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*DETERMINACIÓN DE

LISTERIA
MONOCYTOGENES

Maitane Arrondo
Xabier Egiluz
Andrea Muñoz
Peio Del Hoyo
*INTRODUCCIÓN
* Presente en el intestino de los animales.
* Reservorio: Bacilos anaerobios facultativos que no
forman esporas ni contienen cápsula.
* Resistente a ambientes poco favorables para el
crecimiento de otras bacterias.
* Vías de transmisión: A través del consumo de alimentos
contaminados con dicha bacteria, vertical, zoonótico,
nosocomial.
* Alimentos a considerar: leches no pasteurizadas,
vegetales crudos…
* Produce la enfermedad listeriosis.
*PREPARACIÓN DE MEDIOS
DE CULTIVO
*OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:
1.Identificar la presencia de Listeria monocytogenes en un
alimento.
2.Recuento de mesófilos aerobios totales.
3.Aislar la Listeria monocytogenes en un alimento.
4.Realizar diferentes pruebas bioquímicas para la
confirmación de las colonias.
*MATERIALES:

1.Autoclave
2.Tubos de ensayo con tapón
3.Gradilla
4.Micro pipeta
5.Puntas para micro pipeta
6.Asas de siembra drigalsky
7.Asa de siembra de platino
8.Mechero Bunsen
9.Estufa incubadora
*REACTIVOS:
•Caldo selectivo Fraser
•Placas ALOA
•Placas PCA
•Placa con inoculo de una cepa de Listeria monocytogenes

*MUESTRA:
•Zanahoria con piel

Se utilizan 3 bolsas de stomacher:


•Control negativo: fraser
•Control positivo: fraser+ Listeria monocytogenes
•Muestra problema: muestra + fraser
*PROCEDIMIENTO: presencia de Listeria monocytogenes en 25g
de alimento.

*Se identifican las 3 bolsas estériles para el stomacher.


*Para la muestra problema, se pesa 25 g de muestra en el
equipo Delta Dilutor y se diluye hasta 1:10 añadiendo 250 ml
de caldo selectivo para Listeria (Fraser).
*Para el control positivo y control negativo no se añade
muestra y se le añade 100 ml de Fraser.
*Luego para el control positivo, con un asa de siembra se
inocula la Listeria monocytogenes, introduciendo la asa de
siembra de platino en el caldo.
*Se mezcla y homogeneiza la muestra en el Stomacher.
*Se incuban las 3 bolsas, a 37ºC durante 24h.
*Con una micro pipeta, se siembra 0,1 ml en las 3 placas
ALOA con la ayuda de un asa de siembra estéril.
*Se incuban las placas a 37ºC durante 48h.
*Se examina la presencia de las colonias típicas de Listeria
monocytogenes (colonia azul-verdosa con halo) en el control
positivo.
*En el caso del control negativo, no hay crecimiento de
microorganismos.
*En el control de la muestra, sí que hay crecimiento de
microorganismos.
* AISLAMIENTO DE LAS COLONIAS
1. Se coge un asa de platino y se esteriliza en el
mechero Bunsen.
2. Se hacen las siembras por estría correspondientes en
las placas PCA.
A. Una placa para el control positivo.
B. Una placa para la muestra problema que contiene colonias de color
blanco
C. Una placa para la muestra problema que contiene colonias de color
verde
3.Se incuban las placas PCA a 37ºC durante 24h.
4.Se observa la presencia de microorganismos en las 3
placas
MUESTRA PROBLEMA MUESTRA PROBLEMA
COLONIA VERDE COLONIA BLANCA CONTROL +
*RESULTADOS:
*En el Control positivo, se observan colonias de color verde
con halo. Esto nos indica que es Listeria Monocytogenes.

*En la Muestra problema, algunas colonias son de color


blanco y otras de color verde.
*En el control negativo, no hay crecimiento de
microorganismos. Lo que nos indica que el medio
Fraser, no está contaminado.
* PRUEBAS BIOQUÍMICAS
*TINCIÓN GRAM:
*MATERIAL:
1.Cubetas o bandejas
2.Porta objeto
3.Cubreobjeto
4.Asa de siembra de platino
5.Pinza
6.Pipetas Pasteur
7.Vasos de precipitados
8.Mechero Bunsen
9.Microscopio óptico
10.Aceite de inmersión
* REACTIVOS:

•Genciana Violeta
•Fuchsina
•Lugol
•Alcohol (96%)
•Agua destilada
•Placas PCA con cultivos puros
*PROCEDIMIENTO:
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO

*Se coloca una pequeña gota de agua en el centro de


un portaobjetos limpio.
*Se toma una pequeña cantidad de microorganismo de
las placas de PCA y se transfiere a la gota de agua. Se
remueve la mezcla con el asa de siembra.
*Se acerca el portaobjetos a la llama del mechero
Bunsen, para que se fijen las células.
*Se espera hasta que el líquido se evapore.
*Se deja enfriar el portaobjetos.
* REALIZACIÓN DE LA TINCIÓN GRAM
* Se añade el colorante violeta de Genciana y se espera durante 1
minuto. Se procede a limpiar con agua destilada, para quitar todo
el tinte sobrante.
* Se añade Lugol a la muestra y se espera 1 minuto. De esta forma
se aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Se
procede a limpiar con agua destilada.
* Se decolora con alcohol, durante 30 segundos. Se procede a
limpiar con agua destilada.
* Se añade el colorante Fucshina y se espera 1 minuto.
* Se procede a limpiar con agua destilada, hasta quitar todo el
sobrante.
* Se deja secar la muestra. Para acelerar el secado se acerca el
portaobjetos al mechero Bunsen.
* Se observan las células en el microscopio óptico. Se pone una
gota de aceite de inmersión. Se va enfocando mediante los
*RESULTADOS:
*CATALASA:

*MATERIAL:
1.Portaobjetos
2.Pipeta Pasteur
3.Asa de siembra
4.Mechero Bunsen

*REACTIVOS:
•Peróxido de hidrógeno al 3%
•Placas PCA con cultivos puros
*PROCEDIMIENTO:
1.Se toma una colonia de las placas PCA de cultivos puros y
se coloca sobre un portaobjetos.
2.Sobre ella se deja caer unas gotas de peróxido de
hidrógeno con la ayuda de una pipeta Pasteur.
3.Se detecta la formación de burbujas, si el resultado es
positivo.

*RESULTADOS:
Las tres muestras de colonias, han dado catalasa +. Se
observan burbujas de aire.
*OXIDASA:
MATERIAL:
1.Tiras Oxidasa
2.Asa de siembra
3.Mechero Bunsen

REACTIVOS:
•Placas PCA con cultivos puros

PROCEDIMIENTO:
1.Se coge una colonia de las placas PCA con cultivos puros y
con la ayuda de un asa de platino, se extiende la colonia por
la zona reactiva de la tira.
2.Se observa si la zona impregnada vira a un color azul
violeta.
*RESULTADOS:
*Las tres muestras de colonias, han dado oxidasa -. No hay
cambio de color a azul violeta.
* API:
MATERIAL:
1.Mechero Bunsen
2.Asa de platino
3.Agua destilada
4.Pipeta
5.Pro pipeta
6.Micro pipeta
7.Puntas para micro pipeta
8.Incubadora
9.Fondo y tapa de cámaras de incubación
10. Galerías
11.Hojas de resultados

REACTIVOS
•Placas PCA con cultivos puros
•API Suspensión Medium (2 ml).
•ZYM B
*PROCEDIMIENTO:
*Preparación de la galería
1.Se reúnen fondo y tapa de una cámara de incubación y con
una pipeta se reparte aproximadamente 3 ml de agua
destilada en los alveolos del fondo para crear una atmósfera
húmeda.
2.Se escribe la referencia de las muestras en el lateral de la
cámara.
3.Se saca una galería de su envase individual.
4.Se coloca la galería en la cámara de incubación.
*Preparación del inóculo
1.Se abre una ampolla de API Suspensión Medium (2 ml).
2.Con la ayuda de un asa de platino, se coge una cantidad de
masa bacteriana.
3.Se deposita dentro de la ampolla hasta realizar una
suspensión de turbidez igual a 1 de Mc Farland.
*Inoculación de la galería
1.Se reparte la suspensión bacteriana precedente en los
tubos:
a.Se llena el tubo y la cúpula del ensayo DIM
(100 μL aprox.).
b.Se llena solamente la parte del tubo de los ensayos
ESC a TAG (50 μL aprox.).
2.Se cierra la cámara de inmediato.
3.Se incuba a 37ºC durante 24h.
*Lectura de la galería
1.Se agrega una gota de reactivo ZYM B al ensayo DIM.
2.Pasados 3 minutos se leen todas las reacciones haciendo
referencia a la Tabla de Identificación de la ficha técnica.
3.Se anotan las reacciones +/- en la hoja de resultados.
*Interpretación
*La interpretación se obtiene a partir del perfil numérico.
*1.Se determina el perfil numérico: en la hoja de resultados
los test se separan en grupos de 3 y se asigna para cada uno
un valor 1, 2, 0, 4. Se suman en el inferior de cada grupo
los números que corresponden a reacciones positivas y se
obtienen 4 cifras que constituyen el perfil numérico.

*2.Por medio del software de identificación apiweb tm, se


ha identificado la especie.
*RESULTADOS:
*Los resultados se comparan con la Tabla de identificación
de la ficha técnica correspondiente.
● AEROBIOS MESÓFILOS TOTALES
Solo se ha podido hacer el recuento de dos placas (10-1 y 10-2). Ya que el resto de placas no
contenían colonias entre 30-300 UFC/g.

-1
PLACA 10 1g de alimento×= 247.000 UFC/g

-2
PLACA 10 1g de alimento×× = 940.000 UFC/g
INCIDENCIAS

1. Se ha vuelto hacer la tinción Gram de la Muestra problema que contiene colonias


blancas porque no se aprecia bien la morfología.

2. La hemólisis no se observa muy bien y se ha realizado la prueba dos veces.

CONCLUSIONES
● No se ha realizado correctamente la siembra y ello nos ha llevado a que no se pudiera
llevar a cabo el recuento.
● Solo se ha hecho el recuento de dos placas para el recuento de la cantidad de
aerobios mesófilos por lo cual no se puede afirmar que la muestra no sea apta para
consumo.
● Una de las pruebas realizadas: Tinción Gram positivas (muestra control positivo y
muestra problema con colonia blanca. Gram negativa(muestra problema color verde)
● No hay cambio de color a azul violeta en ninguna de las muestras realizadas (oxidasa
negativa).
● La Listeria monocytogenes es catalasa positiva y debería de reaccionar con el peroxido
de hidrogeno para formar agua y oxígeno.
● Prueba API Listeria determina la ausencia de Listeria monocytogenes.
● En la hemólisis cada colonia reacciona de diferente manera, y se ha podido observar
que ha habido un arrastre de contaminación; teniendo que hacer otra prueba alternativa
(prueba CAMP)
● En la prueba CAMP solo utilizamos una cepa de referencia para poder comparar

A raíz de las pruebas bioquímicas se confirma la ausencia de Listeria monocytogenes. Aun


así, se deberia realizar más pruebas bioquímicas para detectar otras bacterias patógenas.
OTRAS PRUEBAS PARA IDENTIFICAR

● Prueba de la movilidad
● Prueba de fermentación de carbohidratos
● Reducción de nitrato

● Método PCR:

Cuando los cebadores se unen al molde, la polimerasa los extiende y la región


que se encuentra entre ellos se copia.
PASOS DE LA PCR

1. DESNATURALIZACIÓN (96°C)

2. TEMPLADO (55 - 65°C)


3. EXTENSIÓN (72°C)
ELECTROFORESIS
Para visualizar los resultados de una PCR