|NDRUMAR

DE TEHNICI DE LABORATOR
DE BACTERIOLOGIE BK
Cuprins

3
4
 Capitolul I
RECOLTAREA, TRANSPORTUL {I CONSERVAREA
PRODUSELOR BIOLOGICE 1
Investiga]ia bacteriologic` are o pozi]ie central` atât \n diagnosticul [i
monitorizarea cazurilor de tuberculoz`, cåt [i \n evaluarea PNCT, de aceea toate
etapele acesteia - de la preg`tirea pacientului [i recoltarea produsului patologic pån`
la citirea [i interpretarea rezultatelor - trebuie tratate cu deosebit` aten]ie.

A. RECOLTAREA
A.1. ASPECTE GENERALE
Calitatea produselor patologice este esen]ial` pentru ob]inerea unor rezultate de
\ncredere. |n acest sens trebuie s` se ]in` seama de urm`toarele:
1. Recoltarea [i manipularea produselor patologice se fac astfel \ncåt:
- s` se evite contaminarea cu bacterii [i fungi a produsului patologic;
- s` se evite diseminarea germenilor \n mediul ambiant;
- s` se evite infectarea personalului medical implicat.
2. Recoltarea [i manipularea produselor patologice se face sub supravegherea
unui cadru medical (instruit privind reducerea riscului de contaminare a produselor)
care trebuie s` se asigure c` s-a recoltat un produs provenit din focarul lezional, \n
cantitate suficient` pentru prelucrare \n laborator.
3. Respectarea NORMELOR GENERALE DE RECOLTARE [i anume:
b |n cazul persoanelor suspecte de tuberculoz`, produsele se recolteaz` \nainte
de \nceperea tratamentului antituberculos. Chiar [i cåteva zile de tratament pot
compromite eviden]ierea BAAR!
b |n cazul bolnavilor afla]i sub tratament se recolteaz` numai dup` \ntreruperea
tratamentului timp de 3 zile.
b Repetarea examenului bacteriologic \n zile succesive (la suspec]ii de
tuberculoz` pulmonar` se pot recolta pån` la 9 spute, \n cazul \n care primele
examin`ri au fost negative iar suspiciunea de tuberculoz` se men]ine).
b Caracteristicile RECIPIENTELOR pentru recoltarea sputei:
o confec]ionate din material plastic, incasabil, transparent - pentru a observa
cantitatea [i calitatea produsului patologic f`r` a deschide recipientul;
o cu deschidere larg` (minim 35 mm diametru) - pentru evitarea
contamin`rii pere]ilor exteriori ai recipientului;
o capacitate de 30-50 ml pentru sput`, adaptat` pentru fiecare tip de produs
patologic;

5
 o cu capac cu filet care \nchide etan[ recipientul;
o cu posibilitatea de a fi marcate cu u[urin]`.
b Produsele patologice se trimit c`tre laborator \nso]ite de formulare de
solicitare (\n conformitate cu cele stabilite de c`tre PNCT), cu date de
identificare identice pe recipient [i pe formular.
b Transportul probelor c`tre laborator trebuie realizat imediat dup` recoltare
sau, dac` nu este posibil, acestea se p`streaz` la frigider (4ºC), maxim 3-5 zile
(pentru a minimaliza multiplicarea florei de asocia]ie).

FACTORII care pot influen]a viabilitatea micobacteriilor trebuie cunoscu]i

pentru a fi evita]i:
- Administrarea de antibiotice cu efect antituberculos:
- Rifampicin`, Streptomicin`;
- Kanamicin`, Amikacin`;
- Ciprofloxacin`, Ofloxacin`;
- Claritromicin`, Amoxicilin` + Acid clavulanic.
- Conservarea \n formol sau recoltarea pe EDTA;
- Contactul prelungit cu sucul gastric (peste 3-4 ore);
- P`strarea probelor la c`ldur` sau lumin`;
- |ntårzierea prelucr`rii produselor patologice (peste 4 zile);
- Congelarea prelevatelor.

A.2. CONDI}II SPECIALE DE RECOLTARE [I P~STRARE a diferitelor tipuri de

produse patologice
1. PRODUSE PATOLOGICE PENTRU DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI PULMONARE
SPUTA
- Este produsul patologic de elec]ie \n investigarea tuberculozei pulmonare
(dac` este suspectat` o tuberculoz` extrapulmonar`, sputa trebuie recoltat` \n
completarea examenului produsului patologic extrapulmonar la pacien]ii cu simptome
respiratorii concomitente);
- Spa]iul de recoltare trebuie s` fie amenajat special (camere sau boxe de
recoltare), bine ventilat (fereastr` sau exhaustor), prev`zut cu l`mpi de ultraviolete [i
dotat cu grup de aerosoli. Existen]a acestui spa]iu este obligatorie atåt \n ambulatoriu
cåt [i \n unit`]ile cu paturi. |n locurile \n care nu exist` posibilitatea amenaj`rii unor
camere de recoltare corespunz`toare criteriilor de mai sus, este de preferat recoltarea
\n aer liber;
- Este ideal` recoltarea matinal`, \nainte de mas` sau administrare de
medicamente; aceasta d` cea mai \nalt` rat` de pozitivitate \n diagnosticul
tuberculozei pulmonare, chiar [i la pacien]ii care tu[esc [i expectoreaz` pu]in;
- {ansa eviden]ierii BAAR cre[te dac` se examineaz` 2-3 e[antioane de sputa
recoltate in interval de 24-48 de ore;

6
 - Un produs patologic corespunz`tor const` dintr-un material recent eliminat
din arborele bron[ic, cu cantit`]i minime de secre]ii orale sau nazale. O calitate
satisf`c`toare implic` prezen]a unui material mucopurulent sau mucoid \n cantitate de
minim 1-3 ml.
- Transportul c`tre laborator trebuie s` se fac` imediat dup` recoltare.
ATEN}IE! Sputa sub]ire, clar` sau secre]iile nazo-faringiene au o valoare
diagnostic` redus`. Asemenea produse NU se prelucreaz` decåt \n situa]ii speciale, la
cererea expres` a clinicianului, cånd exist` suspiciune mare pentru tuberculoz` sau
1
cånd pacientul nu poate expectora.

Procedura corect` de recoltare a sputei:

b Se explic` pacientului motivul recolt`rii sputei;
b Pacientul este rugat s`-[i cl`teasc` gura cu ap` \nainte de a expectora (aceasta
ajut` la \ndep`rtarea resturilor de måncare sau a bacteriilor contaminante);
b Pacientul este rugat s` inspire adånc de 2 ori, s`-[i ]in` respira]ia cåteva
secunde dup` fiecare inspir [i apoi s` expire lent. Dup` al treilea inspir va expira
\n for]` [i va \ncerca s` tu[easc` (aceast` manevr` are ca rezultat un produs
patologic din profunzimea pl`månilor). Bolnavul poate acum s` expectoreze,
colectånd cu grij` sputa \n recipientul special;
b Dac` sputa este insuficient` cantitativ, pacientul trebuie \ncurajat s`
expectoreze din nou pån` la ob]inerea rezultatului dorit (la unii pacien]i este
nevoie de timp mai \ndelungat pentru aceast` manevr`!);
b Chiar dac` NU ob]ine]i nici o expectora]ie, considera]i recipientul de[eu
infec]ios!
b Dac` a]i recoltat corect, asigura]i-v` c` recipientul este bine \nchis [i eticheta]i-l
corect (pe corpul recipientului [i nu pe capac), cu datele complete ale pacientului!;
b La sfår[itul opera]iunii sp`la]i-v` måinile cu ap` [i s`pun;
b Ve]i da un alt recipient pacientului [i v` ve]i asigura c` acesta a \n]eles c` a doua
zi va trebui s` \[i recolteze singur \nc` o sput`, imediat dup` trezirea de diminea]`;
b Se arat` pacientului cum se \nchide etan[ recipientul;
b Se instruie[te pacientul pentru aducerea probei cåt mai repede cu putin]` la
laborator.

Variante de recoltare acceptate:

- sputa matinal`, \n primele 1-2 ore de la trezire - procedeu de elec]ie \n
sta]ionare sau la domiciliul bolnavului (recoltare supravegheata de personalul
medical);
- sputa colectat` \n interval de 12-24 de ore;
- sputa expectorat` pe loc cu ocazia consultului medical.
Cele 3 e[antioane de sput` necesare la momentul 0 pot fi recoltate \n una dintre
variantele urm`toare:
- 3 spute matinale \n 3 zile succesive;
- 2 spute matinale recoltate sub supraveghere medical` \n zile succesive + 1

7
 sput` colectat` \n 12-24 de ore;
- 2 spute recoltate pe loc (la 1-2 ore interval una de alta) + 1 sput` colectat` \n
12-24 de ore;
- 3 spute \n aceea[i zi la interval de 3-4 ore

Metode speciale de prelevare

Se folosesc \n cazul \n care pacientul nu expectoreaz`, dar este suspect de
tuberculoz` pulmonar` activ`.

1. SPUTA INDUS~
Inhalarea de aerosoli calzi salini-hipertoni (solu]ie de NaCl 5-10%) irit` c`ile
respiratorii suficient de mult \ncåt s` produc` tuse [i expectora]ia unui produs apos
din profunzimea arborelui bron[ic.
ATEN}IE! Produsul patologic astfel recoltat se aseam`n` macroscopic cu saliva
[i prin urmare trebuie specificat pe eticheta produsului care a fost modalitatea de
recoltare pentru a nu fi refuzat de c`tre laborator ca „necorespunz`tor”!
Tehnica este urm`toarea:
- se face o prim` [edin]` de aerosoli timp de 10 minute;
- dac` \n acest interval tusea nu apare, se va recomanda bolnavului s` fac`
eforturi de tuse voluntar` pe o perioad` de \nc` 10 minute;
- \n caz de insucces, se reia aerosolizarea \nc` 10-20 minute;
- e[ecul indic` recurgerea la un alt procedeu.

2. LAVAJUL LARINGO-TRAHEAL (SP~L~TURA BRON{IC~),

LAVAJUL BRONHO-ALVEOLAR, ASPIRATUL BRON{IC au avantajul c` \n
afar` de produsul patologic primar este indus` eliminarea sputei \n intervalul de timp
urm`tor.
Tehnica pentru LAVAJUL LARINGO-TRAHEAL (sp`l`tura bron[ic`):
- se indic` pacientului s` fac` gargar` cu xilin` 1%, repetat` de 2 ori;
- se introduc \n laringe, cu o sering` cu canul` curb` [i sub controlul oglinzii
laringiene, 5-10 ml ser fiziologic steril;
- tusea productiv` apare fie \n cursul manevrei fie dup` dispari]ia anesteziei; se
recolteaz` sputa [i se controleaz` volumul [i calitatea ei (sa aib` un aspect
grunjos, tulbure);
- se va continua recoltarea sputei eliminate spontan \n urm`toarele 24-48 ore.
ASPIRATUL BRON{IC precum [i LAVAJUL BRONHO-ALVEOLAR se pot
efectua numai \n unit`]ile care dispun de instrumentarul necesar (fibrobronhoscop) [i
de personal cu competen]` \n acest domeniu. Produsul se recolteaz` direct \n
recipiente sterile \n timpul manevrei de lavaj prin bronhoscop; se va continua
recoltarea sputei eliminate spontan \n urm`toarele 24-48 de ore.

3. LAVAJUL GASTRIC este metoda recomandat` atunci cånd nici una dintre
metodele men]ionate anterior nu este posibil`.
Indica]iile acestei metode de recoltare sunt urm`toarele:
- pacien]ii cu imagine radiologic` sugestiv` pentru tuberculoz` dar f`r`
confirmare bacteriologic`, dup` examinarea unor produse patologice ob]inute
prin alte metode de recoltare;

8
 - pacien]ii necooperan]i sau care \[i \nghit sputa;
- pacien]ii care nu expectoreaz` din cauza altor tulbur`ri coexistente: com`,
boli neurologice etc.;
- copiii mici care nu [tiu s` expectoreze.
Sensibilitatea metodei este de påna la 70% pentru copii sub 2 ani, sc`zånd pån`
la 30-40% la copiii de pån` la 12 ani.
Recoltarea se face diminea]a la trezire, dup` repaus alimentar de 8-10 ore,
\nainte ca pacientul s` m`nånce.
1
Este indicat` prelucrarea acestui tip de produs \n primele 4 ore de la recoltare.
Tehnica:
- se aspir` con]inutul stomacului diminea]a la trezirea din somn (aspirat
gastric). Se utilizeaz` sonde Nelaton la copii sau sonde Einhorn la adul]i (se
recomand` sondele de unic` folosin]` deoarece decontaminarea celor
reutilizabile este dificil` [i nesigur`!).
Dac` volumul de lichid recoltat este redus, se trece la etapa urm`toare;
- se introduc pe sond` 5-10 ml ser fiziologic la copii [i respectiv 20-30 ml la
adul]i;
- se aspir` con]inutul gastric cu o sering` steril` de 50 ml; se pune lichidul
aspirat \ntr-un recipient steril, cu capac filetat, cu capacitate adecvat`.
Proba trebuie prelucrat` cåt mai curånd dup` recoltare deoarece micobacteriile
sunt distruse rapid datorit` acidit`]ii gastrice. Dac` nu exist` posibilitatea prelucr`rii
\n primele 4 ore, se ajusteaz` pH-ul fluidului la valori neutre cu bicarbonat de sodiu
sau fosfat disodic! (produsele care nu au fost neutralizate nu sunt acceptate!).
Neutralizarea se face astfel: prin amestec in p`r]i egale aspirat gastric cu fosfat
disodic 15 % steril sau bicarbonat de sodiu 10%, steril, \n prezen]a unui indicator de
pH. (ar trebui descris` [i utilizarea indicatorului de pH, dåndu-se un exemplu)
ATEN}IE! De[i atåt pacien]ii cåt [i microbiologii prefer` sputa indus` lavajului
gastric, combinarea inducerii sputei prin folosirea de aerosoli urmat` \n 30 de minute
de lavaj gastric cre[te procentul de culturi pozitive, comparativ cu utilizarea fiec`reia
dintre cele dou` metode \n parte.

2. PRODUSE BIOLOGICE |N TUBERCULOZA EXTRAPULMONAR~

Deoarece infec]ia cu Mycobacterium tuberculosis se poate localiza \n principiu
\n orice organ, laboratorul se poate a[tepta s` primeasc` o varietate de produse
biologice. Acestea se pot \mp`r]i \n 2 categorii:
- produse biologice din colec]ii \nchise - de obicei f`r` microorganisme de
contaminare;
- produse biologice ce con]in flor` normal` de contaminare sau probe care nu
au fost recoltate aseptic.

1. COLEC}IILE |NCHISE
Fluidele (cefalorahidian, pleural, pericardic, sinovial, ascitic, sånge), precum [i
alte produse (puroi, m`duv` osoas`), sunt recoltate de c`tre medic, utilizånd tehnici
de aspira]ie sau proceduri chirurgicale.
Num`rul micobacteriilor din leziunile extrapulmonare este mic \n majoritatea
cazurilor de boal`. |ns`mån]area pe medii de cultur` cu calit`]i nutritive diferite poate

9
 cre[te [ansa izol`rii micobacteriilor! Se poate folosi mediul solid Lowenstein Jensen
sau medii semisolide [i medii lichide, \n func]ie de recomand`rile PNCT.
Atunci cånd produsele patologice cu consisten]` lichid` nu pot fi \ns`mån]ate
imediat pe medii de cultur`, trebuie ad`ugat` 1 pic`tur` de citrat de sodiu 20%, steril,
la 10 ml lichid biologic (sau heparin` - 0,2 mg/ml). Transportul la laborator trebuie
f`cut cåt mai repede. Dac` nu se poate asigura transportul imediat c`tre laborator sau
se \ntårzie prelucrarea, p`strarea se va face la frigider -4-8 ºC. (sau +4-8 ºC)??
Cånd cantitatea lichidului este mic` (< 25ml), se recomand` ca acesta s` fie
transferat \ntr-un balon steril cu mediu lichid tip Middlebrook (atunci cånd este
disponibil \n laborator), \n cantitate de 5-10 ori mai mare.
Izolarea micobacteriilor din sånge, \n special \n cazul disemin`rii infec]iei
asociat` cu sindromul imunodeficien]ei (infec]ie HIV/SIDA), se face prin tehnici [i
cu echipamente speciale: spre ex. recolt`m 10 ml de sånge cu ajutorul unui sistem de
centrifugare-liz`, realizåndu-se liza celulelor mononucleare [i centrifugarea sångelui
\n acela[i container, \nainte de inocularea mediilor de cultur`.

2. FRAGMENTE TISULARE (piese bioptice)

Aceste tipuri de produse biologice trebuie puse dup` recoltare \n containere
sterile, f`r` solu]ii de fixare sau conservan]i.
Dac` produsul trebuie trimis la mare distan]`, fragmentele tisulare trebuie
protejate \mpotriva usc`rii prin ad`ugarea unei mici cantit`]i de solu]ie salin`
fiziologic` steril` [i ambalarea recipientului \n z`pad` carbonic` sau men]inerea la
temperaturi de cel mult 5-10 grade Celsius.

3. URINA
Examinarea mai multor e[antioane cre[te [ansa eviden]ierii micobacteriilor.
M`surile premerg`toare recolt`rii urinei sunt urm`toarele:
- Se exclude o infec]ie urinar` netuberculoas` prin efectuarea unei uroculturi
cantitative prin metoda clasic`;
- Cu 24-48 ore \naintea recolt`rii se recomand`: regim hiposodat, reducerea
cantit`]ii de lichide ingerate [i suspendarea administr`rii de produse care
influen]eaz` viabilitatea micobacteriilor tuberculoase (vitamina C, aspirin`,
streptomicin`, amikacin`, kanamicin`, chinolone, rifampicin`, claritromicin`,
amoxicilin` clavulanat);
- |n cazul \n care pacien]ii sunt sub tratament antituberculos, acesta se
\ntrerupe cu 48-72 ore \naintea recolt`rii.
Tehnica de recoltare a urinei:
- se face o toalet` riguroas` a organelor genitale;
- se recolteaz` prima urin` de diminea]`, \n 3 zile succesive;
- se arunc` primul jet de urin` [i, \n continuare, se colecteaz` \ntr-un balon
steril de 250 ml toat` urina eliminat`;
- se transport` imediat c`tre laborator pentru a fi prelucrat`; dac` nu se poate
prelucra imediat se admite p`strarea urinei la frigider (-4-8º C) cel mult 24 ore.
|n tabelul nr. 1 este sistematizat` recoltarea produselor patologice, cu aten]ionare
asupra aspectelor care pot influen]a rezultatele examenului bacteriologic.

10
 Tabel nr. 1.
Produs Sensibilitate (Se) Cantitate Conservare / Men]iuni
biologic Specificitate (Sp) minim` Transport speciale
necesar`

SPUT~ Se~80-90% 3x 4-8ºC, max. 4 zile, - sputa matinal`

Sp~99% 3-5ml la \ntuneric - NU saliv` !

SPUT~
INDUS~
Se~90% 5-10ml 4-8ºC, max. 4 zile,
la \ntuneric
Se men]ioneaz` pe
biletul de trimitere!
1
ASPIRAT Se~77% variabil 4-8ºC, max. 4 zile, Sputa post-aspirat are
BRON{IC la \ntuneric aceea[i semnifica]ie !

LAVAJ Se~70% (<2ani) 20-50ml - prelucrare IMEDIAT~ - recoltare \ntre orele:

GASTRIC [i ~30-40% - se amestec` \n p`r]i 6-7 a.m.
(2-12 ani) egale cu fosfat disodic - repaus alimentar
15% sau bicarbonat de cu 8-12 ore \nainte
Na10% cu indicator - se men]ioneaz` dac`
de pH (>4 ore) con]ine neutralizan]i

COLEC}II 50-100ml 4-8ºC, max. 4 zile, - tehnic` de recoltare

|NCHISE -min. 2ml la \ntuneric ASEPTIC~!
pt. LCR - e[antioane multiple!

URIN~ min. 40ml prelucrare - toalet` local`

3-6 IMEDIAT~ - urina matinal`
e[antioane - din jetul mijlociu
- min. 3 zile consecutiv

PIESE DE Se~80% - prelucrare IMEDIAT~ NU se conserv`

BIOPSIE (pentru ganglion) - F~R~ conservan]i! \n formol!
- max. 1-2ml ser
fiziologic steril

COLEC}II - mediu Amies - aspirare cu seringa

DESCHISE pentru transport (NU cu tampon)
-1 ml ser fiziologic steril - se men]ioneaz`
TIPUL leziunii!

SÂNGE 5-10 ml - incubare IMEDIAT - medii speciale

M~DUV~ dup` recoltare - NU pe EDTA!
OSOAS~ - se accept` recoltat
pe heparin` sau
polianetol sulfonat

MATERII 5-10 ml Rata de contaminare

FECALE crescut`!

SECRE}IE *minim Prelucrare IMEDIAT~! Recoltare

VAGINAL~, 5-10ml, OBLIGATORIE
CURETAJ +2 ml ap` steril`!
UTER, distilat`
SÂNGE
MENSTRUAL
SPERM~*

11
 B. TRANSPORTUL {I CONSERVAREA PRODUSELOR PATOLOGICE
Prelungirea intervalului recoltare-prelucrare reduce [ansele eviden]ierii
micobacteriilor din produsele biologice. Cu cåt intervalul este mai lung, cu atåt cre[te
riscul usc`rii produsului, compromiterea viabilit`]ii bacililor (culturi fals negative) [i
colorabilit`]ii lor (pierderea acido-alcoolo-rezisten]ei), precum [i cel al contamin`rii
lor cu germeni din microbiota indigen` cu proliferare rapid` (constant prezen]i \n
unele produse precum sputa sau urina), fie cu germeni din mediul extern.
Procesul degrad`rii este accelerat de \nchiderea imperfect` a recipientelor,
expunerea la lumina solar` sau la raze UV, temperatura ridicat` a mediului ambiant
(\n sezonul cald) etc.
Dac` prelucrarea produsului patologic nu se poate face imediat dup` recoltare,
acesta se p`streaz` la frigider. Nu se admite p`strarea la termostat. Se accept` cel
mult p`strarea la temperatura camerei, la \ntuneric, pentru cel mult cåteva ore.
Transportul probelor biologice, conform cerin]elor legisla]iei \n vigoare este
responsabilitatea celui care organizeaz` expedierea.
Probele biologice trebuie ambalate astfel \ncåt s` nu se produc` scurgeri
ambalajul s` fie rezistent la [ocuri, schimb`ri de presiune sau alte incidente ce pot
ap`rea \n cursul manevr`rii lor, \n timpul transportului. Pentru aceasta se utilizeaz`
cutii de transport confec]ionate special, cu o capacitate de 20-30 de recipiente, care s`
fie pozi]ionate vertical. Capacul cutiei trebuie s` fie bine fixat [i s` aib` un mecanism
de \nchidere (\ncuiere). |n timpul transportului, probele trebuie pe cåt posibil,
men]inute la rece [i la ad`post de lumin` (figura nr. 1.)
Formularele de solicitare a examenului bacteriologic \nso]esc cutia, dar NU se
introduc \n interiorul acesteia. |n afara formularelor de solicitare, cutiile pentru
transportul produselor sunt \nso]ite de o list` care permite identificarea probelor [i a
pacien]ilor.
|nainte de expediere, trebuie s` ne asigur`m c` sunt respectate urm`toarele
condi]ii:
- num`rul de probe
biologice din cutie
corespunde cu cel de pe lista
de identificare;
- num`rul de identificare
de pe fiecare recipient
corespunde cu num`rul de
identificare de pe lista de
\nso]ire;
- lista con]ine datele
necesare pentru fiecare
pacient, data expedierii [i
detaliile despre unitatea
sanitar` expeditoare.

Figura nr. 1:
AMBALAREA
PRODUSELOR
BIOLOGICE

12
 Capitolul II
EXAMENUL MICROSCOPIC
A. SPUTA
1. Efectuarea frotiurilor
A.1. Etalarea
- Se marcheaz` lame noi, curate [i degresate cu numere complete preluate din
registrul de laborator, utilizånd de exemplu un creion rezistent la [tergere,
insolubil \n alcool (cu creion de grafit dac` lamele au cap`t m`tuit);
- Se pun \n ordine flacoanele cu produsele patologice;
- Se sterilizeaz` ansa bacteriologic` \n flac`ra de bec de gaz [i se a[teapt` pån`
2
se r`ce[te;
- Cu ansa bacteriologic` (pipeta Pasteur sau be]i[oare de lemn de unic`
folosin]`) se aleg por]iuni purulente, opace din sput` sau se prelev` o ans` din
sedimentul rezultat dup` centrifugare (aproximativ 10-20 µl) [i se etaleaz` \n
por]iunea central` a lamei pe o arie de aproximativ 1x2cm, f`r` s` ajung` la
marginile lamei; verific`m \nc` o dat` identitatea sputei;
- Produsul se \ntinde uniform pe lam`, \n strat sub]ire, astfel \ncåt s` se ob]in`
un frotiu prin care s` se poat` vedea literele unui text tip`rit, atunci cånd este
uscat. Frotiul prea gros se poate desprinde de pe lam` \n cursul color`rii. De
asemenea, pe un frotiu prea gros, bacilii acido-alcoolo rezisten]i (BAAR) sunt
dificil de vizualizat, putånd fi de exemplu masca]i de elementele celulare;
- |naintea steriliz`rii ansei, se descarc` resturile de sput` prin rotirea ansei \n
nisipul acoperit cu alcool medicinal sau cu o substan]` dezinfectant` cu efect
asupra M. tuberculosis, din flaconul Erlenmayer.
Uscarea
- Lamele se las` la uscat la temperatura camerei sau pe o platin` \nc`lzitoare.
Nu se usuc` la flac`r`!
Fixarea
- Se ]ine lama cu pensa [i se trece partea opus` frotiului prin flac`ra becului de
gaz de 3 ori;
- Trebuie s` realiz`m fixarea, dar s` nu aib` loc carbonizarea frotiului;
- Se a[teapt` r`cirea lamelor.

A.2. Colorarea
Colora]iile folosite pun \n eviden]` caracterul acido-alcoolo rezistent al
micobacteriilor.
Colora]ia de referin]` pentru eviden]ierea BAAR este colora]ia Ziehl-Neelsen.
|n afar` de aceasta [i diversele ei variante, pentru eviden]ierea BAAR se pot
folosi [i substan]e fluorescente.

13
 A.2.1. Colora]ia Ziehl- Neelsen
Colorarea
- Se a[eaz` lamele cu frotiurile fixate pe suportul de colorare f`r` s` se ating`
\ntre ele;
- Se acoper` complet frotiurile cu solu]ie 0,3% de fucsin` fenicat` proasp`t
filtrat`;
- Se trece pe sub lame flac`ra unui bec de gaz pån` la emiterea de vapori, f`r`
s` fiarb`;
- Se repet` ac]iunea de 3-4 ori \n primele 3 minute. Se completeaz` cu fucsin`
dac` aceasta s-a uscat sau s-a scurs de pe lam`. Se las` pån` la 10 minute;
- Se spal` cu jet slab de ap` de robinet (sau cu ap` distilat`) [i se scurge apa.
Decolorarea
- Se acoper` frotiul cu acid-alcool 3% [i se las` pentru decolorare maxim 3
minute;
- Se repet` decolorarea dac` frotiul r`måne ro[u. Dup` decolorare frotiul
trebuie s` fie roz pal sau alburiu. O decolorare mai prelungit` nu reprezint`
neap`rat o gre[eal` pentru c` BAAR apar]inånd complexului M. tuberculosis
BAAR sunt intens rezisten]i la decolorare;
- Se spal` din nou cu jet slab de ap` de robinet (sau cu ap` distilat`) [i se
scurge apa.
Recolorarea
- Se acoper` frotiul cu albastru de metilen 0,3% timp de 30 secunde, maximum
1 minut. Prelungind timpul de contact cu albastru de metilen, fondul frotiului va
fi prea \nchis la culoare, f`cånd dificil` vizualizarea BAAR.
- Se spal` blånd sub jet de ap` de robinet (sau cu ap` distilat`).
- Se usuc` frotiurile \n pozi]ie \nclinat` pe suport de lame.
Examinarea frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen se face la microscopul optic
folosind obiectivul cu imersie [i oculare 10x sau 7x.
|n nici un caz nu se vor utiliza ocularele de 5x!

A.2.2. Colora]ia cu auramin` - rhodamin`

Colorarea
- Se acoper` frotiul fixat cu solu]ie 0,1% auramin` - 0,01% rhodamin`;
- Se las` 5 minute la temperatura camerei, f`r` \nc`lzire;
- Se spal` blånd cu ap` distilat`.
Decolorarea
- Se acoper` frotiul cu acid - alcool 3% [i se las` pentru decolorare 2 minute.
Se spal` blånd cu ap` distilat` [i se scurge excesul de ap`.
Recolorarea (pentru eliminarea fluorescen]ei nespecifice a fondului)
- Se acoper` frotiul cu permanganat de potasiu 0,5% sau acridin orange 0,01%
sau albastru de metilen 0,3% timp de 2 minute. Prelungirea contactului cu
permanganatul de potasiu peste 4 minute determin` sc`derea fluorescen]ei
BAAR. Se spal` cu ap` distilat` [i se scurge excesul de ap`.
- Se las` la uscat \n suportul de lame.

14
 |n toate etapele de sp`lare pentru colora]ia cu fluorocromi se folose[te numai
apa distilat`. Nu se folose[te apa de la robinet deoarece clorul con]inut de
aceasta interfer` cu fluorescen]a!
- Frotiurile se examineaz` imediat dup` uscare la microscopul cu fluorescen]`,
folosind oculare de 10x [i obiective de 25x [i 45x.
Frotiurile pozitive BAAR \n fluorescen]` se recoloreaz` Ziehl-Neelsen, pentru
confirmarea rezultatelor.
Pentru c` Mycobacterium tuberculosis poate afecta aproape orice organ,
laboratorul poate primi o \ntreag` varietate de produse patologice, cum ar fi fluide de
la nivelul seroaselor, ]esuturi, puroi sau urin`. Beneficiul examenului microscopic al
acestor produse este limitat [i de aceea diagnosticul tuberculozei extrapulmonare se
bazeaz` mai curånd pe cultivarea probelor.

B. SP~L~TURA BRONSIC~
Se prelucreaz` \n acela[i mod ca [i sputa. 2
C. LAVAJUL GASTRIC
Examenul microscopic poate induce \n eroare, pentru c` \n stomac pot fi
prezente micobacterii apar]inånd altor specii decåt complexul M. tuberculosis
(MOTT). Examenul microscopic nu poate diferen]ia specia de BAAR vizualiza]i. De
aceea, frotiurile pozitive trebuie interpretate cu pruden]`.

D. TAMPONUL LARINGIAN
Examenul microscopic direct nu este justificat pentru acest tip de produs! Cel
mai adesea este negativ, de aceea se prefer` p`strarea cantit`]ii mici de produs \n
vederea cultiv`rii.

E. PUROIUL
Frotiurile efectuate din puroi trebuie s` fie foarte sub]iri. Dac` frotiul este gros
are tendin]a s` se desprind` de pe lam`. |n plus, \n frotiuri groase, BAAR se
eviden]iaz` cu dificultate. |n cazul unui puroi deosebit de våscos, frotiul va fi efectuat
depunånd ini]ial pe lam` o pic`tur` de solu]ie salin` fiziologic` steril` \n care va fi
emulsionat` o ans` de puroi, urmat` de etalare.

F. LICHIDUL PLEURAL
Examenul microscopic este rareori pozitiv pentru lichidele pleurale sero- citrine.
De aceea, efectuarea de rutin` a examenului microscopic nu este recomandat`. Dac`
totu[i acesta este solicitat, frotiul va fi efectuat din sedimentul rezultat prin
centrifugare.

15
 G. LICHIDUL CEFALO-RAHIDIAN
Frotiurile din LCR sunt foarte rar pozitive. Dac` sunt solicitate, se efectueaz`
din sedimentul rezultat prin centrifugare. Pe o lam` nou` [i curat` se trag dou` linii
de aproximativ 1 cm lungime, cu creion rezistent la ap` [i la o distan]` de
aproximativ 2 mm. |n spa]iul m`rginit de aceste linii se etaleaz` o ans` din sediment.
Dup` uscare, pe acela[i spa]iu se pot etala mai multe anse de sediment, \n func]ie de
cantitatea acestuia.

H. URINA
Frotiurile efectuate din urin` au valoare diagnostic` foarte redus`, de aceea nu
recomand`m realizarea acestora. MOTT sunt adesea prezente \n urin`, \ncåt prezen]a
BAAR \ntr-o prob` de urin` trebuie interpretat` cu pruden]`.

Examinarea la microscop
- Tipurile de microscoape cel mai frecvent folosite pentru detectarea BAAR
sunt microscopul optic cu cåmp luminat [i microscopul cu lumin` ultraviolet`;
- La microscopul optic cu cåmp luminat lumina trece prin bacili [i varia]iile \n
culoare date de procesul de colorare eviden]iaz` forma. Fluorocromii sunt
substan]e organice care absorb lumina ultraviolet` [i emit lumin` \n spectrul
vizibil. Cånd sunt expu[i la lumina ultraviolet`, bacilii colora]i cu fluorocromi se
v`d ca particule luminos colorate pe un fond \ntunecat;
- Pentru examinarea frotiurilor este recomandat un microscop binocular.

1. Utilizarea microscopului
- Se verific` dac` microscopul nu prezint` defec]iuni;
- Se verific` focalizarea sursei de lumin`;
- Suprafe]ele lentilelor, oglinzilor [i condensorului trebuie s` fie curate;
- Se ridic` condensorul \n pozi]ia cea mai \nalt`, cu diafragma deschis`;
- Se regleaz` lumina, oglinda, condensorul [i diafragmele astfel \ncåt o raz`
puternic` de lumin` s` fie direc]ionat` spre lentila frontal` a obiectivului;
- Se ridic` obiectivul manevrånd macroviza;
- Se pune lama pe platina microscopului, cu frotiul \n sus;
- Se pune o pic`tura de ulei de cedru (sau alt lichid de imersie) la un cap`t al
frotiului;
- Se aduce obiectivul cu imersie \n axul microscopului;
- Privind din lateral, se coboar` tunul microscopului cu ajutorul macrovizei
pån` \n apropierea lamei, astfel \ncåt lentila frontal` a obiectivului cu imersie s`
intre \n contact cu pic`tura de ulei de cedru;
- Se focalizeaz` imaginea;
- Cu ajutorul microvizei se clarific` imaginea.

16
 |ntre]inerea microscopului
Dup` utilizarea zilnic`
- se [terge uleiul de cedru de pe lentila obiectivului, condensor [i platina
microscopului cu hårtie moale;
- se \ntrerupe sursa de iluminare cånd microscopul nu se folose[te; regulatorul
de tensiune trebuie dat la minim \nainte de \nchiderea microscopului;
- se acoper` microscopul cu husa protectoare.

Lunar
- se folose[te un jet de aer pentru a \ndep`rta praful (o pipet` Pasteur la care se
ata[eaz` o par` de cauciuc. Se cur`]` obiectivul, ocularele [i condensorul cu
hårtie moale sau tifon;
- se demonteaz` sistemul de fixare a lamei pe platin` [i se cur`]`;
- se [terge praful de pe corpul microscopului [i de pe fereastra l`mpii cu o
2
cårp` \nmuiat` \n ap`;

La fiecare 6 luni
- microscopul trebuie verificat, cur`]at [i lubrifiat de o persoan` autorizat`.

2. Examinarea frotiului
Pentru a ob]ine rezultate bune prin microscopie sunt necesare un microscop bun,
un spa]iu de lucru corespunz`tor [i un examinator experimentat. Citirea frotiurilor
trebuie s` fie realizat` \n mod sistematic [i standardizat astfel \ncåt s` ofere garan]ia
examin`rii unei p`r]i reprezentative din frotiu.
Pentru a avea garan]ia c` o anume parte din frotiu este examinat` o singur`
dat`, examinarea trebuie s` fie f`cut` \ntr-o manier` ordonat` (de introdus poze):
- Frotiurile colorate Ziehl-Neelsen se examineaz` numai cu obiectivul cu
imersie;
- Frotiurile colorate cu auramin`-rhodamin` se examineaz` \n interval de 24h
de la colorare deoarece fluorescen]a bacililor scade destul de repede. Dac`
frotiurile nu pot fi examinate imediat dup` colorare vor fi ]inute \ntr-un loc
\ntunecat, de preferat \n frigider, timp de maxim 24 de ore. Pentru reexaminare
la un interval mai mare de timp se recoloreaz` Ziehl-Neelsen;
- Frotiul se examineaz` dintr-un cap`t \n cel`lalt, cåmp microscopic dup`
cåmp microscopic. Dup` ce se examineaz` un cåmp se trece la urm`torul,
mi[cånd lama longitudinal, astfel \ncåt s` poat` fi examinat cåmpul al`turat.
Fiecare cåmp se examineaz` cu grij`, atåt \n centru cåt [i la periferie. Nu se
imprim` lamei o mi[care continu` \n timpul examin`rii;
- Se examineaz` minim 100 de cåmpuri \nainte ca frotiul s` fie declarat
negativ. Un tehnician bun poate examina un frotiu colorat Ziehl-Neelsen \n circa
5-7 minute. |n cazul unui frotiu care are 2 cm lungime, parcurgerea unei lungimi
\nseamn` aproximativ 100 cåmpuri. Dac` frotiul este intens pozitiv pot fi
examinate doar pån` la 25 de cåmpuri;
- La sfår[itul examin`rii se ia lama de pe platina microscopului, se verific`

17
 \nc` o dat` num`rul [i se \nregistreaz` imediat rezultatul (conform 3.4.);
- |nainte de a \ncepe examinarea unei lame noi se [terge lentila frontal` a
microscopului cu hårtie moale;
- Se p`streaz` lamele pentru controlul intern [i extern de calitate conform
recomand`rilor prev`zute \n PNCT;
- Lunar se face analiza procentajului de examene microscopice pozitive. Orice
diferen]` semnificativ` fa]` de rezultatele ob]inute \n lunile anterioare trebuie
analizat`.

3. Caracteristicile morfologice ale BAAR

- BAAR au aproximativ 1-10 µm lungime [i apar ca bacili sub]iri drep]i sau
\ncurba]i;
- |n colora]ia Ziehl-Neelsen, BAAR apar ca bacili ro[ii, drep]i sau u[or
\ncurba]i, uneori cu structur` granular`, izola]i, \n perechi sau grupa]i,
eviden]iindu-se clar pe fondul albastru al frotiului.
Uneori bacteriile pot avea zone intens colorate care apar ca m`rgelele sau pot
avea zone mai colorate [i zone mai pu]in colorate alternånd, ceea ce le confer`
un aspect dungat;
- |n colora]ia cu fluorocromi, bacilii apar colora]i spre exemplu \n galben
str`lucitor pe fondul \ntunecat al preparatului (dac` utiliz`m auramin`-rhodamin`);
- Unele microorganisme, altele decåt micobacteriile, pot avea diverse grade de
acido-alcoolo rezisten]`. |ntre acestea se num`r` Rhodococcus spp., Nocardia
spp., Legionella spp. [i chi[tii de Criptosporidium [i Isospora spp.;
- Micobacteriile cu ritm de multiplicare rapid pot prezenta varia]ii \n ceea ce
prive[te rezisten]a la decolorarea cu o solu]ie de acid-alcool.

Exprimarea semicantitativ` a rezultatelor examenului microscopic – tabel 2

Tabel 2

Ziehl-Neelsen 1000x Rezultat M`rirea \n examinarea

\n fluorescen]`
250x 450x
0 BAAR NEGATIV BAAR 0 BAAR 0 BAAR

1-9 BAAR/100 câmpuri Num`rul exact de Se \mparte Se \mparte

BAAR / 100 câmpuri num`rul num`rul
BAAR BAAR
observa]i la 10 observa]i la 4

10-99 BAAR / 100 câmpuri POZITIV BAAR 1+

1-10 BAAR / câmp POZITIV BAAR 2+

> 10 BAAR / câmp POZITIV BAAR 3+

Not`: Rezultatul pozitiv cu 1-3 BAAR trebuie interpretat cu pruden]`, fiind

necesar` examinarea unui alt e[antion de sput`!

18
 Cauze de eroare \n microscopie
Situa]ii ap`rute \n cursul procesului de prelevare a produsului patologic:
- Prelevat de calitate sau \n cantitate necorespunz`toare;
- Sp`larea insuficient` a recipientelor reutilizabile;
- Gre[eli \n numerotarea recipientelor de recoltare - acestea trebuie numerotate
pe corp, nu pe capac.

Situa]ii ap`rute \n cursul efectu`rii frotiului

- Erori de identificare a lamelor;
- Efectuarea a prea multe frotiuri deodat`. Se recomand` a nu se efectua mai
mult de 12 frotiuri o dat`.
- Reutilizarea lamelor, \n mod particular al celor pozitive din punctul de vedere
al prezen]ei BAAR; aceast` practic` este inacceptabil`!!!
- Utilizarea de lame vechi care prezint` zgårieturi; recomandarea expres` este
de a utiliza lame noi.
- Contaminarea prelevatului din cauza utiliz`rii incorecte a anselor sau
2
pipetelor.

Situa]ii ap`rute \n cursul color`rii frotiurilor

- Utilizarea de fucsin` nefiltrat`;
- |nc`lzirea excesiv` a fucsinei pe lam`, putånd determina cristalizarea
colorantului;
- Decolorare insuficient`;
- Lame lipite unele de altele \n procesul color`rii.

Situa]ii ap`rute \n cursul examin`rii microscopice

- Lentila frontal` a microscopului nu a fost [tears` \ntre examin`ri;
- Prezen]a bacililor \n uleiul de cedru, prin atingerea frotiurilor cu aplicatorul;
- |nregistrare gre[it` a rezultatelor;
- Examinarea superficial` a frotiurilor.

4. Controlul intern de calitate al examenului microscopic

Asigurarea calit`]ii este un proces continuu care are ca scop cre[terea eficien]ei
microscopiei [i garantarea examenului microscopic ca mijloc de diagnostic [i
monitorizare a tratamentului tuberculozei.
Controlul de calitate intr` \n responsabilitatea tuturor celor care lucreaz` \n
laborator. Controlul de calitate trebuie s` fie parte integrant` \n activitatea zilnic`.

Controlul de calitate al examenului microscopic este un proces de monitorizare

intern` efectiv` [i sistematic` a performan]elor, care garanteaz` c` informa]iile oferite
de laborator sunt exacte, de \ncredere [i reproductibile.
Acest deziderat este \ndeplinit prin:
- aprecierea calit`]ii produselor patologice prelevate;
- monitorizarea performan]elor tehnicii de colorare;
- monitorizarea calit`]ii reactivilor;

19
 - monitorizarea performan]elor echipamentului;
- monitorizarea tehnicii de citire.
|n fiecare laborator care face examen microscopic pentru diagnosticul
bacteriologic al tuberculozei se va ]ine \n mod obligatoriu eviden]a scris` a
controlului de calitate, indiferent de nivelul de competen]` [i responsabilit`]ile
laboratorului implicat.

b Recomand`ri generale:
- Orice procedur` folosit` \n laborator trebuie s` fie notificat` exact, a[a cum
se folose[te [i s` se afle \n laborator la \ndemåna tuturor colegilor implica]i.
Orice schimbare trebuie s` fie ini]iat` de [eful laboratorului [i trebuie datat`. Se
vor folosi numai tehnicile de lucru recomandate de PNCT;
- Toate \nregistr`rile trebuie p`strate cel pu]in 2 ani sau / [i \n conformitate cu
normativele \n vigoare.

b Produsele patologice [i formularele de solicitare

- Examinarea microscopic` se face numai \n urma solicit`rii scrise a
medicului;
- Formularele de solicitare trebuie p`strate separat de recipientele care con]in
produse patologice. Formularele care au fost contaminate trebuie autoclavate;
- Se va insista ca formularele s` fie completate corect. Recipientele trebuie s`
fie etichetate corect pentru a asigura identificarea exact` a pacien]ilor;
- Se vor refuza probele care nu pot fi identificate corect, anun]åndu-l pe
solicitant cu privire la aceast` situa]ie;
- Se apreciaz` calitatea probelor de sput` [i se consemneaz` \n biletul de
solicitare [i \n registrul de laborator;
- Produsele patologice care ajung la laborator \n recipiente sparte sau pe care
s-a prelins con]inutul trebuie autoclavate [i se va anun]a solicitantul pentru
trimiterea altui produs;
- Se consemneaz` data la care produsele patologice au ajuns \n laborator;
- Rezultatele examenului microscopic trebuie s` ajung` la solicitant \ntr-un
interval de 24 de ore (maximum 48 de ore) de la recep]ia \n laborator.

b Reactivii [i coloran]ii
- Reactivii se p`streaz` \n flacoanele originale. Nu se amestec` reactivi din
flacoane diferite chiar dac` produc`torul este acela[i;
- Recipientele \n care sunt reactivi [i coloran]i trebuie s` aib` \nscris` data
recep]iei \n laborator [i data deschiderii;
- Orice reactiv dovedit necorespunz`tor trebuie consemnat ca atare [i
\ndep`rtat imediat din laborator (Proces verbal de casare);
- Stocurile trebuie s` asigure necesarul pe 3 luni [i se consum` \n ordinea
primirii [i datei de expirare;
- Flacoanele cu solu]ii de lucru se eticheteaz` clar, cu denumirea complet`,
concentra]ia solu]iei, data prepar`rii [i data expir`rii.

20
b Colorarea [i examinarea frotiurilor
- Pe stativul de colorare se coloreaz` maxim 12 lame odat`;
- \n fiecare zi se coloreaz` 2 frotiuri de control (vezi anexa 1), unul pozitiv
pentru BAAR [i unul negativ, mai ales dac` \n laborator se prelucreaz` mai
pu]in de 10 produse patologice pe zi.

Rezultatele pentru frotiurile de control sunt considerate inacceptabile dac`:

b pentru colora]ia Ziehl-Neelsen:
- \n frotiul pozitiv nu se eviden]iaz` BAAR;
- \n frotiul negativ sunt prezen]i BAAR sau artefacte ro[ii la culoare care pot fi
confundate cu BAAR;
- fondul nu este decolorat corespunz`tor (este ro[u \n loc s` fie albastru).

b pentru colora]ia cu substan]e fluorescente:

2
- \n frotiul pozitiv nu se eviden]iaz` BAAR;
- \n frotiul negativ sunt prezen]i BAAR sau artefacte fluorescente care pot fi
confundate cu BAAR;
- fondul are fluorescen]` proprie.
Pentru evitarea erorilor, se vor lua urm`toarele m`suri:
- Se analizeaz` situa]ia, se identific` motivul erorii [i se aplic` corec]iile
necesare;
- Se reia colorarea a 2 frotiuri de control [i a frotiurilor de la pacien]i;
- Rezultatele citirilor pentru frotiurile de control vor fi \nregistrate;
- Se vor cur`]a [i p`stra toate lamele cu frotiuri pozitive [i negative conform
recomand`rilor PNCT \n vigoare, \n vederea controlului extern de calitate.
Frotiurile pentru control se vor p`stra \n cutii separate: „control pozitiv BAAR”,
„control negativ BAAR”;
- \n fiecare zi se recitesc „orb” (de c`tre al]i examinatori decåt cei care au
f`cut-o ini]ial) o lam` pozitiv` [i o lam` negativ` din ziua precedent`;
- Rezultatele citirii \ncruci[ate vor fi \nregistrate;
- Pentru laboratoarele care prelucreaz` zilnic mai mult de 10 produse
patologice (frotiuri), este obligatoriu ca la schimbarea uneia dintre solu]iile de
reactivi folosi]i la colorare s` se fac` controlul colora]iei cu 1 frotiu sigur pozitiv
[i un frotiu sigur negativ, conform procedurii prezentate mai sus.

b Analiza periodic` a rezultatelor

- Rezultatele examenului microscopic se analizeaz` lunar calculånd rata de
pozitivitate astfel:
Nr. total de examin`ri microscopice / Nr. total frotiuri cu rezultat pozitiv
BAARx 100= rata de pozitivitate
- Se raporteaz` num`rul de pacien]i cu rezultate pozitive la num`rul de pacien]i
suspec]i de tuberculoz` investiga]i. |n medie, pentru fiecare pacient caz nou

21
 pozitiv la microscopie trebuie investiga]i aproximativ 10 suspec]i (indice de
identificare). Dac` exist` o diferen]` marcat` poate fi vorba fie de o deficien]` a
examenului microscopic, fie de o identificare necorespunz`toare a suspec]ilor;
- Indicele de identificare variaz` \ntre 5-30 %, putånd diferi de la zon` la zon`.
|ntr-un teritoriu \n care acest indice nu este cunoscut, IUATLD recomand` s` se
foloseasc` indicele de 10%, urmånd ca acesta s` fie calculat ca o medie pe un
interval mai lung de timp. Dac` de la valoarea stabilit` se \nregistreaz` abateri
notabile, situa]ia trebuie investigat`.
- Se verific` [i se analizeaz` \ntotdeauna rezultatele slab pozitive survenite \n
serie dup` un frotiu intens pozitiv. S-ar putea s` fie vorba de rezultate fals
pozitive cauzate de antrenarea bacililor de pe o lam` pozitiv` pe lame negative
\n cursul color`rii, dac` lamele au fost alipite.

22
 Capitolul III
EXAMENUL PRIN CULTUR~
GENERALIT~}I
|n diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, cultivarea reprezint` metoda de
baz`. Prin cultur` se poate stabili viabilitatea microorganismelor. Cultivarea permite
atåt izolarea, cåt [i identificarea bacililor tuberculo[i, confirmånd etiologia [i
activitatea bolii. De asemenea, ob]inerea coloniilor izolate permite testarea
chimiosensibilit`]ii germenilor. Este o metod` foarte sensibil`, cu o limit` de 10-100
bacili /ml produs (fa]` de 5.000-10.000 \n cazul frotiului direct), dar \n acela[i timp o
metod` laborioas` [i exigent` care nu poate fi corect [i eficient aplicat` decåt \n
laboratoare specializate.
Cultura pozitiv` cre[te num`rul de cazuri confirmate bacteriologic cu 30-50%
prin detectarea cazurilor cu microscopie negativ`, dar trebuie s` avem \n vedere c`
rezultatul este ob]inut tardiv (circa 3-8 s`pt`måni).
Prin prisma cultiv`rii, produsele patologice se \mpart \n dou` categorii, \n
func]ie de condi]ia lor microbiologic`:
- Prima categorie este cea a produselor care sunt recoltate din zone normal
sterile (LCR, lichid sinovial, fragmente de m`duv`, puroi din abcese reci,
biopsii) [i care nu necesit` decontaminare \naintea cultiv`rii. Aceste produse se
\ns`mån]eaz` ca atare \n cazul \n care au fost respectate regulile de recoltare
aseptic`;
3
- A doua categorie este constituit` de produsele care sunt recoltate din zone
normal colonizate sau care se contamineaz` pe traiectul de eliminare [i necesit`
decontaminare (sputa spontan` sau provocat`, aspiratul traheo-bron[ic, sp`l`tura
bron[ic`, sp`l`tura gastric`, tamponul laringian, urina, sångele menstrual,
lichidul spermatic etc).
Izolarea micobacteriilor din sput`, prototip al produselor patologice contaminate
cu flor` microbian` indigen` [i neomogene, implic` urm`toarele etape:
1 - omogenizare / decontaminare urmat` sau nu de concentrarea germenilor prin
centrifugare (pretratarea sputei);
2 - \ns`mån]area pe medii de cultur`, incubarea la termostat [i controlul
cre[terii;
3 - notarea [i interpretarea rezultatelor.

1. METODE DE OMOGENIZARE / DECONTAMINARE

Se folosesc agen]i chimici care omogenizeaz` (fluidific`) sputa prin
descompunerea structurilor sale organice (mucus, fibrin`, detritus) [i concomitent
distrug flora microbian` asociat` din produs. Efectul bactericid al substan]elor
decontaminante nu este strict selectiv, o bun` parte dintre micobacterii fiind distruse.
Acest efect variaz` \n func]ie de agentul chimic folosit, durata contactului cu

23
 germenii [i condi]iile centrifug`rii.
Metoda de decontaminare cu hidroxid de sodiu 4% realizeaz` un echilibru
convenabil \ntre num`rul de micobacterii distruse (aproximativ 50- 60%) [i rata de
contaminare a culturilor (circa 2-5%).
Se accept` o rat` de contaminare de 2-3% pentru laboratoarele care prelucreaz`
produsele \n aceea[i zi [i o rat` de contaminare de maxim 5-10% atunci cånd
prelucrarea se face dup` cåteva zile de la recoltare.
O rat` de contaminare mai mic` de 2% dovede[te o tehnic` agresiv` de
decontaminare, care distruge prea mul]i BAAR.

1.a. Metoda cu hidroxid de sodiu

Hidroxidul de sodiu (NaOH) este larg utilizat ca agent de omogenizare /
decontaminare, fiind aplicabile dou` variante tehnice (cu centrifugare [i cu pic`tura).
Avantaje:
- Metoda este simpl`, ieftin` [i asigur` un control corect [i eficient al
contamin`rii;
- Solu]ia de NaOH sterilizat` poate fi p`strat` cåteva s`pt`måni;
- Concentrarea micobacteriilor din produsul prelucrat (\n varianta tehnic` cu
centrifugare).
Dezavantaje:
- Risc de eroare dac` timpul de contact nu este strict controlat [i respectat (nu
mai mult de 20 minute);
- Risc de eroare dac` parametrii centrifug`rii nu sunt optimi (for]a relativ` de
centrifugare de 3000xg, cu o durat` de 15-20 minute, \n centrifuga cu r`cire);
- Prin aceast` metod` se distrug 60% dintre bacili, chiar dac` este respectat` cu
rigoare tehnica standardizat`; aceast` distrugere ini]ial` este independent` de al]i
factori adi]ionali (c`ldura dezvoltat` \n timpul centrifug`rii, neutralizarea incorect`).

1.a.1 Metoda cu hidroxid de sodiu [i centrifugare

a. Materiale necesare
- centrifug` cu sistem de securitate biologic` [i cu r`cire;
- eprubete (cuve) de centrifug` din material plastic cu capac filetat, cu capacitate
minim` de 10 ml;
- pipete de 1ml, 2ml [i 5ml cu par`;
- pipete Pasteur de unic` folosin]`;
- termostat;
- frigider;
- mediu de cultur` tip Lowenstein Jensen;
- m`nu[i de protec]ie.
b. Reactivi :
b Solu]ie steril` de hidroxid de sodiu 4%;
- se dizolv` 4 g de NaOH \n 100ml ap` distilat`;
- se sterilizeaz` prin autoclavare 30 min la 121 oC.
b Solu]ie steril` de HCl 8%;

24
 - se toarn` 8 ml HCl concentrat \n 92 ml ap` distilat` (niciodat` invers);
- se sterilizeaz` prin autoclavare 30 min la 121 oC.
b Solu]ie de albastru bromtimol (indicator);
- se amestec` 0,1 g albastru bromtimol cu 3,2 ml solu]ie NaOH N/2 (1ml
solu]ie NaOH 4% + 19 ml ap` distilat`) [i cu 250 ml ap` distilat`;
- se sterilizeaz` prin autoclavare 30 min la 121 oC;
- se p`streaz` \n sticl` brun`.
b Solu]ie de NaOH 4% cu indicator de pH (gata de lucru)
- se amestec` 92,5 ml solu]ie NaOH 4% steril` cu 7,5 ml solu]ie albastru
bromtimol steril`;
Solu]iile se p`streaz` \n sticle brune; se noteaz` pe sticle denumirea solu]iei [i
concentra]ia, data prepar`rii [i a expir`rii (sterilitatea se men]ine 8 s`pt`måni).
c. Tehnica
- din e[antionul de sput` se transfer` cu pipeta 2-3 ml \ntr-o eprubet` de
centrifug` de 10-12 ml;
- se adaug` un volum egal de solu]ie de NaOH 4% cu indicator de pH;
- se \nfileteaz` capacul [i se agit`;
- se las` \n repaus 15 min la temperatura camerei, cu 1-2 agit`ri;
- se neutralizeaz` cu HCl 8% la pH neutru (galben-verzui);
- se completeaz` pån` la capacitatea eprubetei cu ap` distilat`;
- se centrifugheaz` la 3000xg timp de 15 min;
- se decanteaz` supernatantul re]inånd 2 ml;
- se resuspend` sedimentul \n lichidul r`mas omogenizånd cu pipeta Pasteur.
Aten]ie : Barbotarea genereaz` aerosoli infec]io[i!
- se \ns`mån]eaz` cu pipeta steril` mediile de cultur` cu cåte 0,2ml sau 4
3
pic`turi din omogenat.

1.a.2. Metoda cu hidroxid de sodiu f`r` centrifugare (metoda cu pic`tura)

Se recomand` \n laboratoarele \n care nu exist` o centrifug` adecvat`.
Absen]a centrifug`rii diminueaz` sensibilitatea metodei, performan]ele acesteia
fiind puternic influen]ate de corectitudinea select`rii particulelor purulente din
produs.
|n consecin]`, aceast` metod` reprezint` o solu]ie de necesitate.
a. Materiale :
- eprubete cu capac filetat, de 16/100-120mm sau tuburi Falcon de 15-50 ml,
sterile;
- pipete de 1ml, 2ml, 3ml cu par`;
- pipete Pasteur de unica folosin]a;
- termostat;
- frigider;
- mediu de cultur` Lowenstein Jensen;
- m`nu[i.
b. Reactivi (prepara]i urmånd indica]iile de la „tehnica cu centrifugare”):
- solu]ie steril` de NaOH 4%;
- solu]ie steril` de HCl 8%;

25
 - solu]ie steril` de albastru de bromtimol.
c. Tehnica:
- din recipientul \n care s-a recoltat sputa se aleg, cu o pipet` Pasteur cu orificiul
larg (picur`toare) sau cu o pipet` cu par`, particule purulente (2-3 ml) care se
pun \ntr-o eprubet` mare, steril`, cu capac filetat, (de 16 / 100-120 mm sau tub
Falcon de 15-50 ml);
- peste sputa din eprubet` se adaug` cu o pipet` steril` o cantitate egal` de
solu]ie de NaOH 4% cu indicator de pH - se \nfileteaz` capacul \nainte de
agitare;
- se agit` manual (1 minut) sau mecanic (cu agitatorul mecanic 10-15 secunde);
- se las` \n repaus la temperatura camerei 15 minute, cu 1-2 agit`ri energice \n
acest interval, \n cazul probelor agitate manual;
- se neutralizeaz` cu HCl 8% pån` la virarea culorii \n galben-verzui (pH
neutru);
- se cultiv` mediile cu pipeta steril` cu par` sau cu pipeta de unic` folosin]`.
Not`: se poate neutraliza cu fosfat monopotasic solu]ie 15%. Aceast` variant` de
neutralizare este valoroas` atunci cånd este urmat` de centrifugare (15g fosfat
monopotasic [i ap` distilat` pån` la 100ml).

Prelucrarea sputei recoltate prin alte metode:

PRODUS PRELUCRARE

Aspiratul bron[ic, - Produsele astfel ob]inute au un con]inut redus de germeni

sputa indus` cu \ntr-un volum relativ mare de lichid;
aerosoli, - Este obligatorie prelucrarea cu concentrare prin centrifugare
lavajul bron[ic 3000xg timp de 15 minute;
- Sedimentul ob]inut se prelucreaz` ca [i sputa.

Lavajul gastric - Se centrifugheaz` 3000xg timp de 15 minute;

- Se \ndep`rteaz` supernatantul;
- Sedimentul se prelucreaz` la fel ca [i sputa.

Tamponul laringian, - Se transfer` tamponul cu o pens` steril` \ntr-o eprubet` de

tamponul faringian centrifug` steril`;
- Se acoper` cu solu]ie NaOH 2% (solu]ia 4% se amestec`
\n p`r]i egale cu apa distilat` steril`);
- Se agit` manual [i se preseaz` tamponul pe peretele
eprubetei pentru a elimina lichidul;
- Tamponul se pune \n recipientul pentru de[euri infec]ioase;
- Neutralizare, centrifugare [i \ns`mân]are ca [i \n cazul sputei.

26
 Prelucrarea altor produse
PRODUS PRELUCRARE

Urina - Se centrifugheaz` \ntreaga cantitate 15 minute la 3000xg;

- Se \ndep`rteaz` supernatantul;
- Sedimentul se prelucreaz` ca [i sputa.

Sângele menstrual Dup` lizarea hematiilor cu ap` distilat`,

se prelucreaz` ca [i sputa.

Sperma Se prelucreaz` ca [i sputa.

Fragmentele de ]esut - Se omogenizeaz` \n tub special cu pistil prin triturare cu

0,5-1ml solu]ie salin` fiziologic` steril` (condi]ii de sterilitate);
- Se poate ad`uga nisip de cuartz steril;
- Se inoculeaz` ca atare sau dup` decontaminare, \n func]ie de
condi]ia microbiologic` a produsului, respectiv:
A - dac` prelevarea a fost aseptic`, se inoculeaz` pe mediu
Lowenstein Jensen;
B - daca prelevarea nu a fost aseptic`, o parte din omogenat
se inoculeaz` direct pe mediul de cultur`, iar cealalt` se
prelucreaz` ca [i sputa.
Not` : Materialul neprelucrat se p`streaz` la frigider 48 ore,
pentru a fi procesat ulterior dac` s-a contaminat cultura ini]ial`.
3
Lichidul pleural, A- Dac` sunt purulente [i volumul lor este mai mic de 10 ml,
pericardic, se prelucreaz` ca [i sputa;
sinovial, ascitic B- Dac` sunt clare [i recoltate aseptic, \n volum mai mare de 10
ml, se centrifugheaz` 15 minute la 3000xg, [i se \ns`mân]eaz`
sedimentul.
Not` : Materialul neprelucrat se p`streaz` la frigider 48 ore,
pentru a fi procesat ulterior dac` s-a contaminat cultura ini]ial`.

Lichidul Se cultiv` ca atare \ntreaga cantitate recoltat` \n mai multe

cefalorahidian tuburi, minim 2ml (0,5 ml/tub).

Materiile fecale Se prelucreaz` ca [i sputa, modificând raportul dintre produs [i

NaOH 4% astfel: o parte produs patologic,
dou` p`r]i hidroxid de sodiu 4%.

M`duva osoas` [i Se pot prelucra doar \n laboratoarele care au medii speciale

hemocultura lichide pentru cultivarea micobacteriilor din produsele patologice
cu con]inut mare de hematii.

27
 2. |NS~MÂN}AREA PE MEDII DE CULTUR~, INCUBAREA LA
TERMOSTAT, CONTROLUL CRE{TERII
2.a. Medii de cultur`
Mediile de cultur` trebuie s` ofere condi]ii optime cre[terii micobacteriilor, chiar
dac` produsul este paucibacilar. Se utilizeaz` de regul` mediul Lowenstein Jensen,
care este cea mai bun` alegere deoarece:
- asigur` cre[terea micobacteriilor;
- se poate p`stra \n frigider cåteva s`pt`måni;
- inhib` germenii de contaminare prin verdele malachit con]inut;
- este mai ieftin.
Are dezavantajul c`:
- intervalul de timp necesar pentru a ob]ine o cultur` pozitiv` este de 4-8
s`pt`måni, \n cazul produselor paucibacilare;
- contaminarea conduce la pierderea culturii respective.

2.b. |ns`mån]area mediilor

2.b.1.Verificarea tuburilor cu mediu de cultur`:
- culoarea mediului Lowenstein Jensen este verde luminos, ocazional poate avea
particule punctiforme datorate prezen]ei lipidelor din ou`. Pot ap`rea mici bule
produse spontan \n timpul coagul`rii, dar acestea nu afecteaz` calitatea mediului;
- suprafa]a mediului trebuie s` fie neted`, lucioas`;
- s` aib` lichid de condensare pe fundul eprubetei;
- eprubetele cu mediu nu trebuie expuse la lumin` \n exces, deoarece mediul va
c`p`ta o culoare albastr` [i \[i va modifica propriet`]ile nutritive devenind inutilizabil;

2.b.2. Preg`tirea eprubetelor cu mediu

- se numeroteaz` tuburile cu mediu astfel: num`rul din registrul de laborator cu
indicativul produsului patologic [i data \ns`mån]`rii pe fiecare tub (se preg`tesc cåte
trei tuburi pentru fiecare produs patologic prelucrat).

2.b.3.Tehnica \ns`mån]`rii
- se \ns`mån]eaz` 3 tuburi cu mediu Lowenstein Jensen pentru fiecare produs;
- se \ns`mån]eaz` cåte 4 pic`turi (0,2 ml) din sedimentul e[antionului de produs
prelucrat \n fiecare tub cu mediu de cultur`, folosind o pipet` Pasteur - se \nclin`
fiecare tub pentru ca inoculul s` inunde toat` suprafa]a mediului;
- tuburile \ns`mån]ate se pun \n pozi]ie \nclinat` (unghi de 25-30°), pe t`vi]e
speciale, astfel \ncåt lichidul \ns`mån]at s` scalde suprafa]a mediului, dar s` nu
ajung` la capac;
- capacul nu se \nchide complet, r`måne semi\nchis;
Aten]ie – cum men]ion`m necesitatea unui procent de CO2 ?

28
 - se incubeaz`, \n func]ie de indica]iile produc`torului, 2-5 zile \n pozi]ie
\nclinat`, la 37º C la termostat, pentru ca excesul de lichid s` se evapore;
- se \nchide capacul (anumi]i produc`tori specific` faptul c` pe \ntreaga perioad`
de incubare capacul trebuie s` r`mån` semi\nchis);
- se a[eaz` \n pozi]ie vertical` (cutii de carton cu loca[uri, dar ideale sunt
suporturile cu loca[uri din materiale ce pot fi dezinfectate - aluminiu, plastic
rezistent);
- cu aceast` ocazie se face prima verificare a culturilor, eliminånd tuburile
contaminate;
- se consemneaz` \n registrul de laborator contaminarea [i se anun]` solicitantul.

2.c. Incubarea culturilor [i controlul cre[terii bacililor

- se incubeaz` culturile pån` la 2 luni de la \ns`mån]are \n termostat, la 36,5 - 37°C;
- este de dorit s` se a[eze culturile \n termostat \n ordine cronologic`;
- primul control se efectueaz` la ridicarea tuburilor \n pozi]ie vertical` [i permite
identificarea mediilor rapid [i integral contaminate (toate cele 3 tuburi). Rezultatul se
comunic` imediat medicilor care au solicitat examenul;
- \n continuare, culturile vor fi controlate s`pt`månal pån` la \mplinirea a 8
s`pt`måni de incubare (60 de zile).

3. INTERPRETAREA {I NOTAREA REZULTATELOR

Tuburile cu mediu solid se examineaz` la intervale de timp fixe. Rezultatele se
exprim` semicantitativ, conform scalei prezentate \n tabelul de mai jos.
Tabel nr. ... Exprimarea semicantitativ` a rezultatelor culturii pe mediul solid tip
3
Lowenstein Jensen
CRE{TEREA MICOBACTERIILOR NOTAREA REZULTATULUI
Absenta coloniilor a NEGATIV
Sub 30 colonii b POZITIV: se noteaz` num`rul exact
de colonii
30-100 colonii POZITIV: 1+
Peste 100 colonii izolate POZITIV: 2+
Colonii confluente nenum`rabile POZITIVE: 3+
3 sau 2 tuburi contaminate [i 1 tub f`r` CONTAMINAT
cre[tere bacterian`

Not`
a Mediul s` nu fie deshidratat \n exces, iar aspectul s`u s` nu fie modificat.
b Colonii cu morfologie macroscopic` sugestiv` pentru micobacterii, identificate
ulterior ca apar]inånd complexului M. tuberculosis.

29
 Rezultatele culturilor se elibereaz` dup` identificarea preliminar` a
micobacteriilor din complexul M. tuberculosis:
- Coloniile de bacili tuberculo[i devin vizibile \n cultura primar` dup` cel pu]in
3 – 4 s`pt`måni de la \ns`mån]are.
- Culoarea coloniilor este crem g`lbui-palid, rugoase, cu aspect conopidiform.
- Bacteriile nu se emulsioneaz` \n solu]ia salin` fiziologic` \n cursul efectu`rii
frotiului (apare un aspect granular).
- |n preparatul microscopic, frotiul realizat din cultur` permite, uneori,
eviden]ierea unei distribu]ii \n corzi-serpentine de diferite lungimi, bacilii izola]i cu
lungime de 3-4 mm fiind \n num`r mic.
- Pentru verificare microscopic` a culturilor se folose[te numai colora]ia Ziehl-
Neelsen, care permite atåt eviden]ierea BAAR cåt [i vizualizarea altor
microorganisme (bacterii, fungi) de contaminare.

Notarea rezultatelor
Pentru fiecare din tuburile examinate rezultatul culturii se consemneaz` \n
registrul de laborator. Deoarece din fiecare produs patologic se \ns`mån]eaza 3
tuburi, rezultatul culturii se noteaz` astfel:
- dac` num`rul de colonii dezvoltate este sub 30 se scrie suma coloniilor
num`rate pe toate tuburile [i num`rul de tuburi pe care s-au dezvoltat;
- dac` num`rul de colonii dezvoltate este mai mare de 30, rezultatul final al unei
culturi va fi reprezentat de tubul cu cre[terea cea mai intens`;
- dac` sunt 2 tuburi cu microbi de contaminare [i colonii de micobacterii pe al
treilea tub, rezultatul culturii va fi dat de cre[terea pe acel tub, cu men]iunea „ /1
tub”;
- mediile contaminate total (3 tuburi); rezultat de cultur` contaminat` la data
de... [i se noteaz` cu C. (C /data)
- mediile contaminate par]ial (1-2 tuburi); se men]ioneaz` data contamin`rii (C.
[i data pentru fiecare tub)
- mediile pe care s-au dezvoltat colonii, rezultat pozitiv, cu interpretarea lui.

La fiecare control se vor nota \n registru rezultatele:

30
 EXEMPLE

Cre[tere Cre[tere Cre[tere REZULTAT

tubul 1 tubul 2 tubul 3

10 colonii 15 colonii 5 colonii 30 colonii / 3 tuburi

20 colonii 10 colonii 8 colonii POZITIVA 1+ (peste 30 col/3 tuburi)
10 colonii 15 colonii 0 25 colonii /2 tuburi
10 colonii 15 colonii contaminat 25 colonii /2 tuburi; se consemneaz` \n
registru tubul contaminat
5 colonii 0 contaminat 5 colonii /1 tub se consemneaz` \n
registru tubul contaminat
8 colonii 0 0 8 colonii /1 tub
0 0 contaminat CULTUR~ NEGATIV~
0 contaminat contaminat CONTAMINAT~
45 colonii 40 colonii 30 colonii POZITIV~ 1+ / 3 tuburi
1+ 20 colonii 10 colonii POZITIV~ 1+
3+ 2+ 2+ POZITIV~ 3+
12 colonii 0 0 12 colonii pe 1 tub

|nregistrarea rezultatelor citirii culturilor trebuie s` se fac` \n mod standardizat.

- rezultatul pozitiv trebuie s` fie notat cu pix ro[u;
- la \nceputul fiec`rei pagini din registru trebuie s` se noteze data controlului la
21, 30, 45 [i 60 zile [i o s`geat` trasat` cu pixul s` indice controalele efectuate
(aceasta s`geat` se prelunge[te pe m`sur` ce se mai efectueaz` o citire);
3
- nu trebuie s` existe spa]ii necompletate.

EXEMPLU Aten]ie la s`ge]i – pozi]ia lor !

CULTURA
Proba 1 Proba 2 Proba 3
21 30 45 60 21 30 45 60 21 30 45 60
Data Data Data Data Data Data Data Data Data Data Data Data

Neg Neg Neg

1+ 1+ 1+
1+ 1+ 1+
1+ 1+ 1+
poz poz poz

31
 Pentru primul rånd s-a efectuat un control, pentru al doilea dou`, pentru al treilea
trei iar penultimul reprezint` o cultur` la sfår[itul perioadei de incubare. Ultimul rånd
reprezint` modul \n care se specific` cre[terea pentru fiecare tub \n parte; aceste
s`ge]i se traseaz` la rubrica corespunz`toare datei controlului (pentru exemplul nostru
la 21 zile). Pentru culturile pozitive se noteaz` data pozitiv`rii [i \n rubrica culturii.
Cånd se schimb` data controlului pe parcursul unei pagini se trece data la acel nivel.
Tubul contaminat se noteaz` cu „C”, la data corespunz`toare controlului, cu 2
s`ge]i care indic` faptul c` celelalte 2 tuburi se incubeaz` \n continuare.
Nu se scrie NEGATIV decåt la citirea de la 60 de zile. Pån` la data citirii de la
60 de zile cultur` este „\n observa]ie”.

Erori de tehnic` [i interpretare

A. cultura fals pozitiv` apare atunci cånd identificarea culturii se face exclusiv
pe baza caracterelor morfologice macroscopice ale coloniilor. Este obligatorie
verificarea morfologiei microscopice a coloniilor, urmat` de teste biochimice de
identificare.
B. rezultatul fals pozitiv - este consecin]a contamin`rii de laborator a unei
culturi care \n mod real ar trebui s` fie negativ`. Contaminarea \ncruci[at` se poate
produce \n timpul prelucr`rii produselor patologice prin transferul de bacili de la un
produs patologic pozitiv la unul negativ. Suspect`m aceast` situa]ie atunci cånd dup`
o cultur` intens pozitiv` constat`m cre[tere de cåteva colonii la culturile urm`toare.
Asemenea rezultate trebuie interpretate \n context clinico-radiologic. Rezultate fals
pozitive pot s` apar` \n aproximativ 2% din culturile pozitive.
C. cultura fals negativ` apare atunci cånd se prelucreaz` o por]iune de produs
patologic cu densitate bacilar` mic`. Pentru evitarea acestei situa]ii trebuie:
- s` se aleag` pentru prelucrare particule purulente reprezentative (mai ales \n
cazul tehnicii cu pic`tura);
- timpul de contact al produsului patologic cu agentul decontaminant s` nu
dep`[easc` 20 de minute (etapa de omogenizare/decontaminare);
- la centrifugare s` se respecte durata [i for]a relativ` de centrifugare pentru a nu
distruge un num`r prea mare de germeni (mai ales \n cazul centrifugilor f`r` sistem
de r`cire);
- s` se neutralizeze corect produsul rezultat prin omogenizare/centrifugare;
- s` nu se foloseasc` medii vechi (uscate);
- s` se monitorizeze permanent temperatura din termostat.
D. examen microscopic pozitiv [i cultura negativ` se poate \ntålni:
- la suspec]ii de tuberculoz` (\nc` netrata]i - cazuri noi). Este rezultatul erorilor
de tehnica [i interpretare (microscopie fals pozitiv` sau cultur` fals negativ`).
- la bolnavii de tuberculoz` afla]i \n curs de tratament. Ace[tia pot elimina bacili
colorabili (BAAR) dar necultivabili (bacili mor]i sau cu viabilitate compromis`).
- rezultat de microscopie pozitiv` cauzat de persistenta BAAR distru[i, afla]i pe
instrumentarul insuficient cur`]at [i sterilizat utilizat pentru prelevarea instrumental`
a produselor patologice.
- tehnica de decontaminare agresiv` sau incorect`, cånd sunt distruse micobacteriile
din produs (contactul produsului patologic cu hidroxidul de sodiu mai mult de 25-30
minute, neutralizare incorect` (inoculul cu pH acid cre[te efectul bactericid al verdelui

32
malachit asupra micobacteriilor, inoculul alcalin modific` consisten]a [i calit`]ile
nutritive ale mediului), calitatea nutritiv` necorespunz`toare a mediului de cultur`
folosit, sau mediu degradat prin p`strare \n condi]ii necorespunz`toare.
Examenul microscopic pozitiv [i cultura negativ` trebuie s` nu dep`[easc` 2-4%
din rezultatele pozitive la examenul microscopic.

4 CONTROLUL INTERN DE CALITATE AL CULTURII (CICC)

a. Calitatea mediilor de cultur`
- Se va ]ine eviden]a datei intr`rii \n laborator a mediilor de cultur`;
- Pån` la folosire mediile se p`streaz` la frigider (4-8 ºC);
- Se noteaz` pentru fiecare zi de lucru lotul de mediu folosit;
- |nainte de numerotarea tuburilor se verific` aspectul macroscopic al mediului
(culoare, aspect, grad de hidratare), consemnånd rezultatul \n caietul de control intern
de calitate al mediului. Se vor elimina tuburile care au mediul deshidratat, mediul are
pete de culoare galben` sau verde \nchis, mediul are aspect spongios, suprafa]a pantei
este anfractuoas`. Toate aspectele men]ionate se scriu \n caietul de CICC.
b. Chiar din momentul \ns`mån]`rii se va face programarea citirii culturilor. Pe
fiecare cutie cu tuburi \ns`mån]ate puse la incubator se ata[eaz` o etichet` dup`
modelul:
Dup` terminarea perioadei de incubare toate aceste etichete se p`streaz` \n
ordine, \ndosariate.

Nr registru Nr culturi Nr tuburi

|ns`mån]at. (data)2005 72 ore
Citire 21 zile (data ). Pozitiv
contam C
contam C
T
T
3
Citire 30 zile Pozitiv contam C T
Citire 45 zile Pozitiv contam C T
Citire 60 zile Pozitiv contam C T

Pe aceea[i parte sau pe verso se scrie:

Lotul de mediu.......................................Expir`.............................................
Produc`tor......................................................................................................
Produsele patologice au fost prelucrate de c`tre...........................................

c. Controlul decontamin`rii
La schimbarea lotului de solu]ii folosite pentru decontaminare (NaOH 4 %,
HCl8% sau fosfat monopotasic 15 %, albastru de bromtimol), din produsul
omogenizat rezultat dup` decontaminarea a 10 spute alese la intamplare, \n afar` de
tuburile cu mediu Lowenstein Jensen, se \ns`mån]eaza cåte 10 microlitri pe mediu
geloza - sånge. Dup` incubare la 37º C, a doua zi se num`r` coloniile dezvoltate.
Este acceptabil` apari]ia a 1-3 colonii. Se noteaz` rezultatul \n caietul de CICC, cu
num`rul culturii.
Rezultatele furnizate din analiza calit`]ii mediului se vor corela cu rezultatele
citirii culturilor [i cu rezultatele controlului decontamin`rii.

33
 Capitolul IV
TESTAREA CHIMIOSENSIBILITATII TULPINILOR DE
M. tuberculosis LA SUBSTAN}E
ANTITUBERCULOASE (ANTIBIOGRAMA)
ASPECTE GENERALE
Programul Na]ional de Control al Tuberculozei are \n vedere nu numai
identificarea [i tratarea bolnavilor surs` de infec]ie, dar [i limitarea apari]iei [i
r`spåndirii tulpinilor cu rezisten]` la medicamentele antituberculoase. Rezisten]a
tulpinilor este \n general consecin]a tratamentului incorect prescris sau incorect
administrat, putånd duce la e[ec terapeutic. Spectrul de sensibilitate / rezisten]` al
tulpinilor micobacteriene poate fi determinat cu ajutorul antibiogramei.

Rezisten]a primar` a tulpinilor de M. tuberculosis se \ntålne[te la pacien]ii care

nu au primit niciodat` vreun tratament antituberculos [i care s-au infectat cu bacili
chimiorezistenti.
Rezisten]a dobåndit` (secundar`) a tulpinilor de M. tuberculosis poate fi
\ntålnit` la pacien]ii care au primit cel pu]in o lun` tratament antituberculos. Poate fi
afirmat` doar \n situa]ia \n care avem dovada sensibilit`]ii ini]iale a tulpinii (\nainte
de \nceperea tratamentului antituberculos).
Rezisten]a combinat` reprezint` prevalen]a rezisten]ei tulpinilor la toate
cazurile de tuberculoz`, indiferent dac` au avut sau nu tratament antituberculos
anterior, \ntr-un an [i o ]ar` dat`.
Multidrogrezisten]a (Multidrug resistance - MDR) se define[te ca rezisten]` a
tulpinilor cel pu]in la INH [i RMP.
Definirea rezisten]ei in vitro a micobacteriilor trebuie s` aib` \n vedere:
4 - metoda de testare folosit`;
- concentra]iile critice ale substan]elor antituberculoase in vitro;
- propor]ia critic` de mutan]i rezisten]i din popula]ia micobacterian` testat`;
- relevan]a clinic` a rezultatelor testului.
Substan]ele antituberculoase fa]` de care se face testarea
Medicamentele de linia I: Izoniazida, Rifampicina, Etambutol, Streptomicina,
fa]` de care ar trebui testate toate tulpinile izolate \nainte de \nceperea tratamentului
(cazurile noi de \mboln`vire), precum [i tulpinile izolate \n cazurile de e[ec
terapeutic.
Medicamentele de linia a II-a: amikacina, kanamicina, cicloserina, etionamida,
protionamida, ofloxacina, ciprofloxacina, rifabutin, capreomicina, clofazimina, fa]`
de care este indicat` testarea tulpinilor rezistente la medicamentele de linia I.
Popula]ia de micobacterii dintr-o tulpin` este heterogen` \n ceea ce prive[te
propor]ia mutan]ilor de rezisten]` fa]` de diversele medicamente antituberculoase.

34
Aceast` heterogenitate se datore[te faptului c` se produc muta]ii spontane, cu o rat` a
frecven]ei care difer` \n func]ie de medicament, rezultånd astfel 1 bacil din 108 cu
rezisten]` la RMP; 1 bacil din 106 cu rezisten]` la INH. |n leziunile cavitare se g`sesc
\n general, peste 107 bacili [17]. Tulpinile „s`lbatice”, care nu au venit anterior \n
contact cu medicamente antituberculoase, sunt de asemenea heterogene, \ns`
bacteriile cu muta]ie de rezisten]` nu dep`[esc 1% din totalul bacteriilor, limita peste
care se consider` c` ar exista corela]ie cu rezultatul terapeutic.
Selectarea mutan]ilor rezisten]i se face numai \n prezen]a medicamentului.
Pentru a eticheta o tulpin` de micobacterii ca fiind rezistent` in vitro este necesar s`
fie dep`[it` propor]ia critic` de mutan]i rezisten]i la o concentra]ie critic` de
medicament.
Principiul antibiogramei: indiferent de metoda de testare folosit`, se compar`
cre[terea bacterian` de pe tuburile test (con]inånd medicamente), cu cea de pe
tuburile martor, dup` \ns`mån]area unui e[antion reprezentativ din popula]ia bacilar`
de testat.

Antibiograma direct`
Folose[te ca inocul produs patologic con]inånd o cantitate mare de BAAR, dup`
decontaminare. Are dezavantajul erorilor de e[antionare a inoculului bacterian [i a
ratei de contaminare similar` cu a culturilor.

Antibiograma indirecta
Inoculul bacterian se prepar` din cultur`. Are avantajul dimension`rii corecte a
inoculului bacterian, cu o rat` de contaminare nul` (cu condi]ia unei tehnici corecte)
\ns` prelunge[te timpul de aflare a rezultatului cu 3-4 s`pt`måni.

Metode standardizate acceptate

a. Folosind mediul solid Lowenstein Jensen:
- Metoda propor]iilor (Canetti, Franta) - m`soar` propor]ia de bacili rezisten]i
din totalul bacililor \ns`mån]a]i, la o concentra]ie dat` de substan]a
antituberculoas`.
- Metoda concentra]iilor absolute (Meissner, Germania) - ia \n considera]ie cea
4
mai mic` concentratie de substan]` antituberculoas` care inhib` cre[terea sau
permite o cre[tere a mai pu]in de 1% din inoculul standardizat.
- Metoda raportului rezisten]ei (Mitchison, Anglia) - compar` pentru fiecare
tulpin` [i substan]` antituberculoas` CMI (Concentra]ia minima inhibitorie) cu
CMI a tulpinii H37Rv.

35
 b. Folosind mediul lichid:
b Metoda Bactec 460 (Becton Dickinson) – radiometric`; compar` cre[terea din
tubul martor (inocul 1%) cu cea din tuburile test (inocul 100%)
b Metode rapide, \n curs de standardizare:
o Testul luciferazei (Jacobs). Principiu: Micobacteriile viabile sunt infectate
cu bacteriofagi care transport` gena luciferazei. Luciferaza interac]ioneaz`, \n
prezen]a ATP-ului, cu luciferina care emite lumin`. Germenii rezisten]i continu`
s` produc` (ATP), respectiv lumin`.
o LIPA-Rif TB (Line Probe Assay). Permite diagnosticul rapid al RMP
rezisten]ei. Presupune fragmentarea ADN-ului, amplificarea regiunii rpo-ß,
hibridizarea - \n linie - cu secven]e nucleotidice complementare din regiunea
rpo-ß. Lipsa liniilor de hibridizare semnific` rezisten]a.
o FASTPlaque TB (Biotech, Ipswich, Suffolk, UK). Suspensia bacterian`
incubat` ini]ial 24 ore \n prezen]a unor substan]e antituberculoase este infectat`
cu fag D29. Fagul se multiplic` \n celulele viabile [i le lizeaz`. Se adaug`
suspensie de M. smegmatis care va fi infectat`, rezultand „pl`ci”circulare de liz`
vizibile cu ochiul liber.
o Metode rapide care folosesc reducerea s`rurilor de tetrazoliu sau
resazurina ca indicatori ai cre[terii bacteriene (Morcillo, Palomino).

Este absolut necesar` folosirea unei tehnici de lucru standardizate deoarece

rezultatele antibiogramei sunt influen]ate de mai mul]i factori:

A. Inoculul bacterian
b Trebuie folosit` pentru testare cultura tån`r`, \n faza logaritmic` de
multiplicare, bogat`, con]inånd mai mult de 10 colonii \n cultura primar`.
b Trebuie dimensionat astfel \ncåt s` determine cre[tere de colonii izolate,
num`rabile pe tubul martor (se va ]ine seama de metoda folosit` pentru testare).

B. Medicamentele antituberculoase
b Se folose[te numai substan]a pur`, p`strata conform recomand`rilor
produc`torului.
b Cånt`rirea substan]elor trebuie s` fie exact`, avånd \n vedere con]inutul \n
substan]a activ` (mg/g).
b Dizolvarea substan]elor [i diluarea solu]iilor se va face ]inånd seama de
particularit`]ile fiec`rei substan]e \n parte.
b Coagularea mediului pe baz` de ou se va face la o temperatur` la care s` nu
inactiveze substan]ele antituberculoase.

C. P`strarea mediului pentru antibiograme se face cel mult o lun`, la 5-8°C.

36
 ANTIBIOGRAMA PENTRU MICOBACTERII
Tehnica indirect`, metoda concentra]iilor absolute
Prepararea inocului bacterian
Se folose[te cultura de 21-30 zile (de la data \ns`mån]`rii):
- primo-cultura cu cre[tere de 2-3+,
- subcultura \n cazul primo-culturii \mb`trånite sau s`race dar nu mai pu]in de
10 colonii.
Pentru subcultur`, indiferent de motiv, se preleveaz` din cåt mai multe colonii.

Preg`tirea materialelor
b Se scot din frigider mediile corespunz`toare num`rului de tulpini care
urmeaz` s` fie testate.
b Se numeroteaz` cu marker permanent cåte o serie de tuburi pentru fiecare
tulpin`, cu num`rul din registru al culturii. Utiliz`m cåte dou` tuburi martor [i
cåte un tub pentru fiecare substan]` antituberculoas` [i fiecare concentra]ie.
b Se numeroteaz` tuburile pentru prepararea suspensiei bacteriene, tuburile
pentru prepararea inoculului standardizat [i tuburile pentru prepararea dilu]iei de
\ns`mån]at.
b Se repartizeaz` cåte 1 ml ap` distilat` steril` (AD) \n tuburile pentru
prepararea suspensiei bacteriene [i cåte 10 ml \n tuburile pentru prepararea
dilu]iei 1/200. Se preg`tesc [i 2-3 tuburi ca rezerv`.
b Se numeroteaz` cåte o lam` de microscop pentru fiecare cultur`
b Se pun la \ndemån`: un flacon cu ap` distilat` steril`, pipete sterile cu par`,
alcool medicinal sau alt` substan]` antiseptic` / dezinfectant`.

Prepararea suspensiei bacteriene

Deoarece toate manoperele sunt generatoare de aerosoli infec]io[i se va lucra \n
hota cu flux de aer laminar. Se pipeteaz` numai cu para. Se schimb` pipeta la fiecare
noua dilu]ie.
b Se \ncarc` o ans` spatulat` cu bacterii prelevate din cåt mai multe colonii
4
(circa 5 mg), f`r` s` fie antrenat [i mediu.
b Se emulsioneaz` \n 1 ml ap` distilat` steril` (AD). La sfår[it se etaleaz` un
spot pe lam` cu num`rul corespunz`tor culturii. Dup` uscare frotiul se fixeaz` [i
se coloreaz` Ziehl Neelsen.
b Se completeaz` cu AD pån` la circa 3 ml omogenizånd f`r` a barbota.
b Se a[teapt` 30 minute s` sedimenteze flacoanele mari.
b Cu o pipet` steril` se trece supernatantul \ntr-un alt tub care are dimensiunile
etalonului pentru verificarea turbidit`]ii.
b Se ajusteaz` turbiditatea prin comparare cu un etalon preparat din vaccin
BCG liofilizat (2 fiole vaccin + 4ml AD) realizånd concentra]ia de 1mg/ml.

37
 Etalonarea se poate face [i utilizånd standardul nr. 1 McFarland. Etalonul se
poate p`stra mai mult` vreme la frigider \n eprubet` cu dop \nfiletat. Este
\ndep`rtat \n momentul \n care apar grunji de „aglutinare”. Cu 30 de minute
\nainte de utilizare etalonul este scos din frigider [i omogenizat prin agitare.
Se procedeaz` astfel:
- suspensia bacterian` din cele 2 eprubete se compar` ]inåndu-le \n fa]a unei
hårtii albe cu linii negre de 2-3 mm, paralele orizontale. Liniile trebuie s` se
vad` cu aceea[i claritate prin cele 2 eprubete.
- dac` suspensia bacterian` are turbiditatea diferit` de a etalonului se adaug`
masa bacterian` sau ap` distilat` dup` caz.

Diluarea suspensiei bacteriene

- Se ia din suspensia bacterian` de 1mg/ml (punctul f) o pic`tur` (0,05ml) [i se
dilueaz` \n 10 ml AD (dilu]ie 1/200).
- Se \ns`mån]eaz` cåte 0,2 ml (4 pic`turi) \n fiecare din cele dou` tuburi
martor [i \n fiecare tub test.
- Se inund` suprafa]a mediului cu aten]ie, astfel \ncåt inoculul s` nu ajung` la
dop.
- Se incubeaz` la 36,5-37º C, 48-72 ore \nclinat astfel \ncåt suprafa]a pantei s`
fie orizontal`, orientat` \n sus, cu capacul semi-\nfiletat.
- Dup` evaporarea lichidului se ridic` tuburile \n pozi]ie vertical`, se \nchid
complet [i se incubeaz` \n continuare pån` la 21 zile, cånd se face citirea/
interpretarea rezultatelor.

Citirea antibiogramelor
Citirea frotiurilor pentru confirmarea purit`]ii culturilor se face imediat dup`
efectuare [i colorare. Nu se vor \ns`mån]a suspensiile bacteriene care con]in microbi
de contaminare.

38
 - Citirea antibiogramelor se face la 21 zile.
- Pentru fiecare lot nou de mediu se cite[te prima dat` antibiograma de control a
tulpinii de referin]a H37Rv – care trebuie s` prezinte sensibilitate, \n caz contrar
rezultatele tuturor antibiogramelor, pentru medicamentul \n cauz`, din \ntreaga
serie, sunt incorecte [i nu se va comunica clinicianului.
- Se apreciaz` rezisten]a sau sensibilitatea \n func]ie de prezen]a sau absen]a
cre[terii pe tuburile cu substan]e antituberculoase comparativ cu tuburile martor.
- Comunicarea rezultatelor se face numai dac` pe tuburile martor sunt cel pu]in
50 de colonii [i nu mai mult de 200 colonii (inocul sub sau supraetalonat).
Coloniile trebuie s` fie distincte, num`rabile.

Interpretarea rezultatelor
- Tulpina sensibil` = absen]a cre[terii sau mai pu]in de 20 de colonii pe
tuburile cu substan]e antituberculoase. Se va nota SENSIBIL;
- Tulpina rezistent` = cre[tere pe tubul cu substan]a antituberculoas` a peste 20
de colonii. Se va nota REZISTENT;
- Antibiograma contaminat` = se constat` dezvoltarea unor colonii microbiene
de contaminare pe tuburile test sau / [i pe tuburile martor. Se va nota
ANTIBIOGRAMA CONTAMINAT~;
- Nu s-au dezvoltat germeni. Pe tuburile martor nu este cre[tere bacterian` sau
sunt mai pu]in de 50 de colonii. Se va nota NEINTERPRETABIL.

Eliberarea rezultatelor se face pe formulare tipizate, conform PNCT \n vigoare.

Exprimarea rezultatelor
Se va nota una dintre urm`toarele variante:
- SENSIBIL
- REZISTENT
- ANTIBIOGRAMA CONTAMINAT~
- NEINTERPRETABIL

Tehnica indirect`, metoda propor]iilor

Prepararea inocului bacterian.
4
Se folose[te cultura de 21-30 zile de la data \ns`mån]`rii:
- primo-cultura cu cre[tere de 2-3+,
- sau subcultura \n cazul primo-culturii \mb`trånite sau s`race dar nu mai pu]in
de 10 colonii. Pentru subcultur`, indiferent de motiv, preleveaz` din cåt mai multe
colonii.

Preg`tirea materialelor
- Se scot din frigider mediile corespunz`toare num`rului de tulpini care
urmeaz` s` fie testate.
- Se numeroteaz` cu marker permanent cåte o serie de tuburi pentru fiecare
tulpin`, cu num`rul din registru al culturii [i cu dilu]ia inoculului (cåte dou`

39
 tuburi martor pentru fiecare dilu]ie [i cåte un tub cu fiecare substan]`
antituberculoas` pentru fiecare dilu]ie).
- Se numeroteaz` tuburile pentru prepararea suspensiei bacteriene, tuburile
pentru prepararea inoculului standardizat [i tuburile pentru prepararea dilu]iei de
\ns`mån]at (cåte 5 tuburi pentru dilu]ii).
- Se repartizeaz` cåte 1 ml ap` distilat` steril` (AD) \n tuburile pentru
prepararea suspensiei bacteriene [i cåte 10 ml \n tuburile pentru prepararea
dilu]iilor. Se preg`tesc [i 2-3 tuburi ca rezerv`.
- Se numeroteaz` cåte o lam` de microscop pentru fiecare cultur`.
- Se pun la \ndemån`: un flacon cu ap` distilat` steril`, pipete sterile cu par` (1
sau 2 ml), alcool medicinal sau alt` substan]` antiseptic` / dezinfectant`.

Prepararea suspensiei bacteriene

Deoarece toate manoperele sunt generatoare de aerosoli infec]io[i se va lucra \n
hota cu flux de aer laminar. Se pipeteaz` numai cu para. Se schimb` pipeta la fiecare
noua dilu]ie!
- Se \ncarc` o ans` spatulat` cu bacterii prelevate din cåt mai multe colonii
(circa 5 mg), f`r` s` fie antrenat [i mediu.
- Se emulsioneaz` \n 1 ml ap` distilat` steril` (AD). La sfår[it se etaleaz` un
spot pe lam` cu num`rul corespunz`tor culturii. Dup` uscare frotiul se fixeaz` [i
se coloreaz` Ziehl Neelsen.
- Se completeaz` cu AD pån` la circa 3 ml. Se omogenizeaz` f`r` a barbota.
- Se a[teapt` 30 minute s` sedimenteze flacoanele mari.
- Cu o pipet` steril` se trece supernatantul \ntr-un alt tub care are dimensiunile
etalonului de turbiditate.
- Se ajusteaz` turbiditatea prin comparare cu un etalon preparat din vaccin
BCG liofilizat (2 fiole vaccin + 4ml AD - se autoclaveaza) realizånd concentra]ia
de 1mg/ml. Etalonarea se poate face [i utilizånd standardul nr. 1 McFarland.
Suspensia bacterian` astfel etalonata corespunde la 106 - 107 UFC/ ml.

Etalonul se poate p`stra mai mult` vreme la frigider \n eprubeta cu dop \nfiletat.
Este \ndep`rtat \n momentul \n care apar grunji de „aglutinare”. |nainte de utilizare
cu 30 de minute etalonul este scos din frigider [i omogenizat prin agitare.

Se procedeaz` astfel :
- suspensia bacterian` din cele 2 eprubete se compara ]inåndu-le \n fa]a unei
hårtii albe cu linii negre de 2-3 mm, paralele orizontale. Liniile trebuie s` se vad` cu
aceea[i claritate prin cele 2 eprubete.
- dac` suspensia bacterian` are turbiditatea diferit` de a etalonului se ad`uga
masa bacterian` sau ap` distilat` dup` caz.

Diluarea suspensiei bacteriene

- Se schimb` pipeta dup` fiecare dilu]ie.
- Cu o pipeta steril` se ia 1 ml din suspensia bacterian` de 1mg/ml (punctul f)
[i se dilueaz` \n 9 ml AD (dilu]ie 10-1).
- Dup` omogenizare, se ia 1 ml din dilu]ia 10-1 [i se transvazeaz` \n 9 ml AD
(dilu]ie 10-2).

40
 - Se continu` \n acela[i fel pån` la realizarea dilu]iei de 10-5.
- Se \ns`mån]eaz` din dilu]ia 10-3 cåte 0,2 ml \n fiecare din cele dou` tuburi
martor [i \n fiecare tub test.
- Se \ns`mån]eaz` din dilu]ia 10-5 cåte 0,2 ml \n fiecare din cele dou` tuburi
martor [i \n fiecare tub test.
- Se inund` suprafa]a mediului cu aten]ie, astfel \ncåt inoculul s` nu ajung` la
dop.
- Se incubeaz` la 36,5-37º C, 48-72 ore \nclinat astfel \ncåt suprafa]a pantei s`
fie orizontal`, orientat` \n sus, cu capacul semi-\nfiletat.
- Dup` evaporarea lichidului se ridic` tuburile \n pozi]ie vertical`, se \nchid
complet [i se incubeaz` \n continuare pån` la 28 zile, cånd se face prima citire /
interpretare a rezultatelor.

Citirea [i interpretarea rezultatelor.

Citirea frotiurilor pentru confirmarea purit`]ii culturilor se face imediat dup`
efectuare [i colorare.
Nu se vor \ns`mån]a suspensiile bacteriene care con]in microbi de
contaminare

Prima citire a antibiogramei se face dup` 28 de zile de la \ns`mån]are. Se \ncepe

cu citirea rezultatelor pentru tulpina H37 Rv pus` \n lucru pentru fiecare lot nou de
mediu. |n interpretarea rezultatelor tuturor antibiogramelor care folosesc acela[i lot se
va face referire la aceasta interpretare.
Se examineaz` tuburile martor pentru tulpinile de testat, num`rånd coloniile.
b Dac` pe tuburile test nu este cre[tere bacterian` se considera tulpina
SENSIBIL~.
b Dac` cre[terea pe tuburile test este mai mare decåt 1% din media numarul
coloniilor de pe tuburile martor se consider` ca tulpina este REZISTENT~ la
acea substan]` antituberculoas`.
b Dac` pe tuburile test cre[terea este mai mic` decåt 1% din media num`rul
coloniilor de pe tuburile martor se vor reincuba tuburile corespunz`toare tulpinii
respective pån` la 35 de zile, cånd se face citirea final`.
4

41
 Capitolul V
IDENTIFICAREA MICOBACTERIILOR
Micobacteriile implicate \n producerea tuberculozei apar]in „complexului M.
tuberculosis“ din care fac parte: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis
inclusiv tulpina vaccinal` (BCG), \n cazul pacien]ilor cu infec]ie HIV/SIDA,
Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canetti.

Dintre acestea, pentru patologia uman` ne intereseaz` doar primele trei specii.

Toate laboratoarele care realizeaz` cultivarea micobacteriilor trebuie s` poat`

identifica M. tuberculosis, M. bovis [i M. africanum.
Celelalte specii micobacteriene, dintre care unele pot produce micobacterioze la
om, vor fi identificate la nivelul LNR.
|n procesul de identificare se efectueaz` o baterie de teste. Nici unul dintre
testele fenotipice nu are valoare absolut`. Oricare dintre testele utilizate, luat separat,
are valoare orientativ`.
Identificarea speciilor de micobacterii se bazeaz` pe propriet`]ile diferite ale
acestora. Setul minimal de identificare a speciilor din complexul M. tuberculosis
(CMT) include:
- aprecierea morfologiei macroscopice a coloniilor (inclusiv a cromogenit`]ii /
lipsei acesteia);
- demonstrarea caracterului de acido-alcoolo-rezisten]` (coloratia Ziehl Neelsen)
a microorganismelor din coloniile izolate;
- examinarea ritmului de multiplicare \n subcultur` (lent, peste 14 zile), la o
temperatur` cuprins` \ntre 35-37º C;
- testul nitrat reductazei;
- testul producerii de niacin`.
Setul minimal de teste de identificare poate fi completat de:
- testarea producerii unei catalaze termosensibile;
- testarea rezisten]ei tulpinii izolate la 5 µg/ml hidrazida acidului tiophen 2
carboxilic (TCH);
- testarea sensibilit`]ii tulpinii izolate la 500µg/ml acid para nitro benzoic (PNB).

1. Morfologia macroscopic` a coloniilor

Morfologia macroscopic` a coloniilor pe mediul Lowenstein Jensen con]inånd
glicerol:
Mycobacterium tuberculosis- colonii rugoase (R), de 1-4 mm diametru, crem-
g`lbui conopidiforme, uscate, cu margini crenelate.
Mycobacterium bovis- colonii netede (S), de 1-2 mm diametru, alb-g`lbui,
bombate. |n subculturi pot avea caracter rugos (R).
Mycobacterium africanum- caractere morfologice intermediare \ntre speciile
men]ionate mai sus.
Examinarea se va face cu ochiul liber [i cu lupa.
|n aprecierea morfologiei macroscopice a coloniilor trebuie avute \n vedere
vårsta culturii [i calit`]ile mediului de cultur`, gradul sau de hidratare, caracteristicile
de mai sus avånd doar valoare orientativ`.

42
 2. Morfologia microscopic`
Se apreciaz` dup` realizarea frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen, numai pentru
micobacteriile din culturi, la circa 3-6 s`pt`måni de la \ns`mån]area produsului
patologic.
|ntr-o pic`tur` de ap` distilat` (lichid Ridley: clorur` mercuric` 2g,
Formaldehida 40% 10 ml, Acid acetic glacial 3 ml, Ap` distilat` pån` la 100 ml) se
descarc` un fragment dintr-o colonie de cercetat, prin mi[c`ri circulare.
Se noteaz` modul de emulsionare: micobacteriile din CMT formeaz` grunji \n
lichidul de emulsionare; MOTT - \n marea lor majoritate, se emulsioneaz` uniform.
Se coloreaz` Ziehl-Neelsen. Se examineaz` la microscopul optic, utilizånd un
ocular 10x, obiectiv 10x, apoi ocular 10x, obiectiv 100x.
|n aprecierea final` se vor men]iona urm`toarele:
Modul de a[ezare \n frotiu:
- prezen]a de corzi-serpentine, cu num`r mic de BAAR izola]i (PC = pozitiv
corzi);
- prezen]a de gr`mezi de bacili, respectiv bacili aglomera]i \n mai multe zone,
f`r` a se putea urm`ri continuitatea sub forma unor corzi, cu num`r mic de
BAAR izola]i (PG = pozitiv gr`mezi);
- bacili distribui]i uniform, nesistematizat (PN = BAAR pozitiv, a[eza]i
nesistematizat). Eventual se descrie modul de a[ezare;
- prezen]a de corzi laxe, cu pu]ine zone libere.
Lungimea bacililor:
- bacili mai lungi de 7 µm. Se va men]iona dac` sunt prezen]i bacili ramifica]i.
- bacili cu lungimea \ntre 3-6 µm;
- bacili de 2 µm sau forme cocoide.
Tinctorialitatea bacililor:
- BAAR colora]i uniform;
- BAAR colora]i granular;
- BAAR incomplet colora]i, alba[tri, cianofili.

3. Evaluarea timpului necesar pentru dezvoltarea coloniilor

Principiu.
Se apreciaz` timpul de dezvoltare a coloniilor \ntr-o subcultur` care con]ine
colonii num`rabile (10-100 colonii).

Se apreciaz` numai \n subculturi!

Materiale [i reactivi necesari:

Apa distilat` steril`, tuburi cu mediu Lowenstein Jensen, tuburi sterile cu capac
filetat, pipete sterile cu par`, ans` bacteriologic`.

Timp necesar:
10-15 minute (dup` 7-30 zile din momentul realiz`rii subculturii pentru
complexul M. tuberculosis [i 3-5 zile pentru micobacteriile cu ritm de multiplicare
rapid).

Tehnica:
5
- Din cultura de identificat se face o suspensie bacterian` cåt mai bine
omogenizat`, se las` 30 minute s` sedimenteze particulele mari apoi se
etaloneaz` la 1 mg/ml mas` bacterian`.

43
 - Se dilueaz` 10-4 [i 10-6, din fiecare dilu]ie \ns`mån]ånd 0.2 ml \n cåte un tub
cu mediu de cultur`.
- Se inund` uniform suprafa]a mediului, se \nchide par]ial dopul [i se
incubeaz` la 37º C examinånd zilnic.
- Dup` evaporarea excesului de lichid se \nfileteaz` complet dopul [i se
incubeaz` \n continuare \n pozi]ie vertical` examinånd zilnic.

Interpretarea rezultatelor:
Se iau \n considerare coloniile vizibile cu ochiul liber notånd timpul necesar
dezvolt`rii acestora.
Coloniile micobacteriilor din complexul M. tuberculosis apar dup` circa 7 zile
de la \ns`mån]are, aprecierea f`cåndu-se pentru tubul cu 10-100 colonii.

Precau]ii, limite ale testului.

Dac` se suspecteaz` prezen]a concomitent` a mai multor specii micobacteriene
este necesar` mai \ntåi ob]inerea de colonii izolate [i culturi pure, pentru fiecare tip
morfologic. Este necesar` aprecierea ritmului de multiplicare pentru fiecare \n parte.

4. Evaluarea temperaturii optime de dezvoltare

Tuburile preg`tite pentru aprecierea ritmului de multiplicare se incubeaz` la
25-28º C, 35-37º C [i 42º C, notånd temperatura la care se constat` dezvoltarea
culturii bacteriene.
Micobacteriile din complexul M. tuberculosis cresc la 35 - 37º C.

5. Evaluarea pigment`rii coloniilor [i respectiv a

fotoreactivit`]ii
Principiu:
- Micobacteriile pot sintetiza pigmen]i carotenoizi care confer` coloniilor
culori care pot varia de la galben la ro[u.
- La micobacteriile scotocromogene pigmentogeneza are loc \n absen]a
luminii, expunerea ulterioar` la lumina intensificånd uneori pigmentarea
coloniilor. Micobacteriile fotocromogene pigmentogeneza necesit` expunerea la
lumin` [i oxigen.
- |n cazul altor micobacterii (cum sunt cele care apar]in complexului M.
tuberculosis) pigmentogeneza nu are loc, indiferent de expunerea la lumin`.

Materiale [i reactivi necesari:

- tuburi cu mediu de cultur` Lowenstein Jensen solidificat \n pant`
- tuburi de 16x125 mm
- pipete sterile cu par`
- lamp` cu bec de 60 W.

Timp necesar:
aproximativ 1 zi (se utilizeaz` subculturi \n vårst` de 2 s`pt`måni)

Tehnica:
- suspensia bacterian` precum cea descris` \n cazul evalu`rii timpului de
multiplicare \n vederea ob]inerii de colonii izolate este \ns`mån]at` \n dou`
tuburi cu mediu solidificat \n pant`. Imediat dup` \ns`mån]are, unul dintre tuburi

44
 se \nvele[te \n hårtie neagr`. Se incubeaz` ambele tuburi.
- Se examineaz` s`pt`månal tubul ne\nvelit, pentru a surprinde apari]ia
coloniilor.
- Se noteaz` absen]a sau prezen]a pigment`rii coloniilor \n tubul ne\nvelit,
dup` care se examineaz` tubul care a fost \nvelit \n hårtie de culoare neagr`.
- |n cazul \n care coloniile din tubul \nvelit nu sunt pigmentate, cultura se va
expune 1-2 ore la lumina unui bec de 60 W, la o distan]` de 20 cm de acesta, cu
capacul desf`cut, pentru a favoriza oxigenarea.
- Se incubeaz` 24 ore la 37º C. Se examineaz` din nou.

Interpretarea rezultatelor:
Compararea culturii expuse la lumin` cu cea neexpus` la lumin` permite
clasificarea tulpinii examinate drept scotocromogen`, fotocromogen` sau
necromogen`.

Precau]ii, limite ale testului

Cultura trebuie s` nu fie prea abundent`, pentru asigurarea cantit`]ii de oxigen
necesara pigmentogenezei.

6. Testarea producerii de nitrat reductaz`

Principiu:
Este cunoscut faptul c` M. tuberculosis produce nitrat reductaz`. Acest test
al`turi de testul producerii de niacin` este util \n diferen]ierea
M. tuberculosis de alte specii micobacteriene.

Timp necesar:
aproximativ 3 ore (dup` 2-4 s`pt`måni de multiplicare \n culturi)

Tehnica:
a. Metoda clasic` (Virtanen, cu reactivi lichizi)
- Se pun 0,2 ml solu]ie salin` fiziologic` steril` \ntr-o eprubet` cu buson.
- Se emulsioneaz` \n solu]ia salin` fiziologic` dou` anse prelevate din cultura
de 3-4 s`pt`måni.
- Se adaug` 2 ml solu]ie de tampon azotat de sodiu ca substrat.
- Se agit`, apoi se incubeaz` \n pozi]ie vertical` \n baie de ap` la 37º C, 3 ore.
- Dup` ce eprubeta este adus` la temperatura camerei se adaug` \n ordine: 1
pic`tura HCl (se agita tubul), 2 pic`turi solu]ie de sulfanilamid` 0,2 % [i 2
pic`turi N-naphthylethylene-diamin` 0,1 %.
- Se examineaz` imediat pentru a identifica apari]ia unei culori ro[ie,
comparånd cu standardul de culoare (prezentat mai jos).

Interpretare
Test negativ:
Lipsa de culoare a lichidului de reac]ie. Dac` nu apare nici o culoare testul este
negativ sau a avut loc „trecerea” peste reac]ia nitrit.
Se adaug` o cantitate mic` de pudr` de zinc \n toate tuburile pentru care testul
este negativ, agitånd fiecare tub \n parte.
Dac` nitratul este \nc` prezent el va fi catalizat de zinc [i va ap`rea culoarea
5
ro[ie, indicånd un test real negativ.
Dac` nu se schimb` culoarea spre ro[u, nitratul a fost prezent dar s-a dep`[it

45
 etapa nitritului. Este necesar` repetarea testului pentru confirmare.
Test pozitiv:
Culoare ro[ie, de la roz pån` la ro[u-violaceu a lichidului de reac]ie.
Se iau \n considerare rezultatele pozitive de la ro[u, la ro[u-violaceu (de la 3+ la
5+). Nuan]ele de roz impun repetare (+/-, la 2+).

b. Metoda cu bandelete de hårtie impregnate cu reactivi

- Se pune 1 ml solu]ie salin` fiziologic` steril` \ntr-o eprubet` cu bu[on.
- Se emulsioneaz` \n solu]ia salin` fiziologic` dou` anse prelevate din cultura
de 3-4 s`pt`måni.
- Folosind o pens` steril` se introduce atent bandeleta test cu s`geata \n jos
direct \n lichid, f`r` s` se ude cu lichid de pe pere]ii eprubetei.
- Se pune bu[onul [i se incubeaz` vertical la 37º C timp de 2 ore.
- Dup` o or` se agit` blånd tubul, f`r` a-l r`sturna.
- Dup` dou` ore de incubare se rastoarn` tubul de 6 ori \n a[a fel \ncåt toat`
bandeleta s` fie udat`.
- Se las` tubul timp de 10 minute, \n pozi]ie \nclinat`, \n a[a fel \ncåt lichidul
s` acopere bandeleta.
- Se examineaz` por]iunea de sus a bandeletei pentru a vedea dac` apare
culoarea albastr` (pozitiv), comparånd cu standardul de culoare (prezentat mai
jos).

Interpretare
Test negativ:
Nu se schimb` culoarea bandeletei.
Test pozitiv:
Por]iunea de sus a bandeletei se coloreaz` \n albastru, albastru \nchis.
Pentru fiecare lot de reactivi se testeaz` [i cultura de M. tuberculosis H37Rv
(martor pozitiv) precum [i reactivii \n lipsa culturii (martor negativ).

Precau]ii, limite ale testului

Culturile testate trebuie s` aib` o vårst` de maxim 3-4 s`pt`måni [i s` fie
abundente.
Trebuie verificat` data expir`rii reactivilor folosi]i.
Bandeletele se p`streaz` la \ntuneric, \n flacon bine \nchis, la frigider.
Daca tubul martor pozitiv d` reac]ie slab pozitiv` sau negativ`, rezultatul nu va
fi luat \n considerare.

Materiale [i reactivi necesari (pentru care dintre teste?????):

Eprubete cu bu[on, pens`, pipete cu par`, nitrat de sodiu, fosfat monopotasic,
fosfat disodic, acid clorhidric concentrat, sulfanilamid`, N-naftiletilen-diamin`,
tulpin` de M. tuberculosis H37Rv.
1. Tampon nitrat - substrat. Se prepar` o solu]ie de nitrat de sodiu 0,01 M \n
tampon fosfat 0,022 M, pH 7 astfel:
Solu]ia 1 KH2PO4 3.02 g
Ap` distilat` pån` la 1000 ml
Solu]ia 2 Na2HPO4 3,16 g
Ap` distilat` pån` la 1000 ml
Solu]ia 3 Se amesteca bine 611 ml din solu]ia 2 cu 389 ml din solu]ia 1.
pH-ul solu]iei finale trebuie s` fie 7.

46
 2. Solu]ia tampon nitrat
NaNO3 0,85 g
Solu]ia 3 1000 ml
Se dizolv` nitratul de sodiu \n tamponul fosfat [i se repartizeaz` cåte 100 ml \n
flacoane brune. Se sterilizeaz` prin autoclavare, 15 minute la 121ºC.
Se noteaz` data prepar`rii [i denumirea solu]iei pe flacon.

3. Solu]ia de acid clorhidric

HCl concentrat 10 ml
Ap` distilat` 10 ml
Aten]ie: se adaug` \ncet acidul \n ap`, niciodat` invers!
Se p`streaz` \n flacoane de culoare brun`, la frigider.

4. Solu]ia de sulfanilamida 0,2 %

Sulfanilamid` 0,2 g
Ap` distilat` 100 ml
Se dizolv` [i se p`streaz` la frigider \n flacoane de culoare brun`.

5. N-naftiletilen-diamina 0,1 %
N-naftiletilen-diamina 0,1 g
Ap` distilat` 100 ml
Se dizolv` [i se p`streaz` la frigider \n flacoane de culoare brun`.

Standard de culoare pentru testul nitrat reductazei

Pentru facilitarea interpret`rii rezultatelor se recomand` folosirea unei serii de 6
tuburi con]inånd o solu]ie colorat`, cu nuan]e care corespund notific`rii de la +/- pån`
la 5+. Acestea se p`streaz` la temperatura frigiderului.
Rezultatele se interpreteaz` prin comparare cu tuburile de control, de fiecare
dat` cånd este efectuat testul nitrat reductazei.

Solu]ii stoc:
1. Fosfat disodic 0,067M (9,47g Na2 HPO4 la 1000 ml ap` distilat`)
2. Fosfat monopotasic 0,067M (9,07g KH2 PO4 la 1000 ml ap` distilat`)
3. Fosfat trisodic 0,067M (25,47 g Na3 PO4 12H2O la 1000 ml ap` distilat`)
4. Fenolftalein` 1% (1g fenolftalein` \n 100 ml alcool etilic 95%)
5. Albastru bromtimol 1% (1g albastru de bromtimol \n 100 ml alcool etilic 95%)
6. Albastru bromtimol 0,01% (se introduce 1 ml solu]ie albastru bromtimol 1%
\n 100 ml ap` distilat`).

Tamponul de lucru:
Se amestec` 35 ml solu]ie stoc 1 cu 5 ml solu]ie stoc 2 [i 100 ml solu]ie stoc 3.

Prepararea solu]iilor standard:

b Se utilizeaz` 8 tuburi curate, numerotate 1-8, care sunt puse \ntr-un stativ.
Tuburile trebuie s` aib` acelea[i dimensiuni cu cele \n care se va face testul !
b Se pun cåte 2 ml din tamponul de lucru \n tuburile numerotate 2-8.
b Separat, la 10 ml tampon de lucru se adaug` 0,1 ml din solu]ia 4 [i 0,2 ml din
solu]ia 6, rezultånd solu]ia 7.
b Se pun 2 ml din solu]ia 7 \n tubul num`rul 1. Acesta reprezint` tubul
standard de culoare 5+.
b La tubul 2 din seria de tuburi se adaug` 2 ml din solu]ia 7. Se amestec` bine,
5
apoi se transfer` 2 ml \n tubul urm`tor. Se continu` \n acest fel dilu]iile seriale,
aruncånd 2 ml din tubul 8.

47
 b Standardul de culoare:
tubul 1 = 5+ tubul 5 = 2+
tubul 2 = 4+ tubul 6 = 1+
tubul 3 = 3+ tubul 8 = +/-
Se \nchid tuburile, se autoclaveaz` [i se p`streaz` la 4º C.

7. Testarea producerii de niacin` (Konno-1956)

Principiu:
Toate micobacteriile sintetizeaz` niacin` (acidul nicotinic) \ns`, datorit` bloc`rii
metaboliz`rii acesteia, \n cazul tulpinilor de M. tuberculosis, niacina se acumuleaz`
\n mediul de cultur`. Marea majoritate a tulpinilor de M. tuberculosis sunt pozitive la
testul Konno. Un num`r restråns de specii micobacteriene altele decåt M.
tuberculosis, pot conduce la o reac]ie pozitiv`. Niacina extras` din mediu
reac]ioneaz` cu bromura de cianogen colorånd lichidul de reac]ie \n galben.

Timp necesar:
1 or` (se utilizeaz` culturi \n vårst` de 4-6 s`pt`måni, dezvoltate pe mediul
Lowenstein Jensen).

Tehnica:
Cultura dezvoltat` pe mediul Lowenstein Jensen este inundat` cu 1,5 ml ap`
distilat`; tubul se men]ine timp de 30 minute la temperatura camerei \n pozi]ie
\nclinat`, pentru extragerea niacinei. Ulterior, tubul este men]inut timp de 5-10
minute \n pozi]ie vertical`, pentru a permite apei s` se adune \n partea decliv`.
Cu o pipet` cu par` se extrag 0,5 ml lichid care se pune \ntr-un tub de 10/100
mm cu capac filetat.

a. Metoda cu bandelete de hårtie impregnate cu reactivi

- Bandeleta pentru testul niacinei se pune cu o pens`, cu s`geata \n jos, \n tubul
cu lichid de extrac]ie, astupånd imediat tubul. Se agit` u[or.
- Se examineaz` culoarea lichidului (nu a bandeletei !) \n primele 15-20
minute.
- Se adaug` 2-3 ml NaOH 4% la fiecare tub, apoi se autoclaveaz`.

b. Metoda clasic` (cu reactivi lichizi)

- Se adaug` 0.5 ml solu]ie de anilin` 4% (vezi mai jos) [i 0,5 ml solu]ie de
bromura de cianogen 10%.
- Se astup` tubul [i se observ` apari]ia culorii galbene, \n urm`toarele 5
minute.
- Culoarea galben` apare ca un inel la interfa]a dintre cei doi reactivi sau, dac`
tubul este agitat, tot lichidul este colorat.
- Se adaug` 2-3 ml NaOH 4% la fiecare tub, apoi se autoclaveaz`.

Interpretarea rezultatelor:
Test negativ: lichidul r`måne incolor.
Test pozitiv: lichidul de extrac]ie se coloreaz` \n galben.
Pentru fiecare serie de teste se folose[te un martor sigur pozitiv (Mycobacterium
tuberculosis H37Rv) [i un martor negativ (extract apos din mediu f`r` cultur`).

48
 Precau]ii, limite ale testului Kono:
- Fiind o metod` de extrac]ie, dac` cultura acoper` toat` suprafa]a mediului
este necesar` scrijelirea suprafe]ei culturii cu ansa.
- Culturile tinere sau s`race (cu mai pu]in de 50 colonii) pot da rezultat
negativ.
- Culturile ce urmeaz` s` fie testate trebuie aerate.
- Dac` rezultatul testului f`cut pe o cultur` de 4 s`pt`måni este negativ, se
repet` testul utilizånd o cultur` de 6 s`pt`måni.
- Suprainfectarea culturii poate altera rezultatul.
- Testul este calitativ.
- Exist` unele specii micobacteriene (spre ex. M. simiae, M. kansasii, M.
marinum, M. avium, M. fortuitum), pentru care testul Konno poate fi pozitiv.
- |n cazul folosirii bandeletelor se va verifica data expir`rii.
- Este obligatorie neutralizarea acidului hidrocianic (extrem de toxic) dup`
fiecare testare, prin ad`ugarea a 2-3 ml hidroxid de sodiu 4% \n fiecare tub de
reac]ie, dup` care tuburile se autoclaveaz`.

Materiale [i reactivi necesari:

- Tuburi de 10/100mm cu capac filetat, pensa, ap` distilat` steril`, bandelete
pentru testul niacinei, hidroxid de sodiu 4%, pipete sterile cu par`, stativ pentru
tuburi.
- Dac` se folose[te testul clasic sunt necesari reactivii men]iona]i \n continuare.

1. Solu]ie de anilin` 4% (anilina este o substan]` cancerigen`!)

Anilin` limpede, incolor` 4 ml
Etanol 95% 96 ml
Se p`streaz` \n flacoane de culoare brun` (ferit de lumin`), la frigider.
Solu]ia nu se mai folose[te dac` se \ng`lbene[te.

2. Bromur` de cianogen solu]ie 10% (toxic`, inflamabil` [i cancerigen` !)

Se lucreaz` numai \n hot` cu protec]ie chimic`, folosind m`nu[i (substan]a poate
penetra prin tegument).
Cristale de bromur` de cianogen 5g
Ap` distilat` 50 ml
Se pun cristalele de bromur` de cianogen \n ap` distilat`, se astup` bine flaconul
[i se las` la temperatura camerei pentru dizolvare (circa 24 ore).
NU se \nc`lze[te la flac`r` pentru dizolvare !
Se p`streaz` \n flacoane de culoare brun` (bine \nchise), la frigider.
Pentru redizolvarea precipitatelor formate la rece solu]ia se men]ine la
temperatura camerei \nainte de folosire.
Se prepar` \n cantit`]i mici deoarece este volatil` [i se produce sc`derea
concentra]iei. Solu]iile cu concentra]ie sc`zut` vor da o reac]ie fals negativ`.

8. Testarea prezen]ei unei catalaze termolabile

Principiu:
- Toate micobacteriile sintetizeaz` catalaza, enzim` care descompune
peroxidul de hidrogen \n apa [i oxigen, \ns` \n cazul tulpinilor care apar]in
complexului M. tuberculosis catalaza se inactiveaz` dup` \nc`lzire la 68º C timp de
20 minute.
5
- Unele tulpini care sunt rezistente la hidrazida acidului izonicotinic (INH)
pierd activitatea catalazic` [i la temperatura camerei.

49
 Timp necesar:
aproximativ 1 or` (se utilizeaz` culturi \n vårst` de 2-3 s`pt`måni).

Tehnica:
- \n dou` tuburi de 16x125mm cu capac filetat se pun cåte 0,5 ml de tampon
fosfat 0,067M, pH 7, folosind o pipet` cu par`, steril`.
- \n condi]ii sterile, se suspend` cåte o ans` de cultur` \n fiecare dintre cele 2
tuburi. Unul din tuburi se las` la temperatura camerei, iar cel`lalt se pune \n baia
de ap` \nc`lzit` la 68º C, unde se incubeaz` timp de 20 minute.
- Dup` incubare se a[teapt` r`cirea la temperatura camerei [i se adaug` \n
ambele tuburi cåte 0,5 ml din solu]ia preparat` extemporaneu, \n p`r]i egale
(10% Tween 80 [i peroxid de hidrogen 30%).

Interpretarea rezultatelor:
- Interpretarea se face prin compararea aspectului lichidului de reac]ie din
tubul incubat la temperatura camerei cu cel incubat la 68º C, pH 7, dup` 20 de
minute, f`r` s` se agite tuburile.
- Apari]ia de bule de gaz \n lichidul de reac]ie \n ambele tuburi indic` alt`
specie decåt M. tuberculosis.
- Daca nu apar bule de gaz \n lichidul de reac]ie din tubul incubat la 68º C, dar
acestea sunt evidente \n tubul incubat la temperatura camerei, specia apar]ine
complexului M. tuberculosis.
- Martor pozitiv: M. tuberculosis H37Rv.
- Martor negativ: reactivii \n lipsa culturii.

Precau]ii, limite ale testului

- Agitarea tuburilor poate determina apari]ia de bule datorate Tween 80, f`cånd
dificila interpretarea (reac]ie fals pozitiv`)
- Nu se testeaz` culturi suprainfectare sau care con]in un amestec de specii
micobacteriene.

Materiale, reactivi necesari:

- Tuburi de 16x125mm cu capac filetat, stativ pentru tuburi, ans` bacteriologic`,
pipet` cu par`, Tween 80, peroxid de hidrogen 30%, baie de termostatare pentru 68º
C.
- Tampon fosfat 0,067M, pH 7
Solu]ia 1 Na2HPO4 anhidru 9,47 g
Ap` distilat` 1000 ml
Solu]ia 2 KH2PO4 9,07g
Ap` distilat` 1000 ml
Solu]ia 3 Tamponul fosfat: se amesteca bine 611 ml din solu]ia 1 cu 389 ml
din solu]ia 2. Se verific` pH-ul; trebuie s` fie 7. Se sterilizeaz` 20 min la 121º C.
Se p`streaz` \n flacoane de culoare brun`, la temperatura camerei.

- Amestec Tween 80-H2O2

Solu]ia 1 Peroxid de hidrogen 30 % care se p`streaz` la frigider. Se lucreaz`
cu m`nu[i, fiind coroziv.
Solu]ia 2 Tween 80 10 ml
Ap` distilat` 90 ml
Se autoclaveaz` timp de 10 min la 121 ºC. Se p`streaz` la frigider.
Solu]ia 3 Amestec extemporaneu, \n p`r]i egale, de solu]ie 1 [i solu]ie 2.

50
 9. Evaluarea rezisten]ei la Hidrazida acidului tiophen 2-
carboxilic (TCH)
Principiu:
Hidrazida acidului tiofen 2-carboxilic incorporat` \n mediul de cultur` inhib`
dezvoltarea tulpinilor de M. bovis [i M. africanum, \n timp ce multiplicarea
M. tuberculosis nu este inhibat`.

Timp necesar:
3 s`pt`måni (dup` 2- 4 s`pt`måni de multiplicare ini]ial`)

Tehnica:
- Un tub cu mediu de cultur` Lowenstein Jensen con]inånd 5 mg/l Hidrazida
acidului tiofen 2-carboxilic precum [i un tub de control, sunt \ns`mån]ate cu cåte
0,2 ml dintr-o suspensie bacterian` diluat` 10-4, din suspensia de 1 mg/ml.
- Se etaleaz` inoculul pe suprafa]a mediului [i se incubeaz` pentru cel pu]in
trei s`pt`måni. Se apreciaz` dezvoltarea coloniilor \n tubul cu TCH prin
comparare cu cea din tubul f`r` TCH (control).

Interpretarea rezultatelor:
Dezvoltarea coloniilor \n tubul cu TCH (tubul test), respectiv apari]ia unor
colonii rezistente la TCH, sus]ine presupunerea c` tulpina izolat` apar]ine speciei M.
tuberculosis. Lipsa multiplic`rii bacteriene \n tubul cu TCH semnific` prezen]a unei
tulpini sensibile la TCH [i conform anumitor autori exclude M. tuberculosis.

Precau]ii, limite ale testului:

Citirea nu se face mai repede de trei s`pt`måni.

Materiale [i reactivi necesari:

- Mediu Lowenstein Jensen con]inånd 5 mg/l Hidrazida acidului tiofen
2-carboxilic
- Tuburi 16x125 mm
- Pipete cu par`
- Ap` distilat`
- Etalon de turbiditate pentru 1 mg/ml mas` bacterian` (Mac Farland nr 1).

10. Evaluarea sensibilit`]ii la acidul Para-nitro-benzoic

(PNB 500mg/l)
Principiu:
Acidul p-nitro-benzoic (500mg/l) incorporat \n mediul de cultur` inhib`
multiplicarea M. tuberculosis, M. bovis [i M. africanum, \n timp ce dezvoltarea altor
micobacterii decåt M. tuberculosis (MOTT) nu este inhibat`.

Timp necesar:
3 s`pt`måni (dup` 2-4 s`pt`måni de multiplicare ini]ial`)

Tehnica:
5
Mediul de cultur` Lowenstein Jensen con]inånd 500mg/l PNB [i un tub de
control (mediu de cultur` f`r` PNB), sunt \ns`mån]ate cu cåte 0,2 ml dintr-o

51
 suspensie bacterian` diluat` 10-4, din suspensia de 1 mg/ml. Se etaleaz` inoculul pe
suprafa]a mediului [i se incubeaz` pentru cel pu]in trei s`pt`måni. Se apreciaz`
cre[terea din tubul test (cu PNB) prin comparare cu cea din tubul control (f`r` PNB).

Interpretarea rezultatelor:
Dezvoltarea coloniilor \n tubul cu PNB (colonii rezistente la acidul p-nitro-
benzoic), sus]ine presupunerea prezen]ei unei tulpini MOTT, \n timp ce lipsa
multiplic`rii sus]ine presupunerea prezen]ei unei tulpini apar]inånd complexului M.
tuberculosis (tulpini sensibile la PNB).

Precau]ii, limite ale testului:

Acidul p-nitro benzoic este solubil \n etilen glicol.
Reactivi necesari:
- Mediu Lowenstein Jensen con]inånd 500 mg/l PNB
- Tuburi 16x125 mm
- Pipete cu par`
- Ap` distilat`
- Etalon de turbiditate pentru 1 mg/ml mas` bacterian` (Mac Farland nr 1).

Tabel nr. X Diferen]ierea speciilor de micobacterii din complexul M.

tuberculosis

Specia M. M. bovis M.
tuberculosis africanum

Colonii rugoase, R + - -
Colonii netede, S - + +
Lungimea bacililor > 7 mm - - -
Lungimea bacililor 3-6 mm + + +
Lungimea bacililor < 2 mm + + +
Temperatura optim` de cre[tere 28º C - - -
Temperatura optim` de cre[tere 37º C + + +
Temperatura optim` de cre[tere 42º C - - -
Timpul de multiplicare > 7 zile + + +
Nitrat reductaza + - -/+
Testul niacinei + - +
Catalaza termolabil` (la 68º C) - - -
Catalaza semicantitativ` > 45mm - - -
Pigmentarea coloniilor - - -
Rezisten]a la Hidrazida + - -
acidului tiophen 2- carboxilic
Sensibilitatea la acidul Para Nitro-Benzoic + + +

52
 Anexa 1 - Prepararea frotiurilor de control
Frotiuri BAAR pozitive
- Se re]ine sputa \n care au fost pu[i \n eviden]` BAAR [i se prepar` imediat
frotiuri pozitive pentru control, care se vor p`stra dup` fixare \n cutii \nchise, la
\ntuneric, la temperatura camerei;
- La 1 ml sput` se adaug` 1 pic`tur` (0,05 ml) formol 40%, se amestec`, se
las` 1 or` la temperatura camerei;
- Se adaug` 1 ml NaOH 4%, se agit`;
- Dup` 5 minute se adaug` ap` distilat` pån` la 20 ml;
- Se amestec`;
- Se incubeaz` timp de o or` la 55-60º C;
- Se adaug` ap` distilat` pån` la 40 ml, se amestec`;
- Se centrifugheaz` timp de 20 minute la 3000xg;
- Se \nl`tur` supernatantul;
- Sedimentul se resuspend` \n 5 ml ap` distilat`;
- Se fac frotiuri sub]iri, uniforme care se usuc` [i se fixeaz`.

Frotiuri BAAR negative

Se procedeaz` ca mai sus, prelucrånd sputa pentru care s-a ob]inut rezultat
negativ BAAR. Singura diferen]`: incubarea la 55-60º C este de 10 minute pentru
negativ, fa]` de 1 or` pentru pozitiv.

Anexa 2 - Re]etele de coloran]i

1. Colora]ia Ziehl-Neelsen
b Fucsina
Solu]ia 1.
Fucsin` bazic`……………………………………3 g
Etanol 95%……………………………………100 ml
Se dizolv` fucsina \n etanol
Solu]ia 2
Fenol cristalizat……………………………………5 g
Ap` distilat`…………………………………….100 ml
Se dizolv` fenolul \n apa distilat` (se \nc`lze[te u[or dac` este nevoie).
Se folose[te numai fenol care are culoare alb`. Fenolul care este brun nu mai
poate fi folosit.
Pentru a evita topirea repetat` a fenolului se prepar` fenol lichefiat astfel:
- Se \nc`lze[te \n baie de ap`, pån` la topire complet`, 1 kg fenol cristale;
- Se adaug` 100 ml ap` distilat`;
5
- Se p`streaz` la temperatura camerei.
1 ml fenol lichefiat con]ine 1 g fenol.

53
 Fucsina fenolat`, solu]ia de lucru
Se amestec` 10 ml din solu]ia 1 cu 90 ml din solu]ia 2 [i se depoziteaz` \ntr-o
sticl` brun` la culoare.
Sticla se eticheteaz` cu numele reactivului, data prepar`rii [i data expir`rii.
Poate fi p`strat` la temperatura camerei timp de 6-12 luni.
b Amestecul decolorant
Acid clorhidric concentrat…………………………..3 ml
Etanol 95%…………………………………………97 ml

Aten]ie! Se adaug` \ncet acidul peste alcool. Niciodat` nu se adaug` alcoolul

peste acid!!! Amestecul va degaja c`ldur`.
Se depoziteaz` \ntr-o sticl` brun` la culoare.
Sticla se eticheteaz` cu numele reactivului, data prepar`rii [i data expir`rii.
Poate fi p`strat` la temperatura camerei timp de 6-12 luni.
b Albastru de metilen
Albastru de metilen……………………….0,3 g
Ap` distilat`………………………………100 ml
Se dizolv` albastru de metilen \n apa distilat` [i se p`streaz` \n sticla de culoare
brun`.
Sticla se eticheteaz` cu numele reactivului, data prepar`rii [i data expir`rii.
Poate fi p`strat` la temperatura camerei timp de 6-12 luni.

2. Colora]ia cu auramin`-rhodamin`
b Solu]ia de auramin`-rhodamin`
Auramin`…………………………..0,1 g
Rhodamin`………………………0,01 g
Ap` distilat`……………………..100 ml
Se dizolv` auramina [i rhodamina \n apa distilat`.
Solu]ia se filtreaz` prin hårtie de filtru [i se p`streaz` \n sticl` de culoare brun`.
Sticla se eticheteaz` cu numele reactivului, data prepar`rii [i data expir`rii.
Poate fi p`strat` la temperatura camerei timp de 1 lun`.
b Amestecul decolorant – vezi colora]ia Ziehl-Neelsen
Permanganat de potasiu ……………..0,5 g
Ap` distilat` …………………………..100 ml
Se dizolv` permanganatul de potasiu \n apa distilat` [i se p`streaz` \n sticl` de
culoare brun`.
Sticla se eticheteaz` cu numele reactivului, data prepar`rii [i data expir`rii.
Poate fi p`strat` la temperatura camerei timp de 1 lun`.
Pentru eliminarea fluorescen]ei preparatului poate fi folosit` solu]ia de albastru
de metilen preparat` dup` re]eta de la colora]ia Ziehl-Neelsen, \ns` folosirea acestei
alternative cre[te costul examin`rii.

54
 Anexa 3 - Controlul de calitate pentru antibiogram`
Fiecare laborator care face antibiograme trebuie s` se \ncadreze \n programul de
control intern [i extern de calitate. (PNCT).[12,17]
Controlul intern de calitate cu tulpina de referin]` M. tuberculosis H37Rv este
obligatoriu pentru fiecare lot nou de mediu (men]ionånd lotul, produc`torul, data
prepar`rii [i expir`rii). Controlul extern de calitate este necesar pentru a se confirma
realizarea [i men]inerea performan]elor tehnice acceptabile la nivel interna]ional. Un
laborator cu nivel de calitate excelent pentru antibiogram` realizeaz` o eficien]` de
peste 97% pentru INH, peste 99% pentru RMP [i o eficien]` peste 92 % pentru SM [i
EMB. Se consider` c` au rezultate acceptabile laboratoarele care au o eficien]` de cel
pu]in 90% pentru INH, cel pu]in 95 % pentru RMP [i o eficien]` de cel pu]in 80%
pentru SM [i EMB.
Substan]ele fa]` de care se face testarea [i concentra]iile critice trebuie s` ]in`
seama de metoda de testare folosit`.

Concentra]ii critice de substan]e antituberculoase folosite pentru antibiogram`

Substan]a Metoda concentra]iilor Metoda Solvent Diluent

absolute propor]iilor
Concentra]ii critice Concentra]ii
µg/ml critice µg/ml

Hidrazida 0,2 1 0,2 AD AD

Rifampicina 20 40 40 Metanol AD
Streptomicina 4 10 40 AD AD
Etambutol 2 3 2 AD AD
Kanamicina 20 30 30 AD AD
Cycloserina 25 40 AD AD
Ofloxacina 2 0,1N NaOH AD
PAS 1 0,5 AD AD
Protionamida 40 Dimetil- AD
sulfoxid

55
 Bibliografie:
1. Van Deun, External quality assessment of sputum smear microscopy: a matter
of careful technique and organization, 2003, IJTLD, Vol 7, No 6, 507-8
2. Cornelia Diaconescu, Daniela Homorodean, M.I. Popa, Dorina B`nic`, O.
Bercea, 1998, Ghid de diagnostic bacteriologic al tuberculozei, 1-120, Atelierul
Tipografic al Centrului de Calcul [i Statistic` Sanitar` [i Documentare Medical`,
Ministerul S`n`t`]ii, ISBN 973-0-00655-5
3. Cornelia Diaconescu, Daniela Homorodean, M.I. Popa, Dorina B`nic`, O.
Bercea, 1998, Ghid de diagnostic bacteriologic al tuberculozei, 1-120, Atelierul
Tipografic al Centrului de Calcul [i Statistic` Sanitar` [i Documentare Medical`,
Ministerul S`n`t`]ii, ISBN 973-0-00655-5
4. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis – WHO 2001
5. Guidelines for establishing Dots Plus Pilot Projects for the management of
multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) – WHO 2000
6. Guidelines for the management of drug-resistant tuberculosis – WHO 1997
7. Investigatia microbiologic` \n tuberculoz` [i micobacterioze – Ed. Academiei
1987.
8. Laszlo A, Rahman M and col, Quality assurance programme for drug
susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in the WHO/IUATLD-
supranational reference laboratory network- five rounds of proficiency testing –1994-
1998, 2002, Int J Tub and Lung Dis, vol 6, No 9, 748.
9. Tsukamura M, Identification of mycobacteria, 1984.
10. De Kantor I N, Kim S J, Laszlo A, Luelmo F, and col, Laboratory services
in tuberculosis control. Culture. Part II. WHO/TB/98.258.
11. Vincent Levi-Frebault V, Portaels F, Proposed minimal Standards for the
genus Mycobacterium and for description of slowly growing Mycobacterium species,
Int J of Sistematic Bacteriology, vol 42, No 2, Apr 1992, 315-323.
12. Herold CD, Fitzgerald RL, Herold DA, Current techniques in Mycobacterial
detection and speciation, Crit Rev in Clin Lab Sciences, 33(2), 1996, 83-138.
13. Collins C.H, Grange J.M, Yates M.D, Organization and practice in
tuberculosis bacteriology, 1985.

56