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Lettres: A, T, G, C
Principe de la réplication de l’ADN. Dans ce processus chaque brin d’ADN est séparé (non montré) puis chaque brin
sert de matrice pour la synthèse d’un nouveau brin en orientation inverse et de séquence complémentaire. On obtient
donc deux molécules double brin strictement identiques.
DNA polymerase
Les enzymes de restriction sont extraites des bactéries. L’enzyme prise en exemple, EcoRI, reconnaît une séquence précise
(un palindrome de 6 paires de bases) puis coupe deux liaisons phosphodiester, de façon dissymétrique. Ce clivage génère
deux fragments d’ADN terminés par deux séquences simple brin. Ces deux séquences simple brin étant de séquence inverse
complémentaires, elles peuvent se réapparier. On appelle donc ces bouts des bouts collants.
Quelques sites de restriction.
-Les enzymes de restriction reconnaissent des sites
palindromiques à 6 ou 4 paires de bases.
-Les enzymes de restriction génèrent des bouts collants ou
des bouts francs
2-3-2 Des fragments d’ADN de taille différente peuvent être séparés
par électrophorèse
Digestion d’ADN par EcoRI puis séparation des fragments de restriction par électrophorèse EcoRI clive l’ADN
représenté en 5 sites (flèches), générant six fragments de tailles différentes. Ces fragments sont séparés en fonction de leur
taille par électrophorèse en gel d’agarose. L’ADN, fortement chargé négativement (sur les groupes phosphate), migre vers l’
électrode positive, dans l’agarose poreux. L’ADN passe dans les pores du gel d’autant plus facilement qu’il est de petite taille.
Après électrophorèse, l’ADN est révélé par un colorant fluorescent et le gel est photographié.
2-3-3 On peut hybrider des acides nucléiques
Dénaturation et renaturation de molécules d’ADN double hélice. Les deux brins d’une double hélice d’ADN peuvent être
désappariés par chauffage à 100°C. On appelle ce phénomène la dénaturation. En ramenant doucement la température à
37°C, les deux brins peuvent se réapparier. Ainsi, dans un mélange de molécules d’ADN, les deux brins de séquence
complémentaire peuvent se reconnaître.
A
*A
*T T
G
C sonde
De façon générale, peuvent s’hybrider tous fragments d’acides nucléiques de séquence complémentaire:
- Deux brins d’ADN
- Deux brins d’ARN
- Un brin d’ADN et un brin d’ARN
Donc l’objet d’intérêt peut être un fragment d’ADN et la sonde peut être une sonde ADN ou ARN, ou un ARN et la sonde
peut être de l’ADN ou de l’ARN
2-3-4 Une séquence d’ADN particulière peut être mise en évidence
par la technique de Southern-blot
Tailles comparées de différents génomes. Les tailles des génomes sont données en paire de nucléotides par
génomes haploïdes.
La méthode du shotgun. L’ADN est fragmenté au hasard. Chaque fragment est amplifié puis séquençé. La
séquence totale est reconstituée grâce aux chevauchements recherchés par bioinformatique.
Limites de la méthode du shotgun.
(A) Problèmes dus à la présence de séquences répétées en tandem (exemple: séquence GATTA). En appliquant
simplement la reconstitution par chevauchements les séquences répétées internes risquent d’être omises.
(B) Problèmes dûs à la présence de séquences répétées réparties dans le génome. De la même manière, en appliquant
le principe du chevauchement, les séquences situées entre les deux séquences répétées risquent d’être omises.
Séquençage des grands génomes. Un génome constitué d’une molécule linéaire d’ADN de 2.5 Mb doit être séquencé.
On connaît dans ce génome la position de 8 marqueur (A-H).
La méthode du shotgun « génome entier » séquence d’abord des fragments au hasard, puis utilise la position connue des
marqueurs, en plus des chevauchements, pour l’assemblage final.
La méthode des « contigs » est basée sur une fragmentation ordonnée, puis sur le séquençage par la méthode du
shotgun de chaque fragment.
Exemple du séquençage du génome
d’Haemophilus influenzae.
H. influenzae est la bactérie responsable de la
méningite. Son génome a été séquené en 1995.
L’ADN a été séquencé au hasard )par sonication,
ce qui génère des fragments de 1.6 and 2.0 kb.
Ces fragments ont été séparés par
électrophorèse en gel d’agarose. Chaque
fragment est extrait du gel et amplifié par
clonage. 19 687 clones ont été générés. Certains
ont été séquencés plusieurs fois, ce qui a généré
28 643 séquences. L’assemblage de ces
séquences par bioinformatique a pris 30 h. et a
généré 140 contigs, c’est-à-dire 140 séquences
continues. Restaient donc 139 trous!
Etablissement du génome
complet d’Haemophilus
influenzae par recherche
des séquences manquantes
entre les contigs.
Deux méthodes sont possibles:
(à droite): Les fragments d’ADN
manquant vont être générés
par PCR à l’aide de primers
correspondant aux séquences
des extrémités de chaque
contig. Toutes les
combinaisons de primers
seront essayées. Les
combinaisons donnant un
produit de PCR indiquent
quels sont les contigs voisins.
Les produits de PCR sont
ensuite extraits du gel et
séquencés.
(à gauche) On génère une
deuxième banque de clones.
Pour repérer et séquencer
uniquement les clones
correspondant aux trous, on
hydride la banque avec des
sondes correspondant aux
extrémités de chaque contig.
Seuls les clones s’hybridant
avec deux sondes
correspondant à une
séquence entre deux contigs;
ils seront séquencés
Bilan: 5 personnes, 2 mois pour un génome bactérien
Séquençage du génome humain
-Décidé en 1980, initié en 1987 avec 400 marqueurs connus, soit 1/10 Mb
Méthode du shotgun applicable?
. il faudrait 70 106 séquences pour chevauchements suffisants
. Soit 70 séquenceurs automatiques, 1000 séquences par jour, 3 ans.
. Mais assemblage trop complexe