Amplification of proto-oncogenes in cancer cells

One mechanism that can lead to increased levels of a particular gene product in a cell is
to amplify the number of copies of the gene encoding that product. Sometimes such an
amplification events will occur as a normal component of the process of development as in the
case of the amplification of rRNA genes during oogenesis in animals. In other cases,
amplification can be induced to be occur by selecting for increased tolerance to an inhibitor of
essential enzyme. Finally, extensive evidence now indicate that specific proto-oncogenes are
frequently amplified in particular types of cancer. Although we still do not have proof that these
amplification play a causative role in the oncogenic process that give rise to these cancer cells, it
seems likely that the amplification of proto-oncogene and the resulting overexpression of the
proto-oncogenes product might well be involved in oncogenesis since this genes products are
known to play a role in the control of cell division.

The best known example of induced gene amplification involves that tolerance of the
animal cells growing in culture to the drug methotrexate. Methotrexate inhibits the enzyme
dihydrofolate reductase, an enzyme that catalyze an essential step in dTMP synthesis (and thus in
DNA synthesis). Methotrexate binds to the active site of the dihydrofolate reductase and prevents
it from binding its normal substrate. If one selects for cells with tolerance to gradually increasing
concentrations of methotrexate, some of the cells will become tolerant by amplifying the gene
that encodes dihydrofolate reductase. The methotrexate tolerant cells contain more copies of this
gene and synthesize more dihydrofolate reductase than normal cells. As a result, they can tolerate
higher levels of methotrexate without being killed. Some of the enzyme molecules will bind
methotrexate and be inhibited, but with more enzyme, enough free enzyme molecules will exist
to allow the cells to survive and grow. The more gene copies that are present (the greater the
degree of amplification), the more enzyme that will be synthesized, and the higher concentration
of methotrexate that the cell can ‘tolerate’ and still survive. In some methotrexate tolerant cell
lines, the dihydrofolate gene is highly amplified with over 1000 copies per cell.

The extra copies of the dihydrofolate reductase gene in this methotrexate tolerant cell
lines are present either (1) on extra very small chromosomes called ‘double minutes’ or DMs
(Fig. 17.11a) or (2) as tandemly repeated sequences within so called ‘homogeneously staining
regions’ or HSRs (Fig. 17.11b) of otherwise normal chromosome in the genome. The double
minute chromosome are supernumerary chromosomes that contain the amplified gene and
adjacent chromosomal DNA on extrachromosomal circular molecules of DNA. The contain the
circular molecules of DNA packaged in nucleosomes and chromatin fibers just like normal
chromosomes. These small chromosomes look like two small dots in chromosome spreads (thus
the name ‘double minute’). The circular DNA molecules in these DM chromosomes are
predominantly in the post replication state with the two DNA circles still attached to each other;
this explains their bipartite structure. The DNA molecules present in the DM chromosomes range
in the size from about 50 kilo base pair (kb) to several hundred kb. The unit of the chromosome
that undergoes the amplification process is often referred to as an amplification. In all case
studied to date, the size of the amplification has been much larger than the size of the gene
encoding the enzyme target of the drug used in the selection process. The same amplicon unit
that is present in DMs is often present as the tandemly repeated unti within the HSR regions of
chromosomes containing amplified genes. A general model of the amplification process is shown
in Fig. 17.12; this model has been shown to be accurate on a gross level for the amplification of
the dihydrofolate reductase gene in response to selection for tolerance to methotrexate in
protozoan leishmanial tropica. Whether or not it provides an accurate picture of the amplification
process in higher animals and plants is still uncertain. In no case do we understand the molecular
mechanism by which the amplification process occurs.

There is now considerable evidence indicating that the amplification of cellular proto-
oncogenes may be directly involved in the progression of oncogenesis in certain types of the
human cancers. In some cases, the amplified proto-oncogene is present on DM chromosomes; in
other cases, the amplified proto-oncogenes is part of tandemly repeated amplicon present in an
HSR of a chromosome. In few cases the cancer cells contain both DMs and HSRs. In particular
c-myc in found to be amplified with a very high frequency in small cell carcinomas of the lung
and with lower frequencies in some other tyes of cancer. In an early study, Alitalo and colleagues
used in situ hybridization and autoradiography to demonstrate the presence of multiple copies of
c-myc in an HSR on an abnormal X chromosome in malignant cells of a patient with a
carcinoma of the colon. The malignant cell of this patient also contain DM chromosomes and
these DMs probably carried amplified copies of c-myc as well. However, the sensitivity of the
autoradiography was not sufficient to establish for certain that the DM chromosome carried
copies of c-myc. Many other studies have yielded similar results and demonstrated the
amplification of c-myc in several different types of human cancer cells, particularly carcinomas
of the lung. In addition, two cellular genes that are closely related to c-myc, namely, L-myc and
N-myc are frequently found to be amplified in lung carcinomas and neuroblastomas,
respectively. Finally c-erbB is often present in the amplified state in squamous cell carcinomas
and glioblastomas.

Presumably, the effect (if indeed there is an effect) in amplification of these cellular
proto-oncogenes result from the overproduction of the proto-oncogenes product. The
amplifications events probably are not involved in the initiation of oncogenesis, but may
contribute at subsequent steps in the oncogenesis pathway. However we should hasten to add that
there is no solid evidence demonstrating that the amplification of any proto-oncogene plays a
causative role in oncogenesis. The amplification events could be nothing more than secondary
effect of other steps in oncogenic pathways. Further evidence will be needed before the putative
role of proto-oncogene amplification in oncogenesis can be evaluated. Nevertheless, the
recurrent amplification of specific proto-oncogenes in particular types of cancer suggest that this
correlation may be more than chance and certainly warrants further study. Moreover, given the
known central roles of the product of some proto-oncogenes in the intercellular communications
circuitry, it seems likely that the overproduction of certain proto-oncogene products might well
contribute to oncogenesis.

Amplifikasi proto-onkogen dalam sel kanker

Satu mekanisme yang dapat menyebabkan peningkatan tingkat produk gen tertentu dalam
sel adalah untuk memperkuat jumlah salinan gen yang mengkodekan produk tersebut. Kadang-
kadang seperti peristiwa amplifikasi akan terjadi sebagai komponen normal dari proses
pengembangan seperti dalam kasus amplifikasi gen rRNA selama oogenesis pada hewan. Dalam
kasus lain, amplifikasi dapat diinduksi untuk terjadi dengan memilih untuk meningkatkan
toleransi terhadap inhibitor enzim esensial. Akhirnya, bukti yang luas sekarang menunjukkan
bahwa proto-onkogen spesifik sering diperkuat pada jenis kanker tertentu. Meskipun kami masih
belum memiliki bukti bahwa amplifikasi ini memainkan peran penyebab dalam proses
onkogenik yang menimbulkan sel-sel kanker ini, nampaknya bahwa amplifikasi proto-onkogen
dan hasil ekspresi berlebihan dari produk proto-onkogen mungkin juga terlibat. dalam
onkogenesis karena produk gen ini dikenal memainkan peran dalam pengendalian pembelahan
sel.

Contoh terbaik dari amplifikasi gen yang diinduksi melibatkan toleransi sel-sel hewan
yang tumbuh dalam kultur ke metotreksat obat. Methotrexate menghambat enzim dihydrofolate
reductase, enzim yang mengkatalisasi langkah penting dalam sintesis dTMP (dan dengan
demikian dalam sintesis DNA). Methotrexate mengikat ke situs aktif reduktase dihydrofolate dan
mencegahnya mengikat substrat normal. Jika seseorang memilih sel dengan toleransi untuk
meningkatkan konsentrasi metotreksat secara bertahap, beberapa sel akan menjadi toleran
dengan memperkuat gen yang mengkodekan reduktase dihydrofolate. Sel toleran metotreksat
mengandung lebih banyak salinan gen ini dan mensintesis reduktase lebih dihidrofolat dari sel
normal. Akibatnya, mereka dapat mentolerir kadar methotrexate lebih tinggi tanpa terbunuh.
Beberapa molekul enzim akan mengikat metotreksat dan dihambat, tetapi dengan lebih banyak
enzim, molekul enzim bebas yang cukup akan ada untuk memungkinkan sel-sel untuk bertahan
hidup dan tumbuh. Semakin banyak salinan gen yang ada (semakin besar derajat amplifikasi),
semakin banyak enzim yang akan disintesis, dan semakin tinggi konsentrasi metotreksat maka
sel dapat 'mentoleransi' dan tetap bertahan. Dalam beberapa jalur sel toleran metotreksat, gen
dihydrofolate sangat diperkuat dengan lebih dari 1000 eksemplar per sel.
 Salinan tambahan dari gen reduktase dihidrofolat dalam jalur sel toleran metotreksat ini
hadir baik (1) pada kromosom ekstra sangat kecil yang disebut 'menit ganda' atau DM (Gambar
17.11a) atau (2) sebagai sekuens tandemly berulang dalam apa yang disebut ' homogen daerah
pewarnaan 'atau HSRs (Gambar 17.11b) dari kromosom normal dalam genom. Kromosom
double minute adalah kromosom supernumerary yang mengandung gen yang diamplifikasi dan
DNA kromosom yang berdekatan pada molekul sirkular ekstrachromosomal DNA. Yang
mengandung molekul melingkar DNA dikemas dalam nukleosom dan serat kromatin seperti
kromosom normal. Kromosom kecil ini terlihat seperti dua titik kecil pada penyebaran
kromosom (demikian nama ‘menit ganda’). Molekul DNA melingkar dalam kromosom DM ini
terutama di negara pasca replikasi dengan dua lingkaran DNA yang masih menempel satu sama
lain; ini menjelaskan struktur bipartit mereka. Molekul DNA yang ada dalam kisaran kromosom
DM dalam ukuran dari sekitar 50 kilo pasangan basa (kb) hingga beberapa ratus kb. Unit
kromosom yang mengalami proses amplifikasi sering disebut sebagai amplifikasi. Dalam semua
kasus yang dipelajari hingga saat ini, ukuran amplifikasi jauh lebih besar daripada ukuran gen
yang mengkodekan target enzim dari obat yang digunakan dalam proses seleksi. Unit amplikon
yang sama yang ada di DM sering muncul sebagai unti berulang berulang di dalam wilayah HSR
kromosom yang mengandung gen yang diperkuat. Model umum dari proses amplifikasi
ditunjukkan pada Gambar 17.12; model ini telah terbukti akurat pada tingkat kasar untuk
amplifikasi gen reduktase dihydrofolate dalam menanggapi seleksi untuk toleransi terhadap
methotrexate di tropica leishmanial protozoa. Apakah atau tidak memberikan gambaran yang
akurat tentang proses amplifikasi pada hewan yang lebih tinggi dan tanaman masih belum pasti.
Dalam hal apapun kita tidak memahami mekanisme molekuler yang melaluinya proses
amplifikasi terjadi.

Saat ini ada banyak bukti yang menunjukkan bahwa amplifikasi proto-onkogen seluler
dapat secara langsung terlibat dalam perkembangan onkogenesis pada beberapa jenis kanker
pada manusia. Dalam beberapa kasus, proto-onkogen yang diperkuat hadir pada kromosom DM;
dalam kasus lain, proto-onkogen yang teramplifikasi merupakan bagian dari amplicon berulang
yang hadir dalam suatu HSR suatu kromosom. Dalam beberapa kasus sel-sel kanker
mengandung DM dan HSR. Khususnya c-myc di temukan untuk diamplifikasi dengan frekuensi
yang sangat tinggi dalam karsinoma sel kecil paru-paru dan dengan frekuensi yang lebih rendah
di beberapa tyes lain kanker. Dalam studi awal, Alitalo dan rekannya menggunakan hibridisasi in
situ dan autoradiografi untuk menunjukkan adanya beberapa salinan c-myc dalam suatu HSR
pada kromosom X yang abnormal pada sel-sel ganas pasien dengan karsinoma kolon. Sel ganas
pasien ini juga mengandung kromosom DM dan DM ini mungkin juga membawa salinan c-myc
yang diperbesar. Namun, sensitivitas autoradiografi tidak cukup untuk memastikan bahwa
kromosom DM membawa salinan c-myc. Banyak penelitian lain telah menghasilkan hasil yang
sama dan menunjukkan amplifikasi c-myc dalam beberapa jenis sel kanker manusia, terutama
karsinoma paru. Selain itu, dua gen seluler yang terkait erat dengan c-myc, yaitu, L-myc dan N-
myc sering ditemukan diperkuat pada karsinoma paru dan neuroblastoma, masing-masing.
Akhirnya c-erbB sering hadir dalam keadaan teramplifikasi dalam karsinoma sel skuamosa dan
glioblastoma.

Agaknya, efek (jika memang ada efek) dalam amplifikasi ini proto-onkogen selular hasil
dari overproduksi produk proto-onkogen. Peristiwa amplifikasi mungkin tidak terlibat dalam
inisiasi onkogenesis, tetapi dapat berkontribusi pada langkah selanjutnya dalam jalur
onkogenesis. Namun kita harus cepat-cepat menambahkan bahwa tidak ada bukti kuat yang
menunjukkan bahwa amplifikasi proto-onkogen memainkan peran penyebab dalam onkogenesis.
Peristiwa amplifikasi bisa tidak lebih dari efek sekunder dari langkah-langkah lain dalam jalur
onkogenik. Bukti lebih lanjut akan diperlukan sebelum peran diduga dari amplifikasi proto-
onkogen di onkogenesis dapat dievaluasi. Namun demikian, amplifikasi berulang dari proto-
onkogen spesifik pada jenis kanker tertentu menunjukkan bahwa korelasi ini mungkin lebih dari
kebetulan dan tentunya memerlukan penelitian lebih lanjut. Selain itu, mengingat peran sentral
yang diketahui dari produk beberapa proto-onkogen dalam sirkuit komunikasi interseluler,
nampaknya kelebihan produksi produk-produk proto-onkogen tertentu dapat berkontribusi
terhadap onkogenesis.