Pseudomona putida

 Medios de cultivo, técnicas de aislamiento y siembra

 Los medios de cultivo

Medios de cultivo a utilizar incluyendo la composición y el tipo de medio de acuerdo a la clasificación por NOM, así
como el procedimiento para su preparación

Los medios de cultivo a utilizar durante el proceso de aislamiento de la Pseudomona putida se muestran a
continuación. Se incluye una breve descripción de su preparación y clasificación acorde a la Norma Oficial Mexicana
NOM-065-SSA1-1993, QUE ESTABLECE LAS ESPECIFICACIONES SANITARIAS DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO. GENERALIDADES.

Nombre: Medio OF con glucosa (oxidación fermentación de Hugh y Leifson)

Clasificación: Medio semisólido selectivo de enriquecimiento

Ingredientes Cantidades

Peptona 2g

Extracto de levadura 0,5 g

Cloruro de sodio 20 g

Dextrosa 10 g

Púrpura de bromocresol 0,015 g

Agar 3g

Agua destilada 1 000 ml

Preparación del medio de cultivo: Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2.
Coloque en tubos y esterilice en autoclave 20 minutos a 121ºC.

Nombre: Medio basal

Clasificación: Medio sólido selectivo

Ingredientes Cantidades

-Agua destilada 1L
-Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 0.4 g
-Fosfato de potasio dibásico K2HPO4 1.6 g
-Cloruro de amonio NH4Cl 1.5 g
-Cloruro de magnesio MgCl2 6H2O 0.17 g
sextahidratado
-Sulfato de sodio heptahidra tado NaSO4 7H2O 1.5 g
-Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 0.045 g
-Solución mineral* 1.0 ml
Preparación del medio de cultivo: Disolver los componentes en 0.5L de agua destilada. Esterilizar en autoclave a
121°C y 1atm de presión por 20 minutos

*La solución mineral se agrega después de esterilizar

Nombre: Agar noble (Difco o similar)

Clasificación: Medio sólido selectivo

Preparación del medio de cultivo: Pesar 1,2 gr. de Agar Noble (Difco o similar) y disolver en 100 mL de SST 0,1 M,
pH 7,4 adicionada de un conservador (10 mg de merthiolate).

 Aislamiento
Una vez que se tenga la muestra de suelo procedente de los alrededores de plantas petroquímicas o industrias
textiles, se pesaran 10 g de suelo.
El método para el aislamiento y cuenta de las bacterias hidrocarbonoclastas del suelo es por la técnica de
cuenta por dilución y vaciado en placa utilizando un medio mineral basal, este se debe disolver en agar noble
para obtener un medio de cultivo sólido y que así contenga petróleo crudo o un hidrocarburo específico de
interés, como única fuente de carbono y energía. El petróleo ligero que se impregna en un papel filtro permite
que las bacterias hidrocarbonoclastas se alimenten de los hidrocarburos volátiles, o la adición de un
hidrocarburo en solución asperjando la superficie de la caja ya inoculada.

Existen ciertas limitaciones, que son las siguientes:

El agar noble para preparar el medio de cultivo sólido debe ser un agar puro, libre de cualquier contaminante;
de lo contrario puede haber crecimiento de bacterias por las impurezas que pueda contener, permitiendo el
crecimiento de bacterias no hidrocarbonoclastas. Se recomienda inocular cajas de medio mineral sin
hidrocarburo para tener un control negativo y asegurar la pureza del agar.

El petróleo crudo o hidrocarburo utilizado para este método debe ser ligero (volátil), ya que el acceso de esta
fuente de carbono y energía es a través de los vapores que se generan de ella.
 Protocolo de diluciones y técnicas de siembra.

1) En condiciones estériles, adicionar 1 g del suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca con
99 ml de solución salina isotónica estéril (dilución 10^-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con agitación
vigorosa.
2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril (dilución 10^-3). De ahí se hacen
diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta 10^-10 o las adecuadas, asegurándose de
utilizar una punta o pipeta estéril diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vórtex en cada paso.
3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la superficie del medio de cultivo
seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por triplicado y con tres diluciones próximas (Ej. 10^-3, 10^-
4 y 10^-5) para asegurar la cuenta.
4) Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio previamente esterilizada (inmersa
en alcohol y pasándola por la flama del mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribución
homogénea por toda la superficie del medio.
5) Incubar las placas de forma invertida a 30ºC en ausencia de luz.
6) Después de un periodo de incubación, contar el número de colonias y reportar como unidades formadoras
de colonias (UFC)/ g de suelo seco.
 Procedimiento

Se debe preparar previamente a todo el procedimiento una solución mineral en el orden que indica la
siguiente tabla

Una vez que se tenga la solución se puede proseguir con el siguiente procedimiento

1) Preparar el medio de cultivo con los componentes del medio basal disolviéndolos en el orden señalado por su
composición en un litro de agua destilada.
2) Ajustar el pH a 7.0, después adicionar 15 g de agar puro (agar noble).
3) Esterilizar a 1.05 atm, 121°C y durante 15 min. Dejar enfriar, cuando el medio se encuentre a 50°C
aproximadamente, añadir la solución mineral estéril previamente preparada (1 ml por L de medio)
4) Vaciar el medio en cajas de Petri en condiciones estériles, esperar a que gelifique.
5) En un disco de papel filtro estéril impregnar el petróleo crudo ligero estéril y colocarlo en la parte interna de la tapa
de la caja de Petri. El hidrocarburo que se volatiliza servirá como fuente de carbono y energía.
6) Preparar la muestra de suelo y diluciones e inocular cada caja como se indica en la sección de protocolo de
diluciones y tecnicas de siembra.
7) Después de cinco días de incubación, proceder al conteo de colonias. Las colonias que se deberán contar son las
que hayan formado un anillo y un sedimento de color verde azulado.
8) Para el cálculo final de unidades formadoras de colonias (UFC) se debe considerar la dilución con que se inoculó la
caja, la cantidad de inóculo (0.1 ml) y la humedad de la muestra.

Cálculos

1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.

2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s. UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).

Donde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC = número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó
la muestra con la que se inocula la caja (10^-2 a 10^-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra húmeda = 1 g.
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100))