1

I. INTRODUCCIÓN

En los ambientes exteriores e interiores se encuentra un gran número

de partículas de diferente origen, forma y tamaño suspendidas en el aire; ellas
constituyen el aerosol atmosférico.

Se pueden clasificar de diferentes formas, teniendo en cuenta el origen

(biológico, orgánico, inorgánico), la localización (marina, continental, rural,
industrial, urbana) y el efecto que pueden causar sobre las superficies en que se
depositan (químico, tóxico, patogénico, degradativo) (Mandrioli, 2002). Entre las
partículas de origen biológico se encuentran bacterias, esporas fúngicas, algas,
virus, protozoos, granos de polen, etc.

Los microorganismos pueden ser transportados del aire exterior hacia

el interior de los locales a través de la ventilación y los visitantes. El transporte se
realiza sobre partículas de polvo, fragmentos de hojas secas, piel, fibras de ropa,
en gotas de agua o en gotas de saliva eliminadas al toser, estornudar o hablar.
(Gallo etal., 1996; Vaillant & Valentín, 1996). La colonización y el crecimiento sobre
la superficie de los objetos que se encuentran en el interior, también pueden ser una
importante fuente de contaminación del aire interior (Petushkova & Kandyba, 1999).

En condiciones estándares la microbiota del aire puede coexistir con los

objetos y colecciones de valor histórico y con las personas en un ecosistema
específico sin causar grandes daños. Sin embargo, en la medida que se produce un
cambio inadecuado en las condiciones ambientales, los microorganismos pueden
tener efectos negativos en el punto de biodeterioro y patogénico (Florian, 2002 a).
 2

Algunos han creado adaptaciones especializadas que favorecen su

supervivencia y permanencia. Los microorganismos dispersados por el aire tienen
una gran importancia biológica y económica porque producen enfermedades en
plantas, animales y humanos, causan alteraciones en los alimentos y materiales
orgánicos y contribuyen al deterioro y corrosión de monumentos y metales.

Este análisis microbiológico del ambiente es muy utilizado en la

industria alimentaria porque es importante para determinar el grado de
contaminación ambiental, ya que las condiciones higiénicas del lugar de trabajo
(utensilios, superficies, etc.) y del propio manipulador van a influir en el número y
tipo de microorganismos de alimento.

Asi mismo, se utiliza también como una medida del control del aire en
ambientes cerrados, principalmente en los hospitales, industrias farmacéuticas y
alimentarias, para saber la cantidad y el tipo de microorganismos que hay en el
ambiente en donde se realiza la toma de muestra.

1.1. Objetivos
 Describir el procedimiento de muestreo microbiológico de aire
 Realizar un recuento de microorganismos bacterianos presentes en el criadero
de cuyes.
 Realizar un recuento de los tipos de hongos presentes en el criadero de cuyes.
 Identificar los tipos de microorganismos bacterianos presentes en el aire
alrededor del criadero de cuyes.
 Reconocer, mediante microcultivo, los tipos de hongos presentes en el aire
alrededor del criadero de cuyes.
 3

II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Muestreo microbiológico de aire

Según Infoaire (Ministerio del Ambiente [MINAM, 2017]) menciona que:

la calidad del aire se puede conocer a través de mediciones con equipos
especializados. Hay muchos factores que afectan la calidad del aire que respiramos
como por ejemplo la presencia de sustancias contaminantes como gases o
partículas generadas de manera natural o por actividades desarrolladas por el
hombre. El crecimiento económico que tiene el país en los últimos años demanda
un mayor uso de energía, recursos y servicios por parte de la población e industrias,
significando la liberación de contaminantes del aire y gases de efecto invernadero
(GEI), que alteran la calidad del aire afectando la salud de la población expuesta,
produce daños en el ambiente (flora, fauna y ecosistemas) y el deterioro de bienes
como los edificios, monumentos y otras estructuras; es por ello que, en el Perú la
calidad del aire se basa en el cumplimiento de los Estándares de Calidad Ambiental
de Aire (ECA Aire), que establecen niveles objetivo para la presencia de
contaminantes en el aire, de modo que al mantenerse bajo estos niveles no
representen riesgo a la salud de la población ni al ambiente.

2.2. Medios de cultivo (de cada uno descripción, incubación, características

del medio)

2.2.1. Caldo BHI

El caldo BHI (Infusión Cerebro Corazón), medio de cultivo líquido color

ámbar claro sin precipitado cuando el medio está preparado, a un pH 7,4 ± 0,2.
 4

Utilizado principalmente para el cultivo de microorganismos de difícil

crecimiento y microorganismos de crecimiento rápido entre los que se incluyen
bacterias aerobias y/o anaerobias.

Es un medio muy rico en nutrientes que proporciona un adecuado

desarrollo microbiano. El cultivo BHI está compuesto principalmente por la infusión
de cerebro de ternera y la infusión de corazón vacuno y la peptona que son la fuente
de carbono nitrógeno y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable
el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga
capacidad buffer.

El agar es el agente solidificante. Se utiliza fosfato disódico como

tampón en el medio. El agar cerebro Corazón mantiene los mismos principios que
el caldo para el cultivo de estreptococos y otras bacterias exigentes. BRIZUELA M.
(2015)

Incubación

Incubar las placas durante 24 – 48 h para bacterias y Cándida, y hasta

un máximo de 5 días para Trichophyton. Las bacterias y Cándida deben incubarse
a una temperatura de 35 a 37 °C, y Trichophyton, a 25 – 30 °C.

Según el diagnóstico clínico y los agentes presuntivos causantes de la

infección, deben incluirse otros medios.
 5

2.2.2. Caldo BHI con antibiótico

El medio BHI + Antibióticos a BHI + (inhibidor de hongos saprófitos) es

un medio selectivo, no es diferencial. se utiliza generalmente en el aislamiento
selectivo de hongos patógenos. Para el aislamiento de hongos de muestras
potencialmente contaminadas, se debe inocular un medio selectivo junto con uno
no selectivo. MURRAY P.R.,1999

Incubación

Incubar las placas a 25 – 30 °C en posición invertida con humedad

aumentada. Para el aislamiento de hongos que causan micosis sistémicas y el
aislamiento de Actinomycetales aerobia, deben inocularse dos conjuntos de medios:
uno debe incubarse a 25 – 30 °C y el otro equivalente, a 35 – 37 °C. Todos los
cultivos deben examinarse al menos semanalmente para detectar crecimiento y
deben mantenerse durante varias semanas antes de notificarlos como negativos

2.2.3. Agar Cled

CLED (Cysteine-Lactose-Electrolyte-Deficient) es un medio de cultivo

diferencial preparado para la recuperación, aislamiento y diferenciación de especies
de microorganismos Gram-positivos y Gramnegativos, se utiliza principalmente para
el recuento de UFC en muestras de orina permitiendo la diferenciación de
microorganismos lactosa positivos y lactosa negativos. NASH P, KRENZ.MM, 1991)
 6

Es deficiente en electrolitos lo cual permite controlar parcialmente el

fenómeno de “Swarming” de diferentes especies de Proteus

Fórmula g/l

 Gelatina de digestión pancreática 4.0 g

 Caseína de digestión pancreática 4.0 g
 Extracto de carne .3.0 g
 Lactosa 10.0 g
 L-Cysteina 128.0 mg
 Azul de bromotimol 0.02 g
 Agar 15.0 g

Incubación

Incubar las placas en posición invertida a 37°C en aerobiosis. Al

término de 24 -48 horas de incubación examinar el cultivo y determinar los estudios
a seguir según las características de las colonias.

Expresión de los resultados

 7

2.2.4. Agar Manitol salado

Medio selectivo para el aislamiento de estafilococos patógenos. Con un

pH: 7,4 ± 0,2 a 25ºC. La mayoría de los microorganismos, que no sean
estafilococos, son inhibidas por la alta concentración de cloruro de sodio. Por lo
general los estafilococos coagulasa positivo fermentan el manitol, haciendo virar el
medio al amarillo. BECTON DICKINSON 2013

Composición: (en gramos por litro)

 Polipeptona 14 g/l
 Cloruro de sodio 75
 Manitol 10
 Rojo de fenol 0,025
 Agar 13

Incubación

Colocar en estufa de cultivo a 35-37 ºC durante 18-48 horas, en

aerobiosis.

Expresión de los resultados

 8

Microorganismos fermentadores del manitol: colonias amarillas.

Microorganismos no fermentadores del manitol: colonias del color del medio, rojas.
BRIZUELA M. (2015)

2.2.5. Agar Sabouraud glucosa

Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de

hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras.
Fundamento Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de
hongos y levaduras. MURRAY P.R.1999

En el medio de cultivo, las peptonas y la glucosa son los nutrientes para

el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa y el pH ácido (pH
5.6±0.2), inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y
levaduras. El agar es el agente solidificante. Puede ser suplementado con otros
agentes selectivos de crecimiento.

Fórmula (en gramos por litro)

 Peptona de caseína 5.0

 Peptona de carne 5.0
 Dextrosa (+) 40.0
 Agar 15.0

Incubación

En aerobiosis a 20-25 ºC. El tiempo dependerá del hongo y levadura

que se quiera recuperar. Como regla general, incubar en las condiciones descriptas
durante 2 a 7 días. En el caso de investigar dermatofitos, incubar durante 5 a 20
días y examinar el cultivo cada 4 a 6 días.
 9

Expresión de los resultados

Observar y describir el color y morfología de las colonias obtenidas.

2.2.6. Agar Mc Conkey

Este medio de cultivo de pH 7.1 ± 0.2 y se utiliza para el aislamiento de

bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos a
partir de muestras clínicas, aguas y alimentos. Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios

para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante.
BRIZUELA M. (2011)

Fórmula

 Peptona de carne 1,5 g

 Peptona de gelatina 17.0 g
 Tripteina 1.5 g
 Lactosa 10.0 g
 Mezcla de sales biliares nº3. 1.5 g
 Cloruro de sodio 5.0 g
 Rojo neutro 0.03 g
 10

 Cristal violeta 0.001 g

 Agar 13.5 g
 Agua purificada 1000 ml

Incubación

Un medio selectivo para el aislamiento e identificación de bacterias

entéricas Incubar las placas aeróbicamente durante 18 a 40 horas a 35 a 37ºC.

Expresión de los resultados

Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en
las colonias, y la precipitación de las sales biliares.

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias

incoloras.

2.2.7. Agar M77

Aislaron en el medio M77 se cogió una sola colonia con el ansa de

siembra, se sembró en todos con medios de cultivo diferenciales, dejamos incubar
a 37°C por 48 horas
 11

2.3. Recuento de microorganismos

Existen varios métodos en las que se puede realizan el recuento de

microorganismos.

2.3.1. Métodos de recuento de microorganismos

2.3.1.1. Métodos de recuento por plaqueo

La técnica de recuento por plaqueo es una de las metodologías más

ampliamente usada para la determinación del número de bacterias u hongos
presentes en una muestra, aunque esta es una de las más antiguas, los datos
obtenidos son muy precisos y aún es usado como método de referencia. Este
método consiste en diluir en factor 1:10 a la muestra original hasta la dilución
1:10000000; se colocan 100 µl de cada una de las diluciones en placas
independientes que contienen un medio de cultivo gelificado (FISHER et al., 1922).

2.3.1.2. Métodos por goteo en placa

Es una de las técnicas cuyo uso se ha intensificado en nuestros días

para el recuento bacteriano, es la técnica de goteo en placa, debido a que ésta es
fácil, rápida y económica. En este método también se realizan las diluciones 1:10 a
partir de la muestra original, pero a diferencia del método de plaqueo, aquí se
colocan tres gotas de 20 µl de cada una de las diluciones seriadas en las placas de
medio gelificado (SOMASEGARAN, 2001).

2.3.1.3. Número más probable (NMP)

El método NMP como en otros métodos de recuento, se realizan

diluciones 1:10 hasta la dilución 1:10000000 (Figura 5). A partir de cada dilución se
toman 100 µl por triplicado o por réplicas de 5 y se siembran en el medio de cultivo
 12

donde esperamos ver el crecimiento característico del microorganismo deseado. En

algunos casos se desea cuantificar la presencia de algún microorganismo
específico difícil de aislar o con un crecimiento que no permite distinguir colonias
delimitadas, una alternativa es seguir alguna actividad metabólica característica del
microorganismo en cuestión (SOMASEGARAN, 2001).

2.3.1.4. Goteo por sellado en placa masivo (GSPM)

Se basan en realizar diluciones seriadas 1:10 con la ayuda de una

pipeta multicanal sobre placas multipozos y además en colocar micro-gotas de cada
dilución en el medio de selección. Una de sus ventajas es que no se requiere el uso
de puntas para una micropipeta durante la dispensación de las gotas y en referencia
al tiempo destinado para dicho goteo también es mucho menor debido a que las
gotas se colocan en un solo paso (FISHER et al., 1922).

2.3.1.5. Método por vaciado en placa

El método de vaciado en placa es también ampliamente utilizado es

parte de las normativas para la detección de microorganismos y cada vez menos
usado en investigación, pero aún hay trabajos reportados con esta metodología.
Este método consiste en diluir en factor 1:10 a la muestra original hasta la dilución
1:10000000 Para el método de plateo, se colocan 100 µl de cada una de las
diluciones en placas independientes que contienen un medio de cultivo gelificado.
La gota de 100 µl de cada placa es extendida (plaqueada) con ayuda de una varilla
de vidrio o bien con bolitas de vidrio, en ambos casos el material de vidrio es estéril
y frio (MORALES L. 2012).

2.4. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias

Existe un conjunto de medios de cultivo que son muy usados para la

identificación bacterias. La siembre de este conjunto o bacteria de pruebas
bioquímicas debe realizarse a partir de colonias aisladas.
 13

2.4.1. Prueba Indol

Es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para

determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano.
Esta división molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares
diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa.

2.4.2. Prueba de Rojo de metilo

a. El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2).

Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo
tanto, permite determinar la formación de ácidos orgánicos que se producen durante
la fermentación de un carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un
caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa,
aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc.,
adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH.

Una reacción positiva, es decir, el viraje del medio a un color

rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía
ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos
orgánico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color
amarillo).

2.4.3. Prueba de Voges-Proskauer

Algunos microorganismos producen acetoína o acetil metil carbinol por

descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico (producto final de la glucólisis).
La acetoína es un producto intermedio de la fermentación butilén-glicólica, que
conduce a la formación de 2, 3 butanodiol.
 14

Tanto la acetoína como el 2,3 butanodiol son productos neutros de la

fermentación de la glucosa que llevan el pH del medio a un valor aproximado de 6
o más, y un aumento en la producción de dióxido de carbono, respecto a la prueba
Rojo de Metilo.

La acetoína en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en

presencia de Oxígeno se oxida a di acetilo. El di acetilo reacciona con compuestos
que contengan núcleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio
(peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo-rosado-violáceo. Se agrega α-
naftol para aumentar la sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de
las enterobacteriaceae, e indicará que la glucosa es fermentada por la vía
butanodiólica.

2.4.4. Utilización del Citrato (Prueba de Citrato de Simmons)

Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que son

capaces de crecer con citrato como única fuente de carbono y sales amónicas
inorgánicas como única fuente de nitrógeno, provocando la alcalinización del medio.

El medio a utilizar es agar Citrato de Simons, que contiene citrato de

sodio, fosfato de amonio y azul de bromo timol como indicador de pH. Sólo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto con el metabolismo del citrato, generará una
fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del mismo
de verde a azul.

2.4.5. Agar TSI

2.4.5.1. Principio

Determinar la capacidad de un microorganismo para atacar un hidrato

de carbono específico incorporado en un medio de desarrollo basal, esta prueba se
 15

recomienda para la identificación de patógenos entéricos Gram negativos. Se

emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación
de ácido y gas, y también para determinación de la posible producción de ácido
sulfhídrico (H2S)

2.4.5.2. Reactivos
Cuadro 1. Composición del Agar TSI

Digerido pancreático de caseína 10.0 g

Digerido péptico de tejido animal 10.0 g
Cloruro sódico 5.0 g
Lactosa 10.0 g
Sacarosa 10.0 g
Glucosa 1.0 g
Sulfato ferroso de amonio 0.2 g
Tiosulfato sódico 0.2 g
Rojo fenol 0.025 g
Agar 13.0 g
Fuente: Laboratorios BD

*Formula por un litro de agua ** pH 7,3 ± 0,2

2.4.5.3. Bioquímica

Este medio diferencial contiene lactosa con una concentración de 1% y

glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o ambos
carbohidratos por parte de las bacterias, además de la producción de gas y ácido
sulfhídrico.

La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones

anaeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior). En el pico de flauta
la glucosa (monosacárido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo
anaeróbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto para los aerobios como por los
 16

anaerobios para dar acido pirúvico y posteriormente este será degradado a través
del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O y energía.

Por otra parte, la lactosa (disacárido) será primero degradada y sus

monosacáridos correspondientes (glucosa y galactosa).

BETA- GALACTOSIDASA

Lactosa Glucosa + Galactosa

CICLO DE KREBS

Glucosa o galactosa CO2, H2O y energía

Después de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria

con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzara a degradarlas. Como
el medio tiene 10 veces menos lactosa que glucosa, las bacterias encontraran
sustrato suficiente para continuar la formación de productos finales ácidos. Luego
de 18-24 horas de incubación todo el medio TSI permanecerá amarillo esta reacción
se denomina acido sobre acido (A/A) y el organismo se identifica como un
fermentador de lactosa.

Un TSI inoculado con una bacteria que no fermenta la lactosa al cabo

de 18-24 horas de incubación presentara la zona inclinada roja y el fondo del agar
permanecerá amarillo debido al metabolismo anaerobio de la glucosa durante la
primera etapa. Esta reacción se denomina alcalina sobre acido (K/A).

Las bacterias que fermentan la glucosa también pueden formar

productos alcalinos a partir de la utilización de la peptona, sobre la zona inclinada,
estas reacciones serán (K/K)
 17

2.4.5.4. Interpretación de la prueba.

 K/A Fermentación solamente de glucosa.

 A/A Fermentación de glucosa y lactosa.
 K/K No fermentación de glucosa y lactosa.

2.4.6. Agar LIA

2.4.6.1. Principio

Detecta las enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en bacilos

Gram negativos. Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de
hidrógeno y gas proveniente de la glucosa.

2.4.6.2. Reactivos.
Cuadro 2. Composición del Agar LIA

Digerido pancreático de gelatina 5.0 g

Extracto de levadura 3.0 g
Dextrosa 1.0 g
L-lisina 10.0 g
Citrato férrico de amonio 0.5 g
Tiosulfato sódico 0.04 g
Púrpura de bromocresol 0.02 g
Agar 13.5 g
Fuente: Laboratorios BD

*Formula por un litro de agua

2.4.6.3. Bioquímica.

Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilación

de los aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta
 18

descarboxilación es la producción de una amina (o diamina) y dióxido de carbono.

Tal es el caso de la producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar
sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina. En el medio LIA se puede
detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción
coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura
de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en
el fondo indica una reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de
glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción
de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la cual provocará un
cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez
debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina
descarboxilasa y un color morado que si es producida.

2.4.6.4. Interpretación de resultados

 K/K Descarboxilación de la lisina con producción o no de gas

(lisina positiva). / tubo color violeta.

 K/A Fermentación de la glucosa, no se descarboxiló ni

desamino la lisina (lisina negativa). / Tubo color violeta en la
superficie y amarillo en el fondo

 K/K+ Descarboxilación de la lisina con producción de H2S (+).

/ Tubo color superficie violeta, fondo negro.

2.4.7. Utilización de malonato

2.4.7.1. Principio.

El malonato de sodio, es una sal orgánica que es utilizada por las

bacterias como única fuente de carbono, si un microorganismo es capaz de utilizar
 19

el malonato de sodio como única fuente de carbono, al mismo tiempo que utilizar el
sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, se produce un aumento de la
alcalinidad que se debe a la formación de Hidróxido de sodio (NaOH).

2.4.7.2. Reactivos.
Cuadro 3. Composición Malonato.

Extracto de levadura 1.0 g

Sulfato de amonio 2.0 g
Fosfato dipotasico 0.6 g
Fosfato monopotasico 0.4 g
Cloruro sódico 2.0 g
Malonato de sodio 3.0 g
Dextrosa 0.25 g
Azul de brumotinol 0.025 g
Fuente: Laboratorios BD

*Formula por un litro de agua

2.4.7.3. Bioquímica

El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar

malonato como fuente de carbono. Las cantidades mínimas de glucosa del medio,
permiten el desarrollo de organismos que no pueden usar malonato o sales de
amonio, sin embargo esos organismos no pueden mantener un pH alcalino. La
producción de ácido por la fermentación de la glucosa impide una posible
alcalinización. Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente
malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de
nitrógeno son capaces de ejercer una acción buffer produciendo hidróxido de sodio.

El aumento de la alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol

cambie de verde a azul. Los microorganismos malonato negativos que fermentan
 20

glucosa hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. La mayoría de las

especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato de sodio. El ensayo también
sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de Salmonella (-).

2.4.7.4. Análisis de resultados.

 Ensayo positivo: Reacción alcalina (azul).

 Ensayo negativo: No hay cambio de color (verde).
 Ensayo negativo: Reacción ácida, sólo fermentación de glucosa
(amarillo).

2.4.8. Prueba Ureasa

2.4.8.1. Principio

Algunas bacterias son capaces de emplear la urea como única fuente

de nitrógeno. En tal caso la bacteria ha de poseer un enzima, la ureasa, capaz de
atacar la urea. Al descomponerse se libera amoniaco que alcaliniza el medio.

2.4.8.2. Reactivos.
Cuadro 4. Composición Agar urea de Christensen.

Peptona 1.0 g

Glucosa 1.0 g

Cloruro de sodio 5.0 g

Fosfato monopotasico 2.0 g

Urea 20.0 g

Rojo fenol 15.0 g

Agar 0.25 g

Fuente: Laboratorios BD

*Formula por un litro de agua

 21

2.4.8.3. Bioquímica.

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando

dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa produciendo un
cambio de color rojo en el medio.

El medio de cultivo posee un indicador de pH que vira a un color rojo

intenso cuando dicho pH se hace básico; de esta forma podemos detectar la
producción de amoniaco y, en última instancia, la presencia del enzima ureasa

Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad

de hidrolizar la urea contenida en el medio con producción de amoniaco, para esta
prueba se utiliza el caldo urea de Stuart o agar urea de Christensen. El caldo Stuart
está estabilizado con sales de fosfato a un pH de 6.8. El microorganismo en estudio
debe producir cantidades relativamente grandes a fin de superar el sistema
estabilizador del medio y elevar el pH del medio los suficiente como para virar el
indicador (por encima de 8.0)

2.4.8.4. Análisis de resultados.

 Positivo: Color rojo rosado intenso en pico de flauta

 Negativo: Amarillo.

2.5. Microcultivo

El microcultivo es el procedimiento idóneo para la identificación de

estructuras fúngicas, pues te permite visualizar al microscopio el micelio en su
conjunto no solo una parte del mismo, como ocurre con el método de disociación.
Este método consiste en cortar de la placa con medio de Sabouraud con hoja de
bisturí, cuadraditos de agar de 0,5 centímetros y colocar un cuadradito en el
portaobjetos que está en la placa con el equipo de microcultivo. Sembrar el hongo
 22

con la espátula en las cuatro esquinas y en el centro del bloque de agar. Colocar el
cubreobjetos sobre el bloque de agar Sabouraud. Verter solución de glicerina por el
borde de la placa de Petri, mojando el papel de filtro, para proporcionar una
adecuada humedad evitando que se deseque el medio de cultivo debido a lo
prolongado de la incubación (RAMIREZ, D. 2008).
 23

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Ubicación del área de estudio

La presente practica se realizó en dos ámbitos: en las instalaciones

internas de la granja de crianza de cuyes de la Facultad de Zootecnia de la
Universidad Nacional Agraria de la Selva - Tingo María y en el laboratorio de
Microbiología General, de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, ambos
políticamente ubicados en la ciudad de Tingo María, distrito de Rupa Rupa,
provincia de Leoncio Prado, Región Huánuco.

Figura 1. Ubicación de la UNAS (Campus Universitario), en el círculo anaranjado se

ubica la zona de muestreo, granja de cobayas y la flecha azul nos indica la ubicación
del laboratorio de Microbiología.
 24

3.2. Ubicación geográfica

Tanto Nuestra zona de muestreo y nuestra zona de ejecución del

análisis, zona de granja de cobayas de la facultad de Zootecnia y el laboratorio de
Microbiología General, se encuentran Ubicados dentro del campus universitario de
la Universidad Nacional Agraria de la Selva, la cual está ubicado en las coordenadas
UTM (E: 390552 m. y N: 8970269 m.).

3.3. Descripción del lugar de estudio

La granja de cobayas de la facultad de Zootecnia es un ambiente

amplio, rodeado de mallas protección la cual permite una adecuada circulación de
aire, costa de dos ambientes amplio de crianza distribuidos en dos columnas de
corrales cada uno. Se observó que no existe un adecuado manejo de excrementos
de los animales, las cuales se encuentran regados en el suelo de concreto, creando
un ambiente con un olor no agradable, esto se debe a que las excretas de los
animales se secan y se esparcen por el aire, por lo cual vimos conveniente realizar
el análisis de calidad microbiológica del aire en este ambiente.

3.4. Lugar de ejecución

Nuestro lugar de ejecución del análisis de calidad microbiológica de

aire, se realizó en los ambientes del Laboratorio de Microbiología General, en el
cual tuvimos el apoyo y la supervisión tanto del profesor del curso y del técnico del
laboratorio.

3.5. Aspectos ambientales

Ecológicamente de acuerdo con la clasificación de zonas de vida o

formaciones vegetales del mundo y el diagrama bioclimático, Tingo María se
encuentra en la formación vegetal bosque muy húmedo Pre-montano Tropical bmh-
 25

PT, y de acuerdo a las regiones naturales del Perú corresponde a Rupa Rupa o
Selva Alta, ubicado entre los 650 y 1,200 m.s.n.m. Hidrográficamente pertenece a
la cuenca del río Huallaga; el comportamiento climático es variable, con una
precipitación anual promedio de 3328.9 mm. Las mayores precipitaciones se
producen entre los meses de septiembre a abril y alcanza un máximo extremo en el
mes de febrero con un promedio mensual de 608.4 mm. (HOLDRIDGE, 1987). La
temperatura media anual es de 22° y 25°C; las temperaturas máximas absolutas
33° y 36°C, y la mínima entre 8° y 15°C.

3.6. Materiales

3.6.1. Medios de cultivos

Los medios de cultivos utilizados en la presente práctica pre profesional

fueron los siguientes: caldo BHI (Brain Heart Broth), Agar CLED (Cistina-Lactosa
Deficiente en Electrolitos), Agar glucosa al 4% según Sabouraud, Agar Mac Conkey,
Agar M77, Agar Plate Count, Agar Manitol Salado.

3.6.2. Medios de cultivo para pruebas bioquímicas

Para la realización de las pruebas bioquímicas se utilizó los siguientes

caldos y agares:

 Caldos: Caldo peptona 0.1%, caldo Rojo de Metilo y Voges-

Proskauer (RMVP),Caldo Malonato.

 Agares: Agar Sulfuro Indol Movilidad (SIM), Agar Hierro – triple

azúcar (TSI), Agar Lisina Hierro (LIA), Agar Citrato de Simmons,
Agar Urea.
 26

3.6.3. Reactivos

Reactivo de Indol según Kovacs, Rojo de metilo, Hidróxido de sodio al

4% (NaOH), Alfa naftol, Cristal Violeta, Lugol, Alcohol Acetona, Azul lactofenol-
glicerol.

3.6.4. Materiales de laboratorio

Matraces Erlenmeyer, placas Petri, tubos de ensayo, algodón, pipetas,

jeringas de 60 ml, pinzas, varillas de vidrio, porta objetos, cubre objetos, mechero
de bunsen, mechero de alcohol, gradillas para tubos de ensayo, asa de siembra,
lanza micológica, espátulas, papel mantequilla, guantes quirúrgicos, mascarillas,
plumón indeleble

3.6.5. Equipos

Autoclave, baño maría, balanza, microscopio, termómetro en forma

horizontal, estufa, cámara fotográfica, Incubadora.

3.7. Metodología

3.7.1. Muestreo

3.7.1.1. Muestreo para bacterias

Con una jeringa estéril se aspiró 50 cc de aire contaminado

seguidamente acercando al calor del fuego del mechero se descargó dentro del
matraz con el caldo BHI previamente preparado, este proceso se repitió por 20
veces hasta llegar a los 1000 cm3.
 27

3.7.1.2. Muestreo para fungi

Con una jeringa estéril se aspiró 50 cc de aire contaminado lo cual

seguidamente acercando al calor del fuego del mechero se descargó en el matraz
con el caldo BHI + antibiótico previamente preparado, este proceso se repitió por 20
veces hasta llegar a los 1000 cm3.

3.7.2. Recuento de microorganismos

3.7.2.1. Recuento de bacterias

Del matraz con caldo BHI, previamente ya introducido la muestra de

aire, se saco 1 ml de muestra y se hizo diluciones hasta 10-3 de donde se saco 1 ml
y se hizo un sembrío por el método de placa vacía donde seguidamente se agregó
Agar Plate Count para luego llevarlo a incubar a 37 oC por 48 hr.

Luego de 48 hr se procedió a hacer el conteo visual del número de

colonias bacterianas. Para determinar el número de bacterias por ml de muestra se
usó la siguiente formula:

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

3.7.2.2. Recuento de fungí

Del matraz con caldo BHI + Antibiótico, previamente ya introducido la

muestra de aire, se hizo las respectivas diluciones hasta llegar a 10-3 de donde se
sacó 0.1 ml de muestra y se sembró por diseminación sobre una placa con Agar
Sabouraud para luego llevar a incubar a To ambiente por 5 días.
 28

Luego de 5 días se realizó el conteo del número de colonias, con la

ayuda del aparato contador de colonias. Para determinar el número de fungí por ml
de muestra se usó la siguiente formula:

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

3.7.3. Identificación de microorganismos

Se prepararon dos matraces con diferentes medios, el primer matraz

fue para las determinar las bacterias que se encuentran en el aire de muestreo, el
medio utilizado para este matraz fue el caldo BHI, el segundo matraz fue para
determinar los hongos que se encuentran en el aire de muestreo el medio utilizado
para este matraz fue el caldo BHI+ antibiótico.

3.7.3.1. Enumeración de colonias bacterianas y fúngicas

Para realizar la enumeración de las colonias bacterianas se extrajeron

0.1ml del caldo BHI con ayuda de una micropipeta luego se procedió a sembrarlo
en una placa al vacío, seguidamente se adicionaron 10 ml de Agar Plate Count tibio
luego para homogenizar la muestra se realizaron suaves movimientos en forma de
8 con cinco repeticiones de este movimiento, se esperó a que el agar se solidifique
para incubarlo a 37°c con un tiempo de 48 horas y después del tiempo de incubación
completo se realizó el recuento de las bacterias incubadas en la placa Petri.

Para realizar la enumeración de las colonias fúngicas se extrajeron

0.1ml del caldo BHI+antibiótico con ayuda de una micropipeta luego se procedió a
sembrarlo en una placa que contenía Agar sabourand, seguidamente con el asa
bacteriológica se procedió a la diseminación de la muestra, esta muestra fue
incubada a temperatura ambiente por tres días. y después del tiempo de incubación
completo se realizó el recuento de las bacterias incubadas en la placa Petri.
 29

Con la ayuda de un contador de colonias se realizó el conteo de las

colonias bacterianas y las colonias fúngicas. Para realizar la enumeración de
bacterias se utilizó la siguiente formula:

M.O./g de aire= # colonias x inoculo de siembra y factor de disolución.

El inoculo de siembra en esta práctica fue de 103.

3.7.3.2. Preparación de medios de cultivos para el

crecimiento de bacterias

Para poder usar la medida correcta de los Agares es necesario que se

lean las indicaciones de los envases de cada Agar. Se utilizaron los siguientes
preparados para el crecimiento bacteriano y posteriormente se vertieron en placas
Petri para su uso.

 18 gramos de Agar Cled con 500 ml de agua destilada.

 400 ml d agua destilada con Agar Manitol Salado.
 26 gramos de agar Mc Conkey con 500 ml de agua destilada.
 400 ml de agua destilada con agar M77.

3.7.3.3. Preparación de medios de cultivo para el crecimiento

de hongos

Se utilizó el siguiente preparado para el crecimiento fúngico.

 32.5 gamos de Agar Sabouraud con 500 ml de agua destilada.

3.7.3.4. Aislamiento de colonias bacterianas en placa Petri

 30

Del matraz para bacterias con medio BHI ya incubado se extrajeron

muestras con un asa bacteriológica y posteriormente se procedió a sembrar en las
placas petri por medio del método de siembra por estrías.

Se sembraron las muestras en las placas petri que contenían medios

de Agar CLED, MANITOL SALADO, M77 CONKEY y MAC. Se procedió a llevar a
incubación a las placas durante 48 horas con una temperatura de 37°c.

3.7.3.5. Aislamiento de colonias puras de hongos

Del medio de cultivo para hongos se es necesario aislar las colonias de

hongos existentes por lo tanto se realizó un aislamiento de cultivo puro y se sembró
la muestra en un tubo de ensayo con Agar Sabouraud.

Posteriormente con esta muestra se realizará el microcultivo de hongos.

3.7.3.6. Realización de pruebas bioquímicas

Luego de haber incubado las placas Petri usadas para el crecimiento

bacteriano se procedió a realizar las pruebas bioquímicas.

Para poder identificar a las bacterias se usó el método de las pruebas

bioquímicas, por lo cual se utilizaron 9 pruebas las cuales son las siguientes:

 Indol
 SIM
 Rojo de metilo
 Voges-proskauer (VP)
 Citrato de Simmons
 TSI
 LIA
 Malonato
 Urea
 31

Se usaron las pruebas bioquímicas para poder aislar un solo tipo de

bacteria en cada prueba.

Luego de haber realizado las pruebas bioquímicas, para poder

identificar la diversidad de géneros bacterianos se utilizó una tabla de pruebas
bioquímica y así se identificó la diversidad bacteriana de la muestra.

3.7.3.7. Microcultivo en fungis

Para realizar el microcultivo se necesitaron los siguientes materiales:

 Placa Petri.
 Soporte de vidrio en forma de v.
 Porta y cubre objetos.
 Agar Sabouraud.

En una placa petri se vertió Agar Sabouraud en estado líquido, se

esperó a que el agar se solidifique y seguidamente de dibujaron cuadritos en la
placa petri para poder extraer con una espátula un cubito de agar.

Se preparó una placa petri con el soporte de vidrio, porta y cubre objetos
debidamente esterilizados y en el portaobjetos se colocó el cubito de agar,
posteriormente con un asa se tomó una muestra del cultivo aislado de hongos y se
lo colocó al cubito de agar, se procedió a tapar el cubito y la muestra con el
cubreobjetos.

Por último, se colocó un trozo de algodón húmedo en la placa petri que

contiene el cubito de agar para que asi el medio se encuentre húmedo y los hongos
se puedan desarrollar, la placa se llevó a incubación por 4 días a temperatura
ambiente.
 32

3.7.3.7.1. Identificación de las colonias fúngicas

Luego 4 días después de haber realizado el microcultivo, se retiró la

placa petri de la incubadora y con los implementos de seguridad debidamente
puestos, se procedió a retirar el cubre objeto y se lo coloco en un portaobjeto limpio
se eliminaron cuidadosamente el microcultivo utilizado para evitar contaminación,
ya en el cubreobjeto limpio se colocaron 2 gotas de azul de lacto glicerol y se
limpiaron los excesos de este colorante, para poder sellar la muestra se usó esmalte
transparente sellando cada lado del cubreobjeto. Posteriormente se observó la
muestra en el microscopio.

Para la identificación de géneros fúngicos se usó el manual genera of

imperfect fungi.
 33

IV. RESULTADOS

4.1. Recuento de colonias

Recuento de bacterias sembradas por estría en agar Plate Count, incubado a

37 °C por 48h.

N° de colonias identificadas: 8

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

8 ∗ 103
𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
0.1 𝑚𝐿

= 8 ∗ 104 𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Recuento de fungi sembrado por estría en agar Sabouraud glucosa, incubado

a temperatura ambiente por 5 días.

N° de colonias identificadas: 3

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

3 ∗ 103
𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
0.1 𝑚𝐿

= 3 ∗ 104 𝑀. 𝑂.⁄𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

 34

4.2. Identificación de microorganismos

4.2.1. Identificación de bacterias

Cuadro 5. Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas para la identificación

de bacterias presentes en el criadero de cuyes.

PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO

Indol -

SIM +

RM -

VP +

CS +

TSI +

LIA +

Malonato -

Urea -

La bacteria identificada de la muestra de aire del criadero de cuyes ha

sido la bacteria Gram negativa del género Enterobacter.

4.2.2. Identificación de hongos

El hongo identificado de la muestra de aire del criadero de cuyes ha sido

del género Geotrichum spp.
 35

V. DISCUSIÓN

Según JACOB et al., (2002) cada región geográfica presenta una flora
fúngica atmosférica diferente, el cual depende en gran medida de los factores
climáticos; así, el Penicillum, Cladosporium, aspergilla y el getrichum son los
géneros más abundantes en ambientes interiores, los cuales provocan afecciones
negativas principalmente en la salud. En nuestros resultados se identificó el género
Geotrichum sp. el cual produce geotricosis (micosis causada por hongos
levaduriformes oportunistas, que afecta pulmones e intestino); siendo un género
fúngico típico de aire donde se crían especies como: Gallus gallus domesticus,
Cavia porcellus, etc. En nuestro caso se tomó muestra de aire en granja de la
Facultad de Zootecnia.

Las especies del género Aspergillus sp. y Geotrichum se aislaron con

mayor frecuencia debido a que las esporas de estos microorganismos son livianas
y esto permite que sean fácilmente transportadas por el aire. En estudios de la
aeromicota en ambientes exteriores, se reportó que el género Aspergillus y
Geotrichum es el de mayor frecuencia de aislamiento y el de mayor número de
especies identificadas (ESQUIVEL et al SOSA, 2003).

Asimismo, SEMPSPH (1999) menciona que el género Geotrichum, es

un hongo que por su detección accesible y su vinculación a la contaminación aérea
se les puede otorgar carácter de indicadores de riesgo biológico aéreo por lo que
indica que la obtención del Aspergillus en el área de muestreo existe un riesgo
biológico dentro del área donde se tomó la muestra.
 36

BOVALLIUS et al., 1978 nos menciona que los fungí son típicamente
más abundantes en verano que en el resto del año, mientras que las bacterias son
más abundantes en primavera y otoño debido a factores como la temperatura,
humedad relativa del aire, exposición a la luz solar, etc. Es por ello que este factor
puede ser uno de las explicaciones del por qué se debieron encontrar varias
especies de fungí en la práctica el cual no fue así debido a que cuando se recolecto
la muestra de aire ya radiación solar no estaba en pleno apogeo.
 37

VI. CONCLUSIONES

Al realizar la practica llegamos a la conclusión que el método más fácil

y practico de realizar el muestreo de aire es con el uso una jeringa, el cual consiste
en succionar la muestra de aire y seguidamente depositar en el matraz con el medio
previamente preparado.

Realizamos distintos métodos de siembras como también diferente

agar, obteniendo resultados con la muestra sembrada por estría en agar Plate
Count, incubado a 37 °C por 48h, y dando un numero de 8 colonias identificadas.

Obtuvimos el resultado de la siembra por estría en agar Sabouraud

glucosa, incubado a temperatura ambiente por 5 días, y dando un numero de 3
colonias identificadas.

Tras varias muestras analizadas y con los resultados obtenidos,

concluimos que en el ambiente del aire del criadero de cuyes de la facultad de
zootecnia hay presencia de la bacteria Gram negativa del género Enterobacter.

Con los resultados obtenidos, podemos concluir que en el ambiente del

aire del criadero de cuyes de la facultad de zootecnia hay presencia del hongo
Geotrichum spp.
 38

VII. RECOMENDACIONES

Se recomienda tener los implementos básicos para ir del criadero de

cuyes.

Límites para agentes biológicos que muestren el nivel de contaminación

de acuerdo a la concentración de bacterias y hongos en el aire.

Se recomienda la limpieza de las estancias del criadero de cuyes, para

evitar que la contaminación de aire.

Es de suma importancia y prioridad ampliar la investigación con

respecto a la identificación de bacterias y hongos en los ambientes, tales como
programas contra los microorganismos que son prejuiciosos.

Implementar un plan de mejora continua de acuerdo al protocolo de

descontaminación microbiológica
 39

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Bioquímicas para Identificar Bacterias, UNAM, México. [En línea]
https://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/atlasmicrobiologia1.pdf
Revisado el 13 de julio, 2018.

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Listos Mannitol Salt Agar.

BECTON, DICKINSON AND COMPANY. 2007. BBL Malonate Broth, Ewing

Modified. Información del producto. USA. [En Línea]
http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/L007466%2808%
29%280107%29_ES.pdf Revisado el 13 de julio 2018.

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Brizuela S.A. Argentina.

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Brizuela S.A. Argentina.

ESQUIVEL, P., MANGIATERRA, M., GIUSIANO, G., SOSA M. 2003. Microhongos

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 40

argentino. Argentina. Boletín Micológico [En Línea]:

(http://revistas.uv.cl/index.php/Bolmicol/article/viewFile/376/34, 15 de
julio 2018)

FISHER R.A., H.G. THORNTON, W.A. MACKENZIE. (1922). The accuracy of the
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of Applied Biology.

J.MACFADDIN.F. (2003). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias

de Importancia Clínica. Editorial Médica, Panamericana. 3ra Edición.
Montevideo

JACOB, B., RITZ B., GEHRING U., KOCH A., BISCHOF W., WICHMANN HE.,
HEINRICH J. 2002. Exposición en interiores a mohos y sensibilización
alérgica. Perspectivas de salud ambiental; 110: pp. 647-653.

M. CAFFER. I, R. TERRAGNO, N.BINSZTEIN. (2008). Manual de procedimientos

diagnóstico y caracterización de salmonella spp. identificación y
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2018. [En Línea]
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MINAM. (2016). Ministerio del Ambiente Perú. Índice de calidad del aire Resolución
Ministerial. Lima. Perú. [En línea]
http://www.minam.gob.pe/wpcontent/uploads/2016/07/RM-N°-181-
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Goteo en Placa por Sellado (o estampado) Masivo, Revista Colombiana
de Biotecnología.
 41

MURRAY P.R., BARON, PFALLER, TENOVER Y YOLKEN. (1999). Manual de

clínica microbiología, 7ma ed. Sociedad Americana de Microbiology,
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[accedido 12 jul. 2018].

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el INSALUD: 1999. Recomendaciones para la verificación de la
bioseguridad ambiental respecto a hongos oportunistas. Med Prev, 1:
15- 20.

SOMASEGARAN, (2001). Comparison of the pour, spread, and drop plate methods
for enumeration of Rhizobium spp. in inoculants made from presterilized
peat, Applied and Environmental Microbiology.
 42

ANEXOS

Figura 2. Toma de muestreo de microorganismos del corral de cuyes de la Facultad

de Zootecnia.

Figura 3. Microcultivo de bacterias.

 43

Figura 4. Muestras de aire en CLED, Mack Conkey, Manitol Salado Y M77.

Figura 5. Diferenciación en los resultados de las pruebas bioquímicas (parte I).

 44

Figura 6. Diferenciación en los resultados de las pruebas bioquímicas (parte II).

Figura 7. Micro cultivo de FUNGI.

 45

Figura 8. Enterobacter observados al microscopio con aumento de 10X

Figura 9. Geotrichum observados al microscopio con aumento de 10X.

 46

ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO Pág.

I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1

1.1. Objetivos .................................................................................................... 2

II. REVISIÓN DE LITERATURA ........................................................................... 3

2.1. Muestreo microbiológico de aire ................................................................ 3

2.2. Medios de cultivo (de cada uno descripción, incubación, características del
medio) ............................................................................................................... 3

2.2.1. Caldo BHI...................................................................................... 3

2.2.2. Caldo BHI con antibiótico .............................................................. 5

2.2.3. Agar Cled ...................................................................................... 5

2.2.4. Agar Manitol salado ...................................................................... 7

2.2.5. Agar Sabouraud glucosa .............................................................. 8

2.2.6. Agar Mc Conkey ........................................................................... 9

2.2.7. Agar M77 .................................................................................... 10

2.3. Recuento de microorganismos ................................................................ 11

2.3.1. Métodos de recuento de microorganismos ................................. 11

2.3.1.1. Métodos de recuento por plaqueo....................................... 11

2.3.1.2. Métodos por goteo en placa ................................................ 11

2.3.1.3. Número más probable (NMP) ............................................. 11

2.3.1.4. Goteo por sellado en placa masivo (GSPM) ....................... 12

2.3.1.5. Método por vaciado en placa .............................................. 12

2.4. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias.......................... 12

2.4.1. Prueba Indol................................................................................ 13

 47

2.4.2. Prueba de Rojo de metilo ........................................................... 13

2.4.3. Prueba de Voges-Proskauer ....................................................... 13

2.4.4. Utilización del Citrato (Prueba de Citrato de Simmons) .............. 14

2.4.5. Agar TSI ...................................................................................... 14

2.4.5.1. Principio .............................................................................. 14

2.4.5.2. Reactivos ............................................................................ 15

2.4.5.3. Bioquímica .......................................................................... 15

2.4.5.4. Interpretación de la prueba. ................................................ 17

2.4.6. Agar LIA ...................................................................................... 17

2.4.6.1. Principio .............................................................................. 17

2.4.6.2. Reactivos. ........................................................................... 17

2.4.6.3. Bioquímica. ......................................................................... 17

2.4.6.4. Interpretación de resultados ................................................ 18

2.4.7. Utilización de malonato ............................................................... 18

2.4.7.1. Principio. ............................................................................. 18

2.4.7.2. Reactivos. ........................................................................... 19

2.4.7.3. Bioquímica .......................................................................... 19

2.4.7.4. Análisis de resultados. ........................................................ 20

2.4.8. Prueba Ureasa ............................................................................ 20

2.4.8.1. Principio .............................................................................. 20

2.4.8.2. Reactivos. ........................................................................... 20

2.4.8.3. Bioquímica. ......................................................................... 21

2.4.8.4. Análisis de resultados. ........................................................ 21

2.5. Microcultivo .............................................................................................. 21

 48

III. MATERIALES Y MÉTODOS ...........................................................................23

3.1. Ubicación del área de estudio .................................................................. 23

3.2. Ubicación geográfica................................................................................ 24

3.3. Descripción del lugar de estudio .............................................................. 24

3.4. Lugar de ejecución ................................................................................... 24

3.5. Aspectos ambientales .............................................................................. 24

3.6. Materiales ................................................................................................ 25

3.6.1. Medios de cultivos ...................................................................... 25

3.6.2. Medios de cultivo para pruebas bioquímicas .............................. 25

3.6.3. Reactivos .................................................................................... 26

3.6.4. Materiales de laboratorio ............................................................ 26

3.6.5. Equipos ....................................................................................... 26

3.7. Metodología ............................................................................................. 26

3.7.1. Muestreo ..................................................................................... 26

3.7.1.1. Muestreo para bacterias ..................................................... 26

3.7.1.2. Muestreo para fungi ............................................................ 27

3.7.2. Recuento de microorganismos ................................................... 27

3.7.2.1. Recuento de bacterias ........................................................ 27

3.7.2.2. Recuento de fungí ............................................................... 27

3.7.3. Identificación de microorganismos .............................................. 28

3.7.3.1. Enumeración de colonias bacterianas y fúngicas ............... 28

3.7.3.2. Preparación de medios de cultivos para el crecimiento de

bacterias .......................................................................................... 29

3.7.3.3. Preparación de medios de cultivo para el crecimiento de

hongos ............................................................................................. 29
 49

3.7.3.4. Aislamiento de colonias bacterianas en placa Petri ............ 29

3.7.3.5. Aislamiento de colonias puras de hongos ........................... 30

3.7.3.6. Realización de pruebas bioquímicas ................................... 30

3.7.3.7. Microcultivo en fungis .......................................................... 31

IV. RESULTADOS ................................................................................................33

4.1. Recuento de colonias............................................................................... 33

4.2. Identificación de microorganismos ........................................................... 34

4.2.1. Identificación de bacterias........................................................... 34

4.2.2. Identificación de hongos ............................................................. 34

V. DISCUSIÓN .....................................................................................................35

VI. CONCLUSIONES ............................................................................................37

VII. RECOMENDACIONES ....................................................................................38

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................39

 50

ÍNDICE DE CUADROS
CUADRO Pág.

Cuadro 1. Composición del Agar TSI .................................................................... 15

Cuadro 2. Composición del Agar LIA .................................................................... 17

Cuadro 3. Composición Malonato. ........................................................................ 19

Cuadro 4. Composición Agar urea de Christensen. .............................................. 20

Cuadro 5. Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas para la identificación

de bacterias presentes en el criadero de cuyes. ................................................... 34
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ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURAS Pág.

Figura 1. Ubicación de la UNAS (Campus Universitario), en el círculo anaranjado

se ubica la zona de muestreo, granja de cobayas y la flecha azul nos indica la
ubicación del laboratorio de Microbiología. ........................................................... 23

Figura 2. Toma de muestreo de microorganismos del corral de cuyes de la

Facultad de Zootecnia. .......................................................................................... 42

Figura 3. Microcultivo de bacterias........................................................................ 42

Figura 4. Muestras de aire en CLED, Mack Conkey, Manitol Salado Y M77. ....... 43

Figura 5. Diferenciación en los resultados de las pruebas bioquímicas (parte I). . 43

Figura 6. Diferenciación en los resultados de las pruebas bioquímicas (parte II). 44

Figura 7. Micro cultivo de FUNGI. ......................................................................... 44

Figura 8. Enterobacter observados al microscopio con aumento de 10X ............. 45

Figura 9. Geotrichum observados al microscopio con aumento de 10X. ............. 45