Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
MICROBIOLOGÍA
1. INTRODUCCIÓN
En una pequeña porción de muestra de agua, suelo, alimento, etc; se puede encontrar una significativa cantidad
de microorganismos, es importante para el microbiólogo tener una idea clara de cada una de las técnicas que
debe desarrollar.
2. OBJETIVOS
3. FUNDAMENTOS
Para la determinación del Número de microorganismos se pueden utilizar métodos directos e indirectos:
Metodos directos:
Recuento total en cámara de New Bauer
Métodos indirectos:
Recuento en placa
Se basan en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada
una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente a una colonia de
forma que el número de éstas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra
plaqueada (sembrada). El sistema es fácil de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve para
hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un
volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen
dado de muestra con el medio de cultivo antes que se solidifique). Esta última opción permite realizar
el recuento de microorganismos microaerófilos (que no crecen bien en la superficie de las placas de
cultivo). Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contra
entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida.
4. MATERIALES
5. PROCEDIMIENTO
El enfoque del microscopio se empieza con el objetivo de menor aumento (10x), ubicándose en el centro de la
cámara, posteriormente, sin desenfocar se pasa al objetivo de 40X.
Se hace el recuento en el cuadrante central, éste tiene 25 cuadros, de éstos se seleccionan 5, los cuatro de las
esquinas y el del centro.
En condiciones asépticas:
Agitar vigorosamente el tubo de ensayo con el crecimiento de E. coli, para homogeneizar.
Pipetear 1 ml de la muestra y verterlo en el primer tubo con 9 ml de agua de dilución esteril, quedando
entonces una dilución de 10 -1.
Agitar la dilución anterior y con pipeta estéril, tomar 1 ml de ésta dilución y agregarla en el segundo tubo,
quedando una dilución 10-2.
Agitar la dilución anterior y con pipeta estéril tomar 1 ml de ésta dilución y agregarla en el tercer tubo,
quedando en éste tubo una dilución 10 -3.
Agitar la dilución anterior y con pipeta estéril tomar 1 ml de ésta dilución y agregarla en el cuarto tubo,
quedando en éste tubo una dilución 10 -4.
Marcar 4 cajas de petri 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4, verter en cada caja de petri 1 ml de su respectiva dilución,
distribuyéndolo bien en el fondo de la caja de Petri vacía.
Antes de que pasen 10 minutos, agregar a cada caja de Petri el medio de cultivo contenido en un tubo, a
temperatura máxima de 47°C (todavía líquido). Una temperatura mayor puede causar la muerte total o
parcial de los microorganismos.
Antes de que el medio de cultivo solidifique homogeneizar cada caja mediante movimientos de traslación
y rotación en una superficie plana, durante aproximadamente 1 minuto, evitando que se mojen la tapa y
los costados de la caja. De ésta manera la muestra y el agar son mezclados íntimamente.
Dejar reposar las cajas el tiempo necesario para que se solidifique el agar.
Una vez solidificado el agar en las cajas, incubar en posición invertida con el objeto de que el agua de
condensación del agar no caiga sobre la superficie del cultivo.
Incubar a 37 °C durante 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubación contar las colonias que se han desarrollado en cada una de las
placas.
Una vez el recuento de las cajas correspondientes, los resultados obtenidos se elaboran de la siguiente manera:
Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 1 ml, la expresión por resultado es directa.
Si la cantidad de aguasembrada ha sido de 1 ml, el número de colonias contadas habrá de dividirse por
el volumen de muestra sembrada, es decirpor 0,1 ml para obtener el número de colonias por mililitro.
En general se tiene:
UFC/ml = Número de colonias en volumen de muestra sembrada en ml.
Si no se observan colonias en ninguna de las cajas sembradas, el resultado no será de 0 UFC/ml, sino
que será referido al menor grado de dilución sembrado.
6. CUESTIONARIO
Realizar una comparación de las ventajas y desventajas de los métodos usados.
Que otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los recuentos.
¿Cuál es la composición del medio de cultivo usado en la caja de petri?
Explicar con un ejemplo la investigación de otro tipo de microorganismos utilizando éstas mismas
técnicas.
Teniendo en cuenta el campo de acción profesional, que tipo de muestra se utilizaría para estudio y
como se prepararía ésta para hacer la dilución?