2.

Historia

2.1. Extracción del Acido Nucleico

El primer aislamiento de ADN hecho por un médico suizo Friedrich Miescher en 1869 [8]. El
esperaba resolver los principios fundamentales de la vida, para determinar la composición química
de las células. Él trató de aislar las células de los ganglios linfáticos para su experimento, pero la
pureza de los linfocitos era difícil e imposible de obtener en cantidades suficientes. Por lo tanto, se
pasó a los leucocitos, donde los obtuvo de la pus de vendas quirúrgicas recogidos mediante sus
pruebas precipitado crudo de ADN.

Inicialmente, Miescher se centró en los diversos tipos de proteína que componen los leucocitos y
demostró que las proteínas eran los principales componentes del citoplasma de la célula.

Durante sus pruebas, se dio cuenta de que una sustancia precipita de la solución cuando se añadió
ácido y se disolvió de nuevo cuando se ha añadió el alcalì. Esto fue, por primera vez que había
obtenido un precipitado crudo de ADN.

Para separar el ADN de las proteínas en sus extractos de células, Miescher desarrolló nuevo
protocolo para separar los núcleos de las células de citoplasma y luego aisla al ADN. Sin embargo,
su primer protocolo no cedió material suficiente para continuar con el análisis adicional. Él tuvo
que desarrollar un segundo protocolo para obtener mayores cantidades de nucleina purificada,
que había sido nombrado como "ácido nucleico" más tarde por su alumno, Richard Altman [8].

2.2. Extracción de proteínas

En el siglo XVIII, las proteínas eran conocidas como una clase distinta de las moléculas biológicas
según Antoine Fourcroy y otros. Se distinguen esta molécula por su capacidad para coagular bajo
tratamiento con calor o ácido. Sin embargo, la primera descripción de proteínas se llevó a cabo
por Gerhardus Johannes Mulder, un químico holandés, en 1893 [9]. Sus estudios sobre la
composición de sustancias animales, principalmente fibrina, albúmina y gelatina, mostraron la
presencia de carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno [9]. Además, reconoció que el azufre y el
fósforo estaban presentes a veces en sustancias animales que consistían gran número de átomos y
estableció que estas "sustancias" eran macromoléculas [9].

La mayor parte de los primeros estudios se centraron en proteínas que se pudo purificar en
grandes cantidades. Por ejemplo, la sangre, la clara de huevo y diversas toxinas. La mayoría de las
proteínas son difíciles de purificar en más de cantidades de miligramos incluso con métodos muy
avanzados de hoy en día. La mayoría de las técnicas para la purificación de proteínas se
desarrollaron en un proyecto liderado por Edwin Joseph Cohn, un científico de proteínas, durante
la Segunda Guerra Mundial. Fue responsable de la purificación de la sangre y funcionó las técnicas
para el aislamiento de la fracción de albúmina en suero del plasma sanguíneo, lo cual es
importante en el mantenimiento de la presión osmótica en los vasos sanguíneos, que ayudan a
mantener protegido y vivo [10].
3. Tendencia actual

Después del evento donde Miescher logró obtener el ADN de la célula, muchos otros han seguido
el ejemplo que dan lugar a un mayor avance en el protocolo de aislamiento y purificación de ADN.
Los procedimientos de laboratorio de rutina iniciales para la extracción de ADN se desarrollaron a
partir de estrategias de centrifugación en gradiente de densidad. Meselson y Stahl utilizan este
método en 1958 para demostrar la replicación semiconservativa del ADN [3].

Posteriores procedimientos hicieron uso de las diferencias en la solubilidad de ADN cromosómico

grande, plásmidos, y proteínas en tampón alcalino [3].

Actualmente, hay muchos método especializado de extracción pura de ADN, ARN o proteína. En
general, se dividen en protocolos basados en la solución o columna. La mayoría de estos
protocolos se han convertido en kits comerciales que facilitan los procesos de extracción de
biomoléculas.

3.1. Tipo Extracción de Acido Nucleico

3.1.1. Método Convencional

(1) Extracciòn de Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo

La sal es la impureza común en muestras de ácidos nucleicos. Siempre ha tenido que ser retirados
de muestras de ácido nucleico antes de que los procesos posteriores por hacer. Por lo tanto, se
necesitan etapas de separación y / o purificación simple o múltiple para desalar la muestra que
comprende el ácido nucleico [11]. Los pasos generales de purificación de ácidos nucleicos incluyen
la lisis celular, que interrumpe la estructura celular para crear un lisado, la inactivación de
nucleasas celulares, tales como DNasa y RNasa, y la separación del ácido nucleico deseado a partir
de restos de células [2]. La extracción del disolvente orgánico fenol-cloroformo es uno de los
ejemplos, que se utiliza ampliamente en el aislamiento del ácido nucleico.

Aunque el fenol, es un ácido carbólico inflamables, corrosivos, tóxicos y pueden desnaturalizar las
proteínas rápidamente, que no inhibe completamente la actividad RNAsa [12]. Este problema
puede ser resuelto mediante el uso de una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24:
1). Las proteínas, lípidos, hidratos de carbono, y los restos celulares se eliminan a través de la
extracción de la fase acuosa con la mezcla orgánica de fenol y cloroformo [12, 13]. Se forma una
emulsión bifásicos cuando se añaden fenol y cloroformo. La capa hidrófoba de la emulsión a
continuación, se instaló en la parte inferior y la capa hidrófila en la parte superior por
centrifugación [3]. La fase superior que contenía el ADN se recoge y el ADN se puede precipitar a
partir del sobrenadante mediante la adición de etanol o isopropanol en 2: 1 o 1: 1 ratios y alta
concentración de sal [3]. El precipitado de ADN se recogió por centrifugación, y el exceso de sal se
enjuaga con etanol 70% y se centrifugó para descartar el sobrenadante etanol. El sedimento de
ADN se disuelve a continuación con tampón TE (Tris EDTA) o agua destilada estéril [3].
El uso de isotiocianato de guanidina en la extracción de RNA fue mencionado por primera vez por
Ulrich et al. (1977). El método era laborioso. Por lo tanto, se ha desplazado por una técnica de un
solo paso, que se conoce como extracción de guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo, por
Chomczynski y Sacchi (1987) [12], con lo cual el homogenado se extrae con fenol / cloroformo a
pH reducido.

El Tiocianato de guanidinio es un agente caotrópico utilizado en la degradación de proteínas. El

principio de esta técnica de un solo paso es que el ARN se separa del ADN después de la extracción
con solución ácida que consiste en tiocianato de guanidinio, acetato de sodio, fenol y cloroformo
[13]. En las condiciones ácidas, el ARN total se mantendrá en la fase acuosa superior del conjunto
de la mezcla, mientras que el ADN y las proteínas permanecen en la interfase o de la fase orgánica
inferior. La recuperación de RNA total se realiza a continuación por precipitación con isopropanol
[12].

El ácido nucleico debe ser precipitado después de esto desde el sobrenadante y se lavó a fondo
para eliminar las sales contaminantes. El ácido nucleico purificado se resuspendió a continuación,
y se almacena en tampón TE o agua destilada estéril.