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NOMBRE DEL CURSO:

GRUPO N° _

APELLIDOS: _

NOMBRES: _

DIA/HORA: __

LABORATORIO:

NOMBRE DEL PROFESOR:


INDICE

Pág.

PRESENTACION 1

PRACTICA N° 1: El Trabajo de Laboratorio-Bioseguridad 3

Material de Laboratorio Utilización y Manejo

PRACTICA N° 2: Soluciones (Cálculos y Preparación) 15

PRACTICA N° 3: pH y Amortiguadores 25

PRACTICA N° 4: Taller- Laboratorio de Bioquímica Clínica 37

Formas de Expresar Los Constituyentes Químicos Del Organismo Humano

PRACTICA N° 5: Espectrofotometría 45

PRACTICA N° 6: Química de Carbohidratos 55

PRACTICA N° 7 Química de Lípidos 63

PRACTICA N° 8: Proteínas I 71

PRACTICA N° 9: Proteínas II 79

PRACTICA N° 10: Extracción de ADN e Identificación de sus Componentes 89

PRACTICA N° 11: Enzimas I 99

PRACTICA N° 12: Enzimas II (Cinética Enzimática) 107

PRACTICAN0 13: Vitaminas 115

BIBLIOGRAFIA 121
PRESENTACION

Ponemos a disposición de nuestros alumnos de MEDICINA HUMANA de la


Universidad Católica de Santa María, esta Guía de Prácticas de BIOQUIMICA MEDICA
I, que consideramos será de ayuda para apoyar el proceso enseñanza - aprendizaje de
nuestro curso de bioquímica y que aprovecha la experiencia acumulada por un grupo de
Profesores de Bioquímica que venimos enseñando el Curso teórico y a la vez realizando las
prácticas respectivas durante muchos años.

Conscientes del creditaje y naturaleza del Curso de Bioquímica en las diferentes


carreras, hemos tenido que seleccionar un grupo de prácticas en razón a que corresponden
en algunos casos; a capítulos de mayor relevancia y en otros casos, a que por su propia
naturaleza deben ser incluidos para alumnos de Medicina.

Igualmente se podrá observar, que en algunos experimentos, se proporcionan


directamente los resultados, para que el alumno los comente y sobre todo haga la
interpretación correcta y adecuada de los mismos.

Asimismo, incluimos actividades denominadas como Práctica Taller, en donde el


estudiante no realizará experimento alguno sino que discutirá un caso clínico y lo explicará
en términos bioquímicos utilizando la información que va adquiriendo y procesando.

Todas las prácticas incluyen un cuestionario, sobre aspectos que trata el tema, donde el
alumno puede aplicar o aportar otros datos a fin de deducir explicaciones y resolver las
interrogantes planteadas.

El estudiante anotará sus resultados, interpretaciones y respuestas en la misma Guía de


Prácticas para optimizar su tiempo.

No dudamos que esta Guía de Prácticas tenga muchos aspectos que puedan ser
mejorados en las próximas ediciones, de allí que los autores seremos muy receptivos a las
sugerencias de los usuarios a quienes desde ya les estaremos muy agradecidos.

Los Autores

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PRACTICA N° 1: EL TRABAJO DE LABORATORIO-
BIOSEGURIDAD

OBJETIVOS
1. Interiorizar las normas de bioseguridad en las personas que trabajan en el
laboratorio.

2. Cumplir con las normas de bioseguridad en el laboratorio.

3. Clasificar las sustancias empleadas en el laboratorio de acuerdo al grado de


peligrosidad.

INTRODUCCIÓN
Bioseguridad: Son normas universales preventivas, destinadas a mantener,
controlar y reducir factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o
químicos, las cuales están encaminadas a lograr actitudes y conductas que prevengan
impactos nocivos y que aseguren que el desarrollo o producto final de dicho
procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de los trabajadores del laboratorio,
pacientes, estudiantes, visitantes y el medio ambiente.
El pilar de la práctica de la bioseguridad es la evaluación del riesgo, que es
evaluado por el juicio del profesional que conozca las características peculiares de los
organismos y productos químicos con los que se va trabajar, el equipo y los
procedimientos que van a emplearse, los modelos animales que pueden utilizarse y el
equipo y los medios de contención disponibles.
La investigación a través de la aplicación de técnicas basadas en las
experimentaciones variadas, se realizan en el laboratorio, el que conduce a la utilización de
materiales, equipos y aparatos específicos. El éxito o fracaso y la seguridad o el desastre,
depende de los procedimientos seguidos en el laboratorio. Es importante el correcto uso de
los reactivos, materiales y aparatos de laboratorio para conservar la integridad física de sí
mismos y de sus compañeros.

La aplicación y comprobación de los conocimientos teóricos se realizan en el


laboratorio el cual es un ambiente adecuado instalado y equipado el que contribuye a
mejorar el aprendizaje de los alumnos, el desarrollo de sus habilidades, destrezas y
capacidades.

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1. El ingreso al laboratorio
El paso por la puerta al interior del laboratorio, es el inicio de una buena técnica de
trabajo. Un ingreso sin producir ruido evita la distracción de los que trabajan o caso
contrario resultaría no solo una mala educación sino de puede convertir un peligro en el
laboratorio. Ingrese con tranquilidad y sin ruido.

2. El vestido
La protección y seguridad en el laboratorio es de vital importancia. Para la
protección se usa el , ya que evita el contacto con
sustancias biológicas, químicas y otras que lleguen a la piel.

Los guantes de goma se usan en determinadas ocasiones para la protección de


manos y para los ojos se usa anteojos de protección. Las joyas y otros adornos metálicos
son atacados por las sustancias químicas, éstas serán retiradas durante el trabajo. El cabello
suelto es un peligro de incendio por lo tanto es recomendable llevarlo recogido. Elimine
todo adorno inútil cuando trabaja. Evite llegar al laboratorio con minifaldas, zapatos
calados y zapatillas de tela.

3. Primeros auxilios
Se contará con un botiquín en el cual se podrá encontrar los medicamentos y otros
materiales indispensables y, el personal de laboratorio estará capacitado para poder usarlo.
La atención primaria de un accidente protege una vida, pero la atención del médico
complementa el trabajo inicial.

Es indispensable saber combatir un incendio por más pequeño o insignificante que


parezca. Se contará principalmente con un extintor de incendios. A todos los incendios no

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se les combate con agua. El fuego inicial se cubrirá con una manta o trapo. El soplar sobre
las llamas y el viento avivará el fuego en el lugar del accidente, el personal de laboratorio
se encontrará listo para combatirlo, para ello, debe conocer cómo hacerlo, pero también
cómo evitarlo.

4. Orden y uso de reactivos


Los reactivos se agrupan de diversa manera, pero todos tienen un lugar en el
laboratorio. Cada frasco con reactivo se encontrará con su respectiva etiqueta o rotulo.
Antes de usar un reactivo leer dos veces el rotulo y compararlo con las instrucciones para
estar seguro que es el reactivo que se necesita. Limpie todos los recipientes para eliminar el
polvo, antes de usar el reactivo. No tocar los reactivos con la mano. El transvasado de los
reactivos se hace con tranquilidad (calma) y nunca agregar un líquido caliente en un frasco.

5. Limpieza del material:


Es una labor muy importante en el trabajo de laboratorio. Un buen trabajo requiere
un material bien limpio. El lavado del material puede resumirse en:
1. Hacerlo más simple y fácil posible. A veces basta sólo agua.
2. Lavar 2 ó 3 veces es suficiente.
3. El cepillo y el detergente o jabón se usan cuando sean necesarios.
4. Lavar por dentro y por fuera con agua de grifo, después se enjuaga con agua destilada.
5. Dejar escurrir el material; no se aconseja secar con toalla u otra tela. Escurrirá en
tableros o dispositivos especiales.
Existen varias soluciones especiales para el lavado del material de vidrio.

DESARROLLO DEL TRABAJO DURANTE LAS PRÁCTICAS


En estos casos el estudiante debe adoptar una conducta responsable que va a
favorecer su aprendizaje. Se sugiere que se adopten las siguientes conductas:

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1. Se ingresará al laboratorio con la guia de trabajo correspondiente, así como también
con la información teórica estudiada previamente y el material biológico adecuado.

2. En cada mesón existirá un alumno responsable de portar u n campo (franela de 40


cm. X 30 cm.) y jabón carbólico para ser usados por los estudiantes al final del
trabajo.

3. La lectura cuidadosa de las instrucciones de trabajo evita cometer errores.

4. Previo al trabajo se dará las instrucciones correspondientes y la introducción al


tema de trabajo. Consultar cuando no está seguro del procedimiento de trabajo.

5. En la sesión práctica de su guía de laboratorio, anote cuidadosamente sus


observaciones y otra información solicitada. Sea breve y claro.

6 . Alguna situación anormal que se de en el desarrollo de trabajo deberá darla a


conocer al docente encargado, como derrame de sustancias, accidentes, etc.

7. No gustar ni tocar los reactivos; evite derramar o rociar sustancias.

8 . Es importante saber esquematizar un procedimiento, proceso y la morfología de


una muestra biológica.

9. La información expresarla preferentemente en valores numéricos, tablas, gráficos,


etc.

10. Al presentar el informe del trabajo realizado, añadir hojas adicionales si desea
consignar mayor detalle e información.

11. Todos los informes de laboratorio se presentarán en la fecha posterior inmediata a


la realización de la sesión de aprendizaje.

INTERROGANTES
1. ¿Qué es bioseguridad?

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2. ¿Qué medidas de protección guardamos en el trabajo de laboratorio?

3. ¿Qué es una “barrera de protección”?

4. ¿Qué tipos de contaminantes conoces?

5. Clasificar lo siguientes residuos por su riesgo y describir su forma de descarte:

RESIDUO RF RQ RB DESCARTE

Papel bond

Trozo de jabón

Solución de NaOH 2M

Hoja de bisturí

Lanceta

Guante con sangre

Guante con reactivo

Resto cadavérico de rata de


laboratorio

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Vendas con sangre

Solución de HC1 0.5M

Termómetro de mercurio roto

Tubo de ensayo roto

Restos de ninhidrina

RF: Riesgo Físico; RQ: Riesgo Químico; RB: Riesgo Biológico

MATERIAL DE LABORATORIO
UTILIZACION Y MANEJO
OBJETIVOS
1. Identificar y describir algunos materiales de mayor uso en el laboratorio de
Biología.

2. Manejar y utilizar correctamente el material descrito.

3. Conocer las diversas formas de lavado y esterilización del material de laboratorio

INTRODUCCION
El trabajo en el laboratorio contribuye a la comprensión de conocimientos teóricos,
el desarrollo de habilidades, destrezas y capacidades. Antes de usar el material, el personal
de laboratorio conoce sus características y uso para obtener resultados confiables y evitar
el gasto y daño innecesario del mismo.

La mayor parte de las manipulaciones que se realizan en el laboratorio indican el


tipo y el tamaño del material a usarse. A cada material se le dará el uso correcto; algún
cambio en el uso requiere que antes se determine si dicho cambio produce algún problema
durante el trabajo.
El material de trabajo se suele dividir de acuerdo al material del que están hechos:
material de vidrio, de madera, de metal, soluciones, equipos y aparatos; o de acuerdo a la
función que realizan: reacciones químicas, preparar soluciones, filtrar sustancias, analizar
cuerpos, medir, etc.
NOMBRE FUNCIÓN DE ELEMENTOS DE MEDICIÓN
Balanza de precisión Medir masas de sustancias sólidas.
Bureta Medir el volumen de una solución que reacciona con un
volumen conocido de otra solución.
Papel de pH Medir el pH. Conocer la acidez de una solución
Pipeta gotero Trasvasar pequeñas cantidades de líquido, de un recipiente a
otro, cuando no es necesario realizar mediciones. Su función es
la misma que la de un gotero.
Pipeta graduada Medir un volumen exacto de líquido, con bastante precisión, y
trasvasarlo de un recipiente a otro.
Probeta graduada Medir volúmenes de líquidos.
Termómetro Medir temperaturas.

NOMBRE FUNCIÓN DE ELEMENTOS DE CALEFACCIÓN


Balón Calentar líquidos cuyos vapores no deben estar en contacto con
la fuente de calor.
Balón de destilación Para calentar líquidos, cuyos vapores deben seguir un camino
obligado (hacia el refrigerante), por lo cual cuentan con una
salida lateral.
Cápsula de porcelana Calentar o fundir sustancias sólidas o evaporar líquidos.
Cristalizador Evaporación de sustancias sólidas o evaporar líquidos.
Erlenmeyer Calentar o fundir sustancias sólidas o evaporar líquidos.
Espátula de combustión Un extremo se utiliza para retirar pequeñas cantidades de
sustancia y depositarla en otro recipiente; el otro extremo para
calentar pequeñas cantidades de sustancia.
Estufa eléctrica Se utiliza, para secado de sustancias y esterilización. Alcanza
temperaturas entre 250 y 300 °C.
Mechero de alcohol Fuente de calor.
Mechero BUNSEN Fuente de calor
Refrigerante Se utiliza para condensar vapores de el o los líquidos que
intervienen en la destilación.
Tubos de ensayo Disolver, calentar o hacer reaccionar pequeñas cantidades de
sustancia.
Vaso de precipitados Preparar, disolver o calentar sustancias.

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NOMBRE FUNCION DE ELEMENTOS DE SOPORTE
Doble Nuez Sujetar aro de Bunsen, pinza para balón y otros soportes similares.
Gradilla Apoyar tubos de ensayo.
Pinza para balón Sujetar el balón.
Pinza para crisoles Sujetar crisoles.
Soporte universal Se utiliza en el armado de muchos equipos de laboratorio.
Triángulo de pipa Sostener un crisol, mientras es sometido a la llama del mechero.
Trípode Apoyar la tela de amianto.
NOMBRE FUNCION DE ELEMENTOS VARIOS
Campana Se utiliza cuando se necesitan evaporar sustancias tóxicas.
Embudo Trasvasar líquidos de un recipiente a otro, evitando que se derrame
liquido; también se utiliza mucho en operaciones de filtración.
Escobilla Limpiar el material de laboratorio.
Mortero con pilón Machacar y/o triturar sustancias sólidas.
Papel filtro Filtrar, se usan junto con un embudo
Propipeta Para evitar succionar con la boca líquidos venenosos, corrosivos o
que emitan vapores. Se utiliza junto con una pipeta graduada.
Varilla de vidrio Mezclar o agitar sustancias; también en ciertas operaciones en que
se necesita trasvasar un líquido, para evitar que éste se derrame.

CORROSIVO
V n
#
RIESGO BIOLOGICO UY TOXICO'-

X V A
IRRITANTE RADIOACTIVO SOLIDO INFLAMABLE

GAS INFLAMABLE
é
LIQUIDO
INFLAMABLE OXIDANTE

Figura.- símbolos utilizados para algunos compuestos químicos que pueden ser peligrosos

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_______
Beaker
Embudo
Matraz Balón

PROCEDIMIENTO
- Identificar, clasificar y describir los materiales de uso en el laboratorio según el
material del que están hechos.

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- Identificar, clasificar y describir los materiales de uso del laboratorio según la
función que desempeñan.

- Identificar y describir algunos aparatos y equipos de uso más frecuente en el


laboratorio.

- Medir en la probeta y en la fióla 100 mi de agua destilada, luego agregar a la fióla


el agua medida en la probeta. Anote sus observaciones

- Con una pipeta de 10 mi agregue en el vaso de precipitados 50 mi de agua, luego


haga lo mismo con una pipeta de 5 mi. Observe y anote.

INTERROGANTES
1. ¿De acuerdo con las ilustraciones y con el material de laboratorio señale el uso de
los siguientes.
a) Los que se usan para medir volúmenes exactos:

b) Los que se usan para medir volúmenes inexactos

c) Los que se usan para calentar

d) Los que se usan para medir la temperatura

2. Porque es importante conocer el uso y materiales de laboratorio

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3. Indique el procedimiento correcto para el uso de la centrífuga

4. ¿Qué cuidados se deben tener con los materiales de laboratorio?

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PRACTICA N° 2

SOLUCIONES (CÁLCULOS Y PREPARACIÓN)

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1.- Preparación de una solución de ácido oxálico 0.1N
2.- Preparación de una solución de ácido clorhídrico 0.1 N
3.- Preparación de una solución de ácido sulfúrico 0.1 M
4.- Preparación de una solución de hidróxido de sodio 0.1 N

INTRODUCCIÓN

En vista que las reacciones químicas que ocurren en el organismo requierenquélas


moléculas de los reaccionantes se encuentren en solución, resulta muy importanteque el
alumno de Bioquímica esté familiarizado con los cálculos necesarios y con el
procedimiento que debe seguir para la preparación de las soluciones.

Una solución corresponde a la mezcla de dos o más sustancias, con las características
de mostrarse homogénea a los procedimientos físicos. El componente que se encuentra en
mayor proporción se denomina solvente, en tanto que el otro, u otros componentes se
denomina soluto(s). El agua por sus notables cualidades de solvente y por ser el
componente químico más importante del organismo, cumple un rol destacado en mantener
solubles a los diversos constituyentes químicos de la célula.

Clases de soluciones

En atención al tamaño de las moléculas de soluto, las soluciones se agrupan en


soluciones coloidales y soluciones verdaderas.

Las soluciones coloidales tienen partículas de soluto (micelas) de un tamaño


comprendido entre 1 mu y 100 mu; es el caso de las soluciones de proteínas, ácidos
nucleicos y polisacáridos. Las soluciones verdaderas tienen un tamaño menor a 1 mu. Las
biomoléculas y bioiones de bajo peso molecular dan soluciones de esta clase.

La concentración de las soluciones corresponde a la cantidad de soluto por unidad de


volumen dé la solución y en Bioquímica existen 3 sistemas importantes para expresar la
concentración de las soluciones. El sistema molar, él sistema normal y el sistema

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porcentual. Solución Molar (M) es aquella que contiene un mol de la sustancia por litro de
solución. Solución normal es aquella que contiene el equivalente gramo de la sustancia por
litro de solución. Solución porcentual es aquella que contiene un .determinado número de
gramos de la sustancia en 100 gr se consideran soluciones porcentuales aquellas que
contienen cierto número de gramos, miligramos o microgramos de soluto en 100 mi de la
solución y se puede escribir (PAO para indicar que en este caso la relación es de peso-
volumen.

En el laboratorio de Bioquímica se usa mucho las soluciones estándar primaria. Una


solución estándar primaria es acuella que tiene como soluto a un compuesto químico muy
estable a las condiciones ambientales. Entre los solutos más utilizados para la preparación
de estas soluciones, se cuentan al ácido oxálico (PM 126.06) y al ftalato ácido de potasio
(PM 204.22).

EXPERIMENTO 1

PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE ACIDO OXÁLICO 0.1 N (lOOml)

Objetivos

1. Familiarizar al alumno con los cálculos necesarios para la reparación de una solución
estándar primaria.
2.-Preparar la solución utilizando adecuadamente el material de laboratorio.

Procedimiento

1. Estimada la cantidad de ácido oxálico necesaria para preparar 100 mi de solución 0.1
N, se pesa con mucha exactitud dicha cantidad.
2. Se coloca la sustancia pesada en un beaker de 100 mi y se añade aproximadamente
50 mi de agua destilada.
3. .Se agita con una. bagueta de vidrio hasta que se disuelva completamente el ácido
oxálico.
4. Se transfiere el contenido a un frasco volumétrico (fióla) de 100 mi y se completa
hasta la marca con agua datilada. Se tapa el frasco y se mezcla.
5. Se trasfiere el contenido a un frasco y se le rotula adecuadamente.

Resultados
Anote en el espacio la cantidad de ácido oxálico que calculó. _________________ _

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EXPERIMENTO 2
PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE HC10.1 N (100 mi)
Objetivos

1. Familiarizar al alumno con tos cálculos necesarios para preparar una solución a partir
de otra más concentrada.
2. Utilización adecuada del instrumental de laboratorio y de las medidas de seguridad
para preparar una solución dé ácido fuerte a partir de una solución concentrada del
mismo.

Procedimiento
1. Estimar el volumen (en mi) que debe medirse de la solución concentrada de HCI
(concentración 36% ; densidad 1.19 g/ml) para preparar 100 mi 0.1 N.
2. Mida en un frasco volumétrico de lOOmi aproximadamente 60 mi e agua destilada.
Deje caer lentamente el volumen calculado del ácido concentrado
3. Completar hasta la marca con agua destilada, tapar el frasco y mezclar.

Resultados
La concentración en normalidad del HCI concentrado utilizado es de:

El volumen calculado de HCI concentrado para preparar la solución pedida es de:

EXPERIMENTO 3
PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DÉ ACIDO SULFÚRICO 0.1 M lOOmi
Objetivos:
1. Familiarizar al alumno con los cálculos necesarios para preparar una solución a
partir de otra más concentrada.

2. Utilización adecuada del instrumental de laboratorio y de las medidas de seguridad


para preparar una solución dé ácido fuerte a partir de una solución concentrada del
mismo.
Procedimiento:
1. Estimar e volumen (mi) que se debe añadir dé la solución concentrada de ácido
sulfurico (concentración 96%; densidad 1.84 g/ml) para preparar 100 mi 0.1 M.

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2. Mida aproximadamente 50 mi de agua destilada en un frasco volumétrico de
100 mi. Deje caer aproximadamente el volumen calculado del ácido
concentrado.

3. Completar hasta la marca con agua destilada, tapar el frasco y mezclar


Resultados

-La concentración en molaridad del ácido sulfúrico concentrado utilizado es de:

-La concentración en normalidad del ácido sulfúrico concentrado utilizado es de:

-El volumen calculado de ácido sulfúrico concentrado para preparar la solución pedida es
de: _____________ ______

EXPERIMENTO 4
PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE HIDROXIDO DE SODIO 0.1 N (100 mi)

Objetivos
1. Familiarizar al alumno con los cálculos necesarios para preparar una solución de
NaOH a partir de una solución saturada de la misma sustancia.
2. Utilización adecuada del instrumental de laboratorio para preparar la solución
pedida.

Procedimiento
1. Calcular los mi de la solución saturada de NaOH (aproximadamente 5 N)
necesarios para preparar 100 mi .de una solución de concentración 0.1 N
2. En un frasco .volumétrico de 100 mi medir el volumen calculado y completar con
agua destilada libre de C02 hasta la marca.
3. Tapar el frasco y mezclar.
4. Transferir a un frasco y rotular adecuadamente

Resultados
El volumen de la solución saturada de NaOH que se debe añadir para preparar 100 mi de la
solución 0.1 N es de:

Expresar la concentración de la solución preparada, en el sistema porcentual (g%).

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INTERROGANTES.
l.-Qué es una solución saturada?

2.-Porque se usa agua libre de CO2 para preparar la solución de NaOH?

3.-Son rigurosamente exactas las concentraciones de las soluciones preparadas en los


Experimentos 2, 3 y 4 ?
Si No Porqué

Si su respuesta es negativa haga la fundamentación del caso

4. Cuántos micromoles de urea (NH2-CO-NH2) por mi tendrá una solución 0.25 M de urea

5. Qué se debe entender por aquellas soluciones cuya concentración se expresen en partes
por mil o partes por millón

6 . Siendo actualmente recomendable el sustituir las concentraciones de las biomoléculas de


los líquidos biológicos del organismo expresadas en forma porcentual, por las
concentraciones expresadas en el sistema molar, haga las conversiones correspondientes
para los compuestos químicos que se señalan e indique si los valores están altos (A),
normales (N) o disminuidos (D), respectivamente.

Compuesto PM Concentración Concentración Valores


(%) milimoles/litro A, N, D
Glucosa (sangre) 180 75 mg %
Urea (Sangre) 60 25.5 mg %
Colesterol (suero) 387 180 mg %
Lactato (suero) 140 5 mg %
Creatinina (suero) 113 0.8 mg%

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Calcio (suero) 40 8.5 mg%
Hierro (suero) 56 75 |ig/dL
Fósforo (suero) 31 4.5 mg/dL
Para resolver puede consultar el siguiente enlace
http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0253-29482002000100008&script=sci_arttext

SOLUCIONES n

( TITULACIÓN O VOLUMETRIA )

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS

1. Titulación de la solución de hidróxido de sodio aproximadamente 0.1 N


2. Titulación de la solución de ácido clorhídrico aproximadamente 0.1 N
3. Titulación de la solución de ácido sulfúrico aproximadamente 0.1 M

INTRODUCCIÓN

Con seguridad, habrá notado que las concentraciones de las soluciones preparadas en
los experimentos 2,3 y 4 de la práctica de soluciones 1 no son exactas; son sólo
aproximadas. En vista que para diversos experimentos en Bioquímica es necesario
disponer de las soluciones preparadas, pero que tengan una concentración rigurosamente
exacta, se hace indispensable determinar su concentración con precisión y así poder
corregirla. Se entiende que es más conveniente que la concentración de tales soluciones
resulté mayor que la requerida para que al hacer la corrección sólo se tenga necesidad dé
agregar agua destilada.

En esta práctica haremos la valoración (titulación) de las soluciones preparadas


anteriormente utilizando un método volumétrico (acidimetría y alcalimetría ). Este método
está basado en el principio de que soluciones de igual concentración en normalidad se
neutralizan volumen a volumen. Para ello es necesario disponer de:

a) Una solución ( ácido o hidróxido) de concentración exactamente conocida.


b) Una solución qué indique el momento de la neutralización (indicador)
c) La solución (ácido ó hidróxido) cuya concentración se quiere determinar.

Añadimos la solución a) hasta que neutralice la solución b). En el • momento de la


neutralización el número de miliequivalentes del ácido será igual al número de,

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miliequivalentes de la base. Como quiera que el producto de la normalidad de una solución
por su volumen en mililitros corresponde al número de miliequivalentes la siguiente
expresión está plenamente justificada :
N xV = N 'xV ' (1)
Donde:-
N = normalidad de la solución de concentración conocida (solución estándar
V = volumen de la solución de concentración conocida (solución estándar)
N' = normalidad de la solución a titular
V' = volumen de la solución a titular
Los indicadores que se usan en volumetría son ácidos o bases débiles, que tienen la
capacidad de cambiar de color según el pH del medio.

EXPERIMENTO 1
DETERMINACCION DE LA CONCENTRACIÓN EXACTA DE LA SOLUCIÓN
DE HIDROXIDO DE SODIO PREPARADA EN LA PRACTICA SOLUCIONES

Objetivos
1. Conocer la concentración exacta de la solución de NaOH aproximadamente 0.1 N
preparada en la práctica Soluciones
2. Conocer la utilidad de los indicadores para determinar el momento de la titulación.
3. Familiarizar al alumno con tos cálculos de volumetría usando la ecuación (1).
Método
Titulación usando como estándar primario la solución dé ácido Oxálico 0.1 N preparada en
la práctica Soluciones I

Procedimiento
1. En un Erlenmeyer colocar 5 mi de la solución de ácido oxálico 0.1 N y añadir 2
gotas de fenolftaleína al l%y mezclar.
2. Cargar una bureta de 10 mi con la solución de NaOH cuya concentración sé quiere
precisar.
3. Dejar caer lentamente la soda sobre el Erlenmeyer hasta que se aprecie un color
rosado estable.
4. Lea en la bureta la cantidad de soda gastada
5. Con los datos obtenidos haga el cálculo de la concentración exacta de la solución
de hidróxido de sodio.

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6 . Añada el volumen estimado de agua destilada para permitir que la solución de
NaOH tenga una concentración exactamente 0.1 N

Resultados
La concentración exacta de la solución de NaOH preparada anteriormente es:

La cantidad de agua destilada que debe añadirse para convertirla en exactamente 0.1 N es:

EXPERIMENTO 2
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN EXACTA DE LA SOLUCIÓN
DE ACIDO CLORHÍDRICO PREPARADA EN LA PRACTICA SOLUCIONES I

Objetivos

1. Estimar con exactitud la concentración de la solución de HCI preparada


anteriormente.
2. Conocer la utilidad de los indicadores para determinar el momento de la
neutralización.
3. Familiarizar al alumno con los cálculos de volumetría usando la ecuación (1).

Método
Titulación usando como estándar secundario la solución de NaOH titulada en el
experimento anterior.

Procedimiento

1. En Un Erlenmeyer colocar 5 mi de la solución de HCI a titular, y añadir 2 gotas de


fenolftaleína al 1%. Mezclar.
2. Cargar la bureta con la solución de NaOH titulada
3. Dejar caer lentamente la solución de NaOH sobre elErlenmeyer agitando
permanentemente, hasta la presencia del color rosado estable
4. Leer en la bureta el volumen gastado de la soda
5. Hacer los cálculos correspondientes para estimar laconcentración exacta de la
solución de HCI
Resultados
La concentración exacta de la solución de HCI es:

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Para hacer esta solución exactamente 0.1 N, se debe:

INTERROGANTES

1. Aplicando la información y la experiencia ganada en esta práctica señale brevemente


como procedería para detenninar la acidez gástrica de una muestra. Tenga en cuenta que
en el Laboratorio Clínico se acostumbra a expresar la acidez del jugo gástrico como el
número de mi de NaOH 0.1 N necesarios para neutralizar la acidez de 100 mi de jugo
gástrico.

2. En los experimentos dé titulación, vistos en esta práctica, se pudo cargar la bureta con
ácido en lugar de álcali?
Si No _____

Fundamente su respuesta:

3. Cómo se prepara:
a) 225 mi de NaCl al 10%

b) 500 mi de NaHCOs

c) 100 mi de glucosa 0.5N

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4. Cual presenta la osmolaridad más alta NaCl 0.1M o Na2S 0 4 0.08 M. Realice los
cálculos

5. A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KC1 y 126 g de glucosa (C6Hi20 6)


¿Cuánta agua habrá que añadirles para que resulte un suero 0.4 osmolar?

6 . Buscar las composiciones de las siguientes soluciones: Hartman, Ringer y Darrow.

7. Calcular la osmolaridad a partir de:


a) Dextrosa al 10 % en solución salina al 0.45%.
b) Dextrosa al 5 % en solución salina al 0.2%.

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PRACTICA N° 3

pH y AMORTIGUADORES
Objetivos:

• Que el estudiante comprenda el concepto de pH y su utilidad en el campo médico.


• Que el estudiante comprenda el concepto de pK y su utilidad práctica.
• Determinar el pH de soluciones usando papel indicador, potenciómetro y mediante
cálculos.
• Comprobar la acción amortiguadora del pH de soluciones buffer.
• Determinar la acidez del jugo gástrico

PRIMERA PARTE: pH e INDICADORES.

INTRODUCCION

La concentración de hidrogeniones [H+] en la célula tiene un poderoso efecto sobre las

reacciones químicas que allí ocurren, desde el momento en que todos estos procesos son
catalizadas por enzimas y éstas a su vez requieren pHs óptimos para trabajar
eficientemente.
En vista que la concentración de hidrogeniones expresada en normalidad, en la mayoría de
soluciones, incluyendo líquidos biológicos, es muy pequeña, hace un buen tiempo se acuñó
el término de pH (potencial de hidrogeniones) para representarlas con cifras más
manejables.
El pH es pues un término que expresa la concentración de iones hidrógeno como el
logaritmo negativo (de base 10) de dicha concentración en normalidad o lo que es lo

mismo el logaritmo del inverso de concentración de hidrogeniones [H+],

pH = - log [Br]

De acuerdo con este concepto, si el pH es 7 el medio es neutro, si el pH es menor de 7 la


solución es ácida, y básica si el pH es mayor a 7.
La escala de pH, nos indica el grado de acidez o de basicidad de una solución y varía entre
0 y 14, valores que en concentración de Hidrogeniones en Normalidad corresponden
desde 1N hasta 10~14 N.

25
El pH de una solución puede ser estimado en la práctica mediante el uso de métodos
colorimétricos o potenciométricos. El procedimiento tan conocido para determinar el pH
de una solución mediante el papel indicador de pH, es un método colorímétrico.
Los métodos colorimétricos, se basan en el empleo de ciertos compuestos conocidos como
indicadores que son ácidos o bases débiles con capacidad de tener de color u otro según
estén o no ionizados

Indicador-H ' ► Indicador' + H+


( Color A ) ( Color B )

Cuando el pH del medio coincide con el pK del indicador, el 50% de las moléculas están
ionizadas y el otro 50% estarán sin ionizar. En esta situación el indicador tomará una
coloración intermedia entre el color de indicador ionizado y no ionizado; por tanto, se
entiende que el indicador tomará una serie de tonalidades de color según predomine una u
otra forma del indicador. En la Tabla 1, se señalan las características de los indicadores
más comúnmente usados

TABLA 1. INDICADORES ( Tabla de Clark - L u b s)

INDICADOR pK Limites Cambio de color


Azul de timol 1.5 0 . 5 - 2.8 Rojo - Amarillo
Azul de Bromofenol 4.0 3 .0 -5 .0 Amarillo - Azul
Vede de Bromocresol 4.7 3 .7 -5 .7 Amarillo - Azul
Rojo de Clorofenol 6.0 5 .0 -7 -0 Amarillo - Rojo
Azul de Bromotimol 7.0 6 .0 - 8.0 Amarillo - Azul
Rojo de Fenol 7.6 6 .8 - 8 .4 Amarillo - Rojo
Azul de Timol 8.9 7 .9 -9 .9 Amarillo - Azul
Fenolfitaleína 9.2 8 .3 -1 0 .0 Incoloro - Rojo

El Fundamento de la determinación del pH por el método del papel indicador es el de


comparar el color que toma el trozo de papel indicador después de haberlo puesto en
contacto con la solución problema con la escala de colores presente y que tiene señalados
los pHs de acuerdo a los colores resultantes. Debe entenderse que los papeles indicadores
tienen a los indicadores como ingredientes. Este método es muy sencillo y práctico y nos
da a conocer el pH de una solución de una manera rápida aunque no en forma exacta.

26
El Método más exacto para la determinación del pH de una solución es el método
potenciométrico que se basa en la medida del potencial eléctrico de ciertos electrodos,
cuando son introducidos a la solución problema. Los electrodos más comúnmente usados
son el de vidrio y el de hidrógeno y el aparato empleado se denomina Potenciómetro.
Relación de experimentos:
1. Determinación del pH de una solución usando papel indicador y potenciómetro
2. Acidez real y acidez titulable
3. Acidez gástrica
EXPERIMENTO 1.1
Determinación del pH de una solución con papel indicador y potenciómetro.
Objetivo.
- Hacer uso correcto del papel indicador y del potenciómetro para conocer el pH de
una solución problema
Métodos
- Utilizando un trozo de papel indicador de pH, se puede conocer el pH de una
solución problema.
- Utilizando el potenciómetro, se puede conocer el pH de una muestra problema
Procedimiento.
1. En un tubo de ensayo medir un volumen adecuado de la muestra problema (aprox.
5.0 mi)
2. Con la ayuda de una pinza coger un trozo de papel indicador y sumergirlo en la
solución muy brevemente.
3. Una vez retirado el trozo de papel indicador sacudirlo ligeramente y esperar unos
segundos.
4. Comparar el color que toma el trozo de papel con los colores de la escala respectiva
y anotar el pH que le corresponde.

Para el caso del pH usando el Potenciómetro.


1. En un Beaker de 50 mi. colocar un volumen (que cubra los electrodos) de solución
estándar de pH conocido e introducir los electrodos respectivos y proceder a
calibrar el equipo oprimiendo el botón respectivo.
2. En otro Beaker de igual capacidad al anterior colocar un volumen determinado de
la muestra problema e introducir los electrodos y proceder a hacer la lectura del pH
respectivo.

27
Resultados.
El pH de la solución problema por papel indicador es: ________________
El pH de la solución problema usando el potenciómetro es: ________________

EXPERIMENTO 1.2
ACIDEZ REAL Y ACIDEZ TITULABLE
Objetivo
- Establecer mediante titulación, uso de papel indicador y mediante cálculos teóricos,
la diferencia existente entre la acidez real y la acidez titulable.
Procedimiento
1. Disponer de una solución de ácido clorhídrico 0.01N y de ácido acético 0.01 N.
2. En un Erlenmeyer colocar 5 mi de una solución de HCI, añadir dos gotas de
fenolftaleína al 1 % y titular con NaOH 0.01 N en la forma indicada en el
experimento de titulación en la práctica de soluciones.
3. Leer en la bureta el volumen de soda gastado.
4. Repetir el procedimiento, sólo que en lugar de usar la solución de HCI, use la de
ácido acético
5. Leer en la bureta el volumen de soda gastado.
6 . Utilizando papel indicador, mida el pH de la solución de HCI y el de la solución de
ácido acético.

Resultados
Llene la siguiente Tabla:
Volumen de pH estimado con pH calculado
NaOH gastados papel indicador
Sol. de HCI 0.01 N
Sol. de Ácido Acético
0.01 N

EXPERIMENTO 1.3

ACIDEZ GASTRICA
Normalmente, el jugo gástrico contiene mucina, pepsina, pequeñas cantidades de otras
enzimas, ácidos orgánicos, sales, pequeñas cantidades de proteínas, fosfatos y una cantidad
importante de ácido clorhídrico. Este HCI es secretado por las células parietales del

28
estómago a una concentración promedio de aproximadamente 160 mEq/L (pH 0.87); esta
secreción está influenciada por diversos factores y es estimulada por las comidas, el
alcohol, la histamina, etc.
La regurgitación del líquido intestinal, los alimentos y otros componentes del jugo gástrico,
hacen que la acidez señalada disminuya, por lo que se señala que la acidez promedio de un
sujeto en ayunas es de aproximadamente 2.5 de pH.

Desde el punto de vista médico, la determinación de la acidez gástrica es de particular


importancia y contribuye al diagnóstico de una serie de enfermedades, como la úlcera
péptica, cáncer gástrico, gastritis crónica, atrofia gástrica, etc.

Hace más de un siglo se estableció el denominado grado de acidez o Unidades de Acidez,


como medida de la acidez gástrica y corresponde a los mililitros de NaOH 0.1 N
necesarios para neutralizar la acidez de 100 mi de jugo gástrico.

La prueba de la determinación de la acidez gástrica en un paciente consiste en dejarlo en


ayunas por toda la noche y al día siguiente introducir una sonda nasogástrica y evacuar
completamente todo el contenido gástrico (muestra basal). Después se da el estímulo que
puede consistir en la comida de prueba, como la de Ewald, que incluye dos tostadas y una
taza de té: o agentes de mayor capacidad estimuladora como el alcohol o la histamina, esta
última se administra por vía intramuscular a una concentración de 0.01 mg / Kg de peso
corporal. Luego se comienzan a tomar muestras de jugo gástrico cada 15 minutos hasta
completar las 2 horas.

En cada muestra de jugo gástrico incluyendo la basal, se determinan las unidades de acidez
total del jugo gástrico, titulando con NaOH 0.01 N y usando como indicador el rojo de
fenol.

La acidez total del jugo gástrico en ayunas en un individuo normal es de aproximadamente


15 -50 mEq de HC1/L. Con estímulo, como la comida de prueba, se alcanzan normalmente
valores como de 20 a 90 mEq de HC1/L . Cuando el estímulo es la histamina que es uno de
los más potentes, el máximo estímulo está entre 30 a 60 mEq/L, en condiciones normales.
Menos importancia se concede en la actualidad a la determinación de la acidez libre y
acidez combinada del jugo gástrico. Se atribuía que la primera correspondía a la acidez del
HC1 libre, en tanto que la segunda era debida a HC1 combinado a fosfatos ácidos y a ácidos
orgánicos. La acidez libre se obtenía titulando el jugo gástrico con NaOH hasta un pH de

29
3.5, en tanto que la acidez combinada correspondía a la titulada e n el jugo gástrico, desde
un pH de 3.5 hasta aproximadamente 8.3. Para esto era necesario e l uso de dos indicadores,
el dimetil-aminoazobenzeno y la fenolftaleína.
Objetivo
- Determinar los grados de acidez (Unidades de Acidez) d e una muestra de jugo
gástrico de un paciente en ayunas.

Método.
- Titular una muestra de jugo gástrico utilizando NaOH 0.01 N y rojo de fenol como
indicador.

Procedimiento.
1. Medir 1 mi. de jugo gástrico filtrado con gasa, en un Erlenmeyer de 50 mi. Añadir
10 mi. de agua destilada.
2. Añadir 2 gotas de rojo de fenol y mezclar.
3. Titular con NAOH 0.01 N Hasta obtener el color de la solución patrón.
4. Preparar el patrón midiendo en un Erlenmeyer 1 mi. tampón fosfato pH 7.0;
Añadir 10 mi de agua destilada y 2 gotas de rojo de fenol y mezclar.

Resultados.
Las Unidades de Acidez del jugo gástrico analizados son:____________
La acidez del jugo gástrico, expresado como mEq de HC1/L de jugo gástrico es:

INTERROGANTES.
1.- Qué relación existe entre pH, pOH y pKw ¿

2.- Cómo se explica que el azul de timol tenga doble ubicación en la tabla de indicadores?

3.- Servirá el rojo de fenol para estimar el pH de cualquier solución? Fundamente su


respuesta.

30
4.- Que se entiende por acidez real y por acidez titulable?

3.- Qué concentración debe tener el HCI para dar el mismo pH que el estimado
teóricamente en el experimento 3.2., para la solución del ácido acético 0.01 N?

6.- Qué es la anaclorhidria o anacidez gástrica?

7 - Con los datos que se señalan, construya en papel milimetrado la curva de acidez
gástrica total. A través de una sonda nasogástrica, se obtuvo una muestra de jugo
gástrico en ayunas de un paciente. Luego se administró la comida de Ewald como
estimulante y se procedió a retirar nuevas muestras de jugo gástrico a losl5’ , 30’ y
60’. En la titulación de estas muestras se gastaron 15 mi. (basal), 20 mi., 29 mi. y 33
mi. de NaOH 0.01 N respectivamente.

31
SEGUNDA PARTE: pK y AMORTIGUADORES

INTRODUCCION
Una característica importante de muchos de los compuestos químicos del organismo
humano, es el presentar grupos ionizables y por lo tanto tener la capacidad de ionizarse en
mayor o menor grado, dependiendo de la concentración dependiendo de la concentración
de hidrogeniones del medio en el cual se encuentran. Así, aminoácidos. Ácidos orgánicos,
porfirinas, purinas, pirimidinas, proteínas, ácidos nucleicos, carbonatas fosfatos, etc., son
algunos ejemplos de compuestos que experimentan ionización.
Así, la ionización de uno de estos compuestos como el ácido acético sería como sigue:

CH 3 -C O O H > CH 3 -C O O - + H*
En el momento en el cual la reacción química señalada alcance el equilibrio, la constante
de esta reacción de ionización (constate de equilibrio)estará dada por la expresión:

Keq

Donde la constante de equilibrio (Keq) será igual al producto de las concentraciones


moleculares de los resultantes, dividido por la concentración molecular del reaccionante
(s) en el momento del equilibrio.

En vista que el ácido acético (ácido débil) se ioniza muy pobremente, en el momento del
equilibrio, la mayoría de sus moléculas estarán sin ionizar y por lo tanto, el valor de la
constante será muy pequeño.

1.85 x 10 '5

Una manera más práctica de expresar esta constante es como su logaritmo negativo y es lo
que precisamente se denomina pK. ; que en el caso del ácido acético el pK tendría un
valor de:
pK = - log Keq

pK = - log 1.85 x 10 '5

pK = [ 0.2553 + ( - 5 ) ]

pK = - ( 4.74 )

pK = 4.74)

32
Los amortiguadores o tampones son soluciones que se oponen a variaciones bruscas en el
pH y por lo general están constituidos de ácidos débiles con sus bases conjugadas. Cuando
hay exceso de OH " interviene el componente ácido del tampón; en cambio cuando hay
exceso de H + , interviene el componente base conjugada del mismo. En uno u otro caso, se
habrán enmascarado los iones OH “ y H + y por lo tanto el pH del medio no se modificará.

Hay dos factores a considerar en la efectividad de un tampón: la concentración de los


componentes del mismo y la relación existente entre ambos. Sin embargo, hay que tener
presente que la mayor acción amortiguadora de pH está en el pK o en las proximidades de
este valor.

Relación de experimentos
1. Curva de titulación de un ácido débil y determinación de su pK.
2. Acción de los amortiguadores.

EXPERIMENTO 2.1

CURVA DE TITULACION DE UN ACIDO DEBIL Y DETERMINACION DE SU

Objetivos
- Estudiar la titulación de un ácido débil empleando u hidróxido
- Estimar el pH teórico en cada punto de titulación
- Encontrar la zona de pH en donde el tampón formado tiene la mayor eficiencia y
estimar su pK aproximado.

Método
Se titula el ácido acético con cantidades crecientes de NaOH y se estima el pH
luego de cada añadido de soda.

Procedimiento
- En cada uno de los cinco tubos de ensayo rotulados del 1 al 5 medir 4 mi de ácido
acético 0.2 N.
- Añadir 1 mi., 2 mi., 3 mi. y 4 mi a los tubos 2, 3 ,4 y 5 respectivamente.
- Mezcla y estimar el pH de cada tubo utilizando papel indicador y de ser posible el
potenciómetro.
- Mediante cálculos, estime el pH para cada tubo.

33
Resultados.
Llene la siguiente tabla
TUBOS 1 2 3 4 5
Relación SAL/ACIDO
pH Teórico
pH práctico (Papel indicador)

Construya en papel milimetrado la curva de titulación del ácido acético y señale en la


gráfica el pK aproximado. Anote en el eje vertical el pH y en el horizontal las cantidades
de soda añadidos en miliequivalentes.

EXPERIMENTO 2.2
ACCION DE LOS AMORTIGUADORES
Objetivo
Demostrar como un amortiguador (tampón acetato) se opone a los cambios bruscos de pH.
Método
Se compara la cantidad necesaria de NaOH y de HCI necesaria para aumentar o disminuir
el pH del agua y de una solución amortiguadora (tampón acetato) en una cantidad definida
de pH.

34
Procedimiento.
- Rotular 2 Erlenmeyers de 50 mi. como A y B y medir en cada uno de ellos 10 mi
de agua destilada.
- Añadir al Erlenmeyer A, 2 gotas de fenolftaleína y titular con NaOH 0.01 N, hasta
obtener una coloración rosa tenue (pH aproximado 8.5). Anote el volumen de soda
gastado.
- Añadir al Erlenmeyer B, 2 gotas de anaranjado de metilo y titular con HCI 0.01 N,
hasta obtener una coloración anaranjada (pH aproximado 3.4). Anote el volumen de
ácido gastado.
- Repetir el experimento, pero ahora utilizando tampón fosfato pH 7.2 en lugar de
agua destilada

Resultados
Llene la siguiente tabla:

AGUA TAMPON
DESTILADA FOSFATO
mi de N A O H 0.01 N
gastados
meq de NaO H gastados

mi. deHCl 0.01 N gastados

meq de HCI gastados

meq de NaOH necesarios


para hacer variar el pH en
una unidad

INTERROGANTES.
1. Calcular la constante de equilibrio y el pK para la disociación de un ácido débil (mono
carboxílico) sabiendo que su concentración inicial es de 0.5 M y que en el equilibrio un
20 % de sus moléculas están disociadas.

K eq. pK: ______________

2. Cuantos gramos de acetato de sodio y cuántos mi. de ácido acético glacial serán
necesarios para preparar 1 L de Tampón acetato de pH 5.3 y 0.05 N. Tenga en cuenta

35
que el acetato de sodio viene frecuentemente hidratado con 3 moléculas de agua (PM
136) y que la concentración del ácido acético glacial es 17.6 N.

Gramos de acetato de sodio: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _


mi. de ácido acético glacial: _______________

3. ¿Por qué es importante que se mantenga constante, dentro de ciertos límites, el pH en el


organismo?

4. ¿Cuáles son las fuentes de iones H+ en el organismo?

5. ¿Cuáles son los sistemas reguladores que facilitan la eliminación del H+ producido en el
organismo con el fin de mantener constante el pH sanguíneo?

6 . ¿Cuáles son las reacciones de formación del ácido carbónico (H2C03) a partir de C02
y H20, y de su disociación para formar el ion bicarbonato? Escríbalas.

7. ¿Qué sistemas amortiguadores participan directamente en la regulación del pH


sanguíneo?

8 . ¿Cuáles son los sistemas extrasanguíneos que tienden a mantener el pH extracelular?

36
PRACTICA N°4: TALLER

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

MANERAS DE EXPRESAR LOS CONSTITUYENTES QUIMICOS DEL


ORGANISMO HUMANO
CASO CLÍNICO
I. F. H., un paciente de 22 años, diagnosticado como diabético hacia 4 años, fue
hospitalizado por presentar fiebre, náuseas y vómitos. Los vómitos continuaron y al
segundo día de hospitalización desarrolló diarrea, con aproximadamente 10 deposiciones
diarias desmejorando notablemente su estado general.

Al cuarto día de hospitalización, el examen clínico mostró un paciente con cierto


compromiso de la conciencia, con una frecuencia respiratoria aumentada (35 por minuto) y
llamaba la atención que en el aire que espiraba se percibía aliento a manzana.

En una muestra de orina que se obtuvo mediante sonda vesical sé encontró


fuertemente positiva (4+) para glucosa y para cuerpos cetónicos. Se le tomó una muestra de
sangre y se la remitió al laboratorio para que se practicara las siguientes determinaciones:
glucosa, nitrógeno ureico, creatinina, sodio, potasio, cloro, concentración total de C 02 y
pH. Los resultados, que llegaron media hora después, fueron los siguientes:

Glucosa sanguínea 25 mmol/L


Nitrógeno ureico 6.5 mmol/L
Creatinina 260 umol/L
Sodio sérico 158 mmol/L
Potasio sérico 5.9 mmol/L
Cloro sérico 94 mmol/L
C02 total 3.0 mmol/L
pH 7.09
Con estos resultados se administró al paciente 100 unidades de
venoclisis se le pasó hasta 3 litros de solución salina con un total de 2 ampollas de
bicarbonato (de 50 mi cada una conteniendo 44 minóles).

Dos horas después del tratamiento se le retiró otra muestra le sangre y los análisis
de laboratorio indicaron los siguientes resultados:

37
Glucosa sanguínea 20 mmol/L
CO 2 total 5 mmol/L
pH 7.15

El estado de deshidratación comenzó a mejorar e igualmente el paciente comenzó a


orinar; pero como los datos de laboratorio todavía estaban alterados (la glucosa seguía
elevada, el C02 total muy bajo y el pH disminuido), se le administró al paciente 300
unidades de insulina y se continuó con la administración de la solución salina y del
bicarbonato. Dos horas después se ordenan nuevos análisis al laboratorio y esta vez los
resultados fueron los siguientes:

Glucosa sanguínea 11 mmol/L


CO 2 total 10 mmol/L

El tratamiento le fue continuado y en el siguiente pedido al laboratorio, se


recepcionaron tos siguientes resultados:

Glucosa sanguínea 7 mmol/L


CO2 total 16 mmol/L
Cuerpos cetónicos en suero cantidades trazas
pH 7.35

En estas condiciones el paciente se toma lúcido, su frecuencia respiratoria se


normaliza y ya no presentaba aliento a manzana.

COMENTARIO

Como habrá podido notar, las concentraciones de los compuestos químicos que se
analizaron en el paciente I.F.H., se expresan en su mayor parte en milimoles o micromoles
por litro, lo cual es actualmente recomendable ya que proporciona una información que se
puede correlacionar mejor; sin embargo, en nuestro medio, todavía se sigue usando la
expresión de estas concentraciones en miligramos por decilitro (mg%). Resulta pues muy
importante que el futuro médico sea capaz de hacer las interconversiones entre ambas
formas de expresar la concentración, sin dejar de lado la idea que la expresión en mmol/L
es la más adecuada.

38
El caso clínico presentado no pretende de manera alguna que o estudiante revise los
mecanismos que llevan a las alteraciones bioquímicas que se presentan en el estado
diabético, que si se estudiaran en su momento durante el curso de Bioquímica. Si lo
usamos es para poner al estudiante frente a una situación real, utilizando datos como se
presentan en la práctica clínica y así abordar el problema planteado.

BIBLIOGRAFÍA

1. - MONTGOMERY R , DRYER R.L. CONWAY T.W. y SPECTOR A.A (1983)


Biochemistry. A case oriented approach IV Ed.Mosby St Louis. (Referencia de donde se
tomó el caso clínico presentado, pag 390 Case 8).

2.- SEGEL I.H. (1978). Biochemical calculation. J. Wiley.New Cork (Un excelente libro
para practicar la resolución de problemas matemáticos de soluciones y de otros temas
generales Bioquímica)

3.- GUERCI A. (1975). Laboratorio. Métodos de análisis clínicos y su interpretación. II


Ed. Ateneo. Buenos Aires.(Este texto, junto a otros de laboratorio clínico son útiles para
precisar los valores normales de los constituyentes químicos en los líquidos biológicos
humanos).

INTERROGANTES

1.- A qué se debe que el paciente estudiado tenga aliento a manzana?

2.- a) Qué se entiende por glicemia? b) Cuáles son sus valores normales en ayunas ? c) Son
estos valores los mismos para cualquier método utilizado ?

39
3.- Al paciente del caso clínico, se le practicó hasta en 4 oportunidades la determinación de
la glicemia: a) Exprese en mg% las 4 concentraciones de glucosa que reportó el
laboratorio. b)Como están estos resultado en relación a los valores normales?, c) Qué
comentario le merece las variaciones encontradas en la concentración de glucosa en sangre
conforme recibía tratamiento el paciente?

Cálculos:

4.- a) Qué es el nitrógeno ureico? b) Cómo se hace el cálculo para convertirlo en urea?.
Justifique su respuesta, c) Cuáles son los valores normales para el nitrógeno ureico y para
la urea en el suero sanguíneo? d)Expresar la concentración del nitrógeno ureico y de la
urea del paciente en mg%? e)Cómo están estos valores en relación a los normales? f) Que
significa el BUN?

a) __________

b) _

c ) _______________________________________________________________________________

d) ___________________________________

40
e)

f)

5.- a) Escriba la estructura química de la creatinina y en base a ello estime su PM


aproximado, b) Estime la concentración de creatinina en el suero del paciente en mg%. c)
Cuáles son los valores normales expresados en mmol/L y en mg % . d) Cómo están los
resultados en el paciente en relación a lo normal ?

b)

c ) _______________________________________________________________________________

d ) ______________________________________________________________________________

6 .- a) Expresar las concentraciones de los electrolitos en el suero de paciente, en mEq/L b)


Cómo están estos resultados en relación a lo normal

7.- a)Cuáles son los valores normales para el CO2 total sérico? b)Que comentario le merece
los resultados obtenidos en este paciente cuando se cuantificó este parámetro ? c)Existe

41
alguna relación entre la mayor frecuencia respiratoria, los niveles de C 0 2 total sérico, el
pH sérico y la administración de bicarbonato, en e! caso del paciente estudiado ? d)Se
anima a intentar una explicación ?

8 .-Pocos días antes de ser dado de alta nuestro paciente, se le practicó una serie de
determinaciones en el laboratorio, habiéndose obtenido los siguientes resultados.

Colesterol sérico total 215 mg%

Alanina sérica 0.8 mmol/L

Cobre sérico 182 |ig/dL

Hemoglobina sanguínea 1.6 mmol/L

Ácido úrico sérico 650 ¡imoles/L

Tiroxina sérica 48 ng%

Zinc sérico 35 ¡imol/L

a) Complete la siguiente Tabla anotando los V.N para los parámetros analizados

Compuesto químico Valores Normales

Colesterol sérico mmol/L

Alanina sérica mg%

Cobre sérico (xmol/L

Hb g%

Acido úrico mg%

Tiroxina sérica nmol/L

Zinc sérico Hg%

42
b) Exprese los resultados del paciente en las unidades en que se expresaron sus V.N. en la
tabla anterior y junto a cada resultado escriba en un paréntesis la letra A, N ó D , según
encuentre que los resultados están aumentados, normales o disminuidos;
respectivamente.

43
44
PRACTICA N° 5

ESPECTROFOTOMETRIA

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:

1. Cáculo del factor de calibración y construcción de una curva de calibración.


2. Determinación del espectro de absorción del anaranjado de metilo.
3. Determinación colorimétrica de colesterol en suero sanguíneo

OBJETIVOS:

1. Calcular la concentración de una sustancia presente en solución aplicando la ley


de Beer-Lambert, mediante un método fotocolorimétrico.
2. Comprender los conceptos de factor de calibración y curva de calibración en el
uso de los métodos fotocolorimétricos.
3. Conocer el fundamento de los métodos fotocolorimétricos.
4. Determinar el espectro de absorción de una sustancia y reconocer su importancia.

INTRODUCCION:

Este es un método muy ampliamente usado en bioquímica y análisis de laboratorio para


determinar la concentración de una sustancia presente en solución. Se le utiliza para medir
la concentración de una sustancia presente en un líquido biológico ( sangre total, suero,
plasma, orina, etc. ) También es útil para la cuantificación de una sustancia presente en un
tejido, sea por examen en el tejido de una actividad enzimática por ejemplo o por previa
extracción de la sustancia a partir del tejido y su posterior determinación. También pueden
ser empleados estos métodos para la identificación de una sustancia o examinar algunas
propiedades de ella a través de la modificación de su espectro de absorción por ejemplo.
Así, hay otros usos que los iremos viendo conforme avancemos en desarrollo del curso.

Como se ha visto en la parte teórica, estos métodos hacen uso del espectro
electromagnético como fuente de radiación para hacer las mediciones.

La espectrofotometría utiliza como fuente, luz visible o del espectro ultravioleta (UV)
empleando los aparatos llamados Espectrofotómetros, en tanto que la fotocolorimetría que
vendría a ser una parte de la espectrofotometría, solamente utiliza luz del espectro visible

45
(400 a 800 nm), para hacer las determinaciones, empleando el aparato llamado
fotocolorímetro el cual emplea filtros de color para seleccionar un intervalo de longitud de
onda correspondiente al filtro usado. Tanto a la espectrofotometría como a la
fotocolorimetría, en conjunto, se les da el nombre de fotometría, pero en la actualidad este
término ya casi no se usa.
En la presente práctica sólo usaremos el fotocolorímetro

inte de Filtro Muestra Fotocelda Registro


luz

Figura N° 1.1.- Componentes de un fotocolorímetro

Los métodos espectrofotométricos y fotocolorimétricos se aplican para medir la fuerza


transmisora de luz de una solución, con el objeto de determinar la concentración de una
sustancia presente en dicha solución, que es la que absorbe la luz. Si la solución de por sí
ya tiene color, lo cual no sucede frecuentemente, se puede comparar la absorbancia
mostrada por la sustancia presente en solución, con la que producen soluciones de la
misma sustancia; pero, de concentración conocida, para así poder determinar la
concentración de esta sustancia en aquella solución en donde no se le conocía.

Si la sustancia presente en solución no tiene color, que es lo que sucede más


frecuentemente, habrá que hacerla reaccionar con ciertos reactivos a fin de que se produzca
un determinado color, cuya absorbancia pueda ser medida en el fotocolorímetro,
comparando su absorbancia con aquellos que producen otras soluciones de la misma
sustancia pero de concentración conocida ( soluciones estándar), mediante la aplicación de
la ley de Beer-Lambert.

Los espectrofotómetros y los fotocolorímetros miden pues kla absorbancia de las


soluciones que tiene una sustancia cuya concentración se desea medir. Pero, como ya se ha
dicho antes, los fotocolorímetros solamente usan luz visible y se emplea filtros para
seleccionar haces de longitud de onda, correspondientes al filtro que se se usa, ( así, el
filtro azul deja pasar haces de longitud de onda entre 400 a 465 nm; el filtro verde entre

46
500 a 570 nm; y el filtro rojo entre 640 a 700 nm). En tanto que los espectrofotómetros
emplean como fuente de luz tanto la visible como la UV, y se puede seleccionar una
determinada longitud de onda mediante el uso de un prisma y colimador; por lo tanto, en
las mediciones de absorbancia se emplea un haz de longitud de onda deseada. Los
fotocolorímetros se usarán para sustancias que absorben luz visible o UV.

En el curso de Bioquímica, en la mayor parte de los casos utilizaremos la expresión


práctica de la ley de Beer-Lambert, que como ya se ha visto en la parte teórica, es:

Abst Cst
----------- = ------------- (Ecuación1)
Abx Cx

Es decir las absorbancias son directamente proporcionales a las concentraciones.


Resulta entonces que en cualquier método fotocolorimétrico, en la mayor parte de los
casos, se trabajará con tres tipos de soluciones. La muestra que contiene la sustancia cuya
concentración se desea medir (Cx) y cuya absorbancia se mide en el fotocolorímetro
(Abx); la solución estándar, cuya concentración de la sustancia es conocida (Cst, y cuya
absorbancia también se conocerá ya que se la medirá en el fotocolorímetro (Abst);
finalmente tenemos la solución blanco, que generalmente tiene el disolvente puro y/o los
reactivos, pero, sin la sustancia que se desea medir, su absorbancia también la medimos en
el fotocolorímetro. Estos tres tipos de soluciones, se tratan siempre de igual manera y con
losmismos reactivos. Antesde aplicar la ecuación 1, hay que de restar la lectura del blanco
a Abxy a Abst (Absorbancias netas) y con estos datos recien podemos proceder a calcular
la concentración Cx, según la ecuación 1:
Cst x Abx
............................... = Cx (Ecuación 2)
Abst

El valor Cst / Abst, se llama factor de calibración ( Fe ); así, la ecuación 2 quedaría


como:
Cx = Fe x Abx (Ecuación 3)

En una buena parte de los métodos fotocolorimétricos que se usan para determinar
una sustancia, se emplea, no una solución estándar sino varias, esto con el objeto de dar
mayor precisión a la medida; por lo tanto antes de emplear la ecuación 3, se deberá obtener
un factor de calibración para cada solución estándar, luego sacar el promedio y recien
emplearlo en la ecuación 3.

47
Otro método que con frecuencia se usa para obtener Cx , es mediante la curva de
calibración. Esto consiste en hacer un ploteo de las concentraciones de los estándar en el
eje “X” , frente a sus absorbancias ( usar siempre absorbancias n e ta s ) en el eje “Y”. Con
esta gráfica se puede extrapolar, usando la absorbancia neta de la muestra X, para ver cual
será su concentración.

Con frecuencia, para hallar la concentración de la sustancia en g % o mg % debemos


hacer operaciones adicionales. Generalmente se usa una muy pequeña cantidad de muestra
para hacer la reacción de coloración y determinar su absorbancia; luego, la concentración
encontrada según los métodos indicados, corresponde a la cantidad de muestra empleada,
para hacer la reacción de coloración, por lo que, para encontra la concentración de la
sustancia en g o mg %, que son las concentraciones como normalmente se expresan,
deberemos hacer una regla de tres simple para encontra dicha concentración en 100 mi de
solución o muestra. Esto se comprenderá mejor cuando hagamos un ejemplo de la
utilización de un método fotocolorimétrico para la determinación de una sustancia, como
lo proponemos en uno de los experimentos que se indican más abajo.

Alternativamente, es posible hallar resultados directamente en porcentaje (g ó mg %),


si se calcula un factor de calibración porcentual; es decir , que el Fe simple encontrado
previamente, se lo corrige para hacer la reacción de coloración; luego, al multiplicar este
factor porcentual por la absorbancia neta de la muestra X, tendremos el resultado
directamente en g % ó mg %. Para el caso de la curva de calibración, podemos calcular las
concentraciones de los estándares en g % ó mg %, así que se plotea absorbancias frente a
concentraciones de los estánda en g % ó mg %, luego la absorbancia neta de la muestra X
se extrapolará en la gráfica, dándonos el resultado directamente en g % ó mg %, con lo que
los cáculos se simplifican.

EXPERIMENTO 1

FACTOR DE CALIBRACION Y CONSTRUCCION DE LA CURVA DE


CALIBRACION.

Reactivos:

Solución de anaranjado de metilo a 1 mg %.


- Solución de anaranjado de metilo de concentración desconocida ( Muestra X ).

48
En este experimento se trata de hallar la concentración de una solución de Anaranjado
de Metilo (Muestra X). Se tendrá cinco concentraciones diferentes de Anaranjado de
Metilo (soluciones Estándar).

Procedimiento. Por el método del Factor de calibración.

En siete tubos de ensayo medir lo siguiente ( en m i ):


Tubo N°
REACTIVOS
1 2 3 4 5 Muestra Blanco
Anaranjado de Metilo 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
1 mg %
Agua destilada 8.0 6.0 4.0 2.0 10.0
Sol. de A. Metilo de 10.0
concentr. desconoc.

Mezclar bien y leer en el fotocolorímetro con filtro azul.


Completar el siguiente cuadro:
.......■........ ■ -----
1 2 3 4 5 Muestra Blanco
Absorbancia o D.O
Absorbancia Neta
Concentración en mg %
de los estándar de A. M.
Factor de Calibración
Concentr de la muestra

D. O : Densidad Optica, A. M. : Anaranjado de Metilo

Por lo tanto el factor de calibración será de: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _


La concentración de la muestra X de Anaranjado de Metilo será de: _____________mg %

Procedimiento: Por el método de la Curva de Calibración.

Con los datos de las absorbancias netas de los tubos del 1 al 5 y sus respectivas
concentraciones, construir la curva de calibración para el anaranjado de metilo. Usar papel
milimetrado haciendo en cada eje las escalas adecuadas, en el eje X colocar
concentraciones de Anaranjado de Metilo y en el eje Y las absorbancias o Densidades
Ópticas netas. Trazar la línea tomando los puntos medios. Colocar o pegar la gráfica en el
siguiente espacio:

49
Figura N° 1.2 Curva de calibración para el anaranjado de metilo

La concentración de la muestra”x” de anaranjado de Metilo, según la curva de calibración


será de:_______________mg %.

Nota (1): Hay fotocol orí metros que nos dan la absorbancia o densidad óptica (D.O)
directamente. Otros aparatos como los fotocolorímetros Klett dan en unidades
Klett (UK), que son unidades proporcionales a la densidad óptica. Para convertir
D.O. en U.K., multiplicar la D.O. por 500; en tanto que para convertir U.K. en
D.O., multiplicar U.K. por 0.002 ó dividir la U.K. entre 500.

Nota (2): Si por alguna razón no está operativo el fotocolorímetro del laboratorio se puede
trabajar con las siguientes D.O. : Tubo 1: 0.320; tubo 2: 0.460; Tubo 3: 0.650;
Tubo 4: 0.840; Tubo 5: 0.950; Tubo 6 (Muestra x): 0.720 y tubo 7 (blanco):
0.00

Nota (3): En el caso de no disponerse de soluciones de Anaranjado de Metilo, se puede


trabajar con una de Bicromato de Potasio a 0.1 g %. Precediéndose en forma
semejante a lo señalado en la tabla ya indicada para el Anaranjado de Metilo.

50
EXPERIMENTO 2.
DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DEL ANARANJADO DE
METILO.
La determinación de un espectro de absorción siempre debe hacerse usando un aparato
que pueda seleccionar una longitud de onda determinada. Como se sabe, para determinar
un espectro de absorción de una sustancia, hay que medir la D.O. en varias longitudes de
onda determinadas, una por una, y luego hacer un gráfico donde se plotea las D.O. ( en el
eje Y) frente a las longitudes de onda ( en el eje X ). Cada sustancia en solución tiene su
espectro de absorción característico y así podemos identificar de que sustancia se trata.

Procedimiento:

De la solución de Anaranjado de Metilo del experimento 1, que tiene una


concentración de 1 mg %, hacer una dilución 1: 2.5 con agua destilada.

Tomar un fotocolorímetro o espectrofotómetro que seleccione longitudes de onda


determinadas, ajustar a 100 % de transmisión usando un tubo con agua destilada, y luego
medir la absorbancia de la solución diluida de A. de Metilo a las longitudes de onda de
400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550 nm. En el caso de no disponer del aparato indicado,
usar las siguientes lecturas:

Longitud de Absorbancia
onda (nm) (D.O)
400 0.290
420 0.320
440 0.380
460 0.420
480 0.375
500 0.200
520 0.180
550 0.090

Construir el espectro de absorción de Anaranjado de Metilo en una hoja de papel


milimetrado, colocando en el eje X las longitudes de onda y en el eje Y las absorbancias
Usar el espacio siguiente para pegar su gráfico

51
Figura N° 1.3.- Espectro de absorción de luz del Anaranjado de Metilo

Cuál es la longitud de onda con la que se obtiene mayor absorbancia para el Anaranjado de
Metilo? ___________

EXPERIMENTO 3 .

DETRM3NACION DEL COLESTEROL TOTAL DEL SUERO SANGUINEO USANDO


UN METODO FOTOCOLORIMETRICO. (Método de Zlatkis).

Los valores normales para colesterol por este método están entre 135 a 256 mg %,
como reactivo se emplea una mezcla de cloruro férrico en ácido sulfúrico, ya que el
colesterol con este reactivo forma un color violeta, el cual puede ser leído
colorimétricamente con filtro verde.

Reactivos:
Reactivo de color para colesterol : 2.5 g de Cloruro Férrico en 25 mi de ácido acético
glacial. Diluir 0.1 mi. del reactivo anterior con 10 mi de ácido
sulfúrico concentrado.
Ácido acético glacial.

52
Sol. estándar de colesterol 100 mg % : Disolver 100 mg de colesterol en 100 mi de una
mezcla a partes iguales de alcohol-acetona.

Procedimiento.
Rotular 7 tubos de ensayo y proceder a medir como se indica en el cuadro siguiente:
* Pipetear con cuidado los reactivos, pues contienen ácidos fuertes concentrados.

Tubo N°
Reactivos 1 2 3 4 5 6
Muestra Blanco

Sol Estand Colesterol 100 % 0.05 0.10 0.15 0,20 ---------- ----------

Acido Acético Glacial 2.95 2.90 2.85 2.80 2.90 3.00


Suero diluido 1 : 2 — — — — 0.10 —

Reactivo de color 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00

Mezclar bien con varilla de vidrio.


Dejar en reposo por 30 minutos y leer la absorbancia en el fotocolorímetro usando filtro
verde.
Completar el siguiente cuadro:

1 2 3 4 5 6
Absorbancia

Absorbancia neta

Concentrac de los estándar


en mg / tubo.

Expresión de resultados:

Cuál es el factor de calibración promedio? _____________


Cuál es la concentración de colesterol en la muestra de suero? __________ mg%
Cuál es el Factor de Calibración porcentual? ___________

Construir la Curva de Calibración con la concentración de los Estándares en mg % en el


eje X, y las absorbancias en el eje Y.

53
Figura Na 1.4- Curva de calibración para la determinación de colesterol

INTERROGANTES BIOQUIMICAS.
1. Que es transmitancia y que es Absorbancia. Qué relación existe entre estos términos?

2. Que entiende Ud. Por espectro de absorción de una sustancia?

3. Que es una curva de calibración y que es Factor de calibración. Como se las obtiene?

4. Si una sustancia en solución tiene una transmitancia de 48 cuál será su absorbancia?


Respuesta: ...................................................

54
PRACTICA N° 6

QUIMICA DE CARBOHIDRATOS

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:
1. Estudiar reacciones propias de los carbohidratos.
2. Identificar los carbohidratos en una muestra problema

INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza tanto en
vegetales como en animales. Su estructura química pennite funciones estructurales así
como de reserva en organismos simples, como en células superiores en donde cumplen
también funciones específicas y especializadas.

La glucosa es el carbohidrato más importante; la mayor parte de los carbohidratos


de la dieta se absorben a nivel intestinal en forma de glucosa pasando luego al torrente
sanguíneo; otros azucares se convierten en glucosa en el hígado. La glucosa es el
combustible metabólico más importante de los mamíferos (excepto los rumiantes), y un
combustible universal para el feto. Es el precursor de la síntesis de todos los otros
carbohidratos en el cuerpo, incluidos el glucógeno para almacenamiento, la ribosa y a
desoxirribosa en los ácidos nucleicos, y la galactosa en la lactosa de la leche, en
glucolípidos, y en combinación con las proteínas en las glucoproteínas y los
proteoglicanos.

Las enfermedades que se relacionan con el metabolismo de los carbohidratos


incluyen a la Diabetes Mellitus, galactosemia, enfermedades por almacenamiento del
glucógeno e intolerancia a la lactosa.

EXPERIMENTO N° 1

PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

1. REACCIÓN DE MOLISH:

Identifica en forma general a los carbohidratos aun estando unidos a proteínas o lípidos

Fundamento:
Los carbohidratos se deshidratan con ácido sulfúrico concentrado dando origen a
furfurales (furfural si es pentosa e hidroximetilfurfúral si es hexosa). Estos pueden

55
condensarse con compuestos fenólicos como el alfa-naftol para d a r sustancias quinónicas
coloreadas (anillo violáceo).

H- c * °
I
HO-C-H
I
H-C-OH
I
HO-C-H
I
HO-C-H
I
CH2 OH
GLUCOSA

H O -*\ y
— CHO
O
FURFURAL

OH
Procedimiento:

En un tubo de ensayo medir 1 mi. de la muestra


Agregar 2 gotas del reactivo de Molish
Luego añadir lentamente por las paredes del tubo, 1.5 mi del ácido sulfúrico
concentrado.

Observar y anotar sus resultados. Hacer una discusión de los mismos.

2. REACCION DE SELIWANOFF. (Identifica cetohexosas.)

Fundamento:

Por acción del ácido clorhídrico en caliente las cetohexosas se convierten en


hidroximetilfurfufural, el cual al condensarse con el resorcinol da un color rojo cereza.

56
CH20H
c= o
HO-C-H
I HCI HOHjC-^ -CHO
H-C-OH
I
H-C-OH HIDROXIME71L
I
CH2OH FURFURAL
FRUCTOSA

HO.
HOH5C
HOH3C- \ CHO
COMPLEJO DE
HIDROXIMET1L OH
FURFURAL COLOR ROJO V\
RESORCINOL
CEREZA

Procedimiento.
- A un 0,5 mi de muestra añadir 1,0 mi del reactivo de Seliwanoff
- Colocar el tubo posteriormente en bailo María hirviente.
- Observar el color a los 2, 5 y 10 minutos de calentamiento.

Anotar sus resultados y discutirlos.

3. PRUEBA DE IODO (Identifica polisacáridos.)


Fundamento:
Algunos polisacáridos tienen la característica de reaccionar con el yodo formando
complejos de absorción entre el metaloide y esta macromolécula, originando diversas
coloraciones que permiten su identificación. El color de la reacción se debe a que eliodo
atrapado absorbe más luz; así por ejemplo, la amilosa da color azul, la amilopectinada
color violeta, el glucógeno da color café rojizo
La prueba es positiva para el almidón si aparece el color azul con el Iodo.

Procedimiento.
- En un tubo de ensayo colocar 2 mi. de la solución de carbohidrato.
- Añadir una gota de iodo
- Observar la aparición de color y anotar en el cuadro

57
Coloque el tubo aquel donde aparece el color en baño María hirviente y observe la
coloración, luego enfríe y observe nuevamente. Haga una discusión de sus observaciones.

4. REACCIÓN DE BENEDICT:
Identifica azúcares reductores.

Fundamento
Los grupos aldehídicos y cetónicos libres o potencialmente libres de los carbohidratos
presentan poder reductor el cual puede actuar sobre el ion Cu"^ reduciéndolo a Cu+. La
reacción es positiva cuando hay formación de un precipitado de color ladrillo o color rojo
ladrillo que corresponderá al óxido cuproso.

Procedimiento:
- Colocar 2.0 mi de reactivo de Benedict en un tubo de ensayo
- Añadir 2 gotas de la solución de carbohidrato. Mezclar bien.
- Colocar los tubos en baño hirviente durante 5 minutos.
La reacción positiva se manifiesta por la aparición de un precipitado que varía del verde al
amarillo o rojo ladrillo, según la cantidad de carbohidrato
Anotar sus observaciones y discutirlas.

5. REACCION DE BARFOED
Fundamento
En esta reacción ocurre también reducción del Cu4^ a Cu+ , pero como la reacción se
realiza en medio ácido su velocidad es mucho más lenta: Esta reacción se utiliza para
diferenciar monosacáridos de disacáridos. Tanto las aldosas como las cetosas dan la
reacción. Las hexosas actúan con mayor rapidez e intensidad que los disacáridos a
concentraciones equivalentes. La maltosa y lactosa, en medio ácido se hidrolizan más
rápidamente que la sacarosa, de modo que los dos primeros carbohidratos dan la reacción
positiva luego de un tiempo de ebullición entre 15 a 20 minutos, mientras que la sacarosa
da una reacción ligera o negativa luego de largo tiempo de ebullición.

Procedimiento:
- Colocar en un tubo de ensayo 0.5 mi. de la solución de carbohidrato.

58
- Agregar 2.5 mi. de reactivo de Barfoed
- Mezclar y colocar el tubo en un baño de agua hirviente.
Controlar el tiempo en que aparece el color. Aproximadamente entre 7 a 10 minutos, la dan
los monosacáridos, dentro de los 15 20 la maltosa y lactosa, luego de ese tiempo es
negativo o ligeramente positivo para la sacarosa. La positividad de la reacción se
manifiesta por la aparición de un precipitado color naranja.

6. REACCIÓN DE TAUBER

Se utiliza para reconocer pentosas libres o unidas a nucleótidos (Como los ácidos
nucleicos).

Fundamento:
El ácido acético deshidrata a las pentosas formando furfurales; estos reaccionan con la
bencidina dando una coloración rojo cereza.
Procedimiento
- Colocar en un tubo de prueba 0.5 mi de reactivo de Tauber.
- Añadir una gota de carbohidrato en prueba.
- Hervir a baño María por poco tiempo y enfriar inmediatamente después en agua
fría.

Observar y anotar sus resultados

7. REACCIÓN DE BIAL U ORCINOL:

Identifica aldopentosas.

Fundamento:
Por acción del ácido clorhídrico en caliente las aldopentosas se transforman en furfural el
que se condensa con el orcinol en presencia de F eti + dando un color verde oscuro. El ácido
glucorónico da también reacción positiva previa descarboxilación.

59
CHO
I
H O -C -H
I HCI H O -\ > — CHO
H -C -O H
I O
H -C -O H FURFURAL
I
ch2oh

VERDE
-CHO
OSCURO
O
FURFURAL
ORCINOL

Procedimiento

- Colocar en 1 tubo de ensayo 0,5 mi. del reactivo de orcinol.


- Añadir respectivamente 0,5 mi de la muestra problema.
- Calentar a baño María hirviente durante 5 minutos.
- Enfriar los tubos y observar el color.

Anotar y discutir sus observaciones.

INTERROGANTES:
1. Haga hasta donde se pueda la ecuación química de la reacción de Benedict y Iodo.

2. Si la amilopectina es más abundante que la amilosa. ¿Por qué la reacción con yodo del
almidón es azul?

60
3. ¿A qué se debe la desaparición del color en la reacción yodo-almidón al calentarla?

4. Escriba la fórmula de la forma reductora de la maltosa.

5. Complete la siguiente tabla colocando los carbohidratos con los cuales Ud. Trabajó y
determine la positividad o negatividad de las reacciones realizadas para cada uno de ellos.

1 2 3 4 5 6
- Molish
- Benedict
- Yodo
- Seliwanoff
- Barfoed
- Orcinol
RESULTADO

Comentarios:

61
62
PRACTICA N° 7

QUÍMICA DE LÍPIDOS

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:

1. Saponificación de una grasa


2. Adición de Yodo
3. Investigación del colesterol en muestras biológicas
4. Determinación cuantitativa del colesterol

INTRODUCCIÓN

Los lípidos son compuestos orgánicos de estructura química muy variada, insolubles
en el agua pero fácilmente solubles en solventes orgánicos, siendo los ácidos grasos parte
estructural importante en la mayoría de ellos.

Estas moléculas cumplen importante rol biológico ya sea como componentes


estructurales de la membrana celular, constituyendo formas de almacenamiento de
energía, moléculas combustibles, agentes emulsificantes, vitaminas, hormonas, etc. El
estudio de los lípidos y su metabolismo se hace aún más importante por la relación que
tienen con muchas enfermedades como la ateroesclerosis, diabetes mellitus, enfermedad
coronaria, hipertiroidismo, etc.

El suero sanguíneo normal, contiene lípidos en cantidades muy variables, donde están
comprendidos los ácidos grasos, colesterol libre y esterificado, acilglicéridos y
fosfolípidos, los mismos que se unen a proteínas transportadoras, constituyendo las
lipoproteínas complejos de naturaleza lábil y fácilmente disociables. Por lo general se
estima que la lipemia en un individuo normal es de 600 mg % por término medio,
oscilando entre 400 a 800 mg %. Se habla de hiperlipidemia cuando los valores
encontrados en los pacientes es superior a la cifra mencionada. Se produce hiperlipemia en
las siguientes condiciones : ayuno prolongado enfermedades endocrinas como la diabetes
mellitus e hipotiroidismos, ictericia de tipo obstructivo después de la ingestión de comidas
ricas en grasas, se presenta hipolipemia en el- hipertiroidismo y anemia perniciosa.

De otro lado el contenido de lípidos en los alimentos es muy variable así como la
calidad de los mismos dependiendo éste de la naturaleza y fuente de origen. La calidad de
los lípidos puede ser valorada por el contenido y clase de ácidos grasos presentes, donde

63
cabe señalar que las grasas o aceites de origen vegetal tienen un alto contenido de ácidos
grasos poliinsaturados (esenciales), comparados con las de origen animal, como se
demuestra en la siguiente tabla :

Oleico Linoleico Linolénico Palmítico Esteárico


Manteca de Cerdo 43.9% 2 . 1% 21 % 13.8%
Aceite de Semilla de algodón 33.0% 43.5% 21 % 2.0 %
Aceite de oliva 83.0% 7.0% 6 .0 % 4.0%
Aceite de linaza (Lino) 5.0% 61.5% 25.0% 5.0% 3.5%

La naturaleza de los ácidos grasos presentes en las grasas neutras puede conocerse
también a través de los índices. El índice de saponificación se define como los
miligramos de KOH necesarios para saponificar un gramo de grasa; mientras que el índice
de iodo se define como los gramos de iodo absorbidos por 100 gramos de grasa.

En la siguiente tabla se muestran los índices de Yodo para algunas muestras:

’ > ------------------------------ ---------------------n


Indice de lodo Indice de Saponificación
Aceite de semilla de algodón 103-111 185-196
Aceite de-oliva 79-88 185-195
Aceite de linaza 192-195 190-195

Algunas investigaciones han indicado que los ácidos grasos poliinsaturados de la


dieta tienen valor como factor preventivo de la aterosclerosis. Por esta razón se aconseja el
consumo de aceites más ricos en ellos, en vez de grasas de origen animal. Se ha encontrado
cierta correlación entre incidencia de aterosclerosis y consumo de grasas animales en la
alimentación.

EXPERIMENTO 1.

SAPONIFICACIÓN DE LA GRASA

Objetivos
1. Hidrólisis de los triglicéridos y obtención de los jabones de potasio
2. Obtención de jabones de-calcio (insolubles)
3. Regeneración de los ácidos grasos a partir de la solución de hidrólisis.

64
Procedimiento
a) Colocar en un Erlenmeyer de 125 mi aproximadamente 5 gr de manteca de cerdo
y agregar 15 mi de solución alcohólica de KOH
b) Calentar en baño maria hasta que al colocar una gota de la solución alcohólica en
un tubo con agua, la gota se disuelva
c) Agregar 25 mi de agua destilada y mezclar. Observar lo que ocurre y anotar
d) Tomar 5 tubos de prueba y colocar en cada uno de ellos 5 mi de la solución de la
etapa anterior y proceder de la manera siguiente :
- Al tubo 1 dejarlo en reposo
- Al tubo 2 añadirle lml deCaCl2 al 10%
- Al tubo 3 añadir de 10 a 15 gotas de HC1 concentrado hasta obtener un
aspecto lechoso.

CH20-C 0-(C H 2)n-CH3 CH2OH H3C - (CH2)n- c o o k


| KOH |
CH-O-C 0 - ( CH2),-C I1; ► CH OH + H3C - (CH2V COOK
Calor
CH20-C 0-(C H 2)n-CH3 CH2OH H3C - (CH2)„- c o o k

Resultados:

1. Complete la siguiente Tabla:

El tubo 1 contiene

El aspecto del tubo 2 corresponde a


El aspecto lechoso del tubo 3 se debe a

EXPERIMENTO 2

ADICIÓN DE IODO

Objetivo
Demostrar por comparación el grado de instauración de los ácidos grasos presentes
en aceites de diferente origen

Procedimiento:

a) Colocar en cada uno dé 3 tubos de ensayo 1 mi de los siguientes aceites : aceite de


oliva, de algodón y de linaza (de éste último preparar dos tubos).

65
b) Diluir añadiendo a cada tubo 2 mi de cloroformo y añadir 2 gotas de solución de
iodo al 1% en cloroformo, observar el color que da iodo.
c) Dejar en reposo y observar cada dos minutos el decoloramiento. De acuerdo al
tiempo de decoloramiento clasifique a los aceites ensayados según su contenido en
ácidos grasos insaturados

CH20 - CO - (CH2)n- CH = CH - (CH2)n- CH3


i
CH20 - CO - (CH2)„ - CH = CH - (CH2)n - CH3
i
CH20 - CO - (CH2)n - CH = CH - (CH2)n - CH3

CH20 - CO - (CH2)n - CH - CH - (CH2)n - CH3


I f 1
CH20 - CO - (CH2)n - CH - CH - (CH2)n - CH,
I
CH20 - CO - (CH2)n - CH - CH - (CH2)n - CH3
I I

Resultados:

Escriba sus resultados en el siguiente cuadro:


Tubo Aceite Tiempo de decoloración Acidos grasos insaturados

EXPERIMENTO 3.

INVESTIGACIÓN DEL COLESTEROL EN MUESTRAS BIOLÓGICAS (Reacción


de Lieberman - Buchard)

El colesterol es un componente importante dé las membranas celulares cuando una


célula se divide y forma nuevas membranas, cuando las repara de una lesión tiene,
necesidad de colesterol. Se ha calculado que más del 93 % del colesterol de nuestro
organismo está presente en las membranas celulares, mientras que sólo el 7 % circula en
el plasma, pero es el nivel del colesterol plasmático el que está implicado como causa de

66
ateroesclerosis. El colesterol también es precursor de compuestos de importancia biológica
como los ácidos biliares, las hormonas esteroideas, la vitamina D3.

La determinación de colesterol tiene importancia desde un punto de vista médico


porque se encuentra relacionado con procesos como la aterosclerosis. xantomatosis,
acumulo de colesterol en las vías biliares (formación de cálculos) lo que nos permite
evaluar el proceso evolutivo de estas enfermedades.

Objetivo.
Determinar cualitativamente la presencia de colesterol en una muestra biológica.

Procedimiento.

a) En un tubo de ensayo colocar 2 mi de una solución clorofórmica de colesterol o


suero o muestra a investigar
b) Añadir 10 gotas de anhídrido acético y dos gotas de ácido sulfúrico
c) Mezclar y observar los cambios de color que se dan.

Resultados.

Escriba en el espacio los cambios de color que se observan :


Norm al________________________________________________
Patológico______ _______________________________________

EXPERIMENTO 4
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL COLESTEROL. (Método deZlatkis)

Objetivo
1. Determinar cuantitativamente la concentración de colesterol en una muestra
biológica ( suero sanguíneo).

Procedimiento
a) En un tubo de prueba se coloca 0.2 mi de suero sanguíneo, se añade 0.2 mi de
agua destilada. De esta muestra se mide 0.1 mi y se coloca en otro tubo al que
se añade 2.9 mi de ácido acético y 2.0 mi de reactivo de color (FeCb y H 2SO4)
se mezcla bien y luego que haya .enfriado se lee al fotocolorímetro con filtro
verde.

67
Determinación delfactor de calibración :

Tubo Estándar (mi) Acido acético Reactivo de color Absorbancia


1 0.1 2.9 2.0 mi 0.60
2 0.2 2.8 2.0 mi 1.18
3 0.3 2.7 2.0 mi 1.81
Blanco —
3.0 2.0 mi 0.07

La solución Estándar tiene una concentración de 100 mg %.


Mezclar bien, dejar en reposo 2 minutos. Leer con. filtro verde.

Calcule en el espacio el Factor de calibración (Fe): _________________

Calcular el Fe % ________________

Calcular la concentración de colesterol de la muestra problema. __________________


(Mostrar los cálculos)

EXPERIMENTO N° 5.
DETERMINACION DEL INDICE DE SAPONIFICACION

El índice de saponificación depende del tamaño de las moléculas de los ácidos grasos
que constituyen la grasa en estudio. Las relaciones son inversas. Desde que las grasas son
mezclas de acilglicéridos, la mayoría de tipo mixto, el índice de saponificación da un
promedio de tamaño molecular de los ácidos grasos presentes en los acilglicéridos
constituyentes de dichas grasas.

Objetivos:
1.- Determinar el índice de saponificación de una muestra de aceite o mantequilla.

Procedimiento:
a) Marcar dos Erlenmeyers con X y B1
b) Colocar en el Erlenmeyer X un gramo de mantequilla o de aceite de algodón.
c) Añadir 10 mi de solución alcohólica de KOH 0.5 N tanto al Erlenmeyer X, así
como al marcado con Bl.
d) Colocar los dos Erlenmeyers en un sistema de reflujo (o baño de agua hirviente),
durante 50 minutos. Agitar continuamente.

68
e) Transcurrido el tiempo indicado, se deja enfriar espontáneamentey se añade
luego 0.5 mi de fenolftaleína a cada uno de los Erlenmeyers.
f) Titular el contenido de cada uno de los frascos con una solución de HC10.5 N
g) Anotar los mililitros de ácido gastados.

1 hora 1 hora

Cálculos

A los mi. de HC1 gastados para titular el blanco restar los mi. de HC1 gastados para
titular el frasco X. Esta diferencia expresa los mi de KOH 0.5 N que se habrán utilizado
para saponificar los ácidos grasos presentes en la muestra de grasa empleada. Con estos
datos se puede calcular los mg de KOH necesarios para saponificar 1 g de grasa (Indice de
Saponificación)

Expresión de Resultados

Se gastaron............... mi de HC10.5 N para titular el blanco


Se gastaron.............. mi de HCL 0.5 N para titular el frasco X
Los mi. de KOH 0.5 N que se usaron para saponificar la grasa fueron: ..................
Por lo tanto, el índice de Saponificación es: .......................

INTERROGANTES:
l.-Cuál es el objeto de añadir KOH y HC1 en el experimento 1

69
2. Explique mediante una ecuación química la reacción que se efectúa en el tubo 3:

3.-A qué se debe la decoloración del iodo

4.-Que es lo que permite la adición de iodo a los ácidos grasos?

6 .-Si se añade iodo a una solución alcohólica de lecitina podría adicionarla? Por qué?

7. Qué funciones metabólicas cumple el colesterol?

8 . Teniendo en cuenta que la saponificación completa de un mol de TG ocasiona un gasto


de 3 equivalentes gramo de KOH. Estimar el PM del TG considerando que su índice de
saponificación es de 210 (PM del KOH = 56).

70
PRACTICAN0 8

PROTEINAS I

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Separación de proteínas por diálisis del suero.
2. Acción tampón de las proteínas del suero sanguíneo.
3. Estudio de la solubilidad de la caseína a diferentes pH.
4. Reacción de la ninhidrina.

INTRODUCCION

Dada la compleja estructura proteica y por lo tanto su elevado peso molecular, las
proteínas son consideradas como macromoléculas, esto determina una serie de propiedades
que posibilitan su aislamiento y análisis.

Debido a su gran tamaño las proteínas son incapaces de atravesar membranas


semipermeables, lo que posibilita que en una solución en donde existen proteínas y otros
constituyentes de menor peso molecular (aminoácidos, monosacáridos, urea, creatinina,
sales, iones, etc.), las primeras puedan ser separadas al no poder pasar a través de los poros
de las membranas semipermeables, en tanto que los otros constituyentes, de menor peso
molecular, pasarán sin problema alguno.

Las proteínas tienen un rol muy destacado en el control del pH celular y


extracelular. Esta acción amortiguadora se explica por la presencia de grupos ionizables en
las cadenas laterales de los aminoácidos, los cuales son capaces de fijar protones y evitar
que el pH baje; o ceder protones al medio para neutralizar los oxidrilos y evitar de este
modo que el pH aumente.

La concentración de hidrogeniones en el medio en que se encuentra disuelta una


proteína, determina importantes variaciones en la carga eléctrica de la misma. En general
una proteína se carga positivamente cuando se encuentra disuelta en un medio de pH
inferior al de su punto isoeléctrico (pl), en tanto que se carga negativamente cuando el pH
del medio en que encuentra es superior al valor de su pl. El punto isoeléctrico de las
proteínas con un alto contenido en aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina), es
alto, como el caso del citocromo c, que tiene un valor de pl de 10,7. Cuando una proteína
tiene un alto contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y glutámico), tendrán un
71
pl bajo, como el caso de la pepsina que tiene un pl cercano a 1. E n general la mayor parte
de las proteínas globulares tiene un pl que varía entre 5,0 y 9,0.

Cuando la proteína está en un medio de pH que coincide con su valor de pl, no solo
es incapaz de migrar en un campo eléctrico sino que su solubilidad llega al mínimo,
incluso algunas llegan a precipitar.

EXPERIMENTO 1

SEPARACION DE PROTEINAS ( DIALISIS DEL SUERO ).

Objetivos
1. En base al carácter macromolecular de las proteínas utilizar un método para
separarlas de otros componentes de menor peso molecular.
2. Estudiar el efecto de la fuerza iónica sobre la solubilidad de las proteínas del
suero sanguíneo.
3. Constatar la acción del ácido tricloroacético (TCA) como agente precipitante de
las proteínas.

Método: ( Diálisis del suero sanguíneo utilizando como membrana semipermeable una
bolsa de celofán o colodión).

Procedimiento:
a) Medir en el interior de una bolsa de celofán, 5 mi de suero sanguíneo y cerrar la
bolsa.
b) Colocar la bolsa de celofán en el interior de un beaker conteniendo agua destilada,
la misma que debe ser renovada cada cierto tiempo (20 minutos).
c) Al notar algo de precipitado en el interior de la bolsa, vaciar su contenido a un
tubo de centrifuga y centrifugar por 5 minutos a 2500 r.p.m.
d) Separar el sobrenadante en un tubo de ensayo y añadirle 5 mi de ácido
tricloroacético al 10%. Observar lo que sucede.
e) Trate de disolver el precipitado que quedó en el tubo de centrifuga utilizando agua
destilada, de no ser posible, añada unas gotas de NaCl al 10% y observe si se
solubiliza.

Resultados:

1. Escriba si observó precipitado en el interior de la bolsa y a que puede corresponder.

72
2. ¿Qué observó al añadir el ácido tricloroacético al 10%?

3. ¿Fue posible disolver el precipitado del tubo con agua destilada?

4.- ¿Qué ocurrió al añadir el NaCl al 10%?

INTERROGANTES

1. ¿Por qué es necesario renovar el agua destilada del beaker cada cierto tiempo?

2. ¿Cuál es el fundamento de la precipitación de las proteínas por el ácido tricloroacético?

3. ¿Con qué experimento(s) podría Ud. demostrar que las proteínas no difundieron a
través de la bolsa de celofán?

Complete la siguiente tabla:

73
ALBUMINA GLOBULINAS

Solubilidad en el agua
Solubilidad en soluciones salinas diluidas

EXPERIMENTO 2.

ACCION TAMPON (BÜFFER) DE LAS PROTEINAS DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos
Demostrar la acción amortiguadora de pH de las proteínas del suero sanguíneo

Método: Volumétrico o titidimétrico.

Se estima los miliequivalentes de HC1 y de NaOH gastados para hacer variar el pH del
suero sanguíneo, hacia el lado ácido y hacia el lado alcalino, respectivamente, y comparar
estos resultados con los obtenidos al utilizar suero desproteinizado en lugar de suero
sanguíneo

Procedimiento:

a) Medir en un Erlenmeyer, 2 mi de suero sanguíneo diluido al medio (1.0 mi de


suero más 1.0 mi de agua destilada) y titular con NaOH 0.01 N hasta un pH
aproximado de 8.5, usando como indicador la fenolftaleína. Anotar el volumen
gastado de la soda.
b) A la misma solución añadir dos gotas de anaranjado de metilo y titular con HC1 0.1
N hasta pH 3.4, anotar el volumen de ácido gastado. Para reconocer el color que
toma este indicador a pH 3.4, preparar un tampón de dicho pH y añadirle dos gotas
de anaranjado de metilo.

c) Repetir los pasos 1 y 2, utilizando en este caso suero desproteinizado ( o agua


destilada). Para obtener el suero desproteinizado, mida cierto volumen de suero en
un tubo de ensayo, y caliente en baño María hirviente por dos minutos; después de
filtrar o centrifugar, usar el filtrado o el sobrenadante, según el caso

Resultados.

1. Con los datos obtenidos en este experimento complete la siguiente tabla:


74
SUERO AGUA
SANGUINEO DESTILADA
Gasto de NaOH 0.01 N en mi.

Gasto de HC1 0.1 N en mi.

1. Estimar los micromoles o miliequivalentes de ácido y base necesario para hacer


cambiar en una unidad el pH del suero y del agua destilada.

SUERO AGUA
SANGUINEO DESTILADA

Gasto de NaOH 0.01 N en miliequivalentes


Gasto de HC1 0 01 N en miliequivalentes

INTERROGANTES

1. ¿Cuántos grupos ionizables tiene el pentapeptido H-K-M-A-D-E?

2. ¿Qué carga eléctrica predominante tiene a pH 7,4?

3. ¿Cuál es su pl?

4. ¿Qué puede decir de la composición de aminoácidos de una proteína cuya acción


buffer esta en las proximidades del pH 4.0?

5. Una proteína se encuentra a una concentración de 7 g %. Si al tomar 5 mi de esta


solución, gastamosl,12 mi de NaOH 0.1 N para hacer variar su pH de 3 a 5, estime con
aproximación cuantos residuos de aspártico y glutámico que debe tener dicha proteína,
considerando que su peso molecular es de 25, 000.

residuos

75
EXPERIMENTO 3.

ESTUDIO DE LA SOLUBILIDAD DE LA CASEINA A DIFERENTES pH

Objetivos
1. Demostrar como varía la solubilidad de una proteína en función del pH.
2. Precisar las alteraciones que ocurren en la solubilidad d e la caseína cuando se
encuentra en un medio de pH cercano al valor de su pl.
3. Determinar experimentalmente el pl de la caseína .

Método
A través de la turbidez, apreciar la solubilidad de la caseína en medios de diferentes pH.

Procedimiento.

a) Rotular una serie de 9 tubos de ensayo, del 1 al 9


b) En el tubo 1 medir 9 mi de ácido acético 0.178 N
c) En el tubo 2 medir 9 mi. de la solución de ácido acético preparada mezclando 10
mi. de ácido acético 0.178 N y 10 mi de agua destilada.
d) En el tubo 3 medir 9 mi. de la solución de ácido acético obtenida al mezclar 10 mi.
de la solución anterior con 10 mi de agua destilada.
e) Proceder sucesivamente con la misma dilución progresiva, hasta completar los 9
tubos.
f) A cada uno de los tubos, añada 1 mi. de la solución de caseína al 0.5 % en acetato
de sodio 0.1 N.
g) Mezclar bien y observar la turbidez o precipitación, inmediatamente y a los 15
minutos.
h) Con ayuda del papel indicador, estime el pH en cada uno de los tubos.

Expresión de resultados.

Anote sus resultados en la siguiente tabla.


TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Relación SAL / ACIDO

pH (teónco)
pH estimado con papel indicador
Precipitación o insolubilidad a 15’

76
INTERROGANTES
1. Cuál es el pl de la caseína? Fundamente su respuesta.

2. Se altera la estructura primaria de las proteínas, cuando se encuentran a un pH que


coincide con el valor de su pl? Fundamente su respuesta.

3. Por qué precipita la caseína en su pl? Es este proceso reversible?

4. El pl de la ureasa es de 5.0 será mayor su solubilidad si se encuentra disuelta en un


tampón acetato 4.7 o si se encuentra disuelta en un tampón fosfato 7.8. Por qué?

EXPERIMENTO 4.

REACCION DE LA NINHIDRINA

Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina ( hidrato de triceto hidrindeno ), en


caliente, y rinden CO 2, amonio y un aldehido de un átomo de carbono menos que el
aminoácido original. La reacción rinde una coloración azul púrpura, que resulta muy útil
para la identificación de los aminoácidos.
o o o

o
C olo ran te

v io leta

:OH

77
Objetivo:
Realizar e interpretar la reacción de color de la ninhidrina para la identificación de
aminoácidos

Método: Colorimétrico Cualitativo.

Procedimiento:

a) En un tubo de ensayo medir 2 mi de la solución del aminoácido al 2%


b) Agregar 0,5 mi de la solución de ninhidrina y colocar el tubo en baño maría
hirviente por 3 minutos. Observar

Resultados:
Anote en el espacio su observación

INTERROGANTES
1. Utilizando el espacio que sigue, escriba con palabras los elementos del complejo de
color que se constituye en esta reacción

2. Cite dos procedimientos para cuantificar los aminoácidos usando la reacción de la


ninhidrina

3. ¿Porque algunas muestras dan positiva (ejemplo Reacción de Millón) solo después de
ser sometidas al calor?

78
PRACTICA N° 9

PROTEINAS II

RELACION DE EXPERIMENTOS

1.- Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo


2.- Desnaturalización de proteínas y actividad biológica
3.- Identificación de la presencia de proteínas en la orina
4.- Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo

INTRODUCCIÓN

La determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo es una determinación de


laboratorio muy utilizada en clínica. Es la cuantificación se suele hacer por diversos
métodos, sin embargo, aquellos que utilizan ciertas reacciones de color, que dan las
proteínas, son los más difundidos. Uno de ellos es el que utiliza la reacción de Biuret.

Desde hace mucho tiempo se conoce que al calentar la urea hasta 180°C, se
descompone para rendir amoniaco y un compuesto denominado biuret. Este último, en
presencia de iones cúpricos y en medio alcalino, rinde una coloración violeta.

No solamente el biuret es capaz de dar esta reacción, otras sustancias que tienen dos
radicales CONH2 o CH2NH2, también pueden hacerlo; incluso estos radicales están
unidos mediante átomos de carbono o de nitrógeno. De la misma manera, los péptidos con
más de dos enlaces peptídicos dan positividad a esta reacción, que es comúnmente
conocida como la reacción de Biuret.

Con aplicación de la reacción de Biuret se ha estandarizado un método para la


determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo y que se utilizará en la presente
práctica. Los valores normales para este método son de 6 a 8 g%. Por debajo de 6 g% se
habla de hipoproteinemia y por encima de 8g% hablamos de hiperproteinemia.

A pesar de existir una concentración tan alta de proteínas en el suero, normalmente no


se detectan proteína en la orina, explicable por la incapacidad de las proteínas
(macromoléculas) de atravesar los poros de la membrana basal del glomérulo renal. Por
esta razón el encontrar proteínas en cantidades demostrables en la orina de un paciente, es
una situación de mucho cuidado desde el punto de vista médico.

79
Las proteínas pueden ser identificadas en la orina, de amanera muy sencilla, al calentar
una muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cual es indicativo d e la desnaturalización de
las proteínas por el calor. Sin embargo debe tenerse en cuenta que los fosfatos también
pueden enturbiar la orina; la distinción puede hacerse considerando que los fosfatos se
vuelven solubles en medio ácido.

En muchos casos no resulta suficiente hacer la determinación de las proteínas del


suero sanguíneo, sino que es también necesario establecer las concentraciones de las
diferentes fracciones proteicas. En este sentido , se usa un procedimiento denominado
electroforesis de las proteínas del suero, que nos permite aislar las diferentes fracciones y
cuantificarlas.

El procedimiento de la electroforesis está basado en el procedimiento de las moléculas


eléctricamente iónicas según el pH del medio, serán moléculas susceptibles de ser
separadas por electroforesis. La velocidad de migración de estas macromoléculas
dependerá de la intensidad de su carga eléctrica, su tamaño y forma, la naturaleza del
soporte sobre el cuál migran, la fuerza iónica del medio, la temperatura, etc. Se entiende
que este procedimiento también será de utilidad para la separación de las proteínas de otros
líquidos biológicos, como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, orina, etc.

La electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo, como comúnmente se realiza,


determina la separación de 5 fracciones proteicas, que ordenadas en función de su
velocidad de migración, son las siguientes: albúmina, alfa 1 globulina, alfa2 globulina, beta
globulina y gamma globulina. La albúmina es la más homogénea, no contiene lípidos, su
peso molecular es de 69,000; su Pl es aproximadamente 4,9 y es la de mayor velocidad de
migración. Tiene como función importante su participación en el equilibrio hídrico y
además el transporte de una serie de sustancias como la bilirrubina, los ácidos grasos, etc.
La albúmina también se une a drogas que son poco solubles en el agua, como barbitúricos,
digitálicos, aspirina, etc. Normalmente, el 50% del calcio plasmático está unido a la
albúmina y esto debe tomarse muy en cuenta para explicar las manifestaciones de
hipocalcemia asociadas a las situaciones en las cuales disminuye la concentración de
albúmina plasmática.

Las alfa globulinas incluye dos fracciones electroforéticas, las alfa 1 Pl (5.1) y las alfa
2 (5.5 - 5.8). las principales alfa 1 globulinas, son la proteína C reactiva y las lipoproteínas
de alta densidad (HDL): en tanto que las alfa 2 globulinas son la haptoglobina,

80
ceruloplasmina y protrombina. La beta globulina (Pl 5.4 - 6.3) incluye la proteína
transportadora de fierro (transferrina) y a las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Las
gamma globulinas (Pl 6.3 - 7.3), contiene las diferentes inmunoglobulinas, como la
inmunoglobulina G (Ig G) que corresponde al 80%, la inmunoglobulina A (Ig A) que
representa un 13% y a otras inmunoglobulinas, que se encuentran en menor concentración
(Inmunoglobulinas M, D, E, etc.).

La técnica más comúnmente usada para la separación de las proteínas del suero
sanguíneo por electroforesis consiste en depositar unos microlitros de suero en una tira de
papel filtro humedecida con buffer barbital pH 8 .6 . Los extremos de la tira luego son
introducidos en dos recipientes que contienen el mismo tampón y que están en contacto
con los electrodos.

En vista que el Pl de todas las fracciones, es menor que el pH del tampón, se cargarán
negativamente y por lo tanto migrarán al polo positivo. Como quiera que la intensidad de
carga de las diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamaño, migrarán a diferente
velocidad. Esto quiere decir que una vez desconectado el aparato de la fuente eléctrica,
quedarán separadas las fracciones y será posible su identificación si las teñimos con un
colorante específico para proteínas (como el amido black). La cuantificación de cada
fracción se hará en función de la intensidad de color que tiene cada banda y que puede
hacerse por diversos métodos, como con el uso de un aparato llamado densitómetro que
nos grafica un pico para cada fracción y cuya área es proporcional a su intensidad de color.

La tabla siguiente muestra los valores que podemos considerar como normales tanto
en valores absolutos (g%) como en valores relativos (porcentaje). En la tabla 2 se muestran
las variaciones en la concentración de las diferentes fracciones electroforéticas de las
proteínas del suero sanguíneo en algunas enfermedades, en donde este método es de gran
ayuda en su diagnóstico.

TABLA 1: VALORES NORMALES PARA LAS DIFERENTES FRACCIONES PROTEICAS


DEL SUERO SANGUINEO SEPARADAS POR ELECTROFORESIS AL PAPEL

Albúmina A lfa l Alfa 2 Beta Gama


globulina globulina globulina globulina
Porcentaje 5 0 -5 8 4 -7 7 -1 1 11 - 15 1 4 -2 2
Gramos por 100 3.24 - 4.42 0.86-0.48 0 .5 -1 -0 .7 2 0.78 -1.04 0.80-1.60
mi de suero

81
TABLA 2. VARIACION DE LAS FRACCIONES DEL ELECTROFORETOGRAMA
DE LAS PROTEINAS SÉRICAS EN ALGUNAS ENFERMEDADES.

ENFERMEDAD P.T. Albumi Alfa -1 Alfa - 2 Beta Gama


Infecciones agudas N N A (+)
Endocarditis bacteriana N N A (++)
Plasmocitoma beta N N A (++)
Artritis reumatoide N D (+) A (+) A (++)
Hipogamaglobulinemia NÓD N D (++)
Mieloma múltiple A N A (+++)
Síndrome nefrótico D (+) D (++) A (+)
Desnutrición D (+) D (+)
Cirrosis hepática D (+) D (+) A (+)

N : Normal A: Aumento D: Disminución

Rietmann y Daniels señalan que la electroforesis de las proteínas séricas ("serum


protein electrophoresis" SPE), junto con la determinación de las proteínas séricas totales
debe ser considerado como un procedimiento rutinario para cualquier paciente, como
ayuda en el diagnostico y en el control de la enfermedad que tiene.

EXPERIMENTO 1.

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos.
Mediante el uso de la reacción de Biuret y la aplicación del método fotocolorimétrico,
hacer la determinación cuantitativa de las proteínas de una muestra biológica (suero
sanguíneo).

Método
Determinación de las proteínas totales del suero por el método de biuret

Procedimiento.
a) A 0,1 mi de suero sanguíneo añadir 1,9 mi de agua destilada y mezclar
b) Medir 1 mi de la solución anterior en un tubo de ensayo y añadir 4 mi del reactivo
de biuret. Mezclar

82
c) Dejar en reposo 30 minutos y medir la absorbancia en el fotocolorímetro utilizando
filtro verde
d) Preparar al mismo tiempo un blanco, que llevará 1 mi de agua destilada en lugar
del suero diluido
e) Durante el desarrollo de este experimento se proporcionará la lectura del estándar,
que se preparará en la misma forma que la muestra, solo que en lugar de suero
sanguíneo se usará una solución de proteínas, de concentración 7 g %.

Resultados

Llenar los espacios en blanco :


Lectura bruta Lectura neta

Tubo Muestra ( M ) ___________ ___________


Tubo Blanco ( B ) ___________ ___________
Tubo Estándar ( S t) ___________ ___________

FACTOR DE CALIBRACION : ______________

Concentración de proteína de la muestra en el volumen del suero usado : _____ g por 100
mi de suero.

INTERROGANTES

1. Se puede hacer la determinación fotométrica de la concentración proteica, sin utilizar


una reacción de color ?. Fundamente su respuesta

2. Cuál es el objeto de preparar el blanco ?

83
3. Por qué se utilizó el filtro verde del fotocolorimetro para m edir la absorbancia de la
solución en el experimento 1 ?

EXPERIMENTO 2.

IDENTIFICACION DE LA PRESENCIA DE PROTEINA EN LA ORINA.

Objetivo:

Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de proteínas en la


orina

Método
Coagulación de las proteínas por el calor

Procedimiento.

a) Medir 5 mi de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición. Observar


lo que sucede
b) En caso observe enturbiamiento, añada alguna gotas de solución de ácido acético
al 2%. Apreciar si la turbidez persiste o desaparece
c) Haga el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le serán
proporcionadas.

Resultados.
1.- Llene el espacio en blanco escribiendo + cuando hay turbidez y - cuando no la hay o
cuando desaparece la turbidez

r.-
ORINA X ORINA Y ORINA Z
Calentando la muestra

Añadiendo Ac. Acético


DIAGNOSTICO

84
INTERROGANTES.

1 - Puede una proteína coagulada dar la reacción de biuret. Fundamente su respuesta

2.- Que puede decir de un líquido biológico que al ser calentado se pone turbio y con el
añadido de unas gotas de limón desaparece su turbidez

EXPERIMENTO 3

DESNATURALIZACION DE PROTEINAS Y ACTIVIDAD BIOLOGICA

Objetivos
1. Verificar como la desnaturalización de la proteína determina la perdida de su
actividad biológica
2. Verificar la acción de varios agentes desnaturalizantes

Método
Estudio de la actividad de la catalaza de los hematíes en presencia de diversos
agentes desnaturalizantes a través de la producción de oxígeno.

Figura N° 3.1.- Fundamento del método

Procedimiento
a) Rotular 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y medir respectivamente, 0,1 mi de sangre
diluida (dos gotas de sangre en 100 mi de agua destilada), 0,1 mi de sangre diluida

85
hervida, sangre diluida en presencia de Urea 8 M y sangre diluida en SDS al 3 %
(0,1 mi)
b) Medir en cada tubo 5 mi de peróxido de hidrogeno 0,05 M y mezclar
c) Con ayuda de una varilla de vidrio depositar en el fondo de cada tubo un circulo de
papel filtro y tomar el tiempo que tarda en cada tubo para subir hasta la superficie

Resultados

Complete la siguiente tabla:


1 Sangre 2 Sangre 3 Sangre 4 Sangre
diluida diluida diluida con diluida
normal con SDS Urea 8 M heñida
Tiempo que tarda en subir el
papel hasta la superficie

INTERROGANTES

1.- Junto al nombre de cada agente desnaturalizante describa su mecanismo de acción


a) Urea 8 M ________________________________________________ _________
b) SDS : ___________________________________________________________
c) DTT : ___________________________________________________________

2.- Escriba la reacción química catalizada por la catalasa

3.- Es la catalasa una proteína simple o conjugada?. Fundamente su respuesta

4.- Con qué experimento (s) podría demostrar que la desnaturalización no afecta la
estructura primaria de la proteína

5.- Que importancia podría tener en clínica la búsqueda de actividad catalásica en la orina

86
EXPERIMENTO 4

ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos
1.- Reconocer las diferentes fracciones proteicas que aparecen luego de realizada la
electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo
2 - Identificar las alteraciones cualitativas y cuantitativas en el electroforetograma y
proponer un diagnostico en los casos de alteración.

Método.

Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo en un medio de Buffer barbital pH


8,6 y usando como soporte papel para electroforesis (papel Watman N°l).

Procedimiento.

a) Cada mesa dispondrá de varios electroforetogramas y su trazo densitométrico.


b) Identificar cada fracción y marcar sus límites utilizando lápiz
c) Contando los cuadraditos estimar el área de cada fracción y estimar el
porcentaje del área total que le corresponde.
d) Con el valor de las proteínas totales del suero, que será proporcionado, estime la
concentración absoluta de cada fracción en g%.

Resultados.

1.- Llene la Tabla con las cifras obtenidas. Junto a cada valor de las cifras absolutas
(g%) anote A(+), A(++),A(+++), D(+), D(++) ó D(+++), según encuentre aumento
o disminución, con respecto a lo normal. Considere (+) cuando el aumento o
disminución es hasta un 10%, (++) cuando el aumento o disminución está entre 10 -
25%; considere (+++), cuando el aumento o disminución sea mayor del 25%.

MUESTRA P.T. Albúmin. Alfa 1 Alfa 2 Beta Gama


A Valor en %
Valor en g %
B Valor en %
Valor en g %
_ .

87
2.- De acuerdo a la tabla 2, el diagnostico probable es:
Muestra A __________________________
Muestra B

INTERROGANTES

1.- Cómo será el electroforetograma de las proteínas del plasma sanguíneo

2.- Si en lugar de buffer de pH 8,6 , se emplea otro de pH 3,8, que diferencias importantes
esperaría encontrar en el electroforetograma

3.- Cuál sería la diferencia fundamental entre el procedimiento usado para la separación de
las proteínas séricas y para la separación de las lipoproteínas séricas

4 - Si las proteínas totales de una muestra de suero fueron 4.74 g % y el porcentaje para las
diferentes fracciones fue de 23.2%, 8.0 %, 31.1 %, 17.7% y 20.0 % para albúmina,
alfal, alfa2 , beta y gamma, respectivamente, estimar la concentración absoluta de cada
una

88
PRACTICAN0 10

EXTRACCION DE ADN E IDENTIFICACION DE SUS COMPONENTES

RELACION DE EXPERIMENTOS

1. Extracción y purificación del DNA de un tejido animal


2. Identificación de desoxirribosa: Reacción de Dische
3. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico

INTRODUCCION

Los ácidos nucleicos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada
nucleótido, el cual está constituido por:

a. - Una pentosa : ribosa o desoxirribosa


b. - Una base nitrogenada : púrica o pirimidínica
c. - Ácido fosfórico (Ácido ortofosfórico)

La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleósido.


Finalmente la unión éster de un nucleósido con ácido fosfórico se conoce como nucleótido.

El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA está


formado por dos cadenas polinucleotidicas, enrolladas en espiral a lo largo de un eje
común. Las dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto
azúcar fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hélice y
las bases nitrogenadas están en el interior. Las dos cadenas están unidas por puentes de
hidrógeno establecidos entre las bases, se constituyen dos puentes de hidrógeno entre los
pares A-T y tres puentes de hidrógeno entre los pares G-C.

La adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina.


Los puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos,
obteniéndose un DNA desnaturalizado.

El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar aprovechando su propiedad de


absorber luz a la longitud de onda de 260 nm.

89
Figura N° 7.1. Estructura helicoidal del ADN

3.4 nm
( 10 Db)

OH

Figura N° 7.2. Modelo de la molécula de ADN según Watson y Crick

90
OBJETIVOS
1. Obtención del DNA usando como fuente, timo de ternera
2. Identificación del componente desoxirribosa del DNA : Reacción de Dische
3. Desnaturalización del DNA: Observación del efecto hipercrómico

Procedimiento
1. Aislamiento del DNA
a) Homogenizar 2 g de timo de ternera en una licuadora en 25 mi de una solución
salina 0,15 M más EDTA 0,1M pH 8
b) Transferir el homogenizado anterior a una probeta de 100 mi y añadir 2 mi de
detergente anionico ( Lauril Sulfato al 25%, m ezclar)
c) Colocar en baño maria a 60 oC durante 10 min.
d) Añadir 6,3 mi de NaCl 5 M; mezclar.
e) Añadir solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24 :1 v/v) en un volumen
igual al obtenido en la etapa anterior; aproximadamente 30 mi, agitar
vigorosamente
f) Centrifugar a 10 000 rpm. por 15 minutos.
g) Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar que el DNA se
desnaturalice y colocarlo en una probeta de 100 mi. Agregar dos volúmenes de
alcohol etílico al 95%. El alcohol debe añadirse lentamente, mientras que con una
varilla de vidrio se trata de enrollar el DNA.
h) Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado en un tubo de prueba y
disolverlo en 20 mi de solución salina citrato (0,015 - 0,0015 M). Dejar en reposo
30 min.
i) Añadir 2 mi de solución acetato de sodio 3 M a pH 7 la cual contiene 0,001 M de
EDTA.
j) Mezclar con una varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota 9,5
volúmenes de isopropanol para precipitar selectivamente al DNA. Seguir
mezclando con la varilla de vidrio tratando de enrollar el DNA.
k) Disolver el DNA obtenido en 20 mi. de solución salina citrato.

1. Identificación de Desoxirribosa : Reacción de Dische


Fundamento:
Desoxirribosa reacciona en presencia de ácido acético y sulfúrico con difenilamina
(DPA), dando como resultado un color azul.

91
Se ha conseguido mayor sensibilidad adicionando a la reacción ácido perclórico y
acetaldehído y dejando que desarrolle el color por 17 horas a 30 °C. El color azul
producido por el ADN, sólo mide los azúcares enlazados a purinas, ya que el reactivo DPA
reacciona solamente con las moléculas de desoxirribosa unidas a purinas.

Según Stacey y col., se ha identificado al intermediario responsable del desarrollo del


color azul, el cual corresponde a un compuesto llamado: © Hidroxilevulínico aldehido.

H3C - CO - CH2 - CH2 - COOH HOH2C - CO - CH 2 - CH 2 - CHO

Ac. Levulínico co OH levulínico aldehido

En cambio las desoxirribosas enlazadas a pirimidinas pueden ser detectadas por el


reactivo Carbazol. Pruebas con varios tejidos usando los reactivos DPA y Carbazol, han
mostrado que la cantidad de ADN es la misma, sin considerar cual reacción se empleó para
la determinación. Esto indica por supuesto que el ADN de estos tejidos contienen iguales
proporciones de nucleótidos púricos y primidínicos, puesto que del apareamiento de bases
según Watson-Crick, se asume que la suma de A + G = T + C .

Procedimiento:

a) Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera :


X (Solución de DNA obtenido en la práctica) y C (Control)
b) En cada tubo medir lo siguiente :

C X
Solución de ADN obtenido 2.0 mi.
Agua destilada 2.0 mi.

Reactivo difenilamina en 4.0 mi 4.0 mi.


solución ácida

c) Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.


d) Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de
desoxirribosa se revela por la aparición de un color azul

3. Identificación de fosfato.

Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato, luego se


identificara éste mediante una reacción de coloración.
a) Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la manera siguiente:
X (solución de DNA obtenida en la práctica) C(control)
b) Luego medir lo siguiente:

X C
Solución de DNA obtenida en la práctica 0.5 mi

Solución salma citrato 0.5 mi


Acido perclónco 7.5 N 0.5 mi 0.5 mi

c) Colocar en cada tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio. Luego colocarlo
en baño hirviente durante 30 minutos.
d) Enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente manera:

C X
Contenido del tubo X después de la hidrólisis 0.5 mi.
ácida
Contenido del tubo C después de la hidrólisis ácida. 0.5 mi.

Agua destilada 3.5 mi. 3.5 mi.


Molibdato de amonio al 2.5 % 0.5 mi. 0.5 mi.
Reactivo Reductor (ácido amino reductor naftol 0.5 mi. 0.5 mi.
sulfómco

e) Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo durante 5 minutos. Observar la


presencia de fosfato inorgánico que se manifiesta por la aparición de un color azul.

4. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico.

Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la constante


dieléctrica del medio, pH extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos como la
urea y la formamida pueden debilitar las fuerzas que unen las dos cadenas
complementarias del ADN y rompen los puentes de hidrógeno lo que origina que las dos
cadenas se desenrollen y se separen, proceso conocido como desnaturalización del DNA.
En estas condiciones las bases nitrogenadas quedan más expuestas que en su estado nativo
y tienden a absorber mayor luz a 260 nm, hecho que se conoce con el nombre de efecto
hipercrómico. Cuando la temperatura desnaturaliza el 50 % del ADN esta se le conoce
como Tm o Temperatura de Fusión; esta es mayor o menor según la proporción de pares
de bases G, C o A,T respectivamente.

93
DNA Nativo D N A Desnaturalizado

Figura N° 7.3.- Esquema que explica el proceso de desnaturalización del DNA

Procedimiento.

a) Medir en un tubo 5 mi de la solución del DNA obtenida en la práctica. Colocar


el tubo en baño hirviente durante 15 min., enfriar.
b) Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm.
c) Si la solución del DNA es muy concentrada, diluirla con solución salina citrato y
detenninar nuevamente la absorbancia, hasta que ésta arroje una absorbancia
entre 0.5 y 1.0 .
d) Medir la absorbancia a varias longitudes de onda entre 230 y 320 nm.
e) Hacer lo propio con la solución de DNA nativo obtenida en la práctica
f) Comparar la absorbancia obtenida, con ambas soluciones de DNA.

Expresión de Resultados.

Realizando los mismos pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a la


presente, se obtuvieron los resultados que a continuación se muestran en el presente cuadro

94
Longitud de onda en Absorbancia del ADN Absorbancia del ADN
mil. nativo desnaturalizado
320 0.005 0.020
310 0.019 0.026
300 0.025 0.038
290 0.062 0.125
280 0.135 0.335
270 0.205 0.520
260 0.283 0.650
250 0.235 0.600
240 0.175 0.420
230 0.140 0.350

En el siguiente espacio coloque el gráfico obtenido con los resultados anteriores,


colocando en el eje de las ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de abscisas las
LONGITUDES DE ONDA tanto para el DNA nativo como para el desnaturalizado en el
mismo gráfico.

95
1. Q u e o tro s te jid o s p o d ría n se r u tiliz a d o s p a r a a isla r D N A e n la p r e s e n te p rá ctica.

2. Porqué razón se usan 6,3 mi de NaCl 5 M en una de las etapas de extracción del DNA

3. Si luego de la extracción del DNA realizada en la práctica al leer la absorbancia a 260


nm se obtiene una lectura de 1,25 D.O. y al calentarla durante un tiempo considerable,
en baño hirviente la lectura es de 1,26 D.O. Que explicación daría Ud.

4. Indique qué otras formas para identificar el DNA aparte de la reacción de DISCHE
conoce Ud.

5. Qué bases se encuentran comúnmente formando la molécula del DNA y RNA

6 . Qué bases no comunes se encuentran también en las moléculas de los ácidos nucleicos
y particularmente cuál ?

7. Qué importancia cree Ud. que tiene el hecho de que en el DNA las bases queden en el
interior de la doble hélice ?

96
8 . Qué tipos de RNA conoce Ud. donde se encuentran localizados en la célula?

9. Cuáles son las funciones de los diferentes tipos de RNA?

10. Cuál es el fundamento de la reacción del DISCHE?

11. Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNAasa II ?

97
98
PRACTICA N° 11

ENZIMAS I

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Determinación del amoniaco y construcción de la curva de calibración.
2. Determinación de la actividad ureásica.

OBJETIVOS
1. Familiarizarse en el trabajo con enzimas
2. Determinar la actividad de una enzima ( ureasa)
3. Aplicar los conocimientos adquiridos en la resolución y explicación de problemas
que se suscitan cuando se trabaja con enzimas

INTRODUCCION

Todos los organismos vivos dependen de las enzimas para su desempeño normal de
sus actividades; por lo tanto, es necesario conocer cómo trabajan las enzimas. Este tema es
muy importante en bioquímica; de allí que hemos dedicado dos sesiones de prácticas para
desarrollar este tema. El rasgo cinético más importante que distingue a los procesos
enzimáticos de las reacciones no catalizadas, es que las primeras muestran saturación.
Como ya se ha visto en la parte teórica, casi todas las reacciones catalizadas por enzimas
muestran una taza de velocidad de primer orden con respecto al sustrato a bajas
concentraciones, pero en lugar de incrementar su velocidad indefinidamente cuando la
concentración de sustrato aumenta, la velocidad se aproxima a un límite, en el cual ya no
hay dependencia de la concentración de sustrato, y por lo tanto, la reacción llega a ser de
cero orden con respecto al sustrato.

Los primeros investigadores que nos dieron una clara interpretación de dicha conducta
fueron A. J. Brown y Henry; y posteriormente, L. Michaelis y M. Menten y G. E. Briggs y
J. B. S. Haldane, quienes señalaron interpretaciones más adecuadas al comportamiento de
la velocidad con respecto a la concentración del sustrato. A ellos debemos casi toda la
teoría de la cinética enzimática que desarrollaremos en esta práctica y en la siguiente.

La enzima empleada en la presente práctica es la Ureasa, cuyo nombre sistemático es


Urea amidohidrolasa (EC. 3.5.1.5).

99
E s ta e n z im a c a ta liz a la sig u ie n te reacció n :

NH 2 Ureasa
O= C / + H 20 ------- —» C 02 + 2 NH 2 (1 )
\
nh2

La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en el


organismo humano, una buena fuente son los microorganismos tales como las bacterias.

La velocidad de una reacción enzimática, como la velocidad de cualquier reacción en


general, puede ser determinada midiendo la cantidad de sustrato transformado en un
determinado tiempo de reacción, generalmente un minuto. También puede ser medida
determinando la cantidad de productos formados, cualquiera de ellos, basta con uno sólo,
lo que nos permite deducir que cantidad de sustrato ha formado cierta cantidad de
producto. Para el caso de la reacción catalizada por la ureasa ( reacción 1 ) en virtud de lo
dicho, podemos medir su velocidad determinando la cantidad de sustrato ( urea )
transformado por minuto. En cuanto a los productos podemos medir el amoniaco o el C 0 2
formado. Si medimos el NH 3 , deducimos que dos moléculas de amoniaco provienen de
una molécula de urea, de acuerdo con la reacción. Si medimos C 0 2, diremos que una
molécula de C 0 2 proviene de una de urea.

De estas tres posibilidades para medir la velocidad de dicha reacción la más fácil es
medir la cantidad de amoniaco (NH3) que se forma en un determinado tiempo. La razón es
por que el amoniaco se mide mediante una reacción sumamente sencilla con reactivos a la
mano y baratos, por eso elegimos medir amoniaco. La medición de la urea, aunque fácil,
usa reactivos más difíciles de conseguir y además más caros: solamente por eso no la
determinaremos, pero como hemos dicho, al medir amoniaco podemos deducir cuanto de
úrea ha entrado en la reacción. Podríamos medir también el C 0 2 producido, el cual es un
gas y por lo tanto necesitaremos métodos gasométricos que son más dificultosos por usar
aparatos más sofisticados y caros. Finalmente, podríamos medir también la velocidad de la
reacción midiendo el sustrato agua, pero como todos los reactivos empleados son acuosos,
la cantidad de moléculas de agua que entran en la reacción es sumamente pequeña en
comparación con las que tenemos en el tubo de ensayo, y por otro lado, medir agua es muy
difícil por lo que esto lo descartamos. Por lo tanto, en esta práctica para medir la velocidad
de la reacción catalizada por la ureasa vamos a medir el amoniaco formado.

100
EXPERIMENTO 1.

DETERMINACION DEL AMONIACO Y CONSTRUCCION DE LA CURVA DE


CALIBRACION.

Conforme lo indicado, en esta práctica mediremos el amoniaco y, por lo tanto,


debemos hacer una curva de calibración para amoniaco, puesto que vamos a hacer una
determinación cuantitativa. Esta curva nos servirá para todos los experimentos que
hagamos en ésta y en la siguiente práctica, ya que en todos ellos determinaremos velocidad
inicial como amoniaco formado por minuto.

Se usará un método fotocolorimétrico para la determinación de amoniaco. Dicho


método emplea el Reactivo de Nessler que es un ioduro doble de mercurio y potasio, que
al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo que tiene color
anaranjado castaño. No se conoce bien la estructura de dicho complejo, pero ha sido
propuesto que la reacción entre el reactivo de Nessler y el amoniaco es la siguiente:

2 K2HgI4 + NH 3 + 3 KOH ------- ► Hg2ONH2I + 7 KI + 2 H20 (2)

La intensidad de color formado será directamente proporcional a la cantidad de


amoniaco presente en cada tubo y mediremos la absorbancia de cada tubo en el
fotocolorímetro con filtro azul.

Dado que haremos una determinación cuantitativa del amoniaco con alta precisión
haremos una curva de calibración para amoniaco a fin de convertir absorbancia en
micromoles ( jumóles) o nanomoles ( nmoles ) de amoniaco o amonio.

Se preparará varios tubos con diferentes concentraciones de amoniaco. Para esto


tendremos una solución de sulfato de amonio:

(NH4)2 S 0 4 , 5 x 1CT4 M
Procedimiento.

Es conveniente tener concentraciones entre 50 a 500 nmoles de sulfato de amonio en


cada tubo, por lo tanto:

a) Medir en cada uno de seis tubos 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; y 0.6 mi de sulfato de
amonio.

101
b) Medir en el tubo blanco, solamente agua un volumen de 4.5 mi.
c) Completar con agua todos los tubos para que tengan un volumen final de 4.5 mi
d) Luego, agregar a cada tubo 0.5 mi. de Reactivo Nessler, mezclar bien y dejar en
reposo por 10 minutos a temperatura ambiente.
e) Medir la absorbancia en el fotocolorímetro con filtro azul.

Si la experiencia está bien hecha, se obtendrá resultados de absorbancia semejantes a


los siguientes: 0.216; 0.332; 0.442; 0.560; 0.680; 0.790; para los tubos del 1 al 6
respectivamente; y para el blanco 0 . 100.

Expresión de Resultados.

1. Complete el siguiente cuadro haciendo los cálculos necesarios

n moles nmoles
Tubo h 2o (NH4)2 s o 4 de de úrea Reactivo Absorban­ Absorban­
mi 5 x 10"4 M amonio por tubo Nessler cia cia Neta
por tubo

1 0.1 mi 0.5 mi 0.216

2 0.2 mi 0.5 mi 0.332

3 0.3 mi 0.5 mi 0.442

4 0.4 mi 0.5 mi 0.560

5 0.5 mi 0.5 mi 0.680

6 0.6 mi 0.5 mi 0.790

Blanco 4.5 — - 0.5 mi 0.100

3. Con los datos del cuadro anterior, hacer la curva de calibración en papel milimetrado,
colocando en el eje X, la concentración de amoniaco ( o de amonio que es lo mismo )
en nanomoles y en el eje Y las absorbancias netas.

En el espacio que sigue adjunte la curva de calibración.

102
Figura N° 5 .1 - Curva de calibración para la urea (sulfato de amonio)

Esta curva de calibración nos servirá para convertir absorbancias en nanomoles de


amoniaco, y por consiguiente podemos deducir los nanomoles de urea hidrolizada.

EXPERIMENTO 1.2

MEDIDA DE LA ACTIVIDAD UREASICA.

Como se ha visto en la parte teórica del curso, la cuantificación de la actividad de una


enzima se hace mediante la medida de las Unidades de Actividad Enzimática, medida de
Actividad Específica y de la actividad molecular.

Antes de hacer estudios cinéticos, es conveniente tener una idea de la actividad


ureásica de nuestro preparado enzimático; por lo tanto, en este experimento calcularemos
la actividad ureásica de la muestra enzimática, midiendo las unidades de actividad y la
actividad molecular.
Se dispondrá para este experimento de los siguientes reactivos:

103
■ Solución de urea 0.3 M
■ Buffer fosfato 0.05 M pH 7.4
* Solución de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH 7.4 que contiene EDTA 5 x
10'4 M ( debe mantenerse en hielo).

Cada sistema de ensayo ( tubos ) para la medida de la actividad ureásica contendrá las
siguientes condiciones: Volumen total 3.0 mi
Sustrato ( urea ): 0.04 M
Ureasa: 20 p,g / mi

Calcule que volumen de los reactivos mencionados previamente habrá que usar para
preparar el sistema de ensayo mencionado. Como el volumen total del sistema es de 3.0 mi
habrá que completar el volumen del sistema con buffer fosfato pH 7.4 para que éste
alcance el volumen mencionado.

Debe usarse un tubo control o blanco, el cual se preparará en forma semejante al


sistema señalado, pero solamente no llevará enzima; en vez de ureasa, se debe colocar el
mismo volumen, pero de agua o buffer fosfato pH 7.4 .

Vaya llenando los datos que se señalan en el cuadro adjunto. Una vez que se tenga los
cálculos pedidos, proceder de la siguiente manera.

Procedimiento.

a) Medir en los tubos ( sistema y blanco ), primero la solución de urea y el buffer


fosfato.
b) Preincubar los tubos en baño maría a 37 °C por 5 minutos.
c) Agregar la enzima al sistema y agua al tubo blanco, mezclar rápidamente y poner
a 37 °C durante 15 minutos, exactamente.

OJO: Tenga cuidado de medir exactamente este tiempo de incubación, ya que la reacción
marcha rápidamente a partir del momento en que se agrega la enzima, así que para este
experimento, o los demás, esta recomendación debe seguirse estrictamente; de esto
depende la obtención de buenos resultados.

d) Terminado el tiempo de incubación, poner los tubos en hielo picado a fin de para
la reacción por unos 5 minutos

104
OJO: Tenga cuidado que los tubos estén bien sumergidos en el hielo, por lo menos la parte
del tubo que contiene líquido, esto es importante porque si no la reacción sigue avanzando
y no se obtendrán buenos resultados.
e) Luego, para medir el amoniaco formado, proceder de la siguiente manera:
■ Con anterioridad, cuando se está midiendo la actividad ureásica, marcar
2 tubos: Sistema y Blanco, y agregar a cada uno 4.2 mi. de agua
destilada y colocarlos sobre hielo picado.
■ Con una pipeta retirar 0.3 mi. de cada uno de los tubos: Sistema y
Blanco, donde ocurrió la actividad ureásica y colocarlos sobre los tubos
que tienen agua destilada y que ya estaban sobre hielo.
■ Mezclar bien y agregar inmediatamente 0.5 mi. del reactivo de Nessler.
■ Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente por 10 minutos.
■ Leer la absorbancia en el fotocolorímetro con filtro azul.

mi ^ Urea 0.3 M 5 mi
mi Buffer Fosfato pH 7.4
mi < Ureasa 0.6 mg / mi
3.0 mi
15 min. 37 °C
0.5 mi Reactivo
NESSLER

Preparar un Blanco con 0.3


mi de Agua destilada en
lugar de solución de
reacción

*
LEER
ABSORBANCIA 4.2 mi
Agua Detener la
destilada reacción en hielo

Figura N° 5.2.- Procedimiento para la medida de la actividad Ureásica

105
Expresión de Resultados.
Anote en la siguiente tabla los volúmenes de los reactivos que midió para cada sistema
........
Sistema de ensayo Blanco o Control

Solución de úrea 0.3 M

Buffer Fosfato pH 7.4

Solución de ureasa 0 6 mg / mi

Volumen total del tubo

Las absorbancias obtenidas, fueron:


a) Sistema de ensayo ______________
b) Blanco ______________

Complete lo siguiente:
a) nmoles de urea hidrolizada: ____________
b) nmoles de urea hidrolizada por minuto: ( v i) _________ _ _

PROBLEMA:
En base a la actividad ureásica obtenida. Calcular la actividad molecular de la Ureasa
Nota : Para el cálculo de la actividad molecular considerar que el PM de la ureasa es de
500,000.
Cálculos:

Respuesta:

106
PRACTICAN0 12

ENZIMAS II (CINETICA ENZIMATICA)

RELACION DE EXPERIMENTOS.

1. Efecto de la concentración de sustrato (urea) sobre la velocidad inicial.


2. Efecto de la temperatura sobre la velocidad inicial.
3. Efecto del pH sobre la velocidad inicial
4. Efecto de la concentración de la enzima (ureasa) sobre la velocidad inicial.

OBJETIVOS

1. Caracterizar los factores que afectan la velocidad inicial de las reacciones


enzimáticas, tales como la concentración de sustrato, la temperatura, el pH y la
concentración de la enzima.
2. Interpretar las curvas cinéticas obtenidas con cada uno de los factores
mencionados.

EXPERIMENTO 1.
INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD INICIAL.

Se hará un experimento donde se tengan varios tubos con diferente concentración de


sustrato, midiendo la velocidad inicial en cada tubo.

Usar las mismas condiciones que en el experimento 2 de la práctica anterior, pero


habrá que usar varios tubos: por ejemplo 6 tubos con diferentes concentraciones de
sustrato, éstas pueden variar entre 0.003 M y 0.06 M. Calcular cuántos mi. de solución de
úrea 0.3 M se deberá medir para cada sistema. Se usará la misma cantidad de enzima que
en el experimento anterior y calcular cuánto de buffer fosfato pH 7.4 le deberá
corresponder a cada sistema.

No olvide que cada tubo o sistema tiene un volumen total de 3.0 mi. y deberá usar un
tubo o sistema blanco o control.

Proceda a completar la siguiente tabla:

107
Sol. de Buffer Ureasa
TUBO (S ) Úrea 0.3M Fosfato 0.6 Absorb Absorb Vi.
N° mM mg/mL i / (S) D.O. Neta nmol/mi 1 / Vi
mi. mi. mi.
1 60 0.6 2.30 0.1 0.625
2 40 0.4 2.50 0.1 0.610
3 30 0.3 2.60 0.1 0.592
4 15 0.15 2.75 0.1 0.528
5 10 0.1 2.80 0.1 0.468
6 5 0.05 2.85 0.1 0.362
Blanco 40 0.4 2.60 0.1 * 0.080

* Agua destilada

Siga los mismos pasos que para el experimento 2 de la práctica anterior. Al final
determinar el amoniaco a través de la reacción del Nessler.

EXPRESION DE RESULTADOS.
Complete la tabla de arriba, expresar la velocidad inicial en nanomoles por minuto.
Para los cálculos puede usar los datos de la tabla o los que haya obtenido en su
experimento.
En el espacio siguiente y usando papel milimetrado haga el ploteo de Michaelis-
Menten.

108
Haga el Ploteo de los inversos 1 / Vi frente a 1 /(S) (lineweaver - Burk) en papel
milimetrado y utilice el siguiente espacio:

Dependiendo del tiempo disponible, puede hacer otros tipos de Ploteo.


Calcular:
Según ploteo de Michaelis Según ploteo de Lineweaver -
Burk
K m.

V max.

EXPERIMENTO 2.
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL
En este experimento se examinará el efecto de por lo menos cinco temperaturas sobre
la velocidad inicial. Se trabajará con las siguientes temperaturas:
Baño de hielo : 0A 4 °C Baño María : 50 °C
Agua T. Ambiente : 20 °C Baño hirviente : 92 - 96 °C
Baño María : 37°C
En cada temperatura usar un sistema igual al del experimento anterior. Proceder de la
misma forma. Hacer un blanco para cada temperatura; no obstante, si hay limitaciones en

109
el material es importante hacer solamente el blanco de las temperaturas de 50 °C y baño
hirviente.

Expresión de Resultados.

1. Complete la siguiente Tabla:


TUBO 1j 1 2 3 4 5 Blanco

O
o

o
O
Temperatura n 20 °C 37 °C 92 °C 37 °C
0

Absorbancia 0.188 0.391 0.693 0.285 0.154 0.100


Absorb. Neta
Velocidad Inicial
nmoles / minuto.
. . .. .............. .... ...........

Puede trabajar con estos datos o con los obtenidos en el experimento.

2. Utilizando papel milimetrado, haga la gráfica del ploteo velocidad inicial versus
temperatura y péguelo en el espacio siguiente:

3. Estimar lo siguiente:
Temperatura óptima de la ureasa : _____________ Q10 :

lio
EXPERIMENTO 3.
INFLUENCIA DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL.

Se examinará la velocidad inicial a diferentes pH. Se preparará diferentes sistemas o


tubos con diferentes pH, que pueden variar entre 6.2 y 8.2 . Se usarán las mismas
condiciones que en el experimento 2 de la práctica anterior, solamente que en cada pH se
deberá usar diferentes buffer fosfato. Se recomienda un blanco para cada pH; pero si esto
no es posible, usar blancos para los sistemas que crea conveniente.

Expresión de Resultados.
1. Calcular la velocidad inicial para cada pH y anotarla en la siguiente Tabla.

1 2 3 4 5 Blanco
pH 6.6 7.0 7.4 7.8 8.2 7.4
Absorbancia 0.410 0.590 0.785 0.398 0.256 0.126
Absorb. Neta
Vi (nmoles/min.)

2. Hacer un ploteo de velocidad inicial versus pH, utilizando el espacio siguiente.

111
Completar:
El pH óptimo de la ureasa es:

EXPERIMENTO 4.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA SOBRE LA VELOCIDAD


INICIAL.

En este experimento se examinará el efecto de por lo menos 4 concentraciones de


enzima. Para tal efecto se puede usar las siguientes concentraciones de enzima ( ureasa ):
5, 10, 15 y 20 juig / mi. Tener en cuenta que el volumen total de cada sistema es de 3 mi. ;
es decir, las mismas condiciones que en los experimentos anteriores, solamente que en
cada tubo hay diferente concentración de enzima.

Expresión de resultados.

2. Complete la tabla siguiente, anotando la velocidad inicial en nmoles/minuto que


corresponde a cada concentración de enzima.

TUBO Sol. de Sol. de Buffer


Urea 0.3 Ureasa (E ) Fosfato Absorb. Absorb. Vi
N° M 0.6 mg/ml. Hg/ml pH 7.4 (D.O) Neta nmoles/min
( mi.) (m i.) ( mi.)

1 0.4 0.100 20 2.500 0.490

2 0.4 0.075 15 2.525 0.400

3 0.4 0.050 10 2.550 0.304

4 0.4 0.025 5 2.575 0.220

Blanc 0.4 0.100 * — 2.500 0.110

* Agua destilada.

3. Usando papel milimetrado, haga el ploteo de la velocidad inicial ( Vi ) frente a la


concentración de la enzima ( E ) y péguelo en el espacio indicado abajo. Puede
trabajar con los datos señalados en la Tabla o con los obtenidos en su experimento.

112
INTERROGANTES.

1. Qué es la Km y que importancia y significado tiene? En que unidades se la expresa.

2. Qué es la velocidad máxima? En que unidades se le expresa.

3. Cómo se explica el efecto de la temperatura sobre la velocidad inicial de una enzima?


Qué es temperatura óptima?

4. Cómo se explica el efecto del pH sobre la velocidad inicial de una reacción


enzimática? Qué es pH óptimo?

113
5. Cómo explica el efecto de la concentración de las enzimas sobre la velocidad de
reacción que catalizan?

6 . Qué otros factores pueden influenciar sobre la velocidad de una reacción enzimática?

7. El pH y la Km puede ser afectados por la temperatura?

8. Si alcanzada la velocidad máxima, se aumentara más enzima qué ocurre?

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PRACTICAN0 13

VITAMINAS

RELACION DE EXPERIMENTOS.

1. Determinación cuantitativa de Vitamina C, en jugos de frutas cítricas.

OBJETIVOS.
1. Cuantificar el contenido de vitamina C en diferentes frutos
2. Interpretar el fundamento de la determinación de vitamina C.

INTRODUCCION.

Las vitaminas son compuestos orgánicos de estructura química diversa, que cumplen
destacada función en el mantenimiento de la salud y que al no poder ser sintetizadas por el
organismo, deben ser ingeridas necesariamente en la alimentación; no obstante sólo se
requiere de ellas, cantidades muy pequeñas.

Las vitaminas no tienen roles plásticos, ni energéticos y su mecanismo de acción es


básicamente regular el metabolismo directamente o a través de la constitución de
coenzimas y/o grupos prostéticos. No obstante, algunas vitaminas cumplen además roles
específicos.

El indicar la incapacidad de la síntesis de las vitaminas, por los animales superiores,


no es del todo cierto, ya que está demostrado que el ácido nicotínico ( niacina ) puede ser
sinteizado a partir del aminoácido triptófano. De otro lado, existen otras vitaminas (ácido
pantoténico, biotina) cuyas manifestaciones carenciales en el hombre, no han podido ser
detectadas adecuadamente.

EXPERIMENTO N° 1.

DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA VITAMINA C EN PLASMA


SANGUINEO O EN FRUTOS CITRICOS.

La vitamina C pura ( ácido L-Ascórbico ) es una sustancia blanca cristalina, de sabor


ácido, insoluble en la mayoría de solventes orgánicos; en el agua su solubilidad es de 1 g
en 3 mi. Tiene un fuerte poder reductor, que deriva de la facilidad con que puede perder los

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átomos de hidrógeno que constituyen los grupos hidroxilo unidos a los átomos de carbono
que conforman el doble enlace ( enediol).

C=0 C= 0
C-OH
o
-2H
> c =o O
II
C-OH +2H c =o
H-C H-C
HO-C-H HO-C-H

Su función mejor conocida corresponde a su participación en la producción de los


tejidos de origen mesenquimatoso, como el colágeno, dentina, etc., aunque su mecanismo
de acción aún no está aclarado; no obstante se piensa que la síntesis de hidroxiprolina está
perturbada cuando hay un déficit de vitamina C. También se ha postulado la participación
del ácido L-ascórbico en otras reacciones de hidroxilación, como la conversión del
triptófano en serotonina. También se ha reportado la intervención de la Vitamina C en la
absorción del Fe en el intestino de humanos.

Experimentalmente es factible producir escorbuto en el hombre, primates, y en el


cobayo. En cambio en otros animales resulta dificultoso en razón a la capacidad que tienen
éstos de poder sintetizar la vitamina. A las manifestaciones clínicas propias del escorbuto y
que se observan muy bien en cobayos, se suman otras alteraciones bioquímicas, como un
metabolismo anormal de la tirosina. En este sentido la administración de tirosina o
fenilalanina, determinan una considerable excreción urinaria de p-hidroxifenilpirúvico. Se
asume que la actividad de la p-hidroxifenilpirúvico hidroxilasa que cataliza la
transformación del p-hidroxifenilpirúvico en ácido homogentísico, está disminuida en
animales escorbúticos.

C1 C1
\
+ 2H

- 2H

La determinación de la vitamina C en líquidos biológicos ( suero o plasma sanguíneo,


jugos de frutas ) se funda en la reducción del 2 , 6 diclorofenolindofenol en presencia de

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ácido acético y ácido metafosfórico los que previenen la oxidación aeróbica de la vitamina
y además precipitan a las proteínas.

Procedimiento.

a) A 2 mi de plasma (o Jugo de frutas), añadir un volumen igual de solución acética-


metafosfórica (ácido acético al 8 % (p/v) y ácido metafosfórico al 2 % (p/v).
b) Titular con una solución 0.05 % 2, 6 diclorofenolindofenol, hasta una coloración
rosada débil y persistente durante 5 segundos.
c) Titular un blanco como control ( agua en lugar de m uestra).
d) Para efecto de los cálculos asuma que cada lm l de 2, 6 diclorofenolindofenol
equivale a 0.12 mg. de ácido L-ascórbico

Expresión de resultados.

En un cuadro anote la concentración de vitamina C en el plasma o las diferentes


soluciones problema (jugos) en mg %.

2, 6 diclorofenol indofenol mg. de Ac. Ascórbico /100 mi de


MUESTRA gastados (mi.) jugo
Naranja

Limón

Mandarina

INTERROGANTES.
1. Comente brevemente la síntesis de vitamina C en otros animales.

2. Cómo se explica que la vitamina C no sea tal para la rata?

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BIBLIOGRAFIA

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