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UNIVERSIDAD DE SUCRE
ASIGNATURA: INMUNOLOGÍA
PRACTICA Nº 2

GUIA 2. OBSERVACION DE CELULAS DEL SISTEMA INMUNE EN SANGRE


PERIFERICA

INTRODUCCION

El sistema inmune de los vertebrados superiores está compuesto por una variedad
de células morfológica y funcionalmente diferentes, que se diferencian a partir de
células primordiales pluripotenciales. Todos estos tipos celulares ejercen funciones
diferentes, interaccionando constantemente entre sí. Estas interacciones pueden
estar mediadas por contacto físico o a través de factores solubles que ejercen su
función en células con receptores específicos. Las células que forman el sistema
inmune se organizan a su vez en tejidos y órganos, estructuras que reciben el
nombre genérico de sistema linfoide. Los tejidos y órganos linfoides se pueden
dividir en primarios o centrales y en secundarios o periféricos. Los órganos
primarios son los lugares de la linfopoyesis, mientras que los periféricos son los
lugares de interacción entre las distintas células y tienen como misión proveer un
ambiente favorable para que se desencadenen las respuestas inmunológicas.

Todas las células del sistema inmune provienen de células madres pluripotenciales
o stem cells. Del hígado embrionario surge la médula ósea, allí existen stem cells
que dan lugar a todas las células. Las células stem de la médula ósea siguen dos
líneas fundamentales de diferenciación:
• Linaje mieloide,
• Linaje linfoide.
Del progenitor mieloide o promielocito derivan los eritrocitos e inflamocitos, este
último grupo se subdivide en:
• Megacariocitos: que van a originar las plaquetas,
• Mastocitos
• Granulocitos (Eosinófilos, Basófilos y Neutrófilos)
• Fagocitos (Eosinófilos , Neutrófilos , Macrófagos y Monocitos)
Del progenitor linfoide derivan:
• Algunas células dendríticas,
• Linfocitos B,
• Linfocitos T (tanto cooperadores Th, como citotóxicos Tc)
• Linfocitos NK.

OBJETIVOS
- Observar las células del sistema inmune
- Comprender la utilidad de algunos colorantes y soluciones en la
identificación de estructuras celulares
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MATERIALES

Microscopio compuesto
Portaobjetos*
Cubreobjetos*
Colorante wright
Agua destilada

Lanceta*
Alcohol
Algodón

*Lo traen los estudiantes

PROCEDIMIENTO

Observación de Células Sanguíneas

A continuación, observaremos células de sangre periférica y para ello


procederemos a hacer un frotis sanguíneo. Siga cuidadosamente las
instrucciones que se darán a fin de lograr una buena preparación.

Limpie con algodón empapado con alcohol la yema de un dedo, pinchelo usando
una lanceta estéril y retire con gasa o algodón estériles la primera gota de sangre.
Enseguida coloque la siguiente gota, generalmente mas pequeña que la anterior
hacia uno de los extremos del portaobjetos limpio, coloque un segundo portaobjeto
en contacto con el borde de la gota formando un ángulo de 45° y dirija el segundo
portaobjeto en dirección opuesta a la gota de sangre, realice esta operación una
sola vez (Ver figura 1).

Durante la observación utilice la región del frotis opuesta al lugar donde


originalmente coloco la gota ya que en este lugar el frotis es mas fino. Deje secar
al aire y luego cubra completamente el frotis con el colorante de Wright, después
de algunos minutos lave el portaobjetos con agua destilada teniendo cuidado de
no dejar caer el chorro directamente sobre el frotis. Seque al aire y proceda a
hacer la observación con el objetivo de inmersión. Identifique, valiéndose de la
figura 2, las diferentes células sanguíneas noten la coloración característica de
cada una de ellas, establezca diferencias morfológicas y de coloración entre
glóbulos rojos (eritrocitos) y blancos (leucocitos) y entre los distintos tipos de
leucocitos.

Bibliografía sugerida como consulta

1. TAK W., Mak and Mary E. Saunders. The Immune Response, Basic and
Clinical Principles (2006). ELSEIVER
3

2. HARALD Theml, Heinz Diem and Torsten Haferlach. Color Atlas of


Hematology. Practical Microscopic and Clinical Diagnosis (2004). 2nd
revised edition. THIEME.

FIGURA 1

Fig.1a. Procedimiento para realizar el extendido de sangre periférica. Fig. 1b. a-c extendidos de
sangre periférica de forma correcta, d-f formas incorrectas de un extendido de sangre.

FIGURA 2

 Neutrófilos: 10-15 µm, presenta de dos a cinco lobulos, abundante


citoplasma y numerosos granulos.

 Eosinófilos: 12-17 µm, presenta de dos a tres lóbulos nucleares,


abundante citoplasma y granulos que contienen cristaloides.

 Basófilos: 14-16 µm. Presentan de 2-3 lóbulos nucleares, abundante


citoplasma con gránulos gruesos.
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 Monocitos: 12-20 µm, el núcleo puede ser redondo, oval, hendido o en


forma de herradura de caballo; presenta abundante citoplasma y abundante
citoplasma.

 Linfocitos: 6-9 µm; núcleo redondo, citoplasma esparcido y pocos gránulos

 Plaquetas: 1.5-3.5 µm, son células que carecen de núcleo y su citoplasma


es granular.

 Eritrocitos: 7.2 µm, son células que carecen de núcleo. No presentan


granulos.
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ASIGNATURA: INMUNOLOGÍA
PRACTICA Nº 3

GUIA 3. PREPARACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEADAS DE SANGRE


PERIFÉRICA POR GRADIENTE DE DENSIDAD

INTRODUCCION
Las respuestas inmunitarias adaptativas están mediadas por linfocitos, de tal
manera que la comprensión de la inmunobiología debe fundamentarse en el
conocimiento de la conducta de los linfocitos. Para ello es preciso aislar las
células, así como identificar y separar las subpoblaciones de linfocitos
funcionalmente distintas.

El primer paso en los estudios sobre linfocitos consiste en su aislamiento a fin de


estudiar su comportamiento in vitro. La separación y aislamiento de células
linfoides de sangre periférica es una técnica básica e inicial para obtener una gran
cantidad de información sobre el sistema inmunológico. Es el paso previo a otra
serie de técnicas más complejas. Esto nos permite, entre otras cosas, conocer:
- Diferentes poblaciones celulares implicadas en la respuesta inmune, mediante el
uso de distintos marcadores de superficie.
- Hacer el diagnóstico de posibles tumores mediante la determinación de
marcadores de superficie tumorales.
- Tipar al paciente en HLA (antígenos de histocompatibilidad) mediante técnicas de
inmunocitotoxicidad mediada por el complemento con fines de trasplantes de
órganos.
- Realizar experimentos in vitro sometiendo a los linfocitos con antígenos
diferentes.
- Extraer el DNA de células linfoides y ver el reordenamiento génico en caso de
tumores.

Los linfocitos humanos pueden aislarse de la sangre periférica con relativa


facilidad mediante centrifugación en distintos gradientes de densidad sobre un
cojín de una mezcla de Ficoll con una solución de sales balanceadas. El Ficoll
Paque PLUS es una solución acuosa con una densidad de 1.077+0.001 gr/ml que
contiene 5,7gr de ficoll 400 y 9 gr de diatrizoato de sodio con 0,0231 gr de EDTA
en cada 100 ml. La mezcla de diatrizoato de sodio con ficoll 400 forma una
solución de baja viscosidad y con alta densidad. La función del diatrizoato de sodio
con el ficoll-paque plus es proveer una densidad óptima y la osmolaridad
necesaria para separar otras células diferentes de los linfocitos y mantener estos
como una población independiente.

Para la separación de linfocitos se utiliza una muestra de sangre diluida en igual


volumen de una solución de sales balanceadas y se vierte cuidadosamente sobre
Ficoll-paque plus en un tubo de ensayo. Después de una corta centrifugación a
temperatura de laboratorio los linfocitos, junto con monocitos y plaquetas, son
cosechados en la interfase entre el Ficoll-paque y el plasma. El material recogido
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es centrifugado con la solución de sales balanceadas para lavar los linfocitos y


remover las plaquetas.

EQUIPOS Y SOLUCIONES REQUERIDAS


1. Dos tubos de ensayo de vidrio por cada muestra a procesar.
2. Solución de sales balanceadas. Mínimo 20ml por cada muestra a procesar. La
solución de sales balanceadas puede ser preparada de dos soluciones stock,
solución A y solución B.

SOLUCION A

Conc. g/l

D-glucosa Anhydra 5.5 x 10-3 M (0.1%) 1.0

CaCl2.2H2O 5.0 x 10-3 M 0.0074

MgCl2.6H20 9.8 x 10-4 M 0.1992

KCl 5.4 x 10-3 M 0.4026

TRIS 0.145 M 17.565

Disolver en aproximadamente 950 ml de agua destilada y adicionar HCl


concentrado hasta obtener un pH de 7.6, después ajustar el volumen a 1 L.

SOLUCIÓN B

Conc. g/l

NaCl 0.14 M 8.19

Para preparar la solución de sales balanceadas, mezcle 1 volumen de solución A


con 9 volúmenes de solución B. Preparar una solución fresca cada semana.
3. Pipetas de 3 mL estériles. Una por cada muestra a procesar.
4. Una centrifuga para tubos de ensayo.
5. Tubos de ensayo de vidrio. Dos tubos por cada muestra de sangre a procesar.
6. Ficoll-Paque PLUS. 3 mL por cada muestra de sangre que será procesada.
7. Jeringa con aguja. Necesaria para extraer el Ficoll-Paque PLUS de la botella
bajo condiciones asépticas.

PREPARACION DE LA MUESTRA

Se debe usar sangre fresca para asegurar una alta viabilidad de los linfocitos
aislados. Preparar la muestra a una temperatura entre 18 y 20 °C.
1. En un tubo de ensayo adicionar 2 mL de sangre tratada con anticoagulante y un
volumen igual de solución de sales balanceadas (volumen final 4 mL).
2. Mezclar suavemente la sangre con el buffer utilizando un pipeteador eléctrico.
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PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE LOS LINFOCITOS


1. Remover la tapa azul de la botella de Ficoll Paque PLUS (Fig. 2).
2. Invertir la botella del Ficoll-Paque PLUS varias veces para garantizar una
mezcla. Usando una jeringa con la aguja ajustada, atravesar el tapón y
extraer el volumen requerido de Ficoll-Paque PLUS (3 ml por cada tubo de
centrifuga) de la botella invertida (Fig 3).
3. Adicionar Ficoll-Paque PLUS (3 ml) al tubo de ensayo
4. Cuidadosamente, adicionar la muestra de sangre diluida (4 mL) sobre el
Ficoll-Paque PLUS (Fig 4).
Nota: cuando de adicione la muestra no debe mezclarse el Ficoll-Paque PLUS y la
muestra de sangre diluida.
5. Centrifugar a 400 g por 30-40 min a 18-20 °C.
6. Extraer la capa superior con una pipeta Pasteur limpia, tratando de no
perturbar la capa de linfocitos en la interfase (Fig. 5).

La capa superior, la cual contiene el plasma, puede ser guardado para posteriores
usos.

LAVADO DE LINFOCITOS
1. Usando una pipeta Pasteur limpia, transferir la capa de linfocitos a un tubo
de ensayo limpio. Este paso es crítico, pues remover exceso de Ficoll-
Paque PLUS causa contaminación con granulocitos y remover exceso de
sobrenadante produce contaminación con plaquetas.
2. Adicionar mínimo tres volúmenes de solución de sales balanceadas a los
linfocitos en el tubo.
3. Resuspender las células suavemente con ayuda de un pipeteador eléctrico.
4. Centrifugar la suspensión a 100 g por 10 minutos a una temperatura entre
18 y 20 ºC
5. Descartar el sobrenadante
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6. Adicionar 6 mL de solución de sales balanceadas a los linfocitos.


7. Resuspender las células suavemente con ayuda de un pipeteador eléctrico.
8. Centrifugar a 100 g por 10 minutos a una temperatura entre 18 y 20 ºC
9. Descartar el sobrenadante

RECUENTO DE LINFOCITOS

Los botones celulares resultantes se resuspenden en 1 ml o más de PBS 1X cada


uno, según el tamaño del botón. Se cogen 10 microlitros de cada muestra, con la
micropipeta y se extiende en el espacio libre entre el cubre y el porta de la cámara
de Neubauer para su contaje en microscópio.

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de


campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una
depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3
mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así, el área
sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central
del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1
milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de
0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro (Fig. 6)

Se puede realizar una adecuada cuantificación de células por mililitro aplicando la


siguiente fórmula:

Número total de células en cuadrados A,B,C,D


X dilución x 104 = Numero de células/mL
Número de cuadrados grandes contados

ESTUDIO DE VIABILIDAD
Muchos experimentos requieren que previamente se valore la viabilidad de las
células que se van a utilizar, con el fin de corregir los valores obtenidos en un
simple recuento de células. De modo que si por ejemplo se ha obtenido una
concentración de células de 10.000 células/mL y se observa una viabilidad del
85%, se pueda corregir la concentración obtenida, considerándose la
concentración real en 8.500 células/mL.
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La membrana plasmática de las células vivas no permite el paso de sustancias


que no sean electrolitos, mientras que las células que no mantienen la integridad
de la membrana (células muertas) las dejan pasar y se colorean. Este método se
utiliza para distinguir células vivas de células muertas y uno de los colorantes más
utilizados para este fin es el azul de tripán.
1. Preparar una solución de azul de tripán al 0.2% de un stock previo al 0.4%.
Para una dilución 1/5, añadir 20 uL de la suspensión celular, 30ul de PBS
1X y 50uL azul de tripán. Antes de añadir las células hay que mover la
suspensión para que esta sea homogénea y el recuento celular sea fiable
2. Tomar con una micropipeta 10 uL de esta dilución 1/5 que ya tiene el
colorante y colocarla en la cámara de Neubauer. Observar cada cuadrado
(A,B.C,D), anotando el número total de células y el número de células
teñidas de azul , que serán células muertas. (Debe realizarse en menos de
5 minutos pues pasado este tiempo la mortalidad aumenta por del
colorante)
3. Calcular el porcentaje de viabilidad (Nº de cel. muertas/ Nº cel. totales x 100)

Problemas de experimentación

1.- Al estudiar los linfocitos de un paciente y hacer un ficoll de 1078 con una
muestra de sangre periférica obtenemos un botón celular grande, el cual
resuspendemos en 3 ml de PBS para su contaje en cámara de Neubauer. El
contaje en el retículo nos da un número de linfocitos en los cuatro cuadrantes (L)
de 867. Podrías indicar:

1.1 El número de linfocitos por ml:.....................................................


1.2 El número de linfocitos totales:.......................................................
1.3 Con qué nombre se conoce el aumento de linfocitos
encontrados:..............................................
1.4 ¿Qué patologías podrían dar ese cuadro?..................................................

2.- Al estudiar los linfocitos de un paciente y hacer un ficoll de 1078 con una
muestra de sangre periférica obtenemos un botón celular pequeño, el cual
resuspendemos en 0´5 ml de PBS para su contaje en cámara de Neubauer. El
contaje en el retículo nos da un número de linfocitos en los cuatro cuadrantes (L)
de 47, Podrías indicar:

2.1 El número de linfocitos por ml:.....................................................


2.2 El número de linfocitos totales:.......................................................
2.3 Con qué nombre se conoce la disminución de linfocitos
encontrados:..............................................
2.4 ¿Qué patologías podrían dar ese cuadro?............................

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ASIGNATURA: INMUNOLOGÍA
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PRÁCTICA Nª 4

GUÍA 4. DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES CELULARES MEDIANTE


CITOMETRÍA DE FLUJO

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, el diagnóstico clínico ha experimentado profundas


modificaciones debidas, en gran medida, a los avances producidos por los nuevos
métodos cuantitativos de análisis celular. De entre ellos destaca la citometría de
flujo, que ha alcanzado gran relevancia, además de la que ya tenía en la
investigación básica. La citometría constituye un complemento valioso de las
técnicas clásicas utilizadas para el estudio de la morfología, biología y bioquímica
celular. Aunque, desde el punto de vista cronológico, la citometría de flujo es una
tecnología relativamente reciente, sus características especiales como técnica de
análisis celular han hecho que en la última década su uso se haya extendido de
forma rápida, desde los laboratorios de investigación básica hasta los laboratorios
clínicos1. La citometría de flujo ha encontrado amplia utilidad en ciencias como la
inmunología, hematología, oncología, anatomía patológica y biología celular 2. La
conjugación de marcadores fluorescentes con anticuerpos monoclonales o
policlonales ha hecho posible los estudios de la densidad y la distribución de
determinantes y receptores de la superficie y del citoplasma celular, permitiendo
identificar subpoblaciones celulares3. Por otra parte, en comparación con los
métodos bioquímicos de análisis celular, en los que se obtiene un resultado
promedio para toda la muestra, la citometría de flujo es capaz de proporcionar una
información cuantitativa sobre cada célula en particular y permite identificar en una
muestra subpoblaciones de células diferentes, incluso cuando están escasamente
representadas.

La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de


análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en
suspensión. El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer pasar
células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante de
un haz luminoso. La información producida puede agruparse en dos tipos
fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la relacionada con la
emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser
excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se transforman
en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que
son procesadas por una computadora4

La citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula. Éstos se


dividen en:
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• Parámetros nucleares
• Parámetros citoplásmicos
• Parámetros de superficie
• Parámetros extracelulares

Un aspecto importante y que representa una ventaja de ella, es la posibilidad de


medir tantos parámetros como anticuerpos se dispongan para ello, marcados con
distintos fluorocromos. Así, es posible caracterizar una célula por su fenotipo de
superficie y, al mismo tiempo, conocer el estado intracelular que guarda la célula
como su patrón de secreción de citocinas, o bien, la etapa del ciclo celular en la
que se encuentra5.

MATERIALES Y REACTIVOS
1. Clitómetro de flujo
2. Micropipetas
3. Puntas para micropipeta
4. Cloruro de Amonio 0.17M (Solución de lisis de células rojas)
5. PBS 1X
6. Tubos Falcón 50ml
7. Centrifuga

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Se debe usar sangre fresca para asegurar una alta viabilidad de los leucocitos
aislados. Preparar la muestra a una temperatura entre 18 y 20 °C.
1. En un tubo de ensayo adicionar 5 ml de sangre tratada con anticoagulante con
45 ml de solución de lisis de células rojas conservada a temperatura ambiente.
2. Incubar por 5 minutos en agitación. No exceder este tiempo porque las células
blancas empiezan a lisarse.
3. Centrifugar por 5 minutos a 2000 RPM.
4. Aspirar el sobrenadante, resuspender el pellet in ~50 ml de PBS 1X frío.
5. Centrifugar por 5 minutos a 2000 RPM
6. Aspirar el sobrenadante y el pellet resupenderlo en 1 ml de PBS 1X

CITOMETRÍA DE FLUJO

Inicialmente, es necesario lavar la celda del flujo y el sistema de toma de muestras


del equipo, utilizando una solución detergente y agua ultrapura. Una vez se hace
el lavado, se procede a leer las muestras. Previo a esto, se realiza un ajuste en el
sistema del equipo, colocando 400 μl de muestra en un tubo eppendor, se ajusta
el sistema y se procede a leer las muestras, las deben diluirse 1/5, en un volumen
total de 400 µl y se procede a realizar la lectura en el equipo.

BIBLIOGRAFÍA
12

Orfao A, Ciudad J, López A, López-Berges MC, Vidriales B, Macedo A, et al. La


citometría de flujo en el diagnóstico clínico. Servicio General de Citometría.
Universidad de Salamanca, 1993.

Orfao A, González M, Ciudad J, López-Berges MC, López A, San Miguel JF, et al.
Aplicaciones de la citometría de flujo en el diagnóstico hematológico. Biol Clin Hematol
1992; 13:456-523.

Goding JS. Conjugation of Antinodies with Fluorochromes Modifications to the


Standard Methods. J Immunol Meths 1976; 13:215-223.

Shapiro HM. Practical Flow Cytometry. 4th ed. New Jersey: Wiley-Liss, Hoboken,
2003.

Barrera Ramírez, LM et al. Citometría de flujo: vínculo entre la investigación básica y la


aplicación clínica. Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. [online]. 2004, vol.17, n.1 [citado 2016-
09-25], pp.42-55. Disponible en: <http://www.scielo.org.mx/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0187-7585.

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ASIGNATURA: INMUNOLOGÍA
PRACTICA Nº 5
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GUIA 5: REACCIONES Y TECNICAS DE INMUNOAGLUTINACION

INTRODUCCION

La inmunoaglutinación es una reacción que tiene lugar cuando se combinan


antigenos particulados (aglutinógenos) con sus anticuerpos específicos
(aglutininas). Esta reacción se ha usado ampliamente debido a la facilidad con que
se lleva a cabo y su alto nivel de detectabilidad. Aunque no permite la
cuantificación exacta de anticuerpos, los resultados pueden expresarse
semicuantitativamente en función de la dilución mayor del suero que permite aun
observar aglutinado (titulo).

En la aglutinación, las partículas quedan asociadas en retículo por anticuerpos


bivalentes (IgG) o pentavalentes (IgM), y se combina cada extremidad de la
molécula anticuerpo (región Fab) con un sitio antigénico idéntico portado por
partículas distintas. Las reacciones de inmunoaglutinación necesitan poco
antigeno y aun menos anticuerpo para manifestarse. Los sitos antigénicos son
dependientes de una estructura relativamente voluminosa, de ahí que una ligera
modificación del estado de dispersión de las partículas sea suficiente para
exteriorizar la reacción serológica.

La hemoclasificacion es una de estas técnicas, en la cual son utilizados


anticuerpos policlonales obtenidos de donantes sanos inmunizados con uno o
varios de grupos sanguíneos, ya sea de una forma natural, como en el caso de
mujeres sensibilizadas durante el embarazo, o mediante inmunización inducida.
En este último caso están las personas sensibilizadas por transfusión o donantes
sanos inoculados voluntariamente con sustancias especificas de grupo (obtenidas
de estroma de eritrocitos) o con glóbulos lavados cuando no se dispone de la
sustancia específica de grupo. En la actualidad se producen anticuerpos
monoclonales hemoclasificadores por la tecnología del hibridoma, a partir de
sustancias específicas de grupo obtenidas por síntesis química o de los eritrocitos
correspondientes.

MATERIALES
Sueros hemoclasificadores anti – A, anti – B y anti – D
Suero problema
Sangres humanas de los tipos A y B citrada o heparinizada
Placa takatsi
Tubos de centrífuga
Tubos de ensayo
Pipetas
Laminas de vidrio o portaobjetos
Lancetas desechables estériles (o agujas estériles)
Aplicadores
Algodón
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Alcohol al 70 %
Guantes
Centrífuga

METODOLOGÍA

Tipificación ABO y Rh de eritrocitos humanos

1. Colocarse los guantes y realizar toda la práctica con ellos


2. Limpiar la yema del dedo medio de la mano con alcohol.
3. Practicar un corte con la lanceta y dejar fluir 1 o 2 gotas de sangre.
4. Dejar caer 3 gotas de sangre separadas una de la otra aproximadamente 2
cm una de la otra
5. Añadir 1 gota de cada uno de los sueros tipificadores en las respectivas
gotas de sangre (una gota de sangre para cada tipo de suero).
6. Homogeneizar rápidamente las tres preparaciones con aplicadores
diferentes y rotar suavemente la lámina unos pocos minutos.
7. Observar los aglutinados. Con el suero anti – Rh puede demorar hasta 5
minutos la exteriorización de la reacción. En caso de duda se repite el
ensayo, incubando la lámina a 37 °C durante 3 minutos.
8. Determinar el grupo sanguíneo basado en la presencia (+) o ausencia (-) de
aglutinación con los sueros hemoclasificadores.

Microtécnica para titular anticuerpos anti – A y anti – B en suero humano.

1. Centrifugar las sangres a 2500 r.p.m durante 10 minutos. Retirar el plasma


con pipeta pasteur u otra (no decantar). Este debe ser incoloro y
transparente; de lo contrario, desechar la sangre.
2. Preparar suspensiones de eritrocitos A y B al 2 %.
3. Preparar por duplicado dos series de diluciones dobles del suero problema,
añadiendo 50 uL de suero fisiológico (SF) a partir del segundo pozo en
todos los pozos de 4 hileras. Desechar 50 uL del último pozo.
4. Preparar por duplicado dos controles con 50 uL de SF y 50 uL de cada una
de las suspensiones (control de eritrocitos del grupo A y control de eritrocito
del grupo B).
5. Añadir a todos los pozos de dos hileras (A y B) 50 uL de la suspensión de
eritrocitos del grupo A y a todos los pozos de las otras dos hileras (C y D),
50 uL de la suspensión de eritrocitos del grupo B.
6. Mezclar los inmunoreactantes dándole unos golpes laterales a la placa o
rotándola varias veces. Cubrirla y dejarla en reposo a temperatura
ambiente durante 1 – 2 horas.
7. Observar los resultados. Las células aglutinadas forman una especie de
alfombra que cubre el fondo del pozo. Las células no aglutinadas resbalan
por las paredes hasta formar un botón en el centro del fondo del pozo.
Determinar el título que se corresponderá con la mayor dilución en la que
se observa reacción positiva. Hacer extensiones en portaobjetos y
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observar la reacción al microscopio óptico con lente de menor o mediano


aumento.

Observación: No se puede utilizar sangre ni suero si no se les realiza las pruebas


para hepatitis B y SIDA. Debe tenerse el cuidado de homogeneizar las
suspensiones de eritrocitos en el momento de añadirlas a los pozos, pues las
células sedimentan rápidamente. Los tubos, pipetas y puntas que se utilicen para
la sangre deben estar bien secos o endulzados con SF para prevenir la hemólisis,
así como enjuagarse inmediatamente después de ser usados con agua corriente
abundante. Hacer lo mismo con la placa de microtitulación al concluir la práctica.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Elabore un informe con estilo de artículo científico sobre los resultados


encontrados incluyendo tablas y gráficas.

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ASIGNATURA: INMUNOLOGÍA
PRACTICA Nº 6

GUIA 6: TITULACIÓN DE ANTICUERPOS

INTRODUCCIÓN
Los inmunoensayos enzimáticos se basan en importantes fenómenos
biológicos:
1). El extraordinario poder discriminatorio de los anticuerpos y 2). El poder
catalítico y la especificidad de las enzimas, que pueden, a menudo, ser
detectadas con gran facilidad; integran la reacción entre los inmunoreactantes
(antígeno y su correspondiente anticuerpo) y la detección de esa reacción al
emplear como indicador a una enzima conjugada al antígeno o al anticuerpo, o
a un tercer compuesto como, por ejemplo, la proteína A(SpA).

La prueba de ELISA fué descrita primeramente por Engwall y Perlman (1971,


1972) quienes para titular inmunoglobulinas utilizaron como
inmunoabsorbentes tubos de poliestireno.

Al estar el antígeno o el anticuerpo marcado con una enzima y a demás


insolubilizado sobre el inmunoabsorbente, la reacción antígeno- anticuerpo
queda inmovilizada y puede ser fácilmente revelada por la adición del sustrato
que, al actuar la enzima, produce un color observable a simple vista o
cuantificable mediante un espectrofotómetro o colorímetro.

MATERIALES

- Ig G de roedores (1/ 200 μL) en buffer carbonado pH 9.6


- Conjugado anti- Ig G (pool de diferentes especies)
- Sustrato ABTS
- Solución de parada (SDS 1%)
- Placas de poliestireno de 96 pozos
- PBS
- PBS-TWEEN 20 0.1 %
- Frasco Lavador
- Toallas de papel
- Agitador
- Película autoadherente
- Tubos de reacción de 0.5 mL
- Tubos falcon de 15 mL
- Micropipetas
- Pipeta multicanal
- Recipiente para pipeta multicanal
17

METODO
1. Adicionar 50 μL de suero a una dilución 1/200 a cada pozo de la fila B por
duplicado de acuerdo a la especie de roedor que le corresponda (B1, B2,
B3, B4, B5, B6). Adicione 50 uL de buffer carbonado en los pozos restantes.
Hacer diluciones dobles a partir de la fila B. Incubar durante una hora a
37ºC. Desechar el sobrenadante y lavar 3 veces la placa con PBS-T (buffer
fosfato salino 1X- Tween 20 al 0.1%) durante 5 minutos cada vez.
2. Añadir 100 μL de la solución bloqueadora (BSA 0.5%) en cada pozo.
Incubar 1 hora a temperatura ambiente. Lavar tres veces la placa con PBS-
T de la misma forma que en el paso anterior. Almacenar la placa a 4 ºC
hasta su uso.
3. Adicionar a cada pozo 50 μL del conjugado anti- Ig G a una dilución 1/5000.
Incubar por 1hora a temperatura ambiente. Descartar y lavar cuatro veces
la placa con PBS-T.
4. Adicionar a cada pozo 50 μL del sustrato ABTS. Incubar en oscuridad a
temperatura ambiente de 10 -15 minutos.
5. Adicionar 50 μL de SDS 1% a cada pozo para detener la reacción
6. Leer en el lector de ELISA a 410 nm.
7. Promediar las absorbancias de cada una de las diluciones. Determinar el
título de anticuerpos en el suero problema.

Elabore un informe con estilo de artículo científico sobre los resultados


encontrados incluyendo tablas y gráficas y compare con los resultados obtenidos
por los otros grupos.

BUFFER DE CARBONATO (pH 9-10.8 – fuerza iónica 0,1)

Solución A (bicarbonato de sodio 0,1 M): disolver 8,4 g de NaHCO3 en suficiente cantidad
de agua destilado completando 100 mililitro.

Solución B (carbonato de sodio 0,1 M): 10.6 g de Na2CO3 anhidro se disuelven en agua
destilada completando 100 mililitro.

Solución A (ml) Solución B (ml) Agua destilada (ml) pH

76.8 7.7 915.5 9

67.6 10.8 921.6 9.2

56.8 14.4 928.4 9.4

45.3 18.2 936.5 9.6


18

34.3 21.9 943.8 9.8

24.6 25.1 950.3 10

17 27.6 955.4 10.2

11.2 29.5 959.3 10.4

7.1 30.8 962.1 10.6

4.1 31.7 964.2 10.8


19

UNIVERSIDAD DE SUCRE
ASIGNATURA: INMUNOLOGÍA
PRACTICA Nº 7

Guia 7. PROTOCOLO MODIFICADO PARA INMUNOFLUORESCENCIA


INDIRECTA (IFI) CON FORMALINA
INTRODUCCION
Durante los últimos años el avance tecnológico ha permitido desarrollar técnicas
que ayudan al diagnóstico de múltiples enfermedades. Aunado al desarrollo de las
nuevas técnicas, la sensibilidad y especificidad en la detección de las
especificidades de los anticuerpos que también han ido en aumento, de tal manera
que el clínico puede contar con pruebas que le permiten hacer los diagnósticos
tempranos con mayor certeza y hacer también el seguimiento del curso de la
enfermedad en función de la variación de los anticuerpos presentes en las
muestras de los pacientes. Entre las técnicas más utilizadas se encuentran: la
inmunofluorescencia, el ensayo inmunoenzimático (ELISA), el ensayo múltiple y la
electroinmunotransferencia (EIT).
La inmunofluorescencia, es una prueba de diagnóstico serológico que emplea
anticuerpos conjugados a fluorocromos. Estas moléculas al ser excitadas
absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energía
(longitud de onda más corta) en luz de menor energía (longitud de onda más
larga). Tiene dos variedades principales: a) Inmunofluorescencia directa (IF)
aplicada fundamentalmente a la detección de antígenos en una muestra clínica y
b) Inmunofluorescencia indirecta (IFI) aplicada a la detección de anticuerpos
específicos en el suero del paciente frente a un determinado antígeno o a la
detección de un antígeno en una muestra clínica.
MATERIALES Conjugado
Microscopio de fluorescencia Azul de Evans 0,04%
Portaobjetos para IF Buffer Fosfato Salino (PBS)
Cubreobjetos Formalina al 2%
Jarra de Copling cámara de Neubawer
Cepa de Leishamnia Acetona
Suero sanguíneo problema Glicerina tamponada
PROCEDIMIENTO
1. Tomar 5 ml de la cepa (LevaCol) y centrifugar a 3000 rpm x 10 minutos a 4 °c.
2. Lavar 3 veces con PBS con igual volumen (5 ml) y centrifugar a 3000 rpm x 10 min a 4
°c.
3. Agregar 5 ml de formalina al 2% y dejar en la nevera a 4 °c durante 24 horas.
4. Centrifugar a 3000 rpm x 10 minutos, lavar el pellet con 5 ml de PBS y resuspender en 3
ml de PBS.
5. realizar una dilución 1/10 de los parásitos (Para preparar 100 uL: 10 uL + 90 uL de PBS)
6. Con la dilución anterior, realizar conteo de parásitos en cámara de Neubawer.
7. Ajustar la concentración a 6x106 parásitos/ml.
8. A cada pozo de la placa para IFI agregar 20 uL de los parásitos y dejar secar durante 2
horas a temperatura ambiente.
9. Sumergir en acetona durante 10 minutos y dejar secar a temperatura ambiente
10. Lavar con PBS (sumergir en jarra de Copling) por 10 minutos, luego, sacar las placas y
dejar secar a temperatura ambiente.
11. Diluir los sueros problema a una concentración 1/32 en PBS 1X. Agregar 20 uL en los
respectivos pozos.
12. Incubar en cámara húmeda a 37°c por 1 hora.
13. Lavar 3 veces en jarra de Copling con una solución de lavado (PBS 1X + Tween 20
0.1%) por 5 minutos cada vez. Después del último lavado, dejar secar a temperatura
ambiente.
14. Agregar 20 uL de conjugado 1/100 (diluido en azul de Evans 0.04%) en cada pozo.
Nota: El azul de Evans debe ser preparado inmediatamente antes de su uso.
15. Incubar 1 hora a 37°c en cámara húmeda en oscuridad.
16. Lavar 3 veces con una solución de lavado (PBS 1X + Tween 20 0.1%) por 5 minutos
cada vez en oscuridad. Después del último lavado, dejar secar a temperatura ambiente en
oscuridad.
17. Agregar 2 gotas de glicerina tamponada entre los pozos y leer en microscopio de
fluorescencia.