1. ¿Como preparar un blanco para el sustrato o para el preparado enzimático?

2. ¿Po que se tiene que determinar el rango de linealidad de una enzima?

3. La cinética enzimática se sostiene sobre la consideración básica de que la velocidad de la reacción
catalizada es proporcional a la concentración de la proteína enzimática activa en la zona de linealidad
de la relación de v vs. t (velocidad inicial).
Solo en situación muy excepcional v=keo
El estudio comparativo cinético de una enzima es de vital importancia para establecer los
mecanismos moleculares de la acción enzimática.
El control blanco de sustrato se usa en estudios de acción enzimática. Se prepara haciendo una
mezcla de reacción igual a la de la mezcla que estamos estudiando, pero en la cual reemplazamos el
sustrato por un volumen equivalente de su solvente, que generalmente es agua o un amortiguador.
Este control es útil cuando sospechamos que hay algún otro componente de la mezcla que está
interfiriendo en la cuantificacion del sustrato o el producto de la reaccion.
 Cómo determinar la actividad catalítica: la actividad catalítica de una enzima se determina midiendo la
velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado o
sustrato transformado frente al tiempo), en el tiempo cero inicialmente las reacciones transcurren
linealmente, pudiendo tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempo más largos el
progreso de la reacción de aparta de la linealidad.
 Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática: la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente es proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo. V=Vmax(s)/(Km+(s))=K(Eo)
Vmax= k(Eo)
 La cinética enzimática se sostiene sobre la consideración básica de que la velocidad de la reacción catalizada
es PROPORCIONAL a la concentración de la proteína enzimática activa en la ZONA DE LINEALIDAD de la
relación Pvs T (velocidad inicial), solo en situaciones muy excepcionales: V=K(Eo)
 El estudio comparativo cinético de una enzima es de VITAL IMPORTANCIA para establecer los mecanismos
moleculares de la acción enzimática.
 BLACO ENZIMA: colocar 0.1 ml de extracto enzimático en un tubo de ensayo, poner en agua hirviendo para
inactivar la enzima x 5 minutos, colocarlo en baño Maria a 40ºC por5 minutos, agregando 2.9 ml de solución
de sacarosa, luego leemos ABS y si lee algo quiere decir que la solución de sacarosa ya tiene azucares
reductores, el cual será restado de los demás tubos.
 BLANCO SUSTRATO: 0.5 muestra + 0.5 DNS ebullir 5` agua helada x 3` 5 de agua destilada reposar
15` agitar medir a 540nm
 XQ DETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD: esta determinación experimental consiste en fijar tiempos cortos,
para ver con que concentraciones de enzimas trabajar, que serán aquella q tengan un comportamiento lineal,
generalmente los tiempos son menores a 30`, pues así sabes q concentración de enzima usar.
 XQ INMOVILIZAR: para retener el potencial catalítico dentro del reactor.
 XQ MEDIR EN TIEMPO CORTOS: xq ai se da la máxima capacidad catalítica de la enzima.
 UI: cantidad de enzima que cataliza un umol de sustrato por minuto a condiciones determinadas.
 ACTIVIDAD VOLUMETRICA (máxima capacidad catalítica que posee una enzima): UI/ml de enzima
 ACTIVIDAD ESPECÍFICA: UI/ml/mg/ml = UI/mg
 El tampón es una proteína polimeraza que se usa para alcanzar la máxima actividad de la enzima, ya que da
un ph adecuado.
 El CaCl2 le da dureza a los bics
 El alginato es un polímero que proviene del ac. Algínico ( formado por cadenas de glucosa, con su ultimo
carbono terminal (COOH) y la posición grupos oh se diferencian de la glucosa)
 XQ MEDIR LA ENZIMA EN TIEMPOS CORTOS: xq la actividad de la enzima disminuye con el tiempo
 El método de investigación fue un método físico de ATRAPAMIENTO GEL + FIBRA, ventaja de ser reutilizable
y el diseño.
 EN LINEALIDAD, OBJETIVO DEL BLANCO: obtener el valor que se va a usar para restarle a todas las muestras
tomadas a diferentes tiempos, para hacer el primer punto 0, y poder graficar v a partir del un P=0
 XQ UTIL EL PERFIL X VS KeT/k: para determinar la concentración de sustrato en producto en función de la
velocidad máxima de reacción, el tiempo y la constante de saturación, pues representa un comportamiento
casi lineal en comparación a las demás curvas características de un reactor enzimático. Permite elaborar un
esquema que predice el comportamiento real de un reactor agitado a diferentes concentraciones de sustrato.
 IMPORTANCIA DE MEDIR LOS PARAMETOS CINÉTICOS: predice el comportamiento del sistema enzimático
(Km y Vm)
 Parámetros = en enzima soluble e inmovilizada: no son semejantes, en la enzima soluble son mayores que
en la enzima inmovilizada, la inmovilización limita el acceso del sustrato al centro activo de la enzima,
reduciendo la actividad.
 Reacción de alginato de sodio con el Ca++: el alginato es un polímero de los ácidos B-D-manurónico y alfa-L-
galurónico, unidos por 1,4. En presencia de Ca++, se forma un gel al encontrarse los grupos carboxilo del ácido
manurónico y galurónico, el cloriro de calcio ayuda a la gelificacion de los polímeros.

1. ¿Por qué la medición de una enzima se realiza en tiempos cortos de reacción?

La actividad de la enzima disminuye con el tiempo.
2. ¿Cómo se mide la actividad de una enzima?’¿qué es IU de invertasa?
Se obtiene diferentes curvas haciendo variar la concentración del caldo crudo. IU de invertasa, es la cantidad
de enzima que es capaz de trasformar 1 umol de sustrato en un minuto de reacción. Expresa la actividad
enzimática de la enzima.
3. El método de investigación usado fue un método físico....

Las ventajas fueron.

Atrapamiento

1. En el rango de linealidad de invertasa ¿Cuál fue el objetivo de emplear un blanco?

El objetivo fue de obtener el valor que se va usar para restar a todos las muestras tomadas a diferentes
tiempos, para hacer el primer punto 0.

2. Una enzima esta siendo analizada a una concentración de sustrato de 10-6M con un K=3x10-3y en un minuto
el 2% del sustrato pasa a producto. Determinar Vmax. Exprésalo.

3. ¿Por qué en la determinación experimental del rango de linealidad de la inulinasa soluble, se tuvo que
ensayar a diferentes diluciones del extracto enzimático de levadura?
La determinación experimental del rango de linealidad me permite determinar la actividad enzimática de la
enzima, una de las variables mas importantes de cinetica enzimática es la [ ] de enzim( además del tiempo de
hidrolisis, [ ] de sustrato y temperatura), al reducri la [ ] de la enzima, se disminuye la actividad de esta. Después
de realizar los ensayos y graficar decido: trabajar con la dilución donde obtenga mayor linealidad a través del
tiempo y donde pueda obtener mayor producto.

4. ¿Para que te ha sido útil obtener el perfil X vs ket/K para el reactor con inulinasa inmovilizada?
Para determinar la conversión de sustrato en productos en función de la velocidad máxima de reacción, el
tiempo y la constante de saturación; la grafica x Vs (Ket/k) presenta un comportamiento casi ideal en
comparación a los curvas características de un reactor enzimático por lote. Permite elaborar un esquema que
prefiere el comportamiento real de un reactor agitado a diferentes [ ] de sustrato.

5. ¿Por qué es importante e indispensable en el experimento determinar los valores de los parámetros
cinéticos de una enzima soluble y/o inmovilizada? ¿Cuáles son los parámetros cinéticos?
 Para predecir el comportamiento del sistema enzimático. , Vmax y Km

La importancia del estudio de la cinética enzimático reside en dos principios básicos. En primer lugar, permite
explicar cómo funciona una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cómo se comportará esa enzima in
vivo. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, Km y Vmax, son los pilares fundamentales a la hora de
intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo.

La velocidad V indica el número de reacciones por segundo que son catalizadas por una enzima

las enzimas pueden ser caracterizadas por la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la
mitad de la velocidad máxima. Esta concentración de sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten
(KM). Es la constante de disociación (la afinidad del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato). Valores
bajos indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato
reaccione para dar producto.

6. En tu experiencia de Biocatálisis, en el caso que se hubiera determinado los parámetros cinéticos de la

inulinasa inmovilizada ¿Podrías intuir que sus valores fueron equivalentes o semejantes a los obtenidos con
inulinasa soluble? ¿Por qué?
No. Debido a que siempre existe una disminución del poder catalítico de la enzima cuando se realiza la
inmovilización, esto puede ser debido a diversos factores como: restricciones difusionales.

No son semejantes: porque los parámetros cinéticos de la enzima soluble son mayores que en la enzima
inmovilizada, la inmovilizada puede limitar el acceso del sustrato al centro activo de la enzima, volviendo la
actividad.

Efecto partición, cuando la [ ] del sustrato es diferente en la superficie del soporte.

7. Ventajas y Desventajas de enzimas inmovilizadas.

Ventajas

 Facilidad para parar rápidamente la reacción.

 El producto no se mezcla con la enzima.
 Usos repetitivos.
 Posibilidad de trabajar en continuo.
Desventajas

 Alteración de la conformación de la enzima respecto a su estado nativo.

 Pérdida de la actividad de la enzima durante su inmovilización.
 Resulta ser más caro.
ventaja desventaja

 Generalmente aumenta la actividad dentro  La rapidez de reacción es función del

de las células inmovilizadas, sin embargo es tamaño de partículas y la densidad
mucho menor que la actividad de células celular.
suspendidas  Es mas costoso
 Fase heterogenea
 Retiene la capacidad catalítica en el tiempo
 El producto que se obtiene es mas limpio

8. ¿Cuál es la reacción del alginato de sodio con el Ca++?

 El alginato es un polímero, en presencia de Ca, se forma un gel al entrecruzarse los grupos carboxilo de los
acidos manuronicos y galuronico.

El cloruro de calcio se usa prinicpalmente ccomo secuestrador para ayudar a la gelificación de los polímeros.

Porque para la formación de la cubierta de las microcapsulas se debe producir en una gelificación iónica. Este
método consiste en suspender las enzimas en una dilución acuosa de alginato sódico. Dicha suspensión se
hace gotear sobre una disolución acuosa de cloruro cálcico en agitación. Se forman así cubiertas de alginato
cálcico que son insolubles pero permeables.

9. ¿Como hallar el Vmáx y el Kmáx?

Se puede determinar utilizando las representación de elineweaver-burk, esta representación se realiza con
las inversas de los valores de V y S

10. ¿Cuál es el verdadero parámetro cinético que determina la eficiencia de la enzima?

Es la división de Vm/km, demuestra la eficiencia catalítica

11. ¿Procedimiento para obtener el rango de linealidad y Enzimas inmovilizadas?

12. ¿Por qué se calienta el alginato de sodio?
Porque el alginato de sodio a T ambiente es un gel y tiene que calentar para volverse líquido y poder covinarse
con el caldo crudo.
El alginato es un polisacárido que se puede polimerizar a T° más baja, 25 °C. El alginato de sodio tiene poder
gelificante y estabilizante.

Para cambiar su estado, de solido a una disolución acuosa.