BIOLOGIA MOLECULAR

Bases de datos biológicas, alineamiento y

análisis de secuencias
Objetivos
* Afianzar el uso de algunas bases de datos biológicas así como las generalidades y usos
básicos de la herramienta BLAST.

* Poner en práctica algunos usos del alineamiento de secuencias tanto de DNA como de
proteínas.

Ejercicio 1
Secuencia 1
TCATAGCTCCGATCCGTTCCGTTCAATCAATGTACCTGGCGGCCATTCGTTCAACGGACGTCCAACCGGG
AATATCACGACGAGTGGGTCCTCGGTGCGCGTGGAAGGGAGATCGGCGTTCACCTCTGCGATGCTCGACC
GCACTCGAACCCCCGTCAAAATGCTAGCCATACCGTTTTGGCAATATCTCTCAACGTGGTTCCGCATGGC
GTGCCGAACTGTCCCAAAGGCGAATGGGACACCAAGCTCCCGCAAAGTTGGAGTCAAAGCACCGACCGAG
TGAGCGATGCCCATTCGCTCCAGATCGGGCCGCACCGCGTATAAGCCCAGTTCAGCCACAAGGAGATCAG
TCTCACCAACCTTAATGAAACGGCGCAACACGCCCATGTGGCTTGCTATCCCGACCGAGTCGTAAGCAAT
TGCGCGGCGTTCCGGTCTCGCGCCGGCCCAACTGCGGCCACCCTCAAATGGTTTCGCGTGGAACGCTCCT
GTGGGCCCATAGGATTTTCGAAAAAATTCTGAGAGCTCCTGGTGGTCTGCACGTTCCAGCTGATTTTCCC
AGCATAGCTTCCACTGCACTTTTAAGGACAT

a) Antes de comenzar con el diseño de primers, usaremos la secuencia 1 para practicar el uso de bases de
datos biológicas y de herramientas básicas para el alineamiento local de secuencias usando la
herramienta BLAST.
Para ello usaremos BLAST (por ejemplo a través del sitio web del ncbi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para
indagar los siguiente:
• A qué corresponde esta secuencia ? cual es el número de acceso en el GenBank

• De qué organismo proviene?

• Cuál es la correspondiente proteína codificada?

• Tiene el gen intrones

• Qué funciones cumple la proteína codificada?

b) Ahora si, los primers, use la secuencia 1 para diseñar una pareja de primers. Sugerencias de programas:
primer 3 http://bioinfo.ut.ee/primer3// , primer3plus ( http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/
primer3plus.cgi/ ), primerlbast en ncbi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Considere
productos de tamaño entre 200 y 1000 pb, una Tm alrededor de 60 oC y un contenido de CG alrededor de
50%.
c) Ahora vamos a probar la especificidad de los primers diseñados haciendo un PCR in silico.
Los siguientes corresponden a links de algunos sitios donde se puede hacer esto:
• Este link direcciona a genoma humano pero se puede cambiar el organismo en la respectiva casilla
http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgPcr?
wp_target=&db=hg38&org=Human&wp_f=&wp_r=&wp_size=4000&wp_perfect=15&wp_good=15&wp_s
howPage=true&hgsid=1296417_xi1Aj37ZhKfAWMEXzzF9huAsMrmJ

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• Para bacterias y virus http://insilico.ehu.es/PCR/

• Para RFLP http://insilico.ehu.eus/T-RFLP/info.html

• Chequee si los primers pueden amplificar todas las especies de sinorhizobium

• Especifique cual ha de ser el tamaño máximo de los productos

• Interprete el resultado

• Baje la secuencia de de los amplicones en formato fasta y verifique si la secuencia de los amplicones
es la misma
d) Otra manera de probar la especificidad de sus primer es haciendo un alineamiento entre sus secuencias
y una base de datos de DNA. Para ello haga un BLAST usando la secuencia de sus primers y una base de
datos nr (no redundante) de DNA. Pueden usar por ejemplo el servidor del ncbi o de expasy, solo no olviden
al momento de elegir la opción de BLAST a utilizar, usar BLASTN que indica alineamiento de nucleótidos.
Con base en los resultados deben contestar las siguientes preguntas:
• Qué rango de valores E y score encontró (solo los primero resultadso) . Qué indica el valor de E?

• Para cada secuencia de primer, se encontró la secuencia que esperaba? hubo otras secuencias no
esperadas?
• Concluya si sus primers se pueden considerar específicos desde este punto de vista.

Ejercicio 2
La secuencia con el número de acceso FJ236988.1 corresponde a un gen eucariote.
• A qué gen corresponde ese número de acceso, de qué organismo es dicho gen?

• A qué base de datos corresponde ese número de acceso?

• Qué significa el .1 que aparece en el número de acceso al final del mismo?

Ahora, usando primer3 o primer3plus diseñe una pareja de primers para amplificar solo la región codificante
de ese gen (es decir, solo los exones). También diseñe otra pareja para amplificar solo la región 5’ UTR del
gen.
• Haga el análisis de especificidad referido en el punto anterior.

• Qué utilidad puede tener el amplificar estas regiones (la codificante y la 5’ UTR)?

Ejercicio 3

Actualmente la compañía Monsanto posee la patente del glifosato, el cual es comercializado como
Roundup® . Este sigue siendo uno de los herbicidas más utilizados por su amplio espectro de
acción.
La cuestion es que Monsanto también posee la patente del gen que confiere resistencia al
glifosato y que la misma compañía ha utilizado para transformar plantas como el maíz o la soya y
así hacerlas ''Round-up Ready” o resistentes a glifosato.
Muchos investigadores están tratando de encontrar nuevos genes que confieran resistencia al
glifosato tanto por razones evolutivas como económicas. Hace ya algunos años (2005), un grupo
Chino encontró una bacteria Pseudomonas putida cepa 4G-1, que es naturalmente resistente a
glifosato. Ellos clonaron el nuevo gen aroA, el cual posee diferencias en secuencia con respecto
al anterior gen AroA.

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El gen AroA codifica para la enzima 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, la cual juega

un papel clave en la biosíntesis de amino ácidos aromáticos. La resistencia surge por un mutación
que hace que el glifosato no se pueda unir a la proteína.
Ustedes han sido contratado para selecccionar cepas de Pseudomonas putida que contengan el
nuevo gen aroA (GenBank AJ812018.1) con la intención de generar un nuevo cultivar resistente al
glifosato. Para lo anterior, ustedes deben:

1. Establecer dónde comienza la región codificante del gen aro A (GenBank AJ812018.1) y cuál
es la región 5’ UTR para este gen. Pueden mostrar sus resultados sobre la secuencia del gen
o pueden hacer un esquema donde muestren las posiciones de cada región.
2. Acerca de la región 5’ UTR del gen: Qué función cumple esta región? (enfóquese solo en el
tipo de organismo que estamos trabajando aquí para la respuesta). Ubique los elementos
reguladores que usted espera encontrar en esta región.
3. Diseñen una pareja de primers que amplifiquen la región del gen que uds consideren
importante para 1) verificar la presencia del gen en la bacteria y posteriormente en las plantas
que se transfecten usando esta bacteria 2) Amplificar alguna región del gen que corresponda
a una región de la proteína codificada que sea diferente de la proteína codificada por el gen
AroA (el original). Para cada primer diseñado:
1. determine si cumple con los parámetros básicos. Tenga en cuenta el Tm, longitud, y
posibilidad de estructuras secundarias o dímeros de primer y use esta información para
decidir si usar o no estos primers en un PCR.
2. Determine la especificidad de su pareja de primers para el gen aroA. Analice los resultados
los 5 primeros hits de cada primer. Examine si en los resultados se encuentra la secuencia
de la cual usted partió.

4. Compare la secuencia de los genes AroA y aroA así como de las respectivas proteínas
codificadas. Para ello haga un alineamiento pairwise entre las respectivas secuencias. Analice
los resultados y con base en ellos explique porque aroA puede ser un gen de resistencia a
glifosato.

5. Más recientemente (2016) Yi y colaboradores aislaron un nuevo gen aroA naturalmente

presente en una cepa de Janibacter sp. aislada de un sedimento marino que le confiere
resistencia a glifosato a la bacteria. Aunque la secuencia en concreto no fue publicada, si se
reporta que la proteína codificada tiene 67% de identidad de amino ácidos con una enzima
aroA de Janibacter sp HTCC2649 (GenBank: EAP99947.1). Con esta información ustedes
deben:
1. Analizar la secuencia de la proteína codificada por este gen (calcular (o indicar el
reportado si ya lo hay) el peso molecular y punto isoeléctrico, ubicar los dominios y
relacionarlos con la función de la proteína) y compararla con la de la proteína de
Pseudomonas.
2. Ya que ambas proteínas son codificadas por genes aroA, haga un alineamiento (pairwise)
con las dos secuencias y analice los resultados (que tanto se parecen? tienen los mismos
dominios? pertenecen a la misma familia? ….). Para este análisis es recomendable hacer
una revisión en la literatura sobre estas proteínas en general.

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