1.

Introdução

Enzimas são catalisadores biológicos de natureza proteica com alta

especificidade e que aumentam a velocidade de reações químicas, por diminuição da
energia de ativação requerida. [1]

Sua história vem desde o século XIX com a descoberta do poder catalítico do
suco gástrico sobre as proteínas e da saliva sobre o amido. Em 1850 Louis Pasteur,
postulou que as reações fermentativas do levedo, convertendo açúcar em álcool, eram
devidas a substâncias existentes dentro do levedo, as quais foram posteriormente
denominadas de enzimas (derivado do latim en = dentro + zima = levedo). [1] [3]

A função metabólica das enzimas exerce influência específica sobre certas

interações bioquímicas, usualmente em ambientes muito complexos - como no interior
de células - e incluem transformações oxidativas e conjugativas que ocorrem em altas
velocidades catalíticas. [2]

A especificidade enzimática baseia-se nas interações entre a molécula do

substrato e o sítio ativo da enzima. Essa região corresponde geralmente, a um entalhe na
estrutura da molécula enzimática formado por uma seqüência de aminoácidos que
garante a forma de uma cavidade (Figura1). Os demais aminoácidos da enzima são
responsáveis por manter a forma deste sítio ativo. No substrato, há sempre um
grupamento que favorece uma ligação suscetível com o sítio catalítico da enzima. [1] [2]

Figura 01: Ligação entre a enzima e o substrato:

Em “A” ocorre o encaixe no sítio catalítico da enzima. Em “B” há a formação do complexo

enzima-substrato. O substrato é convertido em produto em “C”. Em “D” o produto é liberado e a enzima
regenerada.

Na bioquímica o ramo que estuda a ação e influência das enzimas nas reações
químicas é conhecido como Cinética Enzimática. O estudo cinético de uma enzima
propõe sua caracterização: quais substratos ela pode catalisar, e como se comportam
quando há variações do meio (valor de pH, temperatura, tempo de incubação, as
concentrações dos substratos), por exemplo [4]
 Devido a seu caráter proteico, as enzimas possuem um valor ótimo de pH (4,5-
8,0) Figura02 e temperatura (30ºC-40ºC) Figura 03 onde sua atuação é máxima. Valores
acima desse intervalo ocasionam uma possível desnaturação. [4]

Figura 02: Influência do pH. Figura 02: Influência da temperatura.

Em 1913, os cientistas Leonor Michaelis e Maud Leonora Menten,

desenvolveram estudos considerando as principais propriedades enzimáticas e aplicando
as teorias conhecidas de Cinética Química para um modelo simplificado, que envolvia a
enzima livre (E), o substrato (S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P).
Esse modelo pode ser expresso pela equação química: [3]

A partir dessas considerações, Michaelis e Menten desenvolveram a expressão

de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente, onde V é função de [S] e
Vmax e Km são constantes:

A curva da velocidade inicial da reação em função da concentração de substrato

para uma enzima que segue o modelo proposto por Michaelis e Menten obedece à
expressão de velocidade apresentada acima Figura 04.
 Figura 04: Efeito da concentração do substrato sobre a velocidade da reação.

Através da curva é possível identificar o efeito de saturação do substrato, onde o

sistema tende a adquirir velocidade máxima (Vmáx), que é função da concentração
inicial da enzima livre (E). Também é possível definir um valor de (S) para metade de
Vmáx, que é numericamente igual ao Km.

O método mais eficaz para determinação gráfica dessas grandezas num

experimento de Cinética Enzimática é através do gráfico de duplo-recíproco ou de
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Lineweaver-Burk que considera 𝑉 em função de 𝑆.

A enzima utilizada no experimento em questão foi a β-frutofuranosidase, mais

conhecida como invertase, que é uma enzima termoestável classificada na família
GH32, como um glicosídeo hidrolase, classificação essa que possui mais de 370
membros. A invertase formada através da Saccharomyces cerevisiae e é responsável por
promover a formação do produto de hidrólise da sacarose, o xarope de glicose-frutose
também conhecido como “açúcar invertido” Figura 05. Este possui algumas
particularidades importantes em relação ao xarope de sacarose, como maior vigor
edulcorante. [4]

Figura 05: Hidrólise da sacarose pela invertase.

Através da quantificação dos açucares redutores formados (glicose e frutose), é possível

determinar a velocidade da reação por meio do método colorimétrico utilizando o ácido
3,5-dinitrosalicílico (DNS) como agente oxidante. Esses açucares reduzem o DNS a 3-
amino-5nitrosalicílico resultando em um complexo de coloração acastanhada, conforme
reação descrita na figura 06, cujo produto pode ser acompanhado a 540nm. [5]

Figura 06: Oxidação do Açúcar reduzido.

O objetivo da prática foi a produção da enzima invertase de Saccharomyces

cerevisiae, a partir de diferentes fontes de carbono.

2. Materiais e Reagentes

3. Procedimento

4. Resultados e Discussão

A leitura da Transmitância no espectrofotômetro, utilizando comprimento de

onda λ= 540nm, está descrita na Tabela 01.

Tabela 01: Leitura da Absorbância e Transmitância de cada Grupo.

Fonte de carbono Transmitância Absorbancia

Grupo 1 Melaço 30,0 0,523
Grupo 2 Melaço 32,7 0,486
Grupo 3 (Puro) Amido 54,5 0,264
Grupo 3 (com enzima) Amido 10,8 0,964
Grupo 3 (replicata) Amido 5,0 1,300
Grupo 5 Sacarose 26,4 0,580
Grupo 6 Sacarose 25,2 0,598

Pela lei Lambert-Beer, a absorbância em função da concentração deve ser uma

linha reta, logo existe uma relação entre a lei e a equação da reta. Tal equação é obtida
através da reta de calibração de DNS para o açúcar invertido e já foi fornecida junto
com o reagente: 𝒚 = 𝟎, 𝟐𝟒𝟓𝒙 − 𝟎, 𝟎𝟏𝟗. Considerando y = Absorbância, foi possível
calcular a concentração (x) de açúcar invertido (Glicose + Frutose) na solução. Com
 esses valores da concentração foi possível calcular o nº de mols na solução, através da
equação abaixo:

𝑛𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. = 𝑐𝑎ç.𝑖𝑛𝑣. (𝑀) × 𝑉𝑠𝑜𝑙. (𝐿)

Os resultados foram plotados na Tabela 02.

Tabela 02: Concentração de açúcar invertido e nº de mols na solução de cada Grupo.

Volume da solução Concentração de açúcar Nº de mols

incubada (𝑽𝒔𝒐𝒍. ) invertido (𝒄𝒂ç.𝒊𝒏𝒗.)
Grupo 1 10,0 ml 2,212 M 0,022 mol
Grupo 2 10,0 ml 2,061 M 0,021 mol
Grupo 3 (Puro) 10,0 ml 1,155 M 0,012 mol
Grupo 3 (com enzima) 10,0 ml 4,012 M 0,040 mol
Grupo 3 (replicata) 10,0 ml 5,384 M 0,054 mol
Grupo 5 10,0 ml 2,445 M 0,024 mol
Grupo 6 10,0 ml 2,518 M 0,025 mol

A partir desses resultados, foi calculada a Atividade Enzimática utilizando a equação

abaixo, e os resultados foram plotados na Tabela 03.

𝑛𝑎ç𝑢𝑐.𝑖𝑛𝑣. (𝜇𝑚𝑜𝑙)
𝑣=
∆𝑡(𝑚𝑖𝑛. ) × 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎(𝑚𝐿)

Tabela 03: Atividade Enzimática

Fonte de carbono Atividade Tempo de

Enzimática (𝒗) incubação (∆𝒕)
Grupo 1 Melaço 220 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1 10,0 min
−1 −1
Grupo 2 Melaço 210 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛 . 𝑚𝐿 10,0 min
Grupo 3 (Puro) Amido 120 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1 10,0 min
−1 −1
Grupo 3 (com enzima) Amido 400 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛 . 𝑚𝐿 10,0 min
Grupo 3 (replicata) Amido 540 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1 10,0 min
−1 −1
Grupo 5 Sacarose 240 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛 . 𝑚𝐿 10,0 min
Grupo 6 Sacarose 250 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 . 𝑚𝐿−1 10,0 min
 Referências:

[1] Fonte:

[2] Fonte: CARDOSO, C.L ET AL. Imobilização De Enzimas Em Suportes

Cromatográficos: Uma Ferramenta Na Busca Por Substâncias Bioativas. Quim. Nova,
Vol. 32, No. 1, 175-187 p, 2009. Acesso: 24/10/2018 às 21:45h.

[4] Fonte: NOVAKI, L. et al. Produção De Invertase Por Fermentação Em Estado

Sólido A Partir De Farelo De Soja. ENGEVISTA, V. 12, n. 2. p. 131-140, dezembro
2010. Acesso: 26/10/18 às 22:00 h.