos
que incluyen los ciclos de PCR,
denaturalización, en la cual se busca
desnaturalizar la longitud del segmento
que se quiere amplificar, exponiendo a la
muestra a 94°C por aproximadamente
unos 30 segundos; anneling, que depende
de la temperatura de melting de los
primers, es decir de su longitud y
concentración de bases G y C, como
también la afinidad o hibridación con la
cadena molde por lo que se expone a 50°C
por 30 segundos; y extensión, donde la
acción de la Tag ADN polimerasa tiene
mayor acción, se busca que su función
este en óptimas condiciones, tales como
pH , concentración de sales y temperatura,
por ello la reacción de extensión se da a
72° C por aproximadamente 60 segundos.
Hay que recalcar que nuestras muestras
amplicadas no se llevaron a análisis de
electroforesis en gel de agarosa, sino que
las muestras llevadas a análisis fueron
amplicadas anteriormente por la docente
encargada.
Para comprobar si en nuestra muestra se
encontraban bacterias se utilizaron los
primer 27F y 1492R descritos por Lane
(1991) específicos para procariontes(6) de
tal forma que si se obtienen
amplificaciones en estas reacciones se
demostraría la presencia de bacterias en
las muestras de ADN utilizadas. Si el
resultado de la anterior prueba saldría
positivo esto podría afectar los resultados
del PCR practicado para amplificar el
ADN mitocondrial y cloroplástico para las
muestras tanto animal como vegetal ya
que los primer utilizados para estas, los
cuales son el 16Sar-L y 16Sbr-H
- Electroforesis en gel de agarosa
Para realizar la práctica de laboratorio de
electroforesis utilizado gel de agarosa al
1% en donde procederemos a analizar los
resultados obtenidos.
Se procederá a analizar, en primer lugar,
los resultados del grupo N° 1 iniciando por
los dos primeros pocillos, los cual
corresponde a la muestra de ADN target,
(Palumbi, 1991), tienen coincidencias con
un alto número de bacterias de diferentes
orígenes.
El uso de los primers bacterianos se
sustenta en que estos se unen a la
secuencia del ADN que codifica el gen
16S rRNA, el cual está altamente
conservado entre las distintas especies de
bacterias y arqueas, así que utilizando
nBLAST comprobamos si es correcta esta
información y lo pudimos comprobar al
ver que esta secuencia se encuentra un
gran rango de especies procariontes con
una identidad de 100%.
El protocolo para este juego de primer
consiste en una denaturación inicial de 3
minutos a 95°C, seguido de un annealing
a 47°C(4) por un minuto y una extensión a
72°C por 1 minuto. Seguiran 35 ciclos de
denaturaciones a 94°C por 1 minuto,
annealing a 47°C por un minuto y una
extensión a 72°C por 1 minuto; y una
extensión final de 5 minutos(5).
siendo el primer pocillo de muestra
animal(Imagen1-1) y el segundo de
muestra vegetal (Imagen 1-2).
En el primer carril se observa en una
banda curva en forma de sonrisa no muy
separada del pocillo, se observa que hay
un smear o chorreado y también se
observa que el pocillo esta refringiendo;
primero analicemos la banda curva, esta
puede ser provocado por muchos factores,
entre ellos podemos mencionar la vida útil
del buffer utilizado en la electroforesis,
dado que, el buffer (TBE) utilizado en la
práctica es reutilizado, pudiendo este
interferir la corrida del ADN, sin embargo
el buffer TBE puede ser reutilizado hasta
10 veces(10)por ello es una poco probable
explicación; otra posible causa es debido
a la gran concentración de ADN en la
muestra, que al hacerle correr en la
electroforesis y sumado a que el TBE tiene
una alta capacidad tamponante y mucha
11)
fuerza iónica forman una fuerza de
arrastre fuerte que provoca que ese gran
fragmento cruce muy rápido el agar
dejando esa curva en forma de sonrisa,
también eso podría explicar por qué la
banda no avanzo mucho con respecto al
pocillo; además de lo anterior
mencionado, podemos añadir una
probable causa más, la cual sería la
irregularidad en la temperatura en el gel de
agarosa, es decir, la temperatura a lo largo
del gel era variable(12), esto es posible
dado que el gel de agarosa se solidifico en
la mesa y no fue llevado a una
refrigeración para que la temperatura a lo
largo del gel sea la misma. En segundo
lugar, analizaremos el smear o chorreado
que se observa en el primer carril, es un
chorreado ligero lo cual es provocado por
la degradación de la muestra de ADN,
podemos especular acerca de una
contaminación con nucleasas que
degradaron el ADN en diferentes tamaños
haciendo que se vea el chorreado, sin
embargo, para evitar que la degradación
ocurra durante la electroforesis, el buffer
contiene EDTA el cual es un agente
quelante quitándole el Mg a las nucleasas,
de esa manera estas no pueden funcionar,
dado ello, podemos decir que la
contaminación con nucleasas fue durante
la extracción de la muestra de ADN
animal, siendo esta contaminación
mínima por ello solo se ve un ligero
chorreado(10), a ello también debemos
sumar la contaminación registrada por
sales y compuestos aromáticos(13);
finalmente para este carril, analizaremos
el pocillo que está refringiendo, esto nos
indica que no migro toda la muestra de
ADN por falta de carga, las posibles
causas vienen a ser la no disolución del
ADN, es decir, el ADN se encuentra súper
enrollado y dado que estos son
demasiados densos y no fluyen a través
del gel de agarosa(13), otra de las causas
pueden ser la presencia de proteínas de
unión al ADN en la muestra, como ligasas,
fosfatasas, entre otras que interfirieron
con el normal corrido electroforético(15).
El segundo pocillo(Imagen1-2) es de una
muestra de extracción de ADN vegetal
(imagen 1b) en la que se puede observar
similares características que el primer
carril, sin embargo, se logra visualizar de
manera tenue indicando una baja
concentración de muestra debido,
probablemente, a una baja pureza de la
muestra extraída de ADN. En esta banda
no se observa una curva dado la baja
concentración de la muestra no hubo un
gran fragmento que cruce rápidamente el
gel(9); lo que si logra verse en este carril
es la presencia de un smear o chorreado
muy ligero, dándonos a entender también
una contaminación con nucleasas previo a
la realización de la electroforesis(16), como
ya fue mencionado en el caso anterior;
también se observa que el pocillo está
refringiendo, con lo cual podemos deducir
la presencia de contaminantes,
confirmándolo con los datos en la relación
de absorbancias A260/280 y A260/230(14,
además de la probable presencia de ADN
súper enrollado que debido a su densidad
no fluyen por el gel(14).
Teniendo estas dos muestras de ADN
extraído podemos decir que tienen un
tamaño molecular similar el cual no
podemos especular debido a que el leader
utilizado es para muestras de un peso
molecular más pequeño y no nos da una
referencia con el tamaño de estas muestras
ADN.
Siguiendo con el análisis, tenemos los
otros dos pocillos los cuales corresponden
a ADN 16S eucariota amplificado de
muestra vegetal(Imagen1-3) y Con respecto al cuarto pocillo, solo se
animal(Imagen1-4) respectivamente.
Dado que este marcador utiliza DNA
mitocondrial, el cual al ser circular obtiene
una mayor estabilidad y las posibilidades
de tener un mejor resultado son mayores.
En el tercer pocillo(Imagen1-3) se logra
observar dos bandas, la posible
explicación para la aparición de esta
segunda banda es que, durante la
extracción del ADN vegetal, también se
extrajo ADN mitocondrial y de
cloroplastos, los cuales por la hipótesis de
la endosimbiosis, estas provienen de una
bacteria de modo que contienen la
secuencia en el ADN extranuclear similar,
en donde los dos poseen la secuencia
capaz de producir sus ARN ribosómicos
(15)
(12s y 16s) , esta secuencia es
reconocida por el marcador ARNr16s, por
ende durante la ampliación por PCR, el
primer no solo amplifico la secuencia del
ADNmt sino que además amplifico la
secuencia del ADNcp. Estas dos
amplicones poseen diferentes pesos
moleculares debido a que el ADN del
cloroplasto tiene un mayor parecido al de
las bacterias debido a que a lo largo del
tiempo este ha tenido un muy lento
cambio en su secuencia y un muy rápido
cambio en su estructura (16), es por ello que
tiene un mayor tamaño molecular (800-
900 pb) que el ADN mitocondrial (400-
500 pb).
obtuvo la muestra esperada, la cual es la
amplificación del ADNmt en donde se
observa una muy buena electroforesis con
un peso molecular de 400 a 500 pb,
parecido al del ADNmt vegetal.
En los siguientes pares de pocillos se
utilizaron marcadores para 16s bacteriano,
es decir solo amplificara si encuentra
ADN bacteriano y fue así. El quito
pocillo(Imagen1-5), en el cual
amplifico la muestra de ADN animal
amplifico, con una regular concentración
de este lo cual nos hace pensar en una
contaminación de la muestra lo cual pudo
haber ocurrido durante la extracción del
ADN animal, es más, la contaminación de
la muestra debio ser por bacterias que no
tengan pared celular debido a que para
lograr romper esta pared, es necesario
fuerza mecánica la cual se aplicó en la
muestra vegetal, ubicada en
pocillo(Imagen1-6), y es en donde se
logra una mayor cantidad ADN bacteriano
dado que al romper la pared vegetal,
también se rompió pared bacteriana
liberándose ADN bacteriano
amplificándose.
Las causas probables de
contaminación pueden ser la utilización de
material de vidrio contaminado, la falta de
limpieza durante la extracción de modo
que estas muestras se contaminaran con
de un chorreado causado por nucleasas,
con la diferencia que en este carril no hay
un pocillo refringente.
las bacterias que residen en el bivalvo,
sobre todo en su mucus.
En los dos pocillos podemos ver evidencia
de chorreo, de lo cual se explica por la
degradación del material genético
bacteriano provocado por nucleasas (10).
Con respecto a los pocillos 1 y 2 de la
se mesa N° 2 se pueden deducir parecidas
explicaciones acerca de los resultados. En
el primer carril (Imagen1-7) de la mesa N°
2 se observa en una banda curva en forma
de sonrisa con una gran concentración de
ADN, esta banda es un poco distinta a la
de la mesa N°1 sin embargo, puede ser
debida a las mismas causas las cuales
fueron explicadas anteriormente; se
observa que hay un smear o chorreado a lo
largo de todo el carril, lo cual nos indica
el 6 una gran degradación de ADN causada
por contaminación con nucleasas, además
se logra ver un gran cumulo de ADN
degradado; y también se observa que el
pocillo está refringiendo lo cual es señal
y de presencia de ADN súper enrollado de
alta densidad el cual no fue disuelto
dicha durante la extracción.
En el segundo carril de la mesa N°2 se
observa lo mismo que en la mesa N°1, hay
muy poca concentración de ADN, además
En el tercer pocillo se logra ver las dos
bandas, la explicación de la aparición de
estas ya fueron mencionado
anteriormente, sin embargo, aquí hay algo
que resaltar y es la gran concentración de
ADN mitocondrial y cloroplástico.
En el carril 4 de la mesa 2 no se observan
bandas por lo cual se podría conjeturar que
en la muestra que se tomó para depositarla
en el pocillo no poseía fragmentos ADN.
En el carril 5 de la mesa 2 se observa una
banda de brillantez tenue que
representaría una pequeña cantidad de
ADN presente en la muestra en
comparación con la banda del carril 6 de
la mesa 2, y esto se podría fundamentar
en el método de extracción de ADN
utilizado ya que para la extracción de
ADN vegetal se realizó una mayor lisis
proporcionada por el estrés mecanico con
el fin de hacer una buena lisis de la pared
vegetal, pero ya que no solo las celulas
vegetales son las que poseen una pared, es
decir, las bacterias también poseen una y
al utilizar un amplicon para el fragmento
que codifica el rRNA 16s en bacterias se
podría afirmar que el método utilizado
para la extracción del ADN vegetal fue
mas efectivo para realizar una lisis de la
pared bacteriana en comparación del
método de extracción del ADN animal.
En el carril 1 de la mesa 3 se observa un
smear posiblemente causado por las
nucleasas y se observa una mayor
cantidad de copias de fragmentos de
mayor tamaño molecular en comparación
de los fragmentos de un menor tamaño
molecular y esto se colige a partir de la
perdida de brillantez a lo largo del smear
en dirección del extremo superior hacia el
extremo inferior.
En el carril 2 de la mesa 3 se observa un
smear muy tenue con el que al hacer una
comparación del carril 1 y 2 de la mesa 3
se comprueba que se realizo una mayor
extracción del ADN animal con lo cual se
puede evidenciar que con el método de
extracción de ADN animal se obtuvo una
mayor cantidad de ADN pero esto no seria
el único factor posible ya que podrían
entrar a tallar otros casos a considerar
como el lugar de donde se tomó la muestra
que se utilizó para la electroforesis.
En el carril 3 de la mesa 3 se observan 2
bandas que podrían indicar la presencia de
un fragmento de adn extraño a la muestra
o también podría indicar la presencia de
fragmentos de ADN que se desplazaron
con una diferente conformación lo cual
podría tener una influencia en la velocidad
de corrimiento y su posterior posición en
el gel de agarosa.
En la única banda del carril 4 de la mesa
3 se observa una mayor cantidad de ADN
en comparación con la banda en el
extremo inferior del carril 3 de la mesa 3
y esto podría resultar contradictorio ya
que las celulas animales poseen un mayor
numero de mitocondrias que las celulas
vegetales y esto se podría fundamentar en
el hecho de que las celulas vegetales no
presentan motilidad, pero otro punto a
tomar en cuenta es el del método de
extracción de ADN utilizado para el ADN
de origen vegetal ya que al ser un método
en el que se produce un mayor estrés
mecanico habría una mayor posibilidad de
degradar la doble membrana de la
mitocondria para obtener el fragmento de
ADN amplificado.
Al comparar el carril 5 y 6 de la mesa 3 se
puede evidenciar un caso similar al
evaluado anteriormente con las muestras
provenientes de la mesa 2 en el que se
puede conjeturar al método de extracción
de ADN vegetal como un mejor método
para poder obtener la amplificación de los
fragmentos de ADN que codifican el
rRNA 16s presentes en las bacterias, ya
que en el carril 5 de la mesa 3 no se
observo amplificación del fragmento al
que iba orientado dicho amplicón
seleccionado.
CONCLUSIONES
- La técnica de PCR permite obtener
cadenas replicadas de ADN en
gran escala, siendo esta una
técnica sensible y específica.
- La técnica de PCR está delimitada
de muchos factores, tales como la
calidad de la muestra, Tm de los
primers, etc.
- La electroforesis en gel de agarosa
es un método muy utilizado para
lograr la separación, en este caso,
de ADN de acuerdo los pesos y
tamaños moleculares.
- El método de extracción de ADN
vegetal es mas útil que el método
de extracción de ADN animal con
relación a la amplificación del
fragmento de ADN que quería ser
amplificado en bacterias
CUESTIONARIO

I. PCR

1. Completar las tablas 1 y 3. Justificar los parámetros considerados.

Tabla 1. Parámetros a considerar para establecer el tiempo y temperatura del ciclo

de PCR a utilizar

Parámetros
Pasos Nro de ciclos
Temperatura (°C) Tiempo (seg.)
Denaturación inicial 95 180 1
Denaturación 94 35
Annealing 50-52 30-60 35
Extensión 72 60
Extensión final 72 300-600 1

- La denaturación inicial es a una ligeramente mayor temperatura y por mayor

tiempo de tal forma que nos aseguramos de que se denature totalmente el ADN
dejándolo totalmente de una sola cadena. Depende mucho de la longitud del
ADN donde se encuentra la secuencia de interés.
- La denaturación se va a asegurar de separar las cadenas lo suficiente para que la
secuencia de interés quede expuesta y los primers puedan unirse a ella.
- Durante el annealing se debe bajar la temperatura a una temperatura promedio
entre los Melting point de los primers de tal forma que estos puedas unirse a la
secuencia, también se les da un tiempo adecuado para que esto ocurra.
- En la extensión una vez que se han unido los primer, se sube la temperatura de
tal forma que la Taq Pol se active ya que esta funciona a altas temperaturas y al
igual que en el caso anterior se le da el tiempo prudencial para que sintetice la
secuencia de interés, esto depende de la velocidad con la que la Taq Pol une bases
a la nueva cadena.
- En la extensión final se asegura de que todas las cadenas tengan la extensión
correcta para lo que se le da suficiente tiempo.
 Tabla 3. Preparación del master mix (MM).
Componentes CCi CCf Vol x 1rx Vol x 5rx
Buffer PCR 10x 1x 1.5µL 7.5µL
dNTPs 10mM 200µM 0.3µL 1.5µL
Primer F: 27F 10µM 0.1µM 0.15µL 0.75µL
Primer R: 1492R 10µM 0.1µM 0.15µL 0.75µL
MgCl2 Incluido en el buffer
ADN No en MM 1µL 3µL
Taq Pol 100U 1U 0.15µL 0.75µL
H2O 11.75µL 58.75µL
Volumen de reacción 15µL 75µL

2. ¿Cuál es la utilidad de considerar el control positivo y negativo en la reacción de

PCR?
Con el control positivo se puede asegurar de que están funcionando todos los
reactivos usados en la PCR de manera correcta, ya que el control positivo es una
secuencia conocida de la cual se sabe que amplifica correctamente al aplicarle una
reacción de PCR. En cambio, el control negativo es solo agua y su importancia radica
en que al aplicársele una PCR esta no debería amplificar, y si esto llegara a ocurrir
significa que alguna sustancia se encuentra contaminada.
3. ¿Qué factores influyen en la corrección del calculo de la temperatura de melting y la
temperatura de annealing de la PCR?
Cuando se realiza un PCR se tiene que utilizar dos primer, un forward y uno reverse.
Sin embargo, estos primer no comparten una misma temperatura de melting por lo
que es necesario hacer un ajuste para la temperatura de annealing de tal forma que
esta sea un punto medio entre las dos temperaturas de melting de los primers.
4. Quiere realizar un protocolo para diagnóstico por PCR de un virus y determinar el
tamaño del amplificado. La secuencia del virus de referencia es U50923. Considerar
los primers y el kit de PCR que el profesor le indique. Explique todo el
procedimiento.

Nombre Secuencia 5'-3'

146F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG

146R1 TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA

146F2 GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA

146R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT
ANALÍSIS BIOINFORMÁTICO
Secuencia de referencia: U50923
Descripción dada por nBLAST de NCBI: Penaeus monodon (Jumbo shrimp)
nonoccluded baculovirus III SalI fragment genomic sequence / fragmento de la
secuencia genómica SalI de baculovirus III no ocluido presente en Panaeus monodon
(camarón jumbo).

Imagen 1. Resultados de la referencia U50923 en nBLAST.

Se deben analizar los primers proporcionados debido a que este es un virus posee
varias cepas con la misma secuencia y se quiere descubrir cuál es la correcta.
- Primer 146F1: ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG
- Primer 146R1: TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA
Imagen 2. Coincidencias del primer 146F1.

Se puede observar que el primer 146F1 tiene coincidencia con todas las cepas
encontradas en la base de datos con 100% de identidad. El mismo resultado se
obtiene cuando se utiliza nBLAST en la secuencia 146R1.
- Primer 146F2: GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA
 - Primer 146R2: TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT

Imagen 3. Coincidencias del primer 146F2.

En el caso del segundo juego de primers ocurre la misma situación en la que estos
tienen una coincidencia con todas las cepas encontradas en la base de datos con
una identidad del 100%.

Debido a la especificidad de los primers y de la referencia dada se puede determinar

que el virus es White Spot Syndrome Virus (WSSV) del género Whispovirus. Este es
un virus con un largo rango de hospederos tanto entre los camarones marinos como en
otros tipos de crustáceos, con una tasa de mortalidad del 100%. Como ambos juegos
de primers sirven para amplificar dos secuencias distintas se busca referencias 1 acerca
de esta reacción de PCR de tal forma que se encuentra que la PCR que se debe realizar
en este caso es una PCR anidada de dos pasos: este tipo de PCR consiste en utilizar
dos reacciones de PCR consecutivas donde la primera utilizara un juego de primers de
baja especificidad que servirán para obtener productos indeseados donde algunos
contendrán la secuencia de interés dentro de ellos. En la siguiente reacción de PCR se
utilizarán los productos obtenidos de la primera PCR con el segundo juego de primer,
los cuales son de alta especificidad para obtener una amplificación de la secuencia de
interés. El fin de utilizar este tipo de PCR es el de aumentar la sensibilidad de
detección. En este el primer juego de primers son de alta especificidad al igual que los
segundos por lo que se puede esperar que el tamaño de la amplificación obtenida con
la primera reacción de PCR sea de 1447 bp y de la segunda sea de 941 bp.

REACCIÓN DE PCR
 i.Primer paso de PCR:
Utilizando 1µL de ADN problema se preparar el Master Mix (MM) con 0.15µL del
primer juego de primers: 146F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG y 146R1
TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA en concentración de 0.1µM; 1.5µL de
buffer; 0.3µL de dNTP en concentración de 200µM; 0.15µL de TaqPol; y 11.75µL de
agua destilada.
El ciclo de PCR constara de una denaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de
un annealing a 46°C2 por un minuto y una extensión a 72°C por 2 minutos. Seguiran
39 ciclos de denaturaciones a 94°C por 1 minuto, annealing a 46°C 21 por un minuto y
una extensión a 72°C por 2 minutos; y una extensión final de 5 minutos.
Luego se extraerán los productos obtenidos de la primera reacción de PCR y con este
se realizará la segunda reacción de PCR.
ii.Segundo paso de PCR:
Utilizando 1µL de producto de la primera reacción de PCR se preparar el Master Mix
(MM) con 0.15µL del primer juego de primers: 146F2
GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA y 146R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT
en concentración de 0.1µM; 1.5µL de buffer; 0.3µL de dNTP en concentración de
200µM; 0.15µL de TaqPol; y 11.75µL de agua destilada.
El ciclo de PCR constara de una denaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de
un annealing a 55°C2 por un minuto y una extensión a 72°C por 2 minutos. Seguiran
39 ciclos de denaturaciones a 94°C por 1 minuto, annealing a 46°C 21 por un minuto y
una extensión a 72°C por 2 minutos; y una extensión final de 5 minutos.
LECTURA EN GEL DE AGAROSA
Se realizará una electroforesis en gel de agarosa al 1% utilizando GelRed® y
LowRange Mass Ruler Ladder con buffer TBE 0.5X. Se espera obtener
amplificaciones de 1447 bp y de 941 bp en los resultados finales. Se debe incluir tanto
un control positivo como un control negativo en la corrida de tal manera que se
descarte la posibilidad de errores.

II ELECTROFORESIS
1. Explicar la función de los diferentes compuestos utilizados en la electroforesis de
DNA. Aplicaciones de los geles de agarosa para la caracterización de muestras.
- Buffer TBE23: tiene doble función gracias a sus componentes
 o Tris y borato: la primera es una molécula que sirve de buffer básico y el
borato ayuda a mantener el ajuste del pH para el correcto corrimiento del
ADN.
o EDTA: quelante que atrapa los iones Mg2+ evitando la acción de las
posibles nucleasas presentes.
- GelRed4: es un colorante que se intercala entre las bases nitrogenadas de los
ácidos nucleicos y su fluoróforo da un color naranja al ser expuesto a la luz UV
permitiendo la lectura de la electroforesis en el transiluminador.
- Agarosa5: este polisacárido forma la matriz gracias a la cual se puede separar los
fragmentos de ADN según su tamaño ya que los poros de la matriz que forma al
solidificarse retrasan el movimiento de los fragmentos más extensos.
- MassRuler Low Range DNA Ladder24:
o Debido a los fragmentos de ADN puros de tamaños determinado sirve de
referencia para aproximar el tamaño de la muestra de ADN.
o Viene acompañado con un Loading dye21 que además de aumentar la
densidad de la muestra para que pueda caer hasta los pocillos donde
empezará a correr ayuda a tiñendo la muestra de tal manera que se pueda
reconocer en que momento debe detenerse la corrida.
El gel de agarosa ayuda a caracterizar la muestra debido a que separa los
fragmentos de ADN de diferentes tamaños al no permitir que todos pasen a la
misma velocidad por los poros de su matriz.
2. Si necesito correr ARN en un gel de agarosa, ¿qué consideraciones o variaciones
cree usted que debo tener en cuenta?
Se debe considerar que los ARN pueden plegarse formando estructuras que
dificulten su corrimiento haciendo que no se separen según su tamaño, sino que
también dependa de las conformaciones que adquieran. Para evitar esto se colocan
compuestos que puedan romper los puentes de hidrogeno, como los es formamida 25,
propiciando que la separación solo dependa del tamaño de la molécula.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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