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Microbiología medica:
- Microbiología general => se estudia conocimientos históricos, clasificación, estructura
y fisiología de los microorganismos.
- Microbiología especial => se estudia 4 grupos de agentes
infecciosos(bacteriología, virología, micología y parasitología) + recientemente los
viroides(moleculas circulares de ARN de bajo peso molecular que carecen de cubierta
proteica) y los priones (proteínas codificadas por genes celulares y actúan como señales
reguladoras, responsables de algunas enfermedades neurológicas graves - Creutzfeldt-Jacob y
el Kuru)
Evolución histórica de la microbiología - como ciencia especializada no aparece hasta finales
del siglo XIX; cuatro periodos:
-1º => periodo especulativo (desde la antigüedad hasta los primeros microscopistas)
-2º => desde 1675 hasta la mitad del siglo XIX (descubrimiento de los
microorganismospor Leeuwenhoek en 1675 - constructor de lentes holandes que inventó el
microscópio simple)
-3º => periodo de cultivo de microorganismos hasta finales de siglo XIX (Pasteur y Kochlogro
cristalizar a la Microbiología como ciencia experimental bien asentada.
-4º => desde principios del siglo XX hasta ahora (se
estudian fisiológica, bioquímica, genética, ecológica y surgimiento de virología, inmunológia.
- Redi, Spallanzani y otros fisicos del siglo XVII demostraron que el microorganismo no se
genera espontaneamente (de novo), postularon la teoría de la biogénesis (ser vivo nace de otro
ser vivo).
- Pasteur (1822-1895) demostró que la fermentación era producida por microorganismos en
crecimiento.
- Se dobló el interes de muchos naturalistas tras la publicación de los libros de Darwin.
- Davaine (1863-1868) encontró grandes cantidades de m.o. en la sangre de las
vacas(bacteridios) y Robert Koch (1843-1910) en 1876 aisló con sus técnicas de cultivo puro el
bacilo de antrax (Bacillus anthracis); mas tarde Koch y su colegas confirmaron que las esporas
son formas diferenciadas y resistentes de bacilos y demostraron que la
enfermedad podía transmitir sucesivamente a ratones sanos inoculándose bacilos obtenidos de
cultivo puro; basados en los postulados su maestro Henle, Koch postuló siguentes criterios:
- el microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos
- el m.o. debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro
- la inoculación del m.o crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparición de
sintomas específicos de la enfermedad en cuestión (cada enfermedad infecciosa esta causada
por un tipo de bacteria diferente)
- el m.o. debe poder ser re-aislado del hospedador infectado de forma experimental.
Las 2 décadas siguientes, se aislaron una gran variedad de bacterias patógenas; en Francia
el Instituto Pasteur se concentro sobre los procesos infectivos, la inmunidad del hospedador y
la obtención de vacunas (vacuna antirrábica ensayada por Pasteur en 1885, contribuye al
nacimiento de la inmunológia).
Conceptos generales y clasificación - al finales del siglo XIX los microorganismos se agrupan
en un nuevo reino fuera de la teoría de Darwin => Protistas para los protozoos, las
algas microscópicas, los hongos microscópicos y las bacterias como
seres microscópicos; Chatton en 1932 clasifica a los seres vivos en 4 reinos => animalia,
plantae, protistas inferiores o procariotas (bacterias) y protistas superiores o eucariotas (algas,
hongos y protozoos); Whittaker en 1969 agrupa en 5 reinos => animalia, plantae, fungi,
procariotas y protista; Magulis en 1992 los agrupa definitivamente por ahora en 2
superreinos /dominios, 5 reinos y 2 subreinos =>
- Dominio: procaryotae, 1 reino: monera, subreino: archeobacteria y eubacteria (incluyendo
todas las bacterias divididas en grupos)
- Dominio: eucaryotae, con 4 reinos: protista, fungí, animalia y plantae (incluyendo protozoos,
hongos, algas, animales y vegetales); protista => son unicelulares eucariontes pero
que no cumplen con las características para estar en algún otro reino
organismos de este tipo (p.ej. protozoos)
- los virus => un grupo aparte que no se ha integrado en ningún reino y se discute si son o no
seres vivos; es incapaces de reproducirse por si mismos, dependen de un huésped que les
proporcione el mecanismo de la replicación y síntesis de macromoléculas); una vez que han
conseguido esto, salen de la célula infectada produciendo su muerte; hay virus que infectan a
celulas animales, otros a vegetales y otros a bacterias; un virus se define como=> un bloque de
material genético rodeado por una cubierta proteica que le sirve como vehículo de transmisión;
algunos pueden llevar una envoltura circundante compuesta de lípidos y carbohidratos; los
viroides (30 especies) => agentes infecciosos(de menor complejidad genética y estructural
conocida) que solo afectan a plantas superiores; constituidos por 1 cadena de
ARN cíclica corta que no codifica proteínas; tamaño 10 veces menor que los virus (parecen ser
una etapa primitiva de los virus); los priones (proteinceous infectious
particle) => partículas patógenas de naturaleza proteica sin acido nucleico; identificados en
1982, aunque desde el siglo XVIII se sospechaba de su existencia; las enfermedades "prion" en
el hombre (encefalopatías espongiformes transmisibles) afectan al sistema nervioso y se cree
que también a los musculos.
Organización de un laboratorio de microbiologia clínica
Estructura (depende del tamaño y características, espacio que dispone y numero de personal):
1. Áreas/ secciones básicas:
- Sección de toma de muestras
- Sección de recepción y registro de muestras
- Sección de siembra de muestras
- Sección de medios de cultivo
- Área de almacén
2. Áreas/ secciones especializadas:
- Sección de bacteriología (se divide en áreas => urocultivos, coprocultivos y parásitos,
exudados y anaerobios, hemocultivos)
- Sección de micobacterias
- Sección de micología
- Sección de antibióticos
- Sección de serología o inmuno-microbiología
- Otras secciones (virología o biología molecular)
Nivel 3 => es adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo y comprende las
normas de los niveles 1 y 2 y ademas:
- todas las actividades con microorganismo o productos potencialmente patógenos se realizaran
en cabinas de seguridad; ningún trabajo se realizara en las mesas de trabajo.
- se utilizaran batas abiertas por la espalda, que no deben llevarse fuera del laboratorio;
utilizar guantes cuando se trabaja con material contaminado o animales que se desinfectaran
antes de desecharlos; en las habitaciones donde se tienen los animales se
utilizaran mascarillas rígidas.
- en el laboratorio no debe haber plantas o animales que no se utilicen en el trabajo.
- el laboratorio debe estar aislado de la circulación general, existiendo una doble puerta de
entrada con una habitación para cambiarse de ropa y con ducha.
- las superficies y los muebles deben ser de fácil limpieza; las ventanas deben cerrar
hermeticamente; las puertas se cerraran automáticamente.
- cerca de las puerta de salida existirán lavabos que pueden accionar con el pie, codo o rodilla.
- existirá un autoclave para descontaminar en el propio laboratorio
- existirá un sistema de extracción de aire con circulación del mismo de la puerta de entrada
hacia el interior del laboratorio; regulación de la entrada y salida del aire acondicionado; el aire
de salida de las cabinas de seguridad tipo III saldrá directamente al exterior; el de las cabinas
tipo I y II se elimina directamente al exterior o al sistema general del edificio pasando
previamente por filtros de alta eficacia (HEPA).
Nivel 4 => este nivel solo se establece en laboratorios de experimentación y no en laboratorios
de microbiologia clínica; se necesita este nivel cuando se manejan microorganismos
de altísimo riesgo o que son exóticos en ese país, especialmente virus.
Tema 3 - Técnicas de
descontaminación, desinfección y esterilización
En todo laboratorio de microbiologia se debe tener en cuenta:
- todo material para la recogida de muestra debe estar esterilizado
- todo material para la realización de las pruebas debe estar estéril
- antes de cualquier esterilización, el material debe estar limpio y/o desinfectado
- conviene utilizar material desechable
- el material de uso aséptico debe guardarse separadamente del uso séptico
- la limpieza de residuos en el suelo, mesas de trabajo y cualquier superficie se realiza
mediante desinfección periódica
- destreza y formación por parte del personal sanitario de laboratorio (deben trabajar en
condiciones de total asepsia)
- la manipulación de todo material debe seguir el protocolo de trabajo con medidas cautelares
para la prevención de accidentes laborales.
- Rayos gamma => para conseguir esterilización en frió, producidos por isotopos radiactivos;
presentan un poder de penetración muy alto, constituyendo el método de esterilización mas
utilizado a nivel industrial (materiales de uso único o desechable p.ej. guantes,
jeringas, catéteres, prótesis, válvulas y que pudiera alterarse por calor)
- Filtros de Chamberland => son de porcelana porosa, mas caros que los anteriores y menos
utilizados.
- Filtros de flujo laminar => dispositivos de filtrado donde entra aire contaminado y
sale estéril; utilizados como mecanismo de esterilización en campanas de flujo laminar, en
quirófanos y recinto que pretende crear o mantener un ambiente estéril; flujo => vertical u
horizontal.
- Ultrasonidos => introducir el material en tanques de distintos tamaños con liquido
desinfectante; una vez puesto en marcha el dispositivo, comienza a vibrar a gran velocidad
originando pequeñísimas burbujas que entran en todos los recodos del material consiguiendo
eliminar los microorganismos; es poco utilizado, caro y poco practico.
Metodos químicos de esterilización - los mas empleados son "Oxido de etileno" => en forma
de gas (10ºC) mezclado con CO2, ya que puro es muy oxidante y podría explosionar al
mezclarse con O2; presenta un gran poder de penetración y es muy efectivo y duradero;
la esterilización se produce a => temperaturas bajas (40ºC) con humedad relativa alta (40-60%)
durante un tiempo de 3-8 horas (media de 5); se requiere cámaras o instalaciones especificas
para ello, son muy caras; el oxido de etileno se aplica a cualquier material sensible al calor y
que no pueda esterilizarse por otros metodos (p.ej. endoscopia, plásticos termo-lábiles, cauchos,
material eléctrico); el material esta listo para ser utilizado a las 48 horas después de
la esterilización; deberá conservarse estéril en el interior de una bolsa de plástico cerrada por
procedimientos termoeléctricos y dura 6 meses.
Recogida de LCR (el procesamiento inmediato/ urgente) => se recoge insertando un agua,
de forma aséptica, en el espacio sub-aracnoideo a nivel lumbar, se recoge en 3-4
tubos estériles con tapa de rosca (tubo 3º o 4º => recuento celular, 1º y 2º => microbiológicos
y bioquímicos; si solo se llena 1 tubo => microbiologia retirara de forma aséptica la cantidad
necesaria, el resto => citológicos y bioquímicos; el volumen de muestra es importante (10
ml) para la detección (p.ej.M.tuberculosis y C.neoformans); no se deben refrigerar (temperatura
ambiente o estufa a 37º) excepto para estudios virales se pueden refrigerarse hasta 24 horas o
congelarse a -70ºC si hay una mayor demora; la muestra bacteriana => turbio (meningococo
dentro de leucocitos), virales => transparente;
Recogida de orina - el frasco estéril no debe abrirse antes de la recogida; las partes genitales se
lava solo con agua; se recoge a primera hora de mañana para estudio microbiológico, de
forma aséptica, se echa el primer chorro, se recoge la segunda mitad unos 20-30 ml.
Sondaje vesical (puncion de sonda) y puncion suprapubica - se realiza por el personal de
enfermeria
Recogida de muestra de tracto genital - se utiliza un tubo con escobillón de algodón como
medio de transporte; exudado uretral => el hisopo se introduce 2 cm dentro de la uretra y se
rota suavemente antes de retirarlo (muestras separadas para el cultivo de gonococos y clamidias
o ureaplasmas => se utiliza 2 escobillones, 1º para estudio de gonococos 2º para clamidias o
ureaplasmas); exudado cervical => se inserta un hisopo especial (como uretral) en el canal
cervical y rotando-lo y moviendo-lo durante 30" antes de retirar; exudado vaginal => el hisopo
se sumerge en el fornix posterior de la vagina; para aislamiento de gonococos pueden
ser transportados en el medio de Stuart modificado o en el medio de Amies con carbón en
temperatura ambiente, hasta su inoculación; para aislamiento de clamidias y micoplasmas, el
medio es tampon con sacarosa y ATB; se puede refrigerar si hay demora en el proceso.
Procedimiento para muestras en anaerobiosis - se obtiene mejor con una jeringa y aguja, a los
que debe expulsarse todo el aire.
Transporte de muestras:
- Metodos convencionales => el mas utilizado es hisopos en tubos de plástico que llevan
incorporados diversos medios de transporte que consiste en un agar semi-solido, pH regulado,
carece de nutrientes, pero contiene tioglicolato de sodio como reductor, para prolongar la
viabilidad de los microorganismos cuando exista demora entre la recogida y su cultivo; los mas
utilizados => (1) Medio de Stuart (los exudados faríngeos, conjuntivales, nasales y heridas) que
mantiene un pH favorable e impide la deshidratación de las secreciones durante el transporte y
la oxidación y autodestrucción enzimática de los patógenos presentes (2) Medio de Cary y
Blair (muestras fecales) donde las salmonellas y las shigelas pueden recuperarse hasta
49 días después de la toma de muestras y Vibrio cholerae hasta 22 días después.
Envió de muestras (las medidas especiales para un envió por correo a un laboratorio de
referencia):
- Muestras que contengan virus deben ser refrigeradas inmediatamente y enviarse en una caja
con unidades comerciales refrigerantes
- La sangre no se envía entera, se separa el suero y se envía en un tubo estéril
- La muestra <de 50 ml debe ser envasado en un recipiente hermético irrompible con espacio
suficiente entre ambos para retener en caso de rotura; el envase se coloca dentro de otro envase
para el envió; el envase externo se identifica con un rotulo rojo y blanco para
Agentes biológicos /Material bio-medico.
Manejo inicial de las muestras en el laboratorio - la mayor parte de las muestras para
estudio bacteriológico que vayan a demorarse en su procesamiento deben mantenerse en la
nevera a excepción de LCR; los fragmentos de pelos o raspados de piel y uñas para el
aislamiento de hongos pueden ser mantenidos a temperatura ambiente durante varios días antes
de ser inoculados (protegidos del polvo).
[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por agotamiento en
cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para ayudar a
la identificación de E.coli (sensible a colistina - común en orinas); crecen bacilos Gram-
=> Enterobacterias y también Pseudomonas; observaremos las características de lactosa (+)
=> colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa.
[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra en la lengüeta del tubo
preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras de citrato (+) => vira a azul y las que
no, permanece verde; se usa para la diferenciación de Enterobacterias (para diferenciar
entre coliformes y coliformesfecales. Los coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el
citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los
coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el
citrato en este medio dando una reacción alcalina) en base a su capacidad de utilizar el citrato
(mediante citrato permeasa)
Los gérmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se identifican especies):
- E. coli (el mas frecuente) => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (+), indol (+)
- Streptococcus faecalis => coco Gram+, catalasa (-), oxidasa (-).
- Proteus spp (todas) => bacilo móvil Gram-, resistente a Colistina, lactosa (-), oxidasa
(-), Triptófano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardío.
- Stafilococcus aureus => coco Gram+, catalasa (+), coagulasa (+), B hemolítico, oxidasa(-).
- Candidas spp (todas) => morfología de levaduras (parece como hematíes)
- Klebsiella spp => bacilo Gram-, inmóvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias mucosas,
lactosa (+), tardío.
- Pseudomonas spp => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa (+)
[a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecerán el genero Salmonella y
Shigella; en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias lactosas (-), verdosas y pueden
ser SH2/sulfihidrogeno/ acido sulfidrico (+) con fondo negro, son bacilos móviles, sensible a
Colistina; las Shigellas spp => lactosas (-) , SH2 (-), bacilos inmóviles en fresco y sensibles a
Colistina; las colonias lactosas (+) en este medio serán amarillas;
en SS las Salmonellas y Shigella serán el del medio (caramelo) y también con el fondo negro
(Salmonellas SH+ y lactosa- ); colonias lactosa (+) => rojizas; las colonias lactosas+ no
son patógenas (coliformes fecales) y no se investigan.
[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito- Yersinia
pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece
como lactosa (+), sensible a Colistina y bacilos Gram- e móviles, fermentador de manitol. La
inhibición selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal
violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sódico (inhibidor de Gam+) y los agentes
antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de S.epidermidis).
[c] Agar Campylosel => crecerá Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos) como
colonias pequeñas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C. coli y C.jejuni)resistente a
Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S, ureasa (+) oxidasa (+)catalasa (+); al
hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+) y C.coli (-); P. hipurato=> un procedimiento
cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimáticamente
(hipuricasa) el hipurato sódico que da lugar a acido benzoico y glicina un compuesto de color
morado.
[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los géneros Salmonella y Shigella. el selenito de
sodio inhibe la flora Gram+ y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp.
[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecerán como colonias
rojas por ser lactosas (+); no es necesario???
[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) => aparecen
colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram- pleomórficos; el
extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrógeno y las vitaminas. El citrato sódico, el
tiosulfato sódico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte inhiben los organismos Gram+ y
suprimir los coliformes (inhibidor para la mayoría de las entero-bacterias), favoreciendo el
crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los entornos ácidos. La alta
concentración de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante (tolera
el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayoría es halofílica. La sacarosa (+) es un
carbohidrato fermentable, y el cloruro sódico estimula el crecimiento. El tiosulfato sódico es
una fuente de azufre y actúa con el citrato férrico como indicador para detectar la producción
de ácido sulfhídrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH. En
Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).
3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se siembra por
agotamiento en cuadrantes).
[a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo
B (S.agalactiae), que aparecerán como colonias pequeñas translucidas con un halo de B
hemólisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-), anaerobio
facultativo, prueba de látex (+).
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeñas grisáceas
que crecen bien por ser gérmenes exigentes en su crecimiento que requieren factor X y/o
V (proceden de la degradación de la Hb); también podemos colocar discos de factor X y/o V y
mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmóviles, Gram-; oxidasa y catalasa variable.
[c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitisque
aparecerán como colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que
fermentan la glucosa pero no el resto de los azucares.
[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-hemolíticas y al
fresco como bacilo pequeño, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa (-) y catalasa (-). La
presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las especies estudiadas, ya que
producen ß-hemólisis alrededor de las colonias. La ß-hemólisis en agar con sangre humana es
altamente indicativa de presencia de G.vaginalis. Los antibióticos incluidos en el medio inhiben
la mayoría de los contaminantes Gram- y de las levaduras.
[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp)
y Trichomonas (protozoo unicelular flagelado).
[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp)
4. Semen - la muestra llegara en contenedor estéril/ bote de orina; se siembra por agotamiento
en cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate, Thayer Martin o New
York, Roiron, y cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los mismos gérmenes que en el
caso del exudado vaginal.
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas,
que al fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar chocolate
polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de la degradación de Hb)
[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-.
[e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo Gram- (en
realidad, se tiñe muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni oxida los
azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato+ => un procedimiento cualitativo para
determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el hipurato
sódico; necesita L-cisteina para crecer y también iones férricos Fe. La inhibición del
crecimiento de las bacterias Gram+, la mayoría de las bacterias Gram-, levaduras y mohos, a
través de una combinación optimizada de 3 antibióticos. Las colonias que crecen en medio
Agar Legionella y no crecen en medio AS deben considerarse, con alta probabilidad, colonias
de Legionella.
6. Cepillado bronquial (la muestra vendrá en el cepillo y se conservara a 4ºC < de 24H); se
siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) añadiendo ademas: agar sangre
anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicina-vancomicina), selectivo para bacilos
Gram- anaerobios y Bacteroides (bacilo Gram-, anaerobio estricto).
7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por agotamiento en
cuadrante).
[a] Agar sangre => crecera todo tipo de gérmenes (medio general enriquecido)
[b] Agar chocolate => crecera todo tipo de gérmenes
[c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/
inhibe los Gram- => para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos, Enterococcus y
Staphylococcus??
[e] Agar Sabouraud (solo en orales) => deteccion de Candidas spp.
8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes. La
muestra ha de llegar en tubo estéril y se conservara a 4ºC menos de 24H.
[a] Agar sangre => crecerá todo tipo de gérmenes
[b] Agar chocolate => idem
[c] Agar Mac Conkey => crecerán las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco
exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/
inhibidor Gram- => crecerán bien los Steptococcus B-hemolíticos.
[e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque también puede utilizarse agar AKV, agar
sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gram- anaerobios
(estrictos) y Bacteroides.
[f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias; permite el
desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricional-mente
exigentes. Además, se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte
superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las
profundidades del medio.
10. Otros líquidos estériles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por agotamiento; la
muestra ha de llegar en tubo estéril y su conservación no se ha de demorar mas de 24H a 4ºC.
[a] Agar sangre => crecerán casi todo tipo de microorganismos, con características hemolíticas
de algunos de ellos.
[b] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, sobre todo exigentes.
[c] Agar McConkey => crecerán Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.
[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para Gram
(+)
[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios
yBacteroides.
11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la técnica de Maki (rodamiento del cateter)
[a] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, y podrán crecer bien algunos
exigentes como el Haemophillus.
[b] Agar sangre => crecerán bien casi todo tipo de gérmenes y podrá verse sus características
hemolíticas si las tuvieran.
[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se hará un pase por Agar chocolate.
[d] También puede ponerse en una placa de agar MacConkey.
4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayoría de
bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y
aminoácidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina
dinucleótido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.
5. Medio base Christensen (líquidos y sólidos) => para la prueba de la ureasa; ureasa+ de rojo
=> rosa; gérmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory
6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de energía) para
la investigación de bacilos Gram- (la diferenciación entre coliformes y coliformes fecales. Los
coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a
las sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter
aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el citrato en este medio dando una reacción
alcalina); Comp: citrato sódico, azul de bromotimol(indicador pH, de que el citrato esta
consumido /se alcalina; verde => azul); gérmenes con citrato permeasa => Klebsiella
pneumoniae, Salmonella, Enterobacter aerogenes.
7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias mediante prueba
de Voges-Proskauer (producción de acetoína/ acetil metil carbinol => por reducción a 2,3
butanodiol o por oxidación a diacetilo); y prueba de Rojo de Metilo(acidificación del medio
con pH <4,5 y cambio de color a rojo); gérmenes con VP+ => Klebsiella
pneumoniae y Enterobacter aerogenes; gérmenes con RM+ => Proteus, E.coli y Salmonella.
10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial, para
aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus,
Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de
metileno (indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).
11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de entero-bacterias
patógenas Gram-; Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de L+ =>
amarillo/naranja) sacarosa, peptona, tiosulfato sódico y citrato férrico amoniacal(indicador de
la producción SH2/H2S => puntos negro), azul de bromotimol, fuschsina ácida (indicadores de
pH); en condición normal es verde => fermentacion de lactosa/acidificación => vira a
amarillo/naranja (características de fermentadora L+Escherichia, Serratia, Klebsiella,
Citrobacter, Enterobacter y Vibrio cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se
acidifican primero, y después se basifican) => verde; cuando se consume
azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y la colonia se vuelve negro (característica
de Salmonella y Proteus vulgaris).
12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo); muy
semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy utilizado para la
identificación de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp: lactosa
(indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato férrico amoniacal y tiosulfato sódico(componentes
para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los gérmenes productor de SH2+ => Proteus,
Salmonella y Citrobacter; los productores del gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.
15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificación de
la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la ornitina(orinitina
descarboxilasa /está dada por un color púrpura/ alcalinidad del medio y la producción de indol
(al añadir reactivo de Kovacs); La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o
por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación; el germen que da resultado
positivo de los 3 pruebas => E.coli.
16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el aislamiento
de Salmonella; Comp: selenito sódico (inhibidor de flora Gram+ y Gram- excepto Salmonella);
después también se hace cultivo con agar SS.
17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patógenas
importantes Salmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de L), tiosulfato
sódico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde brillante(inhibidor bacillos
Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes - E.Coli y Klebsiella) => rojas o
rosadas; L- y SH2- => incoloras (típico de Shigella); L- y SH2+ con la precipitación de hierro
=> negro (típico de Salmonella).
18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y
diferenciación de bacilos entéricos Gram-, especialmente del género Salmonella y
especialmente Shigella (entero-bacterias patógenas); Comp.: xilosa (la fermentan
los entéricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+); se
puede utilizar para la identificación de lactasa+, lisina descarboxilasa+ => Salmonellaque
alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sódico + citrato de hierro amoniacal).
20. Medio Castañeda (caldo y solido) => búsqueda de gérmenes Brucella, Vibrios y
Pasteurella en sangre (hemocultivos).
24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo de anaerobios
(estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el extracto de levadura,
la hemina y la vitamina K3 y la adición de sangre de cordero permite el crecimiento incluso de
las especies más exigentes.
El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentración de dextrosa en el medio favorecen el
crecimiento
de especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides.
Pared celular - es el limite externo de la célula con estructura rígida, parecida a la pared
celular de las células vegetales; funciones => protegerse de cambios externos
adversos, mantener la morfología de la célula, proporciona la resistencia a los antibióticos, dar
un paso selectivo de algunas sustancias, proporciona la especificidad de grupo y de tipo
(clasificación), implicada en la patogenicidad; dar el color en la tinción de Gram, violeta oscuro
=> Gram+ y color rosa => Gram-.
Citoplasma - es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmática; función => engloba
los orgánulos celulares (región nuclear, ribosomas, inclusiones/depósitos de reserva,
vacuolas); no tienen ni aparato golgi, ni retículo endotelial plasmática, ni
mitocondria; composicion => 80% de agua, enzimas, iones y principios inmediatos.
Región nuclear - una zona en el interior del citoplasma donde se acumula el acido
nucleico; funciones => el acido nucleico transmite la información genética de la célula sobre
estructuras y funciones celulares; estructura y composicion => es un núcleo difuso que contiene
1 molécula ADN bicatenario, formando N cromosomas (enroscada en forma de
anillo); plásmidos => estructuras que pueden existir ademas de ADN cromosómico (formadas
por moleculares de ADN extra-cromosómico bicatenario, pueden estar libres o unidos al ADN
cromosómico /episomas), se replican independientemente, se transmite por conjugación, portan
genes muy importantes que determinan la resistencia a antibióticos, tolerancia a metales tóxicos
y síntesis de enzima.
Flagelos - largos apéndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia es
rara); funciones => responsable de la movilidad (elementos patogénico: facilitar la difusión de
las bacterias a traves de las
membranas); estructura => tres partes (filamento, codo y corpúsculo
basal); tipos => monótricas (1 solo flagelo en un extremo), lofótricas (2 o mas en un
extremo), anfítricos(un grupo de flagelos en un extremo y otro grupo en el otro
extremo), perítricos (flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria);
Pelos /pilis o fimbrias - elementos rígidos constituidos por una proteína (pilina); cortos, muy
numerosos, distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram- que en
Gram+; funciones => capacidad de fijación a superficies (pelos comunes), proporcionan pelos
comunes y sexuales (son morfológicamente iguales), sistema de intercambio de información
genética por conjugación (pelos sexuales).
Endosporas - solo en bacilos (Bacillus aerobio estricto y Clostridium anaerobio estricto); una
forma de resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones adversas (deficiencia
nutricional, desecación, frio, temperaturas elevadas, agentes químicos); se forman por un
proceso de esporulación /esporogénesis, pueden permanecer latentes durante cientos de años y
volver a una forma vegetativa por un proceso germinación; localización => zona central,
subterminal o terminal (depende de su tamaño, pueden o no deformar el bacilo); la
espora => célula en reposo con capacidad de resistencia a la desecación, calor y agentes
químicos; esporulación => la producción de estructuras, enzimas y metabolitos nuevos y la
desaparición de muchos componentes celulares; Morfológicamente comienza con el
aislamiento del núcleo y elementos energéticos mediante el crecimiento en vaginante de la
membrana; los elementos esenciales para la vida quedan protegidos en esa nueva estructura
(endosporas); la bacteria queda en estado latente esperando una condición externas favorables
para resurgir.
Capsula - estructura que rodea la pared bacteriana; se visualiza con tinción negativa (tinta
china); funciones => regula el intercambio de agua, iones y nutrientes, sirve como almacén
externo de nutrientes, defensa frente a Acs, fagos y celulas fagocíticas (elemento
virulencia), protege de la desecación (contiene agua), formación de colonias(habitualmente
engloba mas de una bacteria); estructura y composición => polisacáridos y proteínas.
Tamaño y Morfología de las Bacterias - 0,2 - 2 um; es preciso utilizar el microscopio óptico;
la morfología => información primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma concluyente
(viene dada por la rigidez de la pared; formas => esférica/coco, coco-bacilo,
bastoncillo/cilíndrica/bacilo, helicoidal/espirilo, en coma/vibrio, espiral/espiroqueta, estrella y
cuadrangular /forma de hifas de hongos (actinomyces/ streptomyces - productor de muchos
ATB, ATF y inmunosupresores); agrupación de los cocos => aislados, en
parejas/diplococos (granos de cafe - típico de neisserias/meningitis), en cadenas/estreptococos,
tetradas o tretacocos (4 celulas => micrococcus/micrococacceae), en racimos/estafilococos, en
formas cubicas de 8 elementos/sarcinas (sarcinas ventriculi - tolerancia al medio ácida/
estomago); agrupación de los bacilos => aislados, en parejas/diplobacilos, en
cadena/estreptobacilos, algunos se parecen a cocos/cocobacilos(E.coli), en
forma empalizada/letra china (corynebacterium - algunos son saprofitos de la piel y también
causante de difteria).
2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan patologia
humana (la mayoria).
Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus
Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio)
Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria
Bacilos irregulares no esporulados:
- Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium)
Micobacterias:
- Familia Mycobacteriaceae (genero - Mycobacterium)
3. Micoplasmas (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30); dentro de este grupo,
los que provocan patología humana => genero Mycoplasma/ Mycoplasma
pneumoniae y Ureaplasma.
4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); todas las bacterias de este grupo no provocan
patologia humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/ termogenas)
Taxonomía => la ciencia de la clasificación que agrupa y separa los organismos de acuerdo
con su características fenotípicas, estructurales o genéticas para facilitar su estudio; la misión
=> construir un esquema racional, para clasificar y nombrar los organismos; el sistema
jerárquico de la taxonomía se ha formado gradualmente a partir del sistema binomial /
binominal / binaria de nomenclatura genero y especie establecida por Linneo en 1758 (un
botánico); la taxonomía no es una ciencia estático, goza de gran dinamismo y esta en la relacion
con los avances de los procedimientos empleada para su estudio; el termino de sistemática se
utiliza como sinónimo de taxonomía; los grupos de taxonomía van de dominio - imperio - reino
- tribu - división - clase - orden - familia - genero y especie.
Para la asignación de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el código internacional
de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido publicado por el Int´l Journal of
Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien dentro de los sistemas en las listas de las
bacterias aprobadas que incluyen sus números; una especie bacteriana, viene definida por un
nombre genérico de un nombre especifico latinizado o helenizado y concuerdan
gramaticalmente; la inicial de genero va con letra mayúsculas y el de especie con minúsculas;
tanto el nombre de genero o especie se escriben con letra cursiva/ italica o en su defecto,
subrayado; en la denominación de un especie, la palabra que define genero puede ser abreviada
a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de las bacterias no se eligen
de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej. Staphilococcus aureus (cocos en
forma de racimos - dorados); o pueden dar homenaje a un autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de
Koch, también puede dar referencia a un acontecimiento p.ej. Legionella; el nombre generico
es único; para referirse a un especie o varios especies no determinadas su genero => E.spp/ sp;
algunas de las categorías taxonomia superiores, se forman añadiendo las palabras que las
asignan distintas terminaciones, p.ej. aceae; para el orden => ales (sufijo) p.ej.
Mycoplasmatales; todas las categorías taxonomía se expresa en cursiva o itálica.
FLORAS BACTERIANAS
Flora Normal de la especie humana => la población de microorganismos comensales que
normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las personas adultas sanas; la piel y
las mucosas colonizadas por microorganismos dinámicos => cambios cualitativos y
cuantitativos constantemente; 2 poblaciones:
1. La flora residente (FR) => un numero relativamente fijo de especies de microorganismos
(comensales y oportunistas) en una zona definida (si se producen alteraciones, suelen ser
temporales); permanecen intactas; encuentran condiciones fisiológicas y nutritivas
adecuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente beneficiosa (produce vitamina K
en el intestino y ayudan en la absorción de nutrientes y impide la colonización de
microorganismos potencialmente patógenos.
2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patógenos o potencialmente patógenos,
que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene poca importancia, pero si
la flora residente se altera, la flora transitoria puede multiplicarse y producir infecciones.
La supresión de FR => vació ecológico => ocupación de microorganismos ambientales o de
otras zonas de cuerpo => infecciones.
FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estériles; algunos ejemplos:
- Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, si alcanza
el torrente sanguíneo => si válvula cardíaca dañada => posible endocarditis;
- Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada => posible
peritonitis o bacteriémia.
- Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cáncer, leucemias, linfomas,
SIDA)
- E.coli es comensal del colon => lugar estéril (o no habitual) a traves de uretra => infección
urinaria
Aumento – es el numero de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor real.
En el microscopio óptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento individual del
objetivo por el aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40, x100. Aumento óptico
ocular - x5, x10
Resolución – la capacidad del microscopio para mostrar los detalles más finos de un objeto.
Poder de resolución (limite de resolución o distancia resoluble) – la distancia minima entre dos
puntos que permite distinguirlos como tales (la capacidad de microscopio para distinguir 2
puntos separados aunque están muy próximos entre si).
Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolución = aumentar la apertura
numérica (AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada = aumentar el ángulo alpha
en el espacio objeto = aumentar el índice de refracción (IR) en el espacio objeto (rellenar el
espacio existente entre la muestra y el objetivo con una sustancia de mayor índice de
refracción, como aceite).
Numero de campo – diámetro de la imagen observada a través del ocular (en mm).
Profundidad de foco – el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo ><
aumento y AN (apertura numérica) de la lente.
Tipos de microscopios:
Microscopio de campo oscuro – si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con un
indice de refracción diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e incide sobre
el objetivo y pueden ser visualizados; permite la observación de seres microscópicos
transparentes y no teñidos (Treponema pallidum – preparación en fresco).
Microscopio de fluorescencia – consta de una fuente de luz muy intensa (lámpara de Hg a alta
presión), emite una radiación que puede incidir en la muestra desde abajo, tras atravesar un
condensador de campo oscuro (iluminación transmitida); se emplea un tipo especial de liquido
de inmersión (glicerina); Tipos de fluorescencia: Fluorescencia primaria- fluorescencia natural
(auto fluorescencia) - vitamina A-tiamina, vitamina B-riboflavina; Fluorescencia secundaria -
colorantes fluorescentes: auramina (demostrar la presencia del bacilo de Koch en esputos),
naranja de acridina (detectar Gardnerella vaginalis en los exudados vaginales; Fluorescencia
terciaria inmunofluorescencia - fijación del fluorocromo (colorante) como rodamina y
ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac marcado).
Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz
fluorescente
de exitacion (UV) Observador
Técnicas para observar los microorganismos vivos - examen en fresco, entre portaobjetos y
cubreobjetos, sobre gota pendiente en porta excavado (no lo hacemos) y con tinción vital.
Examen en fresco - suspender el microorganismo en agua destilada o SSF colocandolo en un
portaobjetos y posteriormente visualizarlo por microscopio su morfología (cocos o bacilos),
disposición/agrupación y motilidad; Material => portaobjetos, microscopio, portaobjetos
excavado, cubreobjetos, asa de siembra, mechero Bunsen o de alcohol (para flamear el asa de
siembra), muestra de microorganismo problema, agua destilada estéril, vaselina (opcional).
Técnica - Método de examen en fresco entre portaobjetos y cubreobjetos:
- preparar portaobjetos y cubreobjetos limpios y desengrasados
- depositar una gota de agua estéril en el portaobjetos (50ul/lambdas)
- con el asa de siembra esterilizada por flameado, tomar un poco de muestra del
microorganismo y suspenderla en la gota.
- homogeneizar la muestra, colocar con cuidado sobre la suspensión un cubreobjetos, evitando
que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensión.
- observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos.
Coloración vital - es una técnica intermedia entre los exámenes en fresco y las técnicas de
tinción después de fijación previa???; consiste en teñir las muestras bacterianas con colorantes
muy diluidos, permite al microorganismo acumular parcialmente dichos colorantes; la dilución
debe ser muy altas para que no resulten toxicas para las bacterias, evitando la muerte de tales
gérmenes; material => microscopio, asa de siembra estéril, portaobjetos, cubreobjetos,
mechero, papel de filtro, una suspensión de muestra problema,
aceite de inmersión, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo neutro en
solución acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solución acuosa al
1:1.000 o 1:500).
Técnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos limpio y
desengrasado una gota de suspensión muestra junto con otra gota del colorante diluido
utilizado; mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el cubre objetos con
cuidado para evitar que se formen burbujas de aire; observar al microscopio con objetivo de
inmersión; resultados => los microorganismos se visualizaran vivos y ligeramente coloreados
de rojo, en el caso de haber utilizado como colorante el rojo neutro o de color azul si se utiliza
el azul de metileno.
Preparación de un frotis - realizar una extensión y fijar la muestra problema para posterior
coloración y visualización al microscopio; poner en un portaobjetos, a traves de un asa de
siembra una cantidad de microorganismo problema suspendido en medio liquido estéril,
extendiéndolo adecuadamente hasta formar una fina película homogénea que posteriormente se
fijara generalmente con calor cuando sea requerido, según el método de tinción que se utilizara
posteriormente; material => portaobjetos, asa de siembra o platino, agua estéril, muestra
problema; técnica => pequeña cantidad de la muestra liquida se deposita y se extiende
homogéneamente en el centro del portaobjetos con el asa de siembra para tener una capa fina
(según la viscosidad, se puede diluir con unas gotas de agua estéril); si la muestra es solida (una
colonia), se deposita primero una gota de agua estéril y se añade con el asa de siembra una
pequeña cantidad de la colonia, se extiende homogéneamente; dejar secar al aire; se fija
mediante el flameado (en algunos casos se podrá hacer con alcohol) para coagular las proteínas
y los gérmenes quedan adheridos al portaobjetos.
(2) Tinción negativa => es un tinción simple (1 solo colorante => tinta china o solución acuosa
de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijación previa (no mata las bacterias),
permite observar características estructurales de la bacteria ademas de su morfología sobre un
fondo oscuro, como es la presencia de capsulas p.ej. los neumococos; se basa en => colorante
acido cargado negativamente, los microorganismos no se tiñen (se quedan claros y brillantes
sobre un fondo teñido oscuro); para obtener una capa fina (para dejar pasar el paso de luz del
microscopio y evitar a formarse grietas al secarse el colorante) se puede hacer una extensión
con el borde de otro portaobjetos; resultado => se observan las capsulas (si las tienen) en forma
de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la bacteria.
(3) Tinciones diferenciales => fijación previa (en general por calor), se utiliza 2 colorantes (el
ultimo es de contraste), permite visualizar su morfología y características estructurales
(composicion de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloración ácida (t.Gram y
t.ZhielNeelsen).
(4) Tinciones estructurales => fijación previa (en general por calor), se utiliza al menos 2
colorantes, nos permite observar su morfología y características estructurales como esporas,
flagelos, cilios, capsulas, corpúsculos metacromáticos (utiliza 1 solo colorante???).
Tinción diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando trabajaba
con material de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tinción diferencial; es mas empleado
en bacteriología, para clasificar 2 grandes grupos (Gram+ y Gram-); distinto comportamiento
debido a la distinta composicion de la pared de las celulas bacterianas; se emplea como el
primer colorante básico (cristal violeta o violeta de genciana) que teñirá de color azul violeta
todas las bacterias, posteriormente un mordiente el lugol que aumenta la afinidad del primer
colorante a las celulas (lo fijara), finalmente un agente decolorante que decolora solamente un
tipo de bacterias (Gram-) que serán teñidas con el colorante de contraste o segundo
colorante (la safranina) de color rosa-rojo; si se quedan con el color azul violeta serán Gram+.
Material de la tinción Gram => portaobjetos, pinzas de madera, asa de siembra, mechero de
Bunsen, pipeta Pasteur, asa de tinción (punte), frasco lavador, muestra problema, aceite de
inmersión, colorantes para la tinción de Gram.
Técnica:
- realizar la preparación de frotis => extender 1 gota de agua destilada estéril + una colonia de
la bacteria problema por la superficie de la portaobjeto
- fijación por el calor, pero no quemar las bacterias
- aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2 minutos
- lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante
- añadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solución iodoiodura de potasio con OH de 96º
o con acetona a 5/1 o con OH 50%)
- vuelve a lavar con agua el exceso
- decolorar con solución decolorante (alcohol 90º)
- lavar abundantemente con agua
- cubrir el portaobjetos con la safranina durante 1 minuto
- lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar al aire
- observar con objetivo de inmersión (100x).
B. Método de Kin Youw modificado (coloración en frió) Reactivos => 1º colorante: fucsina
fenicada (con fenol) de KinYouw, decoloración a 3%, 2º colorante: azul de metileno fenicado
(con fenol); técnica => idéntica, salvo para la fucsina de KY, dejamos actuar 5 minutos sin
calentamiento; existen otras técnicas de tinción de los BAAR => tinción de auramina o de
rodamina que usan microscopio de fluorescencia.
Enzima - catalizadores biológicos (proteínas); cada enzima afecta solo a un sustrato especifico.
Reducción => captan electro nes.
2º vía de las pentosas fosfato /vía fosfoglucónica (vía HMP) - es una ruta mixta y vía
alternativa; este ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas y también glucosa, mediante
sucesivas reacciones y produce => pentosas intermedias (precursores de síntesis de ácidos
nucleicos y ciertos aminoácidos) de gran utilidad para las celulas; ademas de la glucólisis via
EMP, muchas bacterias utilizan HMP como una vía alternativa para la oxidación de la
glucosa => produce acido láctico o acido mixto + 1ATP (p.ej. Enterobacterias/ E.coli); esta vía
es un híbrido de la vía ED y la EMP, ya que en las primeras etapas, la oxidación de la glucosa
es similar a la via ED y en las etapas posteriores es similar a la vía EMP, es decir: proporcionan
a las bacterias no oxidativas un medio de oxidar la glucosa a acido pirúvico puro, porque no
tienen las enzimas necesarios para comenzar la vía EMP, apareciendo en los sistemas analíticos
como fermentadoras.
3º vía de Entner-Doudoroff (vía ED/ vía aerobia => requiere O2) - es otra vía por la cual la
glucosa se oxida a acido pirúvico; por cada molécula de glucosa se producen 1 molécula de
ATP para ser utilizada por la célula en reacciones bio-sintéticas; esta vía requiere enzimas
específicos y solo los microorganismos que las poseen pueden utilizarla sin seguir la vía de las
pentosas fosfato ni la glucólisis; los microorganismos que la utilizan son Pseudomonas y
Neisseria (aerobio estricto), por carecer de las deshidrogenasas necesarias para oxidar el acido
pirúvico al acido láctico u otros ácidos; los hidrogeniones se transfieren al ciclo de Krebs y se
acabaran obteniendo agua; oxidación de glucosa => acido pirúvico + 1ATP (no producen acido
láctico ni acido mixto)
Producción de acido sulfhídrico - técnica con indicador incorporado al tubo/a la placa =>
algunos microorganismos actúan metabolizando proteínas con aminoácidos azufrados (cistina,
cisteina) y liberan azufre en forma de gas acido sulfhídrico SH2; el gas es detectado a traves del
medio que contiene fuente de hidrógeno (azucar) fuente de azufre(tiosulfato sodio, cistina,
cisteina) y un indicador de pH (sales de hierro /citrato férrico amoniacal) => un precipitado
negro); se observara la liberación del gas SH2 por algunos microorganismo que poseen enzimas
desulfurasas (activada por la fermentación de la glucosa => acidifica/produce ácidos/baja el
pH) que actúan sobre los aminoácidos azufrados; la temperatura de incubación (estufa) tiene
que oscilar entre 35-36ºC (superior a 37º se inhibiría la producción de SH2).
Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y asas de
siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de cultivo (Hektoen y
SS);
Técnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se tomara una
muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con agotamiento en
cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la técnica se realiza
con Brucella (microaerofila), se debe incubar con una atmósfera de CO2.
Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la linea de
inoculación ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y Shigella) no se ennegrece el
medio.
Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentación de azucar) + indicador de
pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH => precipitado negro
insoluble/ puntos negros (FeS)
Prueba de las descarboxilasas - enzimas que actúan sobre el grupo carbóxilo de los
aminoácidos Lisina, Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y se desprende
CO2 (el proceso se realiza en anaerobiosis) => se realiza mediante el sistema multiprueba (API
- buscar el código en el libro); estas pruebas se aplican para la identificación de
Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinización del medio inicialmente de color purpura, se
observara el viraje del color del indicador del pH; la presencia del enzima investigado supondrá
la alcalinización del medio (sigue el mismo color como el inicio); cada pocillo contiene
indicador de pH y amino acido correspondiente al enzima a investigar; cada descarboxilasa
actúa sobre un aminoácido especifico; en cada reacción se desprende CO2 y se alcaliniza el
medio:
- L-lisina + LDC/lisina descarboxilasa => Cadaverina + CO2
- L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2
- L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilación) =>
Putrescina +CO2
Material => pruebas de API, pipeta Pasteur.
Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequeña cantidad en su composicion
una pequeña cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y purpura de bromo
cresol, pH6); aminoácidos ensayados en forma L, muestra de problema y papel parafina.
Técnica => se añade una gota del inoculo (suspensión microbiana) en cada pocillo de la prueba
de API; se incuba a 35ºC durante 18-24 horas.
Resultados => durante las primeras horas de incubación, el caldo vira a amarillo, por la
fermentación de glucosa que lleva el medio; pero si el aminoácido es descarboxilado, el pH
vuelve a subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura (descarboxilasa+); si
se queda amarillo sera descarboxilasa-; gérmenes con descarboxilasa+ (Escherichia no es 100%
descarboxilasa+ de Lisina, Arginina y Ornitina):
- Lisina => Klebsiella, Serratia, Salmonella
- Ornitina => Serratia, Proteus, Salmonella
- Arginina => Salmonella, Pseudomonas
Pruebas de catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental que actúa sobre el
peróxido de hidrógeno /H2O2 (es un producto final de la degradación aerobica oxidativa de los
hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos gérmenes morirían; fundamento: si el
microorganismo tiene el enzima catalasa y se pone en contacto con H2O2 => se descompone en
H2O + O2; aplicación => diferenciación de Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y
Micrococcus (+);
Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plástico (las de platino catalizará la
reacción)
Reactivo => H2O2/ agua oxigenada, microorganismo de problema
Técnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto, simultáneamente,
con una asa se añade una colonia del cultivo del microorganismo de 12-24 horas, homogeneizar
y observar.
Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no aparecen
burbujas; se podrán observar falsos positivos si se utilizaran medios de cultivo agar sangreo
otros que lleven hematíes (los hematíes contiene catalasa).
Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo,
microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es productor de
H2S (acido sulfhídrico) este impide la formación de color; técnica => hacemos un inoculo a
partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el medio; incubar a 37ºC durante
12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B, observar si hay un cambio o no antes de
30 segundos (se interpreta rápido, ya que el color puede desaparecer); si no se forma color, se
añade al tubo un poco de polvo de Zinc; resultados => hay 2 posibilidades de que
sean Nitratasa+ (Haemophilus y Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o
rosado fuerte al añadir el reactivo A y B que indica la reducción de nitratos a nitritos; [2] al
añadir polvo de zink no se desarrolla color indica formación de otros productos
nitrogenados; Nitratasa- => cuando se forma color rojo o rosado al añadir polvo de zinc en
menos de 30 segundos.
Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de la ureasa
en los microorganismos cuando se observa la alcalinización de un medio liquido; la ureasa
cataliza la hidrólisis de la urea => carbonato amónico, que sube el pH, con lo que el medio se
alcaliniza; aplicación => diferenciar Proteus (+) de otras Enterobacteriaceas / E.coli (-) o
positivo retardado (+) como Klebsiella;
Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o baño maría.
Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color ámbar) y microorganismo de problema
Técnica => con el asa estéril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas;
inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar 37ºC; la reacción
se produce entre 1-4 horas
Resultados => en ureasa (+) el caldo de color ámbar vira a rosa fuerte durante el tiempo de
reacción (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de Klebsiella,
Enterobacter, Brucella, requieren 6 días de incubación.
Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa) - observar
la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitación al ponerse en contacto el
microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la coagulasa es un enzima
producido por microorganismos capaz de coagular en plasma; aplicación =>
diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram+, catalasa+, beta hemolítico + y coagulasa+) de
otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el germen es coco Gram+, catalasa+, beta
hemolítico +; técnica => (usando el kit comercial /prueba de látex) seguir la instrucción de la
casa comercial que hacen el reactivo; resultados => coagulasa+ se observa en forma de grumos
(si se utiliza un plasma como reactivo => se observara la formación de un hilo de fibrina en la
reacción) y en coagulasa- no se forma grumos.
Cambios de pH - [a] resultado final de la fermentación solo de la glucosa => K/A zona
superficial roja (reacción alcalina de las aminas) y zona profunda amarillo (reaccion
ácida); después de la fermentación de la glucosa, el medio de cultivo inicialmente es amarillo
entero, pero posteriormente la parte del pico se alcalina/rojo (había poca cantidad de
glucosa) por la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos (que forman la peptona) que se
produce mejor en aerobiosis; la fermentación de glucosa en el pico es inicialmente mediante la
vía EMP, utiliza tanto para los aerobiosis y anaerobiosis, dando un intermedio clave (acido
pirúvico), que a su vez el acido pirúvico es degradado mediante el ciclo de Krebs por los
aerobiosis o anaerobiosis facultativos dando CO2 + H2O y ATP; en cambio, en el fondo, el
acido pirúvico es degradado hacia acido láctico y acido mixtos que mantiene el pH acido de
manera estable.; son características de Morganella, Providencia y
Shigella; también P.mirabilis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.flexneri.
[b] en la fermentación de glucosa y lactosa => A/A zona superficial y profunda son amarillas
(características de E.coli y K.pneumoniae);
[c] no metabolizan ni lactosa ni glucosa (pero si la peptona) => K/K todo el tubo es de color
rojo (si se trata de anaerobiosis) o si se trata de aerobiosis, la zona profunda es de color naranja
(se alcalina mas la zona con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa)
[d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el tubo
(gérmenes inertes).
Producción de gas CO2 - aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del medio del
fondo del tubo, debido a la formación de hidrógeno y de anhídrido carbónico (CO2)
Producción de acido sulfhídrico SH2 - se manifiesta por el color negro de la capa profunda o
un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda o un precipitado negro en la capa
profunda (que puede enmascarar la acidificación del medio => fermentación de la glucosa
activa la desulfurasas); SH2+ => Proteus y Salmonella.
Prueba de rojo de Metilo => muchas enterobacteriaceas con importancia clínica (E.coli,
Proteus mirabilis, Yersinia, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Sighella, Vibrio) son
anaerobios facultativos, que para tener energía para sus reacciones metabólicas, utilizan la
fermentación acido-mixta de los hidratos de carbono produciéndose => acido succínico, acido
acético, alcohol etílico (ácidos mixtos); en RM positivo, aparecen un color rojo fuerte en la
superficie y en RM negativo, no hay cambio en la superficie del medio.
Material => igual que anterior
Reactivo => Medio de Clark y Lubs en tubo (liquido amarillo), solución de rojo de metilo y
microorganismo
Técnica => (a) en el tubo del medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo problema (b)
actualmente se utiliza la modificación de Barry que es poner un inoculo abundante en 0,5 ml de
reactivo de Clark y Lubs y dejar incubar entre 18-24 horas (c) a este cultivo se le añaden unas 5
gotas de indicador rojo de metilo que es rojo a pH 4,5 y amarillo a pH 6,3; el medio cambiara
de color cuando el pH sea inferior a 4,5.
Resultados => RM+ superficie del medio rojo fuerte y RM- => color amarillo en la superficie
del medio
Micro-técnicas
1. Sistema en Tiras (API - Biomerieux)
El material y reactivos necesarios para la realización de estas pruebas se encuentran
comercializados en kits; fundamento => los medios deshidratados en micro-tubos se re-
hidratan mediante una suspensión de 5 ml de agua estéril con 1 colonia bacteriana y se incuban;
el proceso metabolismo del microorganismo, genera cambios del color en el medio de cultivo o
al añadir reactivos y esos cambios se interpretan mediante tablas de lectura o ordenadores (se
deben seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante); principalmente se utiliza para la
detección de Enterobacteriaceas, bacterias aerobios no-fermentativas, anaerobios, levaduras,
estafilococos; después de utilizar todo debe ser incinerado o descontaminado en autoclave o
sumergido en un germicida.
(b) un microorganismo es resistente => cuando la concentración máxima de ATB que se puede
localizar en el lugar de la infección no es suficiente para eliminar el germen, es decir, la
concentración de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar mas por efectos
tóxicos secundarios.
(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis normales de ATB
dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infección sin llegar a dosis
que produzcan efectos tóxicos, puede eliminar el germen.
Casos clínicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es resistente a casi
todos los ATB, se dará una dosis toxico o una combinación de ATB por vía endovenosa.
Factores a tener en cuenta => (1) características tintoriales del germen (Gram+o-) (2) lugar de
la infección (especialmente las vías urinarias y meningitis); es importante porque es necesario
que la CMI sea alcanzable en los líquidos corporales para que sea efectivo (3) bacteria
investigada.
2. Derivados de betalactámicos:
* Aztreonam - se utiliza comúnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas
aeruginosa, pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como
p.ej. Klebsiella, Haemophilus, Citrobacter y Proteus.
6. Otros
* Fosfomicina - es un ATB de origen español de un amplio espectro que actúa sobre la pared
celular (se usa en infección urinaria)
* Acido fucsidico - actúa sobre la síntesis proteica y destaca su acción sobre Staphylococcus
aureus.
Técnica => el medio Mueller-Hinton se vierte en placas con un espesor de 4 mm; la siembra
utilizada preferentemente (a) la de Kirby-Bauer: se introduce un escobillón en el inoculo
preparado al 0,5 Mc Farland (no tenemos) y se siembra en 3 direcciones y se deja
aproximadamente 4 minutos la placa semi-abierta e invertida antes de colocar los discos;(b) la
de Barry: se hace una inoculación previa al vertido de las placas, se añaden 0,1 ml del inoculo a
25 ml del medio Mueller-Hinton fundido y se vierte en placa (no se usa mas)
Elección de ATB => se debe seleccionar un ATB representativo de cada grupo excepto en los
casos donde existan diferencias significativas en los espectros de actividad o resistencia ; los
aspectos importantes que prevalecen a la hora de seleccionar un ATB => las características
tintoriales del germen (Gram+o-), el lugar de la infección (orina, meningitis) y la bacteria
investigada.
Concentración de los discos => tiene que estar perfectamente estandarizada siguéndose las
normas de la Federación de Drogas y Alimentos/ FDA => la actividad del disco debe estar entre
65% y 150% y de la OMS => entre 75% y 135%; siempre se debe utilizar un control para
controlar la actividad de los discos; en general, se escogen discos con una concentración que
producen un halo de inhibición entre 20 y 30 mm para organismos tipificados como sensibles y
de menos de 10 mm para los resistentes.
Implantación de los discos (papel de filtro grueso de un diámetro 6mm que van impregnados
con una concentración determinada de ATB); Manual => se saca el disco de ATB con unas
pinzas estériles y se deposita en la placa, la distancia mínima entre los discos es de 24 mm para
evitar la superposición de los halos, deben estar situados a 15 mm del borde como mínimo (se
colocan 8 discos) una vez depositado el disco se presiona ligeramente con la punta de
pinzas; Automática => se utilizan dispensadores automáticos que son unos dispositivos de
plástico del tamaño de una placa de Petri con unos orificios guía que permiten la colocación
simultanea de todos los discos en el lugar adecuado, y con una pinza se presionan ligeramente
los discos para que al girar o invertir la placa no se caigan los discos.
Incubación => 18-24 horas a 35-37ºC (máximo 48 horas)
Lectura e interpretación del antibiograma => los resultados se expresan según el halo de
inhibición que aparece alrededor de cada disco; el halo se mide con una regla calibrada o pie de
rey midiendo los diámetros, y según cual sea clasificaremos al germen como sensible (la dosis
habituales es eficaz), intermedio (se deben incrementar las dosis habituales sin llegar a dosis
toxicas) o resistente (ATB es totalmente ineficaz);
Observación al método:
1. preservar la estandarización en todos sus pasos
2. puesto que la difusión del ATB es casi instantánea no debe moverse ningún disco una vez
que se ha puesto en contacto con la superficie del agar
3. los discos se tienen que conservar en la nevera
4. procurar que la lectura se haga a las 18-24 horas, evitándose el exceso de incubación
5. Aunque el medio elegido es el Mueller-Hinton, se pueden emplear medios enriquecidos
como AS (estreptococo), agar chocolate (Haemophylus) para gérmenes exigentes
6. de vez en cuando hay que colocar controles de calidad
7. cuando el germen sea anaerobio el método es diferente
Estudio de la orina
Función del riñón:
- La eliminación de nuestro organismo de una importante cantidad de residuos metabólicos,
muchos de ellos inútiles, y de otros que incluso pueden comportarse como tóxicos.
- La regulación de la composición de los fluidos de nuestro organismo facilitando así, tanto la
supervivencia de las células como el optimo desarrollo de todos los procesos metabólicos.
- El control hormonal de la presión arterial (adrenalina, noradrenalina)
- El control de los niveles orgánicos del calcio (mineral corticoides aldosterona, 1,25
dihidroxicolecalciferol)
- El control de la eritropoyesis (eritropoyetina)
Nefronas - son unidades funcionales básicas consiste de 2 partes => el glomerulo (dentro de la
cavidad "capsula de Bowman") y la red tubular.
El glomerulo - rodeado de una cavidad (capsula de Bowman) y dispone de una extensa red
vascular; filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/ dia); se
filtra agua, urea, creatinina, aminoácidos, ácido úrico, glucosa, proteínas de bajo pm.
Tipos de análisis de orina => análisis elemental, completo, rutinario, anormales y sedimento.
El orden cronológico de
un análisis general=> características físicas macroscópica - sedimentación (a 1500 rpm
durante 10-15 minutos) - pruebas bioquímicas (tiras reactivas); la muestra sobrante se debe
guardar hasta que la analítica haya concluido; hay que revisar los resultados del sedimento
concuerdan con las pruebas químicas y comprobar las anomalías detectadas han sido
confirmadas.
Proteínas - en condiciones normales las proteínas se encuentran 130-150 mg/día en función del
volumen de orina eliminado; en recién nacidos 2-8 mg/100 ml; cantidad de proteína (con peso
molecular menor)=> (a) albumina 1/3 del total (fisiológica); (b) globulinas; (c) proteína de
Tamm-Horsfall (T-H) es muco-proteína viscosa que no se encuentra en el plasma - se forma en
el tubulo contorneado distal, constituye la matriz de los cilindros; (d) transferrina; (e) IgA.
Proteinuria => eliminación de proteina en orina superando los VN
- intensa (>4 g/día) indica un daño renal grave; se dan en síndrome nefrótico, glomerulonefritis
(aguda y crónica), congestión venosa renal;
- moderada (de 0,5 - 4g/día) indica un daño renal menos graves; se dan en pielonefritis
con hipertensión, nefropatía diabética, mieloma multiple.
- leve (<0,5 g/día) se dan en riñones poliquísticos, lesiones renales incipientes.
- de patrón glomerular => pierde su selectividad en la filtración.
- de patrón tubular => cuando hay lesión tubular
- de forma intermitente o transitoria => puede ser fisiológica (hay que comprobarlo)
- de forma persistente => suele cursar con hematuria y su pronostico es peor.
Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa (filtrado y absorbido);
normoglucemia => 6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de
la concentración de glucosa en orina por encima de los VN, causada por (1) aumento de la
glucemia por encima de umbral renal (2) alteración renal (tubulopatía)
Urobilinógeno - BB directa con la bilis, pasa al intestino delgado donde por acción de la
flora bacteriana se transforma en urobilinógeno o estercobilinógeno (se elimina en mayoría con
las heces y la orina en menor concentración); la cantidad de urobilinógeno aumenta en la
orina en las hepatitis y las anemias hemolíticas; la determinación de urobilinógeno debe
realizarse rápidamente en orina, ya que se transforma en urobilina + O2 (falso negativo).
Estructuras organizadas
- Hematíes: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran
numero indica infección, traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal de 1-
2/campo o como una contaminación menstrual; pueden confundirse con levaduras y cristal de
oxalato cálcico monohidratado; con tinción Gram se diferenciar => los hematíes son teñidos de
rojo, levaduras de violeta y cristales incoloros; es importante distinguir entre macro-
hematuria (se ve en el sedimento de color rojizo) y micro-hematuria (únicamente se detecta al
microscopio), también si el color rojo observado macroscópicamente procede de hematíes o
Hb (al centrifugar el sedimento, el color rojizo de Hb permanece).
- Leucocitos (neutrófilos): pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; >50% de ellos
se lisan al permanecer mas de 2-3 horas a temperatura ambiente; presencia normal de 1-
2/campo (varón) y 1-3/campo (mujer); cifra superior de normal en el sedimento => piuria
(>5 leucocitos/campo indica => infección renal en cualquier nivel);
- Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamaño 1/3 mayores que los leucocitos; su
forma normal es redonda con núcleo grande y céntrico; un sedimento normal 0-1/campo;
aumentado en pielonefritis y glomerulonefritis.
- Cilindros céreos: son muy refringentes, rígidos, de apariencia dura, superficie rugosa y
brillante (como la cera de las velas), los extremos angulados y generalmente de gran tamaño; su
presencia es un síntoma claro de una alteración renal importante; suelen estar inmersos en
una cilindruria (presencia de la mayoría de los diversos tipos de cilindros).
Estructuras no organizadas
Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas
cristalinas según la condiciones físico-químicas de la orina (la pH sobretodo, densidad,
temperatura, etc.) y se excretan a nivel urinario; se diferencian en 3 grupos:
(1) Cristales endogénos normales - no corresponden a alteraciones metabólicas ni funcionales,
muy frecuente en el sedimento y pueden aparecer en orinas recién emitidas.
(2) Cristales endogénos patológicos - reflejan trastornos metabólicos o afectación grave
de algún órgano o sistema y muy raras veces aparecen en orina.
(3) Cristales exógenos - aparecen en la orina tras la introducción en el organismo(vía enteral o
parenteral) diversas sustancias (contrastes radiológicos/ contraste radiopaco vía endovenosa y
medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)
- Cristales de acido úrico: en orinas ácidas; son birrefringentes; de formas variadas(p.ej.
agujas); color entre marrón rojizo, el amarillo e incluso incoloros; indica
una situación patológica o concentraciones elevadas de acido úrico; un sedimento normal 0-
2/campo.
- Cistina: en orinas ácidas; tiene significación clínica por si solos => aparecen
como consecuencia de cistinuria; aspecto incoloro con forma de placas hexagonales, regulares
finas y transparentes; es imprescindible una vez observados en el sedimento, confirmar
la concentración de cistina en la orina.
- Leucina y tirosina: en orinas ácidas; raramente se observan; son productos finales del
metabolismo proteico y suelen aparecer juntos en situaciones clínicas graves=> destrucción o
necrosis tisular importante, fundamentalmente de tejido hepático (hepatitis, cirrosis, etc.); los
cristales de tirosina forman manojos de agujas finas y los de leucina son
como gránulos esféricos de estrías radiales y concéntricas, de aspecto oleoso o graso y muy
refringentes; ambas son de color amarillo o marrón.
- Cristales de bilirrubina: en orinas ácidas; de pacientes con bilirrubinemia(bilirrubina alta en
sangre); de forma agujas con color marrón-rojizo (flecha verde).
- Fosfato amorfo: en orinas alcalinas; de semejante forma a uratos amorfos, pero de color
blanquecino.
Informe del sedimento urinario
1. debe preceder por el estudio de "anormales" en orina (tiras reactivas => pH, densidad
y características patológicas)
2. deben observarse al microscopio optico (40x) al menos 10 campos.
3. debe proporcionar una visión del valor medio de cada elemento o estructura, obtenido en
todos los campos observados.
4. debe ser "escueto" y "conciso" (solo hay que poner lo verdaderamente importante)
5. debe seguirse un orden => hay que informar primero el examen realizado de citológico,
segundo el de químico y por ultimo el de microbiológico.
Examen citológico:
- celulas hematológicas => se redactan con números y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C =
no.leucocitos por campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se forma acúmulos.
- celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) - moderada (3-4)
- abundante (6-8) - intensa (muy abundante 10-12); las importantes son las renales y las
de transición; las celulas escamosas (de las vías bajas), se informan cuando son abundantes.
- cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos e indicar en el
informe el tipo de cilindro.
Examen químico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos en el
informe):
- cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de "diatesis".
- compuestos amorfos => se redactan con adjetivos
Examen microbiológico:
- bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su movilidad
- levaduras => se informa con adjetivos.
Staphylococcus => cocos Gram+ inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, tamaño +/- 1
um; en forma de racimos, catalasa+, gelatinasa+, nitratasa+, fermentadores de muchas
azucares (via EMP); no capsulados y resiste al calor; crecen en medios generales y medios con
alto contenido de NaCl (halófilo); resistentes a agentes externos, distribuidas ampliamente en la
naturaleza, flora normal de las mucosas y la piel, causante de la intoxicaciones alimentarias,
heridas, etc.
Clasificacion
A. según el tipo de hemolisis (capacidad de romper hematíes - produce hemólisis alrededor de
sus colonias en AS) => gamma hemolítico,
alfa hemolíticos/ hemólisis parcial (decoloración parda verdosa
- S.viridans); beta hemolíticos/ hemólisis total (halos de transparencia grandes entorno a su
colonia) - grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-hemolíticos - grupo
D, S.viridans y S.pneumoniae (alfa y gamma)
(4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolíticos; resistentes a agentes
externos y ATB;
- los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del hombre; crecen
bien en NaCl 6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan la bilis esculina; son alfa-
beta-gamma hemolíticos; resistente a la bacitracina; puede producir infección urinaria e herida.
- los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y caballos); hidrolizan
la bilis esculina; resistente a la bacitracina;
(5) Streptococcus del grupo G, F y E => saprofitos de la rinofaringe, vias genitales e intestino
en el hombre; pueden producir infecciones en vias urinarias, heridas; resistente a la bacitracina;
son alfa y beta-hemolíticos; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%)
(6) Streptococcus Alfa hemoliticos (S.viridans) => no son capsulados; producen alfa y gamma
hemolisis; saprofitos de la orofaringe, mucosa bucal, placa dental (caries); resistente a la
optoquina;
(7) Streptococcus pneumoniae (neumococo) => es un grupo a parte; diplococos, Gram+ y son
capsulados; muy sensibles a medios externos; son alfa y gamma hemolíticos; sensibles a
optoquina; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%); saprofito en aparato respiratorio;
puede producir neumonias, inflamaciones sinusitis, otitis y meningitis (mas frecuente en
adultos);
Aislamiento:
- toma de muestra con total asepsia de la rino-faringe con hisopo estéril, una muestra del pus (si
hubiera); se analiza de inmediato (estreptococos son sensibles a medios externos);
- un frotis para la tinción de Gram; si se sospecha S.pneumoniae se realiza
una tinción negativa con tinta china y prueba de "Quellung" (determinar Ags de la capsula); se
produce una reacción de Quellung cuando un Acs tipo específico se une al polisacárido
capsular del neumococo y causa un cambio en el índice refractivo de la cápsula haciéndola
aparecer “hinchada” y más visible.
- la siembra en AS-CNA (posibles hemólisis - estreptococos son resistentes a nalidixico que
inhibe el crecimiento de otros gérmenes); realizar hemocultivos si se sospecha endocarditis o
sepsis; las colonias son grisaceos, redondos de bordes lisos y pequeños; medios selectivo y
diferencial con NaCl 6,5% => permite el crecimiento de enterococos del grupo D.
Pruebas bioquímicas:
- pruebas de catalasa-, hemolisis en AS, sensibilidad o no de optoquina y bacitracina; hidrolisis
de hipurato (positivo en el grupo B), utilización de bilis esculina.
- identificar los grupos antigénicos según el tipo de sustancia polisacárido C(clasificación de
Lancefield) por metodo serológicos => prueba de látex (romper la capsula para sacar la
sustancia; reacción inmuno-complejo Ag-Ac).
- los Gram+ en general son sensibles a la vancomicina excepto algunos cocos Gram+, catalasa-
que no son estreptococos (Pediococcus es resistente a la vancomicina).
Pruebas serologícas / inmunologicas:
- la búsqueda en el suero (dilución seriadas) del paciente de Acs frente a toxinas y enzimas de
estreptococos (sobre todo grupo A) => títulos de Acs antiestreptolisinas O (ASLO); para saber
si la infección es aguda o creciendo; en caso de fiebres reumáticas con títulos de ASLO
negativos, se determinan los títulos de Acs
antiestreptoquinasas (ASK), antihialuronidasas (ASH); pruebas de hinchamiento capsular con
suero antineumococico polivalente (prueba de Quellung) muy utilizado para
determinar S.pneumonia => se añaden Acs contra Ags capsulados, si hay aglutinación es signo
de que esta estreptococo.
Neisseria => cocos Gram-; en forma de diplococos (granos de café), aerobios; son saprofitos
de mucosas (genitales, faringe, fosas nasales) y cavidades del hombre y los
animales; citocromo-oxidasa y catalasa+; utilizan azucares con metabolismo oxidativa y
fermentativa; producen pigmentos carotenoides; nutricional-mente exigentes; sensibles a
medios externos.
Características antigénicas:
- Ag somático / Ag O => es lipo-polisacárido, termo-estables, se encuentra en la pared
bacteriana, es una endo-toxina (la parte polisacárido es muy antigénico y la parte lipídica es
inactiva bioquímica-mente).
- Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacárido, es anti-
fagocitarías (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-1 y Salmonella
thyphi).
- Ag flagelar /Ag H => es característico de las cepas móviles, es proteico y responsable de
la acción patógena de la bacteria.
Cuadros clínicos
1. Infecciones entéricas (S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C - para-
tifoideas); Las fiebres tifoideas son transmitidas al hombre vía oral (alimentos crudos, poco
hechos, mal conservados y aguas contaminadas), llega al estomago, resiste la
acidez gástrica, pasa al intestino delgado (íleon), penetra por endocitosis destruyendo parte de
las celulas de la mucosa intestinal; una vez dentro las salmonellas
son fagocitadaspor macrófagos y transportadas por diferentes vías y provoca bacteriémia =>
todo sucede en el periodo de incubación (8-15 días); comienzo brusco de signos y sintomas
=> los macrófagos les transportan hacia el bazo, higado y MO, produciendo multiplicación de
nuevas salmonellas, volver al intestino generando placas ulceradas, necrosación de placas de
Peyer y en casos mas graves originar perforación y hemorragias.
Las fiebres para-tifoideas son mucho mas leve con un periodo de incubación de entre 7-10
dias con bacteriémia y estado febril que dura varias semanas; no hay perforación intestinal ni
hemorragias ni invasión de salmonellas a otros órganos; cuadros clínicos => dolores de cabeza,
fiebres altas, anorexia, astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-10 días.
Acción patógena e interés clínico - los cuadros clínicos son variables según el tipo de toxina
que originen; algunas cepas de E.coli forman Ag O y K anti-fagocitarías y resistencia a
bactericidas y ATB (alto poder invasivo); otras cepas forman endo-toxinas, causante de cuadros
febriles y diarreicos; otras cepas tienen un mecanismo de acción análogo al de Shigella con
menor gravedad; a veces la entero-toxina que producen es parecida a la de Vibrio cholerae que
causa perdida masiva de agua y electrolitos.
- si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotóxica parecida a Shigella => cuadros
diarreicos en brotes epidémicos que afectan a niños y lactantes (E.coli entero-patógena)
- si forma una entero-toxina semejante a Vibrio cholerae => procesos diarreicos en niños,
adultos, originándose esporádica-mente brotes epidémicos (diarrea del viajero - E.colientero-
toxígena)
- si forma una entero-toxina citotóxica similar a S.disenteriae => procesos diarreicos graves,
hemorragico esporádicamente en brotes (E.coli entero-hemorragica)
- si presenta ciertos plásmidos que incrementan su capacidad de invasión => cuadros diarreicos
graves que afectan a niños, adultos con brotes epidémicos en casos aislados (E.coli entero-
invasiva)
Las cepas de E.coli se distingue con sueros antigénicos; E.coli también puede provocar
infecciones urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares, heridas, meninges
(meningitis en neonatos).
Aislamiento, pruebas bioquímicas - diagnostico
Toma de muestra representativa de alimento, agua, heces, exudado; frotis de Gram; medios de
cultivo Mc, Levine; pruebas bioquímicas => lactosa+, indol+, citrato-, sensible a la Colistina.
Acción patógena e interés clínico de Y.pestis => cuadros agudos y febriles con
alta inflamación de los ganglios linfáticos, hemorragias internas, petequias difusas en la piel, en
ocasiones septicemia y neumónia; es muy contagiosa, se origina en lugares de salubridad
baja; la muerte se produce por shock séptico (fracaso multi sistémico) o por neumónia; factores
de virulencia:
- La toxina murina (liberada al medio cuando muera la bacteria) => proteína que bloquea
la utilización de O2 por parte de las celulas.
- Endo-toxinas (liberadas en el transcurso de la enfermedad) => origina el proceso febril
- Ag V con propiedades anti-fagocitarías
- Coagulasas y fibrinolisinas
Y.pestis llega al hombre a traves de la picadura de pulga (infectada por ratas con
peste), atraviesa los vasos linfáticos, pasa a los ganglios donde se multiplica originando
bubones, pasa a la sangre y se disemina por el bazo, higado, pulmones, piel, mucosas, se
multiplica provocando lesiones piógenas (toxina murina), hemorrágicas, necrótica y
edematosa; en casos graves aparece coagulacion intravascular diseminada (CID) (por
la acción de las coagulasas) o diátesis hemorragica (por la acción de las fibrinolisinas), colapso
circulatorio, toxemía generalizada y muerte; formas clínicas:
1. Peste bubónica (la mas frecuente); tras el periodo de incubación de 3-7 días después de la
picadura, aparecen signos y sintomas con escalofríos, vómitos, formación de bubones en las
ingles axilas y/o zonas submaxilares (los tejidos circundantes aparecen inflamados); sin
tratamiento se agrava hasta la muerte.
2. Peste pulmonar (es la complicación de peste bubónica); se produce afección pulmonar
grave con insuficiencia respiratoria, cianosis; es altamente mortal.
3. Peste septicémica es estadios últimos de la peste en cual quiera de sus formas y es
generalmente mortal.
4. Citrobacter (huelen a peste) => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+), móvil, fermenta la
glucosa y VP- RM+, citrato+; son comensales del tubo digestivo del hombre y puede provocar
infecciones urinaria, respiratoria, sepsis, bacteriémias, meningitis a los individuos debilitados;
especies importante => C.freundii.
Brucella - bacilos pequeños (coco-bacilos) Gram- inmóviles, aerobios estrictos, algunas crecen
mejor en atmósferas ricas en CO2 (5-10%), su crecimiento es lento, catalasa+, oxidasa+,
nitratasa+, ureasa+, sensibles a medios ácidos y se destruyen fácilmente a temperatura de
pasteurización.
Acción patógena e interés clínico - se transmite vía aérea a partir de aerosoles procedentes de
aguas contaminadas o sistemas de aire acondicionado o humidificadores
contaminados con Legionella; tras el periodo de incubación (+/- 1 semana) se produce fiebres
altas, astenia, malestar generalizado, tos, anorexia, dolor pleural agudo, disnea (un
cuadro típico de una neumónia atípica); se conoce como la enfermedad de los legionarios; el
pronostico sera mas severo en ancianos o adultos debilitados aunque con el tratamiento preciso
suele remitir sin problema.
El genero Nocardia - corresponde a actinomicetos aerobios que forman micelio vegetativo que
tiende a fragmentarse originando estructuras bacilares o coco-bacilares;
Gram+ inmovil, aerobios estrictos y AAR+ (tiene características análogas alMycobacterium)
poseen gran cantidad de acidos micolicos de cadena larga en su pared bacteriana; poseen
ademas glicolípidos y fosfolípidos que sirve para su identificacion y diferenciación; algunas
especies son patógenas para el hombre.
Para que se produzca el tétanos es necesario una serie de condiciones tales como que el
microorganismo germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una herida profunda
(cortante, punzante, mordeduras, arañazos, partos, abortos, quemaduras, ulceras por decubito) o
herida superficiales (rozaduras) se pueden infectar y formar costra que facilita
la infección anaerobia; en las condiciones favorables de anaerobiosis, las esporas
de Clostridium tetanii en el ambiente pasan a la herida, germinan y tras un periodo
de incubación (5-7 días), se origina su acción patógena; es rara que se produzca de forma local
en la zona de entrada; la forma generalizada es mas habitual y mas grave; es importante
la detección precoz y medidas profilácticas (vacunación se renueva cada 10 años).
Clostridium botulinum - bacilos Gram+ anaerobios estrictos, grandes, móviles por
su flagelación y presentan esporas; es capaz de formar neuro-toxinas peligrosas y potentes
sobre las personas que originan parálisis o debilidad muscular; las esporas son distribuidas
ampliamente en el aire, suelo, ciertos alimentos (conservas, pescados, etc.); si las condiciones
en el ambiente son de anaerobiosis, germinaran; su accion patógena sobre el organismo
sera neuro-paralizante y con una dosis de 10 elevado a -8 (10 nanogramos) de su toxina es
suficiente para causar la muerte (es el veneno mas potentes hasta ahora), que solo se producen
en condiciones adecuadas de anaerobiosis, temperatura en torno a 30ºC, pH neutro o
ligeramente acido y permiten que germine la espora; sus toxinas son de carácter proteico y
termolábiles (se destruyen a temperatura 100ºC durante 5 minutos o 70ºC de 30-60 minutos).
Genero Treponema - son espiroquetas pequeñas, finas con un numero de espiras entre 5-
20 distribuidas de forma regular, con gran movilidad; se tiñe difícilmente con Gram y se tiñe
mejor con Giemsa o tincion de plata y se visualiza con la microscopia de campo oscuro y de
contraste de fases; no crece en medios de cultivo in vitro y requiere un medio de cultivo in vivo
para crecer (testículo de conejo); crece bien en situaciones de bajo potencial oxido-reductor
(microaerofila), presentando en ocasiones una respiración anaerobia y un metabolismo
fermentativo; el especie patógena para el hombre es Treponema pallidumque transmite
la sífilis por contacto directo; existen dentro del genero Treponema especies comensales de las
mucosas, tracto urinario, vaginal, tubo digestivo, etc. que no son patógenos para el hombre y se
pueden cultivar.
Resumen de la evolución de sífilis => Incubación 10-90 días (termino medio 21 días) -
Periodo primario (2-6 semanas) - fase silente (2 meses - 2 años) - Periodo
secundario/ sífilis florida (2-6 semanas) - fase latente (3-30 años) - Periodo terciario/ Neuro-
sífilis forma muy grave con mal pronostico.
Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamaño con espiras mas amplias e irregulares
con extremos afilados y son móviles; las especies patógenas para el hombre y los
animales, originan fiebres recurrentes endémicas y epidémicas; es microaerofílica con
un metabolismo fermentativo; se tiñen con facilidad de Gram- y se puede cultivar in vitro, pero
requiere medios muy específicos; las especies mas importantes del genero Borrelia, se
transmiten por piojos y por garrapatas.
Acción patógena e interés clínico - las fiebres recurrentes son una enfermedad muy
cosmopolita, en ocasiones endémica a condiciones de salubridad muy baja; tras la picadura del
vector, ya sea garrapata o piojo, pasan las borrelias a la sangre del huésped, ayudadas por el
rascado que provoca el aplastamiento del piojo /garrapata, que dará lugar a micro-traumas en la
piel y facilitan el paso de dichas borrelias; después de unos 7 días de incubación se
originan fiebres, dolores musculares, cefalea, etc; clínica que dura unos 10 días y luego
desaparecer, produciendo posteriormente recurrencias; no es una enfermedad grave y es fácil de
tratar, especialmente con tetraciclinas.
Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy numerosas y
apretadas, con sus extremos ligeramente incurvados y móviles; se tiñen débilmente con
Gram, también se pueden teñir con Giemsa; su metabolismo es oxidativo (crecimiento aerobio);
existe en la naturaleza leptospiras saprofitas y parásitas; puede originar de forma
casual leptospirosis en el hombre con cuadros febriles; el reservorio son animales, consideradas
como zoonosis.
(2) Tifus murino o endémico - producido por R.typhi mediante la picadura de la pulga,
garrapatas y ácaros; tras el periodo de incubación de 4-15 días, se produce fiebres altas,
cefaleas, artralgias y mialgias generalizadas con un cuadro clínico leve sin complicaciones ni
recidivas como el tifus exantemático.
(3) Fiebres manchadas de las montañas rocosas - producida por R.rickettsiitrasmitidas por
las garrapatas; tras el periodo de incubación de 3-6 días, aparecen fiebres altas, mialgias
generalizadas y una mancha negra en la zona de la picadura; en España la especie mas
extendidas es R.conorii, el agente de la fiebre botonosa o exantemática mediterránea,
transmitida al hombre por la garrapata (sobre todo del perro); tras el periodo de incubación de
2-6 días provoca una mancha negra a modo de botón en el lugar de la picadura, fiebre,
artralgias, mialgias generalizada y manchas maculo-papulosas; no se suelen complicar y
responden bien al tratamiento.
(4) Fiebre Q - producida por Coxiella burnetii mediante inhalación de esta u otras(presencia
de artrópodos), la vía de entrada no se conocen hasta la fecha; tras el periodo de incubación de
3 semanas, se produce un estado febril con mialgias generalizadas y cuadro clínico leve.
Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o alas de
gaviota (en cultivos jóvenes); son microaerofílicos, móviles por un único flagelo polar; no
fermentan los carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+; habitan el tracto gastrointestinal de muchos
animales; en el hombre se asocian a infecciones gastrointestinales (via de entrada oral/
digestiva), fundamentalmente, y cada vez en mayor grado a infecciones extra-
intestinales (meningitis, endocarditis, artritis séptica), especialmente en pacientes con SIDA.
Especies clínicamente importantes para el hombre - C.jejuni, C.coli y C. laridis son agentes
etiológicos de diarrea; C.fetus subsp. fetus produce septicemia en pacientes inmuno-
suprimidos.
Identificación - los campylobacter termofílicos dan lugar a colonias grises, incoloras, mucosa
y no hemolíticas; se les hace una tinción Gram (bacilos Gram- con forma de S en cultivo joven
y en cultivo viejo pueden dar formas cocoideas); se monta un fresco para observar la
movilidad; son oxidasa y catalasa positivos; para diferenciar entre las especiesse puede montar
un API o se realizan varias pruebas => (1) crecimiento a distintas temperaturas, (2) sensibilidad
al acido nalidixico y a la cefalotina (3) hidrólisis del hipurato (se introduce una tableta dentro
de un tubo inoculado, dará + si cambia a color amarillo).
Campylobacter jejuni => crecimiento a 42ºC, hipurato+, sensibilidad a Nalidixico y resistente a
Cefalotina
Campylobacter coli => crecimiento a 42ºC, hipurato-, sensibilidad a Nalidixico y resistente a
Cefalotina
Campylobacter fetus => no crecen a 42ºC, hipurato-, resistente a Nalidixico y sensible a
Cefalotina
Campylobacter laridis => crecimiento a 42ºC, hipurato-, resistente a ambos Nalidixico y
Cefalotina
Helicobacter Pylori - se aislaron por 1ª vez (1982) del estomago de pacientes con
lesiones gástricas y ulcera péptica; son bacilos curvados Gram- con forma de espiral y gran
actividad ureasa; se les denomino Campylobacter pyloridis, posteriormente se rectifico a
Campylobacter pylori y cuando demostraron que difería morfologicamente del genero
Campylobacter, se propuso la creación de un nuevo genero Helicobacter que se incluyo la
especie de Helicobacter pylori; se trata de una especie de reciente descubrimiento, implicada
en procesos de infección gástrica.
Metodos indirectos:
- Prueba de la urea rápida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un medio con
alta concentración de urea y un indicador de pH.
- Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de tiempo
se mide el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea marcada con C13, que se detecta con
un espectrofotómetro de masas y urea marcada con C14 detectada con un contador de centelleo
(un método diagnostico rápido y no invasivo, pero requiere un equipo especial par al lectura).
- Prueba serología => para detectar Acs utilizando la técnica de ELISA.
Patología - existen pruebas claras de que H.pylori esta implicado en
diversas patologías gástricas, pero se cuestiona como la causa de dichas infección; parece claro
que es agente etiológico de gastritis aguda; se piensa que también pueda tener un papel en la
gastritis crónica activa; en las ulceras pépticas se aísla 100% de pacientes con ulcera duodenal y
77% de ulcera gástrica; parece ser que su presencia no es suficiente para desarrollar la ulcera;
no esta claro el papel que desempeña en la dispepsia no ulcerosa, en el reflujo gastro-esofágico
y en el carcinoma gástrico; hasta 50% de la población adulta de >60 años es portadora de este
microorganismo; se desconoce su modo de transmisión; se ha propuesto una
posible adquisición del mismo por contacto con animales, región periodontal
y transmisión persona-persona (ninguno están demostrados)
Tema 26
- VIROLOGÍA CLÍNICA (características generales de
los virus)
Introducción - virus es un parásito intracelular estricto que requiere infestar una célula para
sintetizar sus componentes y ensamblar nuevos viriones; son de muy pequeños tamaños
(filtrables) y se caracteriza por su mecanismo de replicación, organización y
composicion; virología clínica se remonta al siglo XX y la composicion de un virus fue
determinada por Schlesinger en 1933; en los últimos años se han descubierto otros agentes
infecciosos mas simples como los viroides y los priones;
- los viroides => moleculas circulares de ARN de bajo Pm sin cubierta proteica que causan
enfermedades a las plantas, infectar a los hombres y animales;
- los priones => son proteínas que parecen estar codificadas por genes celulares y actúan como
señales reguladoras en las celulas que invaden, resistentes a los procesos físico-químicos que
inactivan a los virus y no producen respuesta inmune o inflamatoria en el huésped; provocan
prurigo lumbar de las ovejas y cabras (scrapie), encefalopatía espongiforme en las vacas y
enfermedades neuro-degenerativastransmisibles en el hombre (p.ej. Creutzfeldt-
Jacob /encefalopatía espongiforme progresiva y síndrome de Gerstman-Straussler-Streinker y
el kuru); la patogenia (de todas) se caracterizan por desordenes progresivos como ataxia
(dificultad motórica), demencia, deterioro cognitivo y motor; tras un periodo
de incubación largo (meses o años), aparecerá los sintomas clínicos; el tropismo de la
infectividad es SNC, seguido por el bazo y nódulos linfáticos; en el cerebro se
detecta acumulación anormal de proteína-prionen el genoma del huésped; los priones son
resistentes a las proteasas e induce una degeneración neuronal.
Estructura y morfología de los virus - son de tamaño entre 20-25 nm hasta 200-300
nm; su observación requiere un microscopio electrónico.
- Estructura del genoma => ADN o ARN mono-catenario o bicatenario; la mayoría de virus
ARN tienen genomas mono-catenaria excepto los reovirus/rotavirus (bicatenario); los virus
ADN suelen ser bicatenario, excepto parvovirus (mono-catenario); los genomas (core o núcleo)
pueden ser moleculas lineales o circulares únicas o segmentadas en varios fragmentos.
- Estructura de la cápside => su función es de proteger el genoma del medio extracelular y
facilitar la entrada al interior de la célula; están compuestas de subunidades proteicas repetidas
(capsómeros) que a su vez están compuestas de moleculas proteicas
(protómeros); según la disposición que adopten los capsómeros /la cápside, se clasifican en
virus de simetría helicoidal (normalmente son virus ARN), icosaedrica (20 caras triangulares y
12 vértices) y compleja.
- Estructura de la envoltura => los lípidos de la envoltura es lipoprotéica y procede de la
membrana célula infectada, pero las proteínas suelen ser virales desplazados a
las proteínas celulares originales; en algunos casos, las proteínas incluyen una matriz
(proteína M) que contacta/ engancha con la nucleocápside; los virus envueltos tienen
estructuras glucoprotéicas (espículas) importantes para los procesos
de adsorción y penetración al interior de la célula.
Ciclo vital de los virus - las estrategias de replicación varían dependiendo de la estructura del
virus y de su material genómico, pero en general conlleva pasos de => adsorción/ adherirse
- penetración - decapsidación - replicación - ensamblaje - liberación.
- Adsorción => la unión de la partícula viral a la superficie de la célula; no requiere energía y
no depende de la temperatura; intervienen moleculas proteicas de la superficie
del virión (proteínas de unión) y proteínas de la superficie de la membrana de la célula diana
(proteínas receptoras); en los virus envueltos, la proteína de adherencia viral son
las espículas de la capa externa de la envoltura.
- Penetración => tras ser adherido, se penetra el virión completo o solo el genoma y las
polimerasas entran en el citoplasma celular, esto se lleva a cabo por 3
mecanismos: penetración directa, endocitosis o fusión; penetración directa => la membrana
solo permite la entrada del genoma viral (ocurre en virus sin envuelta p.ej.
fagos); endocitosis => los viriones adsorbidos, quedan rodeados por la
membrana citoplasmática de
la célula huésped formándose una vesícula endosómica (mecanismo mas utilizados de los virus
sin envuelta); fusión => utilizado por los virus envueltos; existen 2 maneras de fusión: en
los paramyxovirus, su envuelta se fusiona con la membrana citoplasmática directamente y
la nucleocápside se libera al interior del citoplasma; en el resto de virus envueltos, la envoltura
viral se fusiona con la membrana celular formándose una vesícula endosómica que
posteriormente libera la partícula viral hacia el citoplasma.
- Decapsidación => se degrada la cápside viral para que el genoma viral pueda liberarse e
iniciar la transcripción y la traducción; en la mayoría la penetración y la decapsidación se
produce a la vez.
- Replicación => es la fase donde se produce la síntesis de todas las macro-moleculas virales;
la célula huésped debe proporcionar la energía y los medios suficientes que a veces puede
afectar su propio metabolismo celular, pero en otros casos apenas se alteran; es esencial que
los ARNm transcriban la información viral y la replicación de la información genética y que
posteriormente mediante los componentes celulares se traducen para fabricar proteínas que se
necesitan.
a. Replicación de virus ADN bicatenario => tras la adsorción y la penetración, el ADN viral es
liberado y penetra en el núcleo + ARN polimerasas celulares => ARNm transcrito y traducido
para la síntesis ADN viral; para el proceso de traducción => ARNm emigra al citoplasma
celular y es traducido para formar las proteínas de la cápside => que posteriormente son
transportadas al núcleo para ensamblar el virión completo que serán liberados por lisis
celular; la excepción dará al virus ADN poxvirus (grande y de simetría compleja) que realiza el
proceso de transcripción y traducción en el citoplasma celular utilizando su propia ARN
polimerasa dependiente del ADN viral, ya que no pueden utilizar ARN de la célula huésped que
se localiza en el núcleo.
d. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (-) => su ARN de polaridad (-)
complementa el ARNm que es de polaridad (+); mediante su propio ARN polimerasas
sintetizara el ARNm que después le servirá de molde para la síntesis de nuevo ARN de
polaridad (-) y también para la traducción de sus proteínas utilizando la maquinaria celular.
e. Un caso especial de Retrovirus => virus ARN mono-catenario de polaridad (+) que poseen
un enzima transcriptasa de reversión (transcriptasa inversa / retro-transcriptasa); su genoma
ARN + retro-transciptasa => produce ADN de polaridad (-) + (la misma) retrotranscriptasa =>
origina ADN bicatenario que se integran al ADN celular y permanece alli durante tiempo
prolongado; En un momento dado el ADN integrado se reactiva y es transcrito a
ARNm vírico por la polimerasa del huésped y entonces, se completa el ciclo replicativo.
- Ensamblaje y liberación => se puede producir tanto en el núcleo como en el citoplasma, tras
la replicación del genoma viral y la transcripción de las proteínas virales, los viriones se
ensambla y se libera de la célula huésped; consiste en la unión ordenada del acido nucleico y de
las proteínas para formar la nucleocápside, dando lugar a un virión viable; la liberación de los
virus sin envuelta (desnudos) se produce por lisis celular; en caso de virus envueltos, salen al
exterior por gemación de una zona de la membrana nuclear o citoplasmática (depende si son
virus ADN o ARN); la zona de la membrana por donde
se producirá la gemación, adquiere primero las espículas y las proteína de la matriz
(codificadas por el virus), que atrae a la nucleocápside, fusionándose a la
membrana, formándose la envuelta y liberándose el virión al exterior; en caso
de poxvirus (mas grandes y complejos), estos pueden sintetizar sus propias envueltas; en caso
de retrovirus, el virus no se libera de la célula sino que se integra en su genoma y
permanecer así largo tiempo o de por vida; el proceso de ensamblaje y liberación es a veces
ineficaz, formándose partículas no infectivas.
Taxonomía vírica - los virus se dividen en familias, genero, especie o tipo y según su forma
del genoma, tamaño, forma, estructura, sintomatología clínica que producen, tropismo celular,
etc; según el tipo de genoma que contienen y su estructura => se clasifica en virus ARN y virus
ADN.
Virus ARN
1. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de polaridad (+) que utiliza
su propio ARN como mensajero (pueden ser inmediatamente traducidos por la célula huésped
ya que no se necesita transcribir ARNm) con la excepción de Reoviridae(bicatenarios) que
utilizan su propia ARN polimerasa para transcribir ARNm; todos se ensamblan en el citoplasma
de la célula huésped y son resistentes al éter.
- Familia Reo-viridae => tamaño intermedio (60-80 nm de diámetro), los únicos bicatenarios; el
mas importante para el hombre es el Rotavirus (provoca problemas diarreicos), tiene forma
redonda.
- Familia Calici-viridae => son pequeños (35-39 nm), tienen poca importancia en
microbiología clínica; el mas importante /patógeno para el hombre es el virus de
Norwalk (productor de gastroenteritis) y el virus de Hepatitis E (su inclusión no es definitiva)
- Familia Picorna-viridae => son pequeños (20-30 nm); los géneros mas importantes son
los Enterovirus (>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus, Echovirus, Cosxackievirus y el
virus de la hepatitis A) y los Rhinovirus (>100 rhinovirus).
- Familia Flavi-viridae => son de 40-50 nm y adquieren su envoltura en las membranas intra-
citoplasmáticas (antes se incluyen dentro de la familia Togaviridae y los han separado por su
menor tamaño y por el lugar de su ensamblaje que ocurre en el retículo endo-plasmático);
incluyen 2 géneros de importancia clínica: (1) Flavivirus (antes llamados arbovirus del grupo
B) que destaca el virus de la fiebre amarilla y del dengue; (2) virus de la Hepatitis C;
actualmente se incluye de manera no definitiva al virus de la hepatitis G.
3. De simetría helicoidal - todos son envueltos, mono-catenario de polaridad (-) que utiliza su
propia transcriptasa (ARN polimerasa) para transcribir ARNmensajero; se ensamblan en el
citoplasma y son sensibles al éter.
- Familia Rhabdo-viridae => de forma bala o bastón; el diámetro del cilindro +/- 70nm con
longitud de 175nm; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmática; el genero mas
importante es virus de la rabia.
- Familia Parvo-viridae => de tamaño muy pequeño 18-26nm con genoma ADN mono-
catenario; la mayoría no tienen importancia clínica, excepto parvovirus B19, pertenece al
genero Parvovirus que causa eritema infeccioso.
- Familia Papova-viridae => son de tamaño pequeños 45-55nm con ADN de tira circular; el
genero mas importante es el Papilomavirus o virus de las verrugas con 66 tipos
depapilomavirus humanos (PVH); los Papovavirus en general producen enfermedades latentes
y crónicas y algunos son oncogénicos.
c. De simetría compleja
- Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma ladrillo o
ovoide; se caracteriza como la única familia de virus ADN que se replica y ensambla en el
citoplasma, pues contienen una RNA polimerasa ADN dependiente (no necesita la maquina
nuclear), de hecho su replicación es posible en celulas a-nucleadas (sin núcleo); son resistentes
al éter y poseen una doble envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y la otra en la
membrana citoplasmática; los mas importante son virus de la viruela, virus de la vacuna
o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.
Principales familias de virus de interés clínico
1. Virus ARN (mono-catenario)
1.1. Familia Reo-viridae (tamaño mediano 60-80nm - icosaedrico - sin envuelta - se
ensamblan en el citoplasma) - contiene 6 géneros, únicamente cabe destacar Rotavirus)
Rotavirus (forma de rueda - el único bicatenario) => descubiertos en 1973 en niños con
gastroenteritis; el único con importancia clínica (agente causal
de gastroenteritis esporádica y epidémica en lactantes y niños; la infección suele
ser asintomática en neonatos; afecta principalmente a niños entre 6-24 meses; la
prevalencia máxima en invierno y raramente en verano; periodo de incubación 1-3 días,
precediendo los vómitos a la diarrea que suele mantenerse de 4-5 días; el virus se detecta en
heces (dura bastante horas fuera del huésped)
1.3. Familia Picorna-viridae (virus muy pequeños 20-30nm - icosaedrica - sin envuelta - de
polaridad+) - es una familia importante y una de las que mayor numero de virus presenta,
destacando 2 géneros Enterovirus y Rhinovirus.
Enterovirus - se asocian con distintos síndromes clínicos como parálisis, meningitis aséptica,
encefalitis, miocarditis, pericarditis, pleurodinia, herpangina, infecciones agudas del tracto
respiratorio y fiebre aftosa; son habitantes transitorios del tracto digestivo humano; existen >70
sero-tipos, siendo el tipo 72 es el virus de la Hepatitis A; todos se diseminan por vía fecal-oral y
la mayoría son asintomáticas; los mas importantes son Poliovirus, Echovirus y Coxsackievirus;
- Los virus de poliomielitis /Poliovirus son tres (tipos 1,2 y 3), mas temidos normalmente por
la parálisis flácida (de cintura para-bajo) y deformidades aunque
son complicación infrecuente; la vacuna es de Sabin (virus atenuados), también Salk (virus
inactivados); la vacuna de poliomielitis se administra a los niños de 2-4-6-18 meses.
- Los virus Echo y Coxsackie tienen distintas manifestaciones (muy ubicuo/ de todo tipo).
Para el diagnostico debe recurrirse al cultivo; el aislamiento de un enterovirus de heces o de
faringe no indica necesariamente una relacion causal con el cuadro clínico, y deben descartarse
otras causas; por el contrario si se trata de LCR.
Rhinovirus - agentes etiológicos mas frecuentes del resfriado común (rinitis agudas); existen
>100 tipos
Virus de la Rubeola del genero Rubivirus (no es un arbovirus) - descrito hace >200 años;
consta la importancia como agente causal de malformaciones congénitas desde la epidemia
de 1940 en Australia (un oftalmólogo australiano constato un elevado numero
de cataratas congénitas y ceguera asociados a esta enfermedad); la infección suele ser benigna
y auto-limitada; sintomas => procesos respiratorios superiores leves, erupción eritematosa y
linfadenopatía sub-occipital y retro-auriculares; en adultos se puede complicar con artritis
transitoria o artralgias; rara vez produce encefalitis o purpura trombocitopénica; muy
importante la infección en gestantes por posibles aparición de sordera neuro-sensitiva,
alteraciones cardíacas, cataratas, retraso del crecimiento y sintomas encefalíticos;
la incubación dura 14-21 días; diagnosticopor método serológico (técnica de ELISA) para
detectar IgG y sobre todo IgM en las embarazadas y un resultado positivo
indica inmunización frente al virus; actualmente es poco frecuente debido a la vacuna
obligatoria que se incluye en latriple vírica (paperas, sarampión y rubeola) que se pone a los
niños de15 meses (suele dar inmunidad permanente) y una dosis de recuerdo a los 6 años (solo
las niñas); a los 11 años solo se dan vacuna de varicela.
Clínica de Rubeola => empieza con eritema en la cara y se extiende hacia abajo (es un
eritema maculo papuloso); es menos llamativo que de la sarampión; dura +/- 3 días y puede
haber enantema palatino.
1.5. Familia Retro-viridae (de tamaño grande +/- 100nm - icosaedrica - con envuelta - de
polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima transcriptasa inversa / retro-
transcriptasa; a esta familia pertenece el virus de la inmuno-deficiencia humana VIHque se
estudia aparte.
Virus Influenza /la gripe española (empezó en España) - causan gripe, infección respiratoria
aguda epidémica normalmente durante mes de noviembre-abril; la vía de transmisión es aérea,
periodo de incubación 1-4 días, seguido de clínicas tipo respiratorias superior, mas grave en los
ancianos; se realizan campañas de vacunación todos los años (sobre todo a los ancianos y
pacientes bronco-pulmonares), ya que presentan gran variabilidad antigénica segun el
serotipo que causa la epidemia (tiene gran poder mutagénico); existe 3 tipos => A, B y C (A y
B causan epidemias de importancia); los influenza A se subdividen según la diferente
composicion antigénica (en la envoltura) de la hemaglutinina y la neuraminidasa; el diagnostico
es clínico; recientemente se introduce metodos de diagnostico de
muestras clínicas de antígenos virales; el de mayor importancia clínica es virus respiratorio
sincitial (VRS); para el diagnostico rápido se usa la inmuno-fluerescencia directa en aspirados
naso-faringeos, esputos o biopsia de pulmón; existe un kit con Ags virales para detectarlos.
Virus Parainfluenzae (VPI) del genero Paramyxovirus - los 5 tipos de VPI producen
infecciones del tracto respiratorio, siendo el 1 y el 2 los principales causantes de laringo-
traqueobronquitis, el 3 de bronquiolitis y neumónia en niños (segundo agente después del
VRS), el 4 y el 5 causan infecciones mas suaves; el diagnostico es clínico.
Virus respiratorio sincitial (VRS) del genero Pneumovirus - es la causa mas importante
de neumónia y bronquiolitis en niños y recién nacidos; produce un amplio espectro de
infecciones, siendo la mas frecuente es el resfriado común con abundante rinorrea; VRS es muy
contagioso y se manifiesta en forma de brotes invernales; la inmunidad no es completa por lo
que se dan las re-infecciones (mas suaves); Es importante que la excreción de virus se
mantenga durante 2 o 3 semanas (mas tiempo para los inmunodeprimidos), por lo que al
ingresar un niño en el hospital durante 1 o 2 semanas, puede ser contagioso todavía (es el
agente mas frecuente de infección nosocomial en pediatría); las infecciones graves se trata con
la ribavirina (inhibe la síntesis del ARN viral); el diagnostico rápido es la inmunofluorescencia
en secreciones respiratorias.
Virus del Sarampión - causa una enfermedad aguda, febril, exantemática, de gravedad variable
que afecta a niños de 5-9 años, se contagia por vía respiratoria y
conjuntival; sintomas clínico => los primeros días como un catarro naso-oculo-faringo-
laringeo, luego aparece fiebre, cara rubicunda, congestión de mucosa y a los 3-4 días aparece
"manchas Koplik" (manchas blanquecinas diminutas delante del 1º y 2º molar) dura un par
de días; empieza aparecer exantema, primero retro-auricularmente, despues se extiende a todo
el cuerpo, las palmas y las plantas de los pies mas tenue en zonas distales, sube a la fiebre y el
exantema tenue se hace muy eritematoso; tras 2-3 días mejora bruscamente y desapareciendo
los signos en el orden del aparecimiento (dará inmunidad permanente); el diagnostico es por
metodos serológicos.
Virus de la parotiditis - es una enfermedad endémica con incidencia todo el año; es rara en
niños < 1 año, gracias a la inmunidad de la madre; afecta a niños de 5-14 años, se transmite
por vía aérea y por objetos introducidos a la boca (dará inmunidad permanente); clínica => tras
24horas de clínica inespecifica, aparecerán dolor y tumefacción de retro-parotidia y oído,
aumento de fiebre, puede haber afectación de nervio facial leve y bilateral; complicación =>
meningitis, orquitis, pancreatitis o artritis; diagnostico es por vía serológico; el diagnostico es
por metodos serológicos.
1.8. Familia Rhabdo-viridae (de tamaño grande en forma de bastón, diámetro 70nm y
longitud 175nm - helicoidal - con envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma)
=> característica típica de su morfología es forma de "bala"; el mas importante es el causante
de la rabia o hidrofobia (se atraganta con el agua).
1.9. Familia Corona-viridae (de tamaño 80-130nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y
se ensamblan en el citoplasma) => adquieren su envoltura (con proyecciones a modo
de pétalos/ corona solar) en las membranas intra-citoplasmáticas; escasa
importancia en patología, únicamente causan el resfriado común y pueden estar involucrados en
cuadros de gastroenteritis.
Parvovirus B19 (estaban incluidos en virus Norwalk) - fue vinculado al eritema infeccioso en
1983; es benigna y afecta niños en edad escolar; presentan una erupción eritematosa en las
mejillas (cara enbofetada) y un exantema en extremidades y tronco (respeta a las palmas, las
plantas y los labios); los adultos son propensos a artropatía asociada, que se resuelve en 2-4
semanas; diagnostico por método serológico y metodos de ELISA.
2.2. Familia Papova-viridae (de tamaño pequeño 45-55nm - ADN de tira circular -
icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => son unos viruses
oncogénicos (efecto cancerígeno), producen enfermedades latentes y crónicas, causantes
verrugas genitales o condilomas (se asocian a carcinoma de cérvix)
y papilomas (Papilomavirus/ virus Papiloma humano); el diagnostico es de
tipo clínico y serológico; prevención => se vacunan a las niñas de < 14 años.
2.3. Familia Adeno-viridae (de tamaño mediano 70-90nm - icosaedrico - sin envuelta - se
ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => producen principalmente patología al tracto
respiratorio, ocular y gastroenteritis; las infecciones respiratorias solo son significativas en
niños <6 años; el diagnostico se realiza mediante clínicas y técnicas serologícas.
2.4. Familia Hepadna-viridae (de tamaño pequeño 40-50nm - ADN parcialmente bicatenario -
icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el núcleo - resistentes al éter) => su envuelta se
adquiere en la membrana citoplasmática y se ensamblan en el núcleo; en esta familia se
encuentra virus hepatitis B que se estudiara a parte.
Virus Herpes Simple (VHS) - producen infecciones latentes que se reactivan con o sin
lesiones que sirven de fuente de infección para individuos susceptibles (los virus de Herpes no
se cura, solo se acantona y se puede reactivar); existen 2 tipos => VHS-1 (tropismo por
lesiones por encima de la cintura y suele ser leve) y VHS-2 (se encuentra principalmente en los
genitales, transmitiéndose por vía venérea); cada individuo tiene un tropismo estable; suele ser
bucal, comienza con hormigueo y luego aparecen vesículas, costra y desaparece en +/- 1
semana; VHS-1 se transmite por secreción oral, infección a nivel peri-oral, también otras zonas
como los ojos; VHS-2 normalmente daran infección genital y se contrae por vía sexual; en
EEUU en ciertas capas sociales, es la enfermedad venérea mas frecuente; en mujer gestante se
puede transmitir al bebe vía placenta o canal de parto o en los primeros días de vida; en general
estos virus tienen capacidad oncogénicos como VEB (virus Epstein-Barr), puede
producir cáncer cervical; el diagnostico se realiza mediante la tinción de Giemsa de celulas
raspadas de lesiones herpéticas, para observar las características de las celulas gigantes multi-
nucleadas; también se cultivan en SHELL-VIAL.
Herpesvirus Humano 7 - se descubrió en 1989 (reciente); tiene tropismo por los linfocitos T,
provocando exantema súbito; se investiga si tiene relacion con síndrome de fatiga crónica (que
lo padecen sobre todo mujeres mayores).
2.6. Familia Pox-viridae (ADN bicatenario - doble membrana) - son de tamaño grande 230-
400nm, con forma de ladrillo, se replica en citoplasma y se ensamblan en el citoplasma; el mas
importante es el virus de la viruela, virus de Moluscum Contagiosum y virus de la Vaccinia ;
- Viruela se contagia por inhalación y tras 15 días aparece fiebre, mialgias
y erupción pápula vesicular dura y luego evoluciona a pústulas y a la curación; a veces puede
provocar muerte por exantema hemorragica o una sobre infección bacteriana.
- Virus de la Vaccinia es muy próximo al virus de la viruela; en individuos inmunodeprimidos
puede provocar complicaciones, pero en los inmuno-competentes es auto-limitado; es
importante en los principios de la vacunación (Jennen); últimamente se investiga
su utilización como vector para actuar como vacuna contra virus de Hepatitis B, Herpes simple
y VIH, ya que su genoma es susceptible de poder insertarle secuencias de genes que
codifiquen proteínas de otros virus y que se expresarían posteriormente cuando el virus se
replique, con lo cual tendríamos Acs contra estos virus.
Virus de la Hepatitis A (VHA) - aislado en 1973, pero se sospechó mucho antes; virus ARN
de la familia Picornaviridae (de pequeño tamaño 20-30nm, icosaédrica, sin envuelta,
polaridad+) dentro del género Enterovirus, el tipo 72; la mayoría de infecciones son aguda sin
cronificarse (<1% fulminante); se encuentra en las heces durante el periodo de
incubación (hasta 2 semanas).
Sintomatología clínica – suele ser menos grave que la hepatitis B; en general, la infección
es asintomática y la gravedad aumenta con la edad; el periodo de incubación 20-45 días, a
continuación suele aparecer fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de cabeza o dolor
en epigastrio y aumento de las transaminasas (GPT, GOT) y hepatomegalia.
Diagnostico – requiere la confirmación del laboratorio; se observó el virus por la primera vez
por Feinstone en 1973 y es cultivable, pero se utiliza la serología basada en la respuesta
inmunitaria; el método más utilizado es ELISA detectando Acs IgMVHA en su fase aguda;
también se pueden detectar Ags virales en heces (detectar Acs total de IgG y IgM no tiene
utilidad clínicamente); IgM suele durar 6 meses; IgG confiere inmunidad y la mayor parte de
nuestra población de >40 años los tienen; hasta la fecha no se han descrito casos de cronicidad.
Prevención – las medidas más importantes son la higiene personal, lavado y desinfección de
manos y objetos contaminados; no es necesario el estricto aislamiento del paciente mientras se
mantiene las medidas de desinfección-esterilización, cloración y nivel higiénico-
sanitarias; inmunización pasiva => se dispone una inmunoglobulina eficaz tanto para profilaxis
pre-exposición (se estudia la relación coste-eficacia antes de utilizarla/ solo si viajan a zonas
endémicas) como post-exposición; inmunización activa => existe una vacuna con buenos
resultados (virus inactivados) que se pone al mes, 6 meses y al año (3x).
Estructura – se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a los marcadores
serológicos:
-Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado por el gen
S) que induce a la formación de HBsAc o anti-HBs que confiere inmunidad.
-Ag del core o nucleo-cápside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta en sangre
pero si su HBcAc (marcador epidemiológico que se mantiene de por vida); IgM-HBcAc se
detecta como marcador más fiable de hepatitis B aguda.
-Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de pronóstico de la
enfermedad, ya que se correlacionan con el nivel de replicación del virus; HBeAc es
un marcador de buena evolución).
-Además se distinguen su genoma ADN y una polimerasa.
- El virión completo se denomina partícula de Dane, ya que existen formas incompletas en
sangre (como p.ej. HBsAg).
Infección por VHB – la mayoría son sub-clínicas/ asintomática (50-80%) y solo se detectan en
controles serológicos; la mayoría de las infecciones sintomáticas son auto limitadas y se
resuelven en menos de 6 meses (Hep.aguda); la lesión hepática puede ser nula o leve o llegar a
casos de hepatitis fulminante (> de 6 meses se pueden cronificar); la sintomatología clínica es
similar a la de Hepatitis A; un periodo de incubación es de 1-6 meses; entre 5-10% de las
infecciones se hacen persistentes y se mantiene de por vida (como portador asintomático o
sintomático); en la mayoría de ocasiones la función hepática y la histología son normales, pero
en otras ocasiones dan lugar a síndromes hepatitis crónica persistentes (HCP) y hepatitis
crónica activa (HCA); HCP es menos progresiva que HCA (puede ser más grave y desembocar
en cirrosis).
Epidemiologia – existen áreas hiper-endémicas, endemia media y baja (España está en baja); el
único reservorio importante es el hombre que transmite el virus por contacto íntimo (vía sexual,
parenteral y vertical-perinatal) y mediante objetos personales o materiales de
hospitales (familiares y personal sanitario corre un mayor riesgo); la existencia de HCP
presenta un reservorio estable para el virus y asegura su supervivencia indefinida que se detecta
en líquidos corporales (sangre, heces, orina, bilis, lagrimas, semen, leche materna, sudor,
secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y sangre de cordón);
Prevención – es la medida más eficaz para combatir la infección; es un virus muy contagioso
cuando hay exposición parenteral; existe inmunización pasiva(gammaglobulina hiper-inmune
eficaz en situaciones de pre y post-exposición ) y inmunización activa (vacuna de HBsAg que
se administra universalmente a 0-1-6 meses que produce respuesta inmunitaria de 90-95%).
Virus de la Hepatitis D (VHD) – descubierto en 1977; es un virus ARN incompleto /defectivo
que requiere HBsAg para su replicación (adquieren su envuelta del virus B y si no hay
infección de por VHB no la hay por VHD).
Tipos de infección:
1-Coinfección => infección simultáneamente por ambos virus (VHB y VHD); el curso natural
de VHB no se modifica; al resolverse la infección de VHB, re resuelve también la de VHD ;
clínicamente la hepatitis es más grave y la tasa de hepatitis fulminantes es mayor (hasta 20%).
2-Sobreinfección => cuando el VHD sobre infecta a portadores crónicos de VHB; aquí si se
modifica el curso natural de VHB y la mayoría de las sobreinfecciones (70%) desembocan en
hepatitis crónica y acaban en cirrosis entre 15-20 años.
El pronóstico de VHD depende de marcadores de replicación del virus (anti-HBe) => puede
acabar en hepatitis crónica o cirrosis; cuando no hay marcadores de replicación => puede
evolucionar a la curación.
Infección por VHC – se diseminan fundamentalmente por la vía parenteral; es la causa más
frecuente de hepatitis post-transfusional, hepatitis esporádica y ampliamente distribuido entre
ADVP (adicto a la droga de vía parenteral), pacientes en diálisis y hemofílicos; se puede
transmitir por contacto sexual o convivencia con portadores (menor importancia que Hep.B); la
clínica es similar a la de la hepatitis B; 25% cursan con ictericiay la tasa de mortalidad es <1%;
el curso es indolente y prolongado; el inicio no es muy brusco, es frecuente las
recurrencias, 50-70% tienden a cronificar y 20-25% acaban desarrollando cirrosis.
Prevención – tratar todo tipo liquido corporal como potencialmente infeccioso; todavía no se
dispone inmuno-profilaxis; un paciente con VHC negativa no significa que no lo padece,
porque la sensibilidad de las técnicas más utilizadas no es 100% fiable; si se sufre un accidente
en el laboratorio o en la práctica clínica con sangre anti-VHC+, se debe realizar un protocolo de
seguimiento serológico de la persona; existen evidencias de que VHC puede estar implicada en
cáncer hepático.
Virus de la Hepatitis G (VHG) – se transmite por vía parenteral; esta relacionado con virus de
la familia Flaviviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño pequeño 40-50nm, con envuelta de
polaridad+); provoca aisladamente un cuadro benigno, pero puede dar una coinfección con el
VHB y VHC con mayor tendencia a la cronicidad.
-Ag de superficie HBs Australia (HBsAg) => se sintetiza en el citoplasma del hepatocito;
debido a que los hepatocitos fabrica un exceso de estos, una parte es liberada a la sangre y
puede ser detectada durante el periodo de incubación (es el 1º marcador que aparece, incluso 2-
6 semanas antes de que aparezca los síntomas, aunque pueda haber de 5-10% de hepatitis aguda
sin este marcador), en la fase aguda de la enfermedad y en el estadio crónico; si la evolución es
favorable desaparecerá a los 3-6 meses de la enfermedad; por el contrario, si se mantiene más
de 6-8 semanas después o si no existe una disminución significativa de su título, es indicio de
mal pronóstico y de evolución a la cronicidad.
-Ac anti-HBs => es el indicador de recuperación de la enfermedad y el ultimo en aparecer(+/- a
los 3 meses de su evolución); persiste durante mucho tiempo neutralizando al virus y
confiriendo protección; en los individuos vacunados es el único marcador presente.
- Ac anti-HBc => Ag HBc pertenece a la cápside y no se detecta serológicamente, ya que no se
encuentra libre, sino en el virus entero; solo se detecta Anti-HBc; es el 1º Ac que aparece en la
enfermedad, detectable con los primeros síntomas de la enfermedad en la fase aguda y en la
crónica (entre 3-5 semanas después de Ag Australia y es el 4º marcador en hacerse positiva);
puede significar una infección pasada o curada dada la larga persistencia de estos Acs en el
suero (su positividad confirmada en solitario no asegura la protección frente a la enfermedad).
-Ag e (HBeAg) => es parte del Ag core; proteolíticamente degradado y antigénicamente
diferente; es el 2º marcador, detectable en la fase aguda y en algunas formas de enfermedad
crónica en las que histológicamente se corresponde con hepatitis crónica activa (HCA); su valor
clínico se funda en su excelente correlación con la presencia de replicación viral y viremia; la
sangre con HBeAg (+) se debe considerar como infecciosa; su estudio es obligatorio en todos
los sueros de HBsAg (+).
-Ac anti-HBe => es el 5º marcador; su aparición indica buena evolución y una baja infectividad
del paciente; en la mayoría de los casos es detectable poco antes de que desaparezca HBsAg,
pudiendo encontrarlo (+) durante varios años después de la infección.
-DNA viral libre (VHB-DNA) => es el 3º marcador; su detección en el suero mediante la
hibridación no es una técnica de rutina, a pesar de tratarse de un marcador muy sensible tanto
de la presencia del virus como de su actividad replicativa; el VHB-DNA es positivo en un
elevado número de pacientes HBeAg (+).
Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis D
1º- Antígeno delta (HDcAg) => aparece fugazmente en sangre en la primo infección y su
utilizad clínica es muy limitada.
2º- Anticuerpos Anti-Delta (Anti-HD IgM) => es el marcador más importante que aparece
después de la aparición del Ag y se mantiene positivo a bajos títulos a un tiempo limitado si la
evolución es favorable; persistirá su positividad a títulos altos en casos que evolucionan a la
cronicidad.
3º- Anticuerpos Anti-Delta IgG (Anti-HD IgG) => aparecen más tardía y se mantiene positivo
durante largos periodos de tiempo; su detección indica solamente contacto con el virus.
Esquema evolutivo:
-Coinfección de VHB y VHD = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (+) y AntiHD IgM (+)
-Sobre infección de VHD en paciente con VHB = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (-) y Anti-
HD IgM (+)
4º- RNA Viral (HD-RNA) => la positividad por técnicas de hibridación o PCR indica presencia
del virus.
DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
A-Hepatitis Aguda
Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio):
VHA => anti-VHA IgM
VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM
VHC => anti-VHC (totales)
VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP)
Criterios de interpretación en pacientes ADVP – las tasas de seropositividad para VHB (anti-
HBc total) y VHC (anti-VHC) en individuos ADVP superan el 80%; entre los ADVP
crónicamente infectados por VHB (positivos para HBsAg), la seropositividad para VHD (anti-
VHD total) se aproxima a dicho porcentaje; es frecuente que los ADVP se hallen crónicamente
infectados por uno o más de dichos agentes en un episodio de hepatitis aguda, resultando
imposible precisar su etiología.
B-Hepatitis Crónica
Marcadores de rutina:
VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG)
VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg)
VHC => anti-VHC
Criterios de interpretación:
-La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crónica => es diagnostica de
hepatitis B crónica; la presencia adicional de anti-VHD total => indica una sobre infección
crónica por ambos VHB y VHD.
-La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crónica => es altamente indicativa de hepatitis
C crónica, aunque no es un diagnostico seguro; la detección de ARN viral en suero mediante
PCR ayuda a establecer el diagnostico, pero un resultado negativo aislado no lo descarta, ya
que la viremia es intermitente en muchos casos; dado el alto costo de métodos de confirmación
de anti-VHC, se considera que una re comprobación del resultado positivo mediante un
segundo método de cribado (método screening con técnica de ELISA) que utilice Ags
obtenidos por tecnología diferente, es suficiente para establecer la presencia de anti-VHC en
pacientes con hepatitis crónica.
VIH o SIDA
Descubrimiento del virus – se sospechó desde 1981 en 5 casos de neumonía por Pneumocystis
carinii en varones homosexuales previamente sanos y va aumentando el número de casos y se
fue asociando esta inmunodeficiencia adquirida al sarcoma de Kaposi; en junio de 1982 se
contabilizaron 439 casos y en EEUU se emite un informe para definir los casos de SIDA; en
febrero del mismo año Montagnier expone la hipótesis de un retrovirus linfotropico pudiera ser
el agente causante del síndrome; en Mayo de 1983 se aislo por primera vez el virus
por Montagnier en Francia a partir de un ganglio linfático de un paciente con linfadenopatia
persistente (LAV) y Gallo en EEUU de un enfermo de SIDA (HTLV-III).
b) Reguladores => genes que regulan la replicación viral y el papel de todos ellos no está
completamente dilucidado
Epidemiologia – las vías de transmisión del virus => por sangre, sexual y vertical-perinatal; en
España la tasa de transmisión por sangre es importante (el principal grupo afectado son los
UDVP/ ADVP y homosexual), a diferencia de Francia o EEUU, donde los mas afectados son
homosexuales; en cuanto a las tasas de transmisión madre-hijo oscilan 15-50%, cobrando una
especial importancia en África; la transmisión al personal sanitario o similar es 0,2% y requiere
contacto con mucosas de la sangre o liquido corporal infeccioso (o también de líquidos donde
se haya cultivado al virus).
Sintomatología clínica de SIDA – desde que una persona se infecta hasta que se desarrolle la
enfermedad, suele transcurrir 6-10 años; el estudio de la evolución de SIDA puede realizarse
por las manifestaciones clínico que van apareciendo o por marcadores bioquímicos (el descenso
de la cifra de linfocitos T4); a partir del 1996 la determinación de la cantidad de virus circulante
en la sangre de la persona infectada (carga viral) se ha convertido en principal marcador de la
evolución de la enfermedad.
Fases de la enfermedad
(1) fase de la infección aguda => la mayoría de los pacientes experimentan al cabo de unas 3
semanas de haber infectado con el virus una serie de síntomas pseudogripales como fiebre,
cefalea, eritema, adenopatías y sensación de mal estar, desaparecen después de 1-2 semanas;
durante esta fase, el VIH se multiplica a gran velocidad; en un primer momento se produce un
descenso de la cifra de linfocitos (total), pero dentro de poco alcanzan las cifras normales en
respuesta de una activación del sistema inmunológico; los individuos son altamente contagiosos
durante esta fase;
(2) fase asintomática que puede durar 10 años o incluso mas; durante este periodo, el virus
continua replicándose, causando destrucción progresiva del sistema inmune; durante esta fase,
el recuento de los linfocitos es normal;
(3) fase sintomática precoz, se suele iniciar el desarrollo del síntoma clínico característica de la
enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carácter leve p.ej. de tipo viral => CMV,
Herpes zoster, de tipo bacterianas => Mycobacterium, Legionella, infestación de parásitos
=> Pneumocystis carinii, Cryptosporidium, algunos hongos => Aspergillus y Cándida;
(4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del SIDA(sarcoma de
Kaposi) que además, puede complicarse con un cuadro neurológico (demencia del
SIDA) con alteraciones motoras y del área cognitiva, debido a la acción directa del virus sobre
SNC; la supervivencia media de los pacientes con la SIDA ya desarrollado suelen ser 18-125
semanas, dependiendo del tipo de infección que tenga; en ningún caso habrá supervivencia
cuando están en esta fase.
Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH – en España fundamentalmente
serológico, por la importancia y las implicaciones que conlleva; se realiza mediante técnicas de
ELISA en primera instancia (técnica de cribado), aplicando a los positivos, métodos de
confirmación => Western Blot (WB), inmunofluorescencia (IFI) o radioinmuno-precipitacion
(RIPA).
**) El Western Blot es más utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las distintas
proteínas del virus; tiene distintos criterios para la interpretación de los resultados (OMS,
CDC, Cruz Roja) y los resultados se clasifiquen en:
-Positivos => lo más aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y gp160) y
además bandas del core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos.
-Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna proteína del virus
(solo algunas proteínas del core en pacientes con lupus y factor reumatoide).
-Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a estas personas
se hace un seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean falsos negativos).
La técnica de WB consiste básicamente en la incubación de unas tiras de nitrocelulosa en los
que sean transferido las proteínas de los virus, básicamente las estructuras con el suero del
problema durante un tiempo que oscila 2-4 horas hasta los 18 horas; tras cual se revela la
presencia de Acs frente a diferente proteínas del virus mediante diferentes técnicas inmuno-
enzimáticas dependiendo del fabricante; el resultado será la aparición de bandas coloreadas de
mayor o menor intensidad en el lugar de la tira donde están situadas las proteínas de VIH contra
las cuales existen Acs en el suero del problema; la lectura puede hacerse de manera manual,
comparando las bandas con un control (+) o de manera automatizada por densitometría;
recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500 linfocitos/m3 de sangre (en valores
relativos 35-45%); las de CD8 600-900 linfocitos/m3 de sangre; cuando la cifra de CD4
disminuye por debajo de las 200-400 linfocitos/m3 de sangre, será indicativo de SIDA.
*) Los métodos de cribado (ELISA) son más sensibles y más específicos, siendo lo más
novedoso los de 3ª generación con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando el periodo de
ventana.
*) Las técnicas de centros especializados => cultivo y PCR; la PCR es una técnica con mucho
futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no están al alcance de la
mayor parte de los laboratorios; una importancia aplicación de estas técnicas es el diagnostico
de hijos y madres portadoras del VIH.
*) De todos modos, el que más se utiliza para un diagnóstico de SIDA es el recuento celular de
los linfocitos CD4 o T4 (o el cociente respecto a los T8).
b) Microscópia => con la Microscópia óptica solo se puede identificar los cambios celulares
(efecto citopático) sufrido por las celulas infectadas y con la Microscópia electrónica se puede
visualizar el virus (en laboratorios de experimentación).
c) Cultivo => los virus se multiplican exclusivamente en el interior de las celulas vivas, por ello
debemos preparar previamente un soporte celular que permita su crecimiento in vitro mediante
siguientes técnicas:
- cultivo de órganos => las secciones de algunos órganos pueden ser viables varias semanas y
nos permiten cuidadosamente aislar por ej. virus sincitial respiratorio (VRS) mediante
secciones de tejido respiratorio.
- cultivo de tejidos => fragmentos de tejidos en suspensión (cultivar adenovirus en un tejido
adenoideo)
- cultivos celulares => celulas aisladas obtenidas por disociación mecánica y con
enzimas proteolíticas a partir de tejidos; las celulas disociadas y separadas se colocan en un
frasco de cristal o de plástico; las celulas se adhieren a las paredes del frasco y se cubren con
medios nutritivos para mantenerlas viables; en condiciones optimas, las celulas se multiplican
hasta que cubran la pared formando una capa continua de crecimiento sobre las que
se podrán replicar los virus del problema; tipos de cultivos celulares:
*) cultivos primarios => es el primer pase in vitro, tomados directamente de un organismo
vivo; las celulas se siembran en un frasco con medio de crecimiento, conservan el numero de
cromosomas, tienen un periodo de vida corto y permiten el crecimiento de gran variedad de
virus (p.ej. celulas del riñon de conejo y mono, embrión de pollo).
*) lineas diploides => son celulas de un solo tipo (somáticas) que se pueden cultivar durante un
tiempo limitado, conservan el numero de cromosomas (46) y con ventaja de que se mantiene
durante mas tiempo que cultivo primario.
*) lineas celulares continuas => se cultivan in vitro indefinidamente y tiene un cariotipo
heteroploide (numero menor que las celulas somáticas); se originan de tejido maligno o
por mutación de una célula diploide; el cultivo se multiplican de forma indefinida y suelen
presentar aberraciones en el numero de cromosomas; estas celulas se pueden mantener a -70ºC
o -90ºC indefinidamente (p.ej. lineas celulares Hep-2 y Vero).
*) Shell-vial => es una técnica de cultivo celular que se ha desarrollado en los últimos años y
que permite obtener el crecimiento de numerosos virus y ciertas bacterias en un corto periodo
de tiempo (24-48 horas); sobre un vial se coloca una mono capa de celulas con 1ml de medio
de crecimiento, y sobre ello se coloca 0,2 ml de la muestra problema; el método se basa en
la centrifugación (suave) de la muestra sobre la mono capa, y tras un corto periodo
de incubación se pone de manifiesto la expresión de los Ags virales en la mono capa
mediante tinción inmunológica; la ventaja => la rapidez de obtención de resultados en 24-48
horas, detectamos los Ags a las pocas horas de iniciarse la infección; tiene una sensibilidad
superior al cultivo celular, porque inoculamos el mismo volumen de muestra en un área mas
pequeña y mas fácil la observación al microscopio de fluorescencia.
Las muestras para el aislamiento de virus se deben recoger lo antes posible, no después de los
3-7 primeros días del inicio de la enfermedad; se pueden conservar a 4ºC durante 24 horas y si
no, se deben congelar a -70ºC porque muchos virus son lábiles a -20ºC; las muestras que se
utilizan con mayor frecuencia son secreciones nasales, frotis faríngeo, exudado
conjuntival, líquidos vesiculares, raspados de piel, heces, orina, LCR, etc.
d) Detección de los componentes estructurales virales - las técnicas mas usadas que permiten
detectar Ags en suero y líquidos orgánicos (cuando existe una alta concentración viral,
sera fácil detectarlos) son:
- Aglutinación en látex => a las moleculas de látex se les une varias moléculas de Acs
conocidos y cuando se pone en contacto con una solución que contiene el Ag (la muestra
problema) se origina una aglutinación que puede visualizarse; es una técnica sencilla,
sensible, re-producible y barata. Su sensibilidad dependerá de la pureza del Ac utilizado.
- Radioinmunoanalisis => tiene el mismo fundamento que el ELISA, pero en vez de unir un
enzima al Ac, se le une un radioisótopo, y lo que se mide en ultima instancia es
la radiactividad que estará en proporción directa a la cantidad de Ag que había en la muestra
problema; es una técnica con la misma sensibilidad que el ELISA, pero es mas costosa y se
necesita trabajar con material radioactivo, lo que plantea problemas en cuanto al personal y las
instalaciones; esta técnica se utilizo por primera vez para detectar el Ag de superficie del virus
de la hepatitis B.
- Inmunofluorescencia directa (IFD) => el Ag unido a una fase solida, en este caso un
portaobjetos, se pone en contacto con el Ac marcado con una sustancia fluorescente (p.ej.
isocianato de fluoresceina, rodamina, europio, etc.); tras un periodo de incubación, se lava para
eliminar el exceso de Acs y se observa al microscopio de luz ultravioleta; esta técnica nos
permite demostrar no solo la reacción Ag-Ac, sino también la localización exacta donde se
produce (superficie celular, citoplasma, núcleo...).
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