Métodos de fusión

6.1 Métodos químicos

Los casos informados de fusión controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de

regeneración de híbridos somáticos. se, empleo nitrato de sodio como agente fusógeno. La
frecuencia de formación de heterocariones en tales casos era muy baja. Posteriormente, se lograron
mejores resultados fusionando protoplastos de células del mesófilo de Nicotiana en un medio
conteniendo alta concentración de Ca++ (50 mM) y pH elevado Sin embargo, el fusógeno que
alcanzó mayor aceptaciónes el polietilenglicol (PEG) debido a que, en comparación con los otros
agentes químicos, produce mayor proporción de heterocariones , Además, el tratamiento con PEG
genera una mayor proporción de heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones
entre más de dos protoplastos.

En la fusión de los protoplastos ocurren, en forma sucesiva, los siguientes eventos:

1. Las membranas plasmáticas de protoplastos adyacentes entran en íntimo contacto,

2. Se producen alteraciones en sitios localizados de las mismas, formándose puentes
citoplasmáticos entre protoplastos vecinos.
3. Las interconexiones citoplasmáticas se expanden, provocando la fusión.

6.2 Electrofusión

Este efecto se denominó ruptura eléctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para
reparar tales perturbaciones. El voltaje mínimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la
formación de poros disminuye a mayor duración del pulso eléctrico. Este fenómeno de ruptura
reversible también es aplicado en la técnica de electroporación, con la que se pueden introducir en
las células construcciones de ADN y otras moléculas de alto peso molecular.

El método de electrofusión en esencia involucra dos pasos:

1. Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos, se ponen en
contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo eléctrico no
uniforme. Las cargas se separan dentro de las células formando un dipolo y generando, por lo tanto,
un potencial de membrana. Este proceso se denomina dielectroforesis. La polaridad de la célula
incrementa el campo local no uniforme, atrayendo a las células vecinas. Luego, los protoplastos se
aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las líneas de campo aplicadas.

Figura 4: Electrofusión de protoplastos de mesófilo de

pasto llorón.
A. Dielectroforesis de células. Las diferencias en
intensidad de campo eléctrico hacen que las células
se muevan hacia la zona cercana al electrodo.
B. Aplicación de pulsos cortos de corriente directa,
que inducen la formación de poros en la membrana,
generando puentes entre las membranas de las
células adyacentes.
C. Los puentes con continuidad citoplasmática
poseen un radio de curvatura muy pequeño. Las altas
tensiones superficiales generadas en ese sector
conducen a la formación de una nueva célula esférica.
La fuerza ejercida sobre la célula bajo condiciones dielectroforéticas depende
 de la intensidad de campo eléctrico,
 del gradiente del campo,
 del volumen del protoplasto y
 de la diferencia entre las constantes dieléctricas de la célula y su ambiente

2. El segundo paso consiste en la aplicación de uno o más pulsos cortos de corriente directa de 15 a
100 μseg., con una intensidad de campo elevada, suficiente para causar la ruptura reversible de la
membrana. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crítico de membrana sea alcanzado en
cuestión de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces la fusión de las dos células cuyas
membranas están en estrecho contacto (1 a 2 nanómetros de distancia. Durante este proceso
pueden formarse puentes lipídicos entre las membranas de las dos células. Los puentes formados de
esta manera, con continuidad citoplasmática entre las dos células. Como consecuencia se forma una
nueva célula esférica, ya que el proceso es favorecido energéticamente.

La ruptura es reversible si el número y el

tamaño de los poros son pequeños en
relación con el total de la superficie de la
membrana.

La frecuencia de fusión depende de varios factores:

• El genotipo.
• La procedencia de los protoplastos dentro del mismo genotipo. los protoplastos obtenidos a partir
de hojas se fusionan más fácilmente que los provenientes de raíz o de cultivos celulares.
• El tamaño de los protoplastos. Los más grandes se fusionan más fácilmente.
• La densidad de los protoplastos.
• El número, la duración y la fuerza de los pulsos de corriente directa. El tiempo requerido para la
fusión que sigue a la aplicación de un pulso varía desde pocos segundos a varios minutos.
• El medio de fusión. Un factor de limitación en la agregación dielectroforética de las células es la
conductividad eléctrica del medio; si ésta es muy alta, hay mucho flujo de corriente en la solución y
se producen calentamientos y turbulencias que impiden la formación de cadenas.
• El potencial osmótico del medio de fusión. La inclusión de iones en el medio puede incrementar el
porcentaje de fusión.

• La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la dielectroforesis, que además

depende de factores como la densidad de protoplastos. Pulsos de corriente más largos y de mayor
voltaje producen un aumento de los eventos de fusión múltiple; obviamente, pulsos muy largos y
voltajes muy elevados pueden matar a los protoplasto.

Ventajas de la electrofusión

1. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los híbridos pueden ser
fácilmente identificados y transferidos a un medio nutritivo o selectivo.

2. Puede preseleccionarse el número de células a ser fusionadas. Las formaciones de dos

células son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos.

3. El proceso de fusión es sincrónico, ya que el pulso provoca la fusión de todas las células
expuestas al campo.
4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80 - 100 %) y cariogamia.

5. La viabilidad de las células fusionadas es muy buena.

6. Este método ofrece ventajas sobre otros como el del PEG, que: -requiere condiciones no
fisiológicas -las frecuencias de formación de heterocariones binucleados son bajas y
variables-resultan tóxicos para diversos tipos celulares -el fusógeno debe ser removido antes
del cultivo de los protoplastos y tiene bajo rendimiento de células fusionadas.