INTRODUCCION

En los laboratorios de Microbiología se utiliza una gran variedad de medios de

cultivos para mantener las cepas, aislar o identificar microorganismos con varias
finalidades: determinar la existencia de contaminación de alimentos,
medicamentos o cosméticos diagnosticar alguna enfermedad, elaboración de
vacunas bacterianas, etc.

Como ya sabemos la microbiología es la ciencia que estudia a los

microorganismos, y para poder estudiarlos de manera adecuada y eficiente, lo
mejor que podemos hacer es aislarlos, esto es para ver cómo se comporta una o
más colonias sin otros factores presentes.

Todo esto se consigue mediante distintas técnicas de desinfección y

esterilización para dejar el medio sin otro microorganismo presente, además de
técnicas de cultivo para sembrar de colonia en el medio.

OBJETIVOS

Conocer los diferentes tipos de medios de cultivo existentes para el

crecimiento de microorganismos en el laboratorio.
Identificar los diferentes pasos a seguir en la elaboración de un medio de
cultivo.
MARCO TEORICO

De manera general se denomina Medio de Cultivo a cualquier material presente

una adecuada combinación de nutrientes para permitir el crecimiento o el
incremento del número de células de una población microbiana. El objetivo
último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno
de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo ' el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Han
preparado más de medios de cultivo diferentes para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad, presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. En medio de
cultivo debe contener los nutrientes ' factores de crecimiento necesarios debe
estar exento de todo microorganismo contaminante.

Siembra: procedimiento mediante el cual se inserta una pequeña cantidad de

microorganismos en un medio de cultivo estéril.

Cultivo: un cultivo de microorganismos es un método para favorecer la

multiplicación de microorganismos, para luego estudiarlos. Existen
distintos tipos de cultivos:
 Cultivo axenico puro: contiene un solo tipo de microorganismo
 Cultivo mixto: contiene más de un tipo de microorganismo.
MEDIO DE CULTIVO.: consta de un gel o solución que contiene todas las
condiciones necesarias, o que se deseen, para que uno o más
microorganismos vivan y crezcan, para su posterior estudio. El gel que más
se usa es el llamado agar, un medio sólido. Existen dos tipos de medios de
cultivo:
MEDIO DEFINIDO: se conocen exactamente todos los componentes que
se encuentran.
MEDIO NO DEFIIDO O COMPLEJO: es un medio muy rico en nutrientes,
cuyos componentes exactos no se conocen. este tipo es útil si se estudian
microorganismos cuyas necesidades nutricionales son desconocidas
ENRIQUESIMIENTO. Método por el cual se favorece el número de
microrganismos de un tipo, pudiendo afectar o no a los demás
microorganismos en su medio.
COLONIA: corresponde a un grupo grande de microorganismos,
generalmente visible a simple vista, que se sabe que provienen de un
único ancestro. Para lograr presentar colonias, normalmente se necesita
aplicar alguna técnica de aislamiento microbiano, de este modo, es
posible separar físicamente a los microorganismos, para que luego se
multipliquen por separado, dandolugar a diferentes colonias.
AGAR: es una sustancia solida muy necesitada en los medios de cultivo,
debido a que sirve para retener físicamente a los microrganismos,
permitiendo que se aíslen y formen colonias.
ESTERILIZACION: proceso de eliminación de todos los microorganismos
presentes en un objeto inanimado o sustancia, la cual se acondiciona de
tal forma que no puede contaminarse nuevamente con ellos .un método
usual de esterilización es calentar un objeto hasta temperaturas
intolerables para toda forma de vida.
DESINFECCION: proceso de todos los agentes patógenos deseados, pero
necesariamente de todos los microorganismos presentes en un objetivo
inanimado o sustancia.
 SANEAMIENTO: proceso que consiste en reducir la población microbiana
o concentración de sustancias químicas aniveles no peligroso para la salud
pública
MICROORGANISMOS AEROBICOS: requieren de oxígeno para vivir.
MICROORGANISMOS ANAEROBICOS: no requieren de oxígeno para vivir.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para
el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá
de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales
varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que
crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy
exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero
o sangre para crecer.

Existen medios cuya composición permite el crecimiento de:

1. un gran número de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar

de Sabouraud),

2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros),

son los denominados medios selectivos.

3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas

pruebas fisiológicas o test bioquímicos (utilización de citratos,
acidificación a partir de azúcares, etc.).
Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:

1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos

(hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P,
Fe, N, Mg, S, etc)

2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidifícate (agar-

agar), tampones, indicador de pH, etc.

Medio de cultivo líquido

1. Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 100 mL de caldo del medio de

cultivo deshidratado.

3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser
rápida para evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido
del frasco.

4. Disolver el medio en 50 mL de agua destilada en un matraz de 250 mL, y una

vez disueltovcompletar el volumen con 50 mL más.

5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.

6. Colocar 10 mL de caldo en 5 tubos de 16x150 c/u.

Medio de cultivo semisólido

1. Colocar los 50 mL restantes del caldo en el matraz de 150 mL y calcular la

cantidad necesaria de agar-agar para obtener un medio semisólido (2 g agar/ 1
L medio).

2. Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente, procurando agitar

repetidamente.

3. Una vez fundido el medio de cultivo semisólido colocar 10 mL en 5 tubos de

16x150 c/u.

NOTA: si el medio de cultivo está deshidratado, hacer los cálculos y disolver con
calentamiento.
Medio de cultivo sólido

1. Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 70 mL de medio de cultivo sólido

deshidratado y seguir los pasos 3 y 4.

3. No medir pH. No es recomendable para medios que contienen agar-agar.

4. Tapar el matraz y calentar hasta disolución total, para ello agitar

repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.

5. Distribuir el medio de cultivo en el siguiente material: 2 tubos de 22x175 con

20 mL 4 tubos de 16x150 con 7 mL

6. Tapar cada uno de los tubos con algodón, etiquetarlos y esterilizarlos en

autoclave a 121oC y 15 lbs. De presión durante 20 minutos.

NOTA 1. No pipetear el agar fundido pues se tapará la pipeta. Para ello medir el
volumen con agua y marcar los tubos, posteriormente agregar el medio hasta
dicha marca.

NOTA 2. Un medio de cultivo sólido (agar) se puede preparar a partir del medio
de cultivo líquido (caldo), agregando a éste la cantidad necesaria de agar-agar
(15 a 20 g agar/ 1 L medio) para el volumen de medio de deseado.

c) Control de calidad del proceso de esterilización.

Actividad para un equipo por mesa

1. En uno de los tubos que contiene 10 mL de caldo, colocar una tira de papel
filtro impregnada con esporas de Geobacillus stearothermophylus (indicador
biológico de esterilidad).

2. Acomodar los tubos (incluyendo el que contiene el indicador biológico) de

acuerdo a su estado físico en tres latas o cestos metálicos (líquido, semisólido y
sólido) y cubrir con papel kraft o de estraza.

3. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, a 15 lbs. De

presión durante 10 a 20 minutos (dependiendo de la cantidad de material).

4. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la

presión interior sea igual a la del exterior.
Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy
variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios sólidos,
semisólidos y líquidos. Este último aspecto es importante a la hora de la
preparación de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintéticos se pueden
preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir
comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir
la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composición, la caducidad, y
la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe
esterilizarse.
Objetivos concretos de la práctica

1. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el

desarrollo de los microorganismos in vitro.

2. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el

laboratorio de microbiología.

3. Hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos.

Adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las
técnicas más comunes para realizarlo.

Cada mesa de trabajo se encargará de la preparación de una cantidad suficiente

de un determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por
todos los alumnos del grupo de prácticas. Las instrucciones a seguir dependerán
del número de mesa y el medio de cultivo asignado, pero en todos los casos, los
pasos son los siguientes:

1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se

parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados.
Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, añadir la cantidad de
agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos. Si el
medio contiene un agente solidifícate (agar-agar) hay que calentar el preparado
hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una
completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios
líquidos no es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la
completa disolución de la misma.

2. Esterilizar la disolución.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para

evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a
utilizarse el medio, el procedimiento será diferente:

a) Medios sólidos en placa.- Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con
papel de aluminio. Llevar a esterilizar al utoclave (1210C) durante 15-20 minutos.
Una vez estéril repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que
solidifique.

Precauciones generales

 Al calentar los medios de cultivo con agar-agar es muy importante procurar agitar
repetidamente el medio para evitar que el agar-agar se pegue en el fondo del matraz y que se
queme. Asimismo evitar que hierva para evitar su derrame.

 Etiqueta debidamente tu material de vidrio (tubos d ensayo, matraces) antes de verter los
medios de cultivo en ellos. Procura no utilizar maskin-tape.

 Los cestos o las latas metálicas deben estar debidamente forradas con papel kraft o de estraza.
 El material donde se preparó el medio de cultivo sólido (agar-agar) debe ser lavado con agua
y jabón inmediatamente después de su uso. Así evitarás que el agar-agar se pegue al vidrio.

 Antes de mandar a incubar el material con los medios de cultivo, verifica la manera cómo hay
que prepararlo para que sean recibidos (Reglamento del Área de Esterilización e Incubación).
CONCLUSIONES

Concluimos con el reconocimiento de los diferentes tipos de medios de

cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos en el
laboratorio.
Identificamos los diferentes pasos a seguir en la elaboración de un medio
de cultivo.

BIBLIOGRAFIA

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolo2_3_19088.pdf
(esterilización y medio de cultivo)
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P2.MediosCultivoEsteriliza
cion_20891.pdf ( esterilización)
ANEXOS