UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MEXICO

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Carrera: QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOTECNÓLOGO

Grupo: 01B Materia: Biología Celular Fecha: 06/04/16

INTRODUCCIÓN
El objetivo del fraccionamiento celular es aislar y separar los
principales orgánulos de las células. El instrumento utilizado para
fraccionar las células es la centrifuga, que puede hacer girar los
tubos de ensayo a diferentes velocidades. La fuerza centrífuga
separa los componentes celulares por tamaño y densidad. Las más
potentes, denominadas ultracentrífugas, pueden alcanzar 130 000
revoluciones por minuto (rpm) y ejercer fuerzas sobre las partículas
de un millón de veces la fuerza de la gravedad (1 000 000g)

El fraccionamiento celular permite al investigador preparar

componentes celulares en cantidades masivas para estudiar su
composición y funciones. Utilizando este método, los biólogos han
sido capaces de asignar funciones a los diferentes orgánulos de la
célula, una tarea que hubiera sido mucho más difícil con células
intactas. Por ejemplo, una fracción celular obtenida por
centrifugación tiene enzimas que participan en el proceso
metabólico conocido como respiración celular.

La mayoría de los procedimientos de fraccionamiento celular comienzan con la centrifugación

diferencial de un homogenado celular previamente filtrado, a velocidades cada vez más altas.
Luego de la centrifugación con cada velocidad por un tiempo apropiado, se vuelca el
sobrenadante y se centrifuga a una velocidad aún mayor. Las fracciones sedimentadas
obtenidas por centrifugación diferencial suelen contener una mezcla de orgánulos, aunque el
núcleo y las partículas virales pueden a veces ser purificados por completo por este
procedimiento. Una fracción de orgánulo impura, obtenida por centrifuga diferencial, puede
luego purificada aún más por centrifugación en gradiente de densidad en equilibrio, que separa
los componentes celulares de acuerdo con su densidad. Una vez re suspendida la fracción, se
coloca en la parte superior de una solución que contiene un
gradiente de una sustancia densa no iónica (p, ej., sacarosa o
glicerol). El tubo se centrifuga a alta velocidad (alrededor de
40.000 rpm) durante varias horas, permitiéndole a cada
partícula migrar a una posición de equilibrio donde la densidad
del líquido circundante es igual a de la partícula.
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Debido a que cada orgánulo tiene rasgos morfológicos únicos, la pureza de las preparaciones
de orgánulos puede evaluarse mediante el análisis con un microscopio electrónico.
Alternativamente, se puede cuantificar las moléculas marcadoras específicas de orgánulos. Por
ejemplo, la proteína citocromo c está presente solo en la mitocondria; así que la presencia de
esta proteína en un fraccionamiento de lisosomas indicaría su contaminación con mitocondrias.
En forma similar, la catalasa está presente solo en los peroxisomas; la fosfatasa acida solo en
los lisosomas, y los ribosomas solo en el retículo endoplasmatico rugoso o en el citosol.

OBJETIVO
Conocer el fundamento o bases físicas de la centrifugación. Utilizar la técnica de centrifugación
para realizar fraccionamiento celular.

HIPOTESIS

Al aumentar el número de revoluciones por minuto al sobrenadante resultante de una

centrifugación diferencial, se logrará un fraccionamiento celular total, en el que las estructuras
serán tan pequeñas que no podrán ser observadas en un microscopio óptico.

REACTIVOS
NaCl

KH2PO4

KCl

dH2O

Na2 HPO4

RIESGO A LA SALUD: 1 (POCO PELIGROSO)

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PROCEDIMIENTO
Procedimiento de 500 ml de PBS
1. Prepare 100 mL de Ácido Clorhídrico 1M (1M HCl) agregando 8.62 mL de HCl concentrado a
91 mL de dH20 previamente colocados en un vaso de precipitados de 250 mL. ¡No agregar el
agua al ácido! Mezcle en una plancha agitadora magnética durante 5 minutos. Afore a 100 mL
con dH20.
2. Prepare 100 mL de Hidróxido de Sodio 10M (10M NaOH) agregando 40 g de NaOH a 40 mL
de dH20 previamente colocados en un vaso de precipitados de 250 mL. Mezcle con una barra
magnética en una plancha agitadora hasta que el NaOH se haya disuelto por completo. Afore a
100 mL con dH20. ¡Precaución, esta reacción es exotérmica!
3. Añada las sales a un vaso de precipitados adecuado para el volumen de la solución por
preparar. De acuerdo a la Tabla de Preparación mostrada a continuación.
4. Añada el 80% del volumen de dH20 requerido y mezcle encima del agitador magnético hasta
diluir las sales.
5. Ajuste el pH a 7.4 con 1M HCl o 10M NaOH (según sea necesario) empleando para ello una
pipeta de transferencia de plástico (ver nota #2) mientras se monitorea el pH. Añada las
soluciones de HCl o NaOH gota a gota.
6. Afore la solución con dH20 al volumen final requerido.
7. Filtre la solución a través de unidades de filtración o discos de 0.45 µm para eliminar
partículas suspendidas.
8. Esterilice en autoclave.
9. Dentro del Gabinete de Seguridad Biológica (GSB) y bajo técnica aséptica, distribuya
alícuotas de 50 mL en tubos cónicos esterilizados.
10. Almacene a temperatura ambiente (uso rutinario) o bajo refrigeración entre 4 y 8 °C.

Compuesto 500 ml

NaCl 4.03 g
KCl 0.11 g
Na2 HPO4 0.575 g
KH2PO4 0.10 g
dH2O cbp 500 ml
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Procedimiento fraccionamiento molecular.

1. Lave, seque y limpie perfectamente 5gr de espinacas. Coloque en un mortero
agregando 20ml de la solución de NaCl 0.35 M en buffer de fosfatos, moliendo
perfectamente durante 10 minutos.

2. El molido resultante deberá ser colado con ayuda de 8 capas de gasas.

3. Tome 4 gotas del colado y colóquelas en un tubo de plástico marcado como

colado.

4. El colado restante divídalo en 2 partes iguales y colocarlos en tubos de ensayo.

Posteriormente centrifugar a 1000rpm durante 2 minutos.

5. Tome 4 gotas del sobrenadante y colóquelas en un tubo de plástico marcado

como primer sobrenadante.

6. Decante en un vaso de precipitado el sobrenadante, re suspendiendo con ayuda

del buffer para así obtener el precipitado y vacíelo en un tubo de plástico marcándolo
como primer precipitado.

7. Reparta el sobrenadante en dos partes iguales en tubos de ensayo.

Posteriormente centrifugue a 2500rpm por 15 minutos.

8. Repita el procedimiento del punto 5 y 6 para obtener 4 gotas de segundo

sobrenadante y segundo precipitado, colocadas en tubos con su respectiva etiqueta.
Segundo sobrenadante y segundo precipitado.

9. Reparta el sobrenadante restante en partes iguales, para realizar la última

centrifugación a 5000rpm durante 15 minutos.

10. Para la obtención del tercer sobrenadante y tercer precipitado repita el

procedimiento del punto 5 y 6. Colóquelos en tubos etiquetados con tercer
sobrenadante y tercer precipitado.

11. Prepare 7 muestras con cada tubo de plástico etiquetado, para así poder
observarlas al microscopio.

*No olvide mantener en frío las muestras obtenidas para evitar el cambio de su
estructura al ser sometidas a un cambio de temperatura abrupto.
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DATOS/RESULTADOS

 COLADO

En la figura 1 se puede observar que no hubo una

completa fragmentación celular debido a la (fig. 1)
presencia de una célula completa, en la que aún
está intacta su pared celular. Alrededor de ésta y Ocular: 10
en la figura 2, se observan estructuras redondas,
Objetivo: 40x
verdes claro, en gran cantidad, con su estructura
intacta, las cuales identificamos como cloroplastos, Aumento: 400 veces
a lo que además le atribuimos el color verde a las (fig. 2)
gotas obtenidas del colado. Además se observan
fibras.

 PRIMER PRECIPITADO 7 min→1000rpm

(fig. 4) En la figura 3 se observa claramente un

detrito celular, producido por el conjunto de
Ocular: 10 paredes celulares fragmentadas, es por esto
que asemeja una red verde. En la figura 4 se
Objetivo: 40x
observan nuevamente célula verdes,
Aumento: 400 veces redondas, en gran cantidad y en un medio de
PVS. Además se observan células rotas y casi
(fig. 3) no se perciben fibras.
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 PRIMER SOBRENADANTE 7 min→1000rpm

En la figura 5 se observa una pequeña

aglomeración de tejidos, a lo que se le Ocular: 10
identificó como un pequeño detrito
celular. Se observa poca presencia de Objetivo: 40x
cloroplastos, ya que el color verde es
Aumento: 400 veces
muy tenue. Se observan pequeñas
estructuras redondas y verdes.
(fig. 5)

 SEGUNDO PRECIPITADO 15 min→2500rpm

En la figura 6 nuevamente se observaron

Ocular: 10 cloroplastos, en gran cantidad. Además de
redes pequeñas, que se identificaron
Objetivo: 40x como restos de pared celular y residuos
de tejidos. No hay presencia de detritos
Aumento: 400 veces
celulares.

(fig. 6)
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 SEGUNDO SOBRENADANTE 15 min→2500rpm

En la figura 7 se observa un detrito celular, Ocular: 10

con estructuras poco dañadas, ya que se
observa la separación entre células. Se Objetivo: 40x
identificaron restos de fibras.
Aumento: 400 veces

(fig. 7)

 TERCER PRECIPITADO 15 min→5000rpm

Ocular: 10
En la figura 8 se observan pequeños restos
Objetivo: 40x de células fragmentadas, no se observa
coloración verde, ni estructuras definidas.
Aumento: 400 veces

(fig. 8)
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 TERCER SOBRENADANTE 15 min→5000rpm

Ocular: 10
En la figura 9 no se observó presencia de
estructuras ni coloración en el medio. Objetivo: 40x

Aumento: 400 veces

(fig. 9)

DISCUSIÓN
Nuestros resultados, conforme se fueron realizando las centrifugaciones de los
sobrenadantes, nos percatamos que en estos, se hacían cada vez menos evidente la
presencia de los orgánulos pertenecientes a las células, esto bien como lo podemos
observar de la (figura 1) a la (figura 5) se observará desde la presencia de núcleos o una
incompleta fragmentación celular, a una aglomeración de tejidos y/o restos de pared celular.
Como lo plasma Jan Koolman,Klaus-Heinrich Röhm, en el año 2005 , en su libro titulado
“Bioquímica: texto y atlas”, editorial Panamericana, en la página 198, citó.- “Si se decanta la
capa superior (“el sobrenadante”) y se suspende cuidadosamente el “sedimento” o “pastilla”
en un medio isotónico se obtiene una fracción enriquecida con núcleos celulares. Sin
embargo, en esta fracción pueden haber quedado otros componentes celulares, como por
ejemplo restos del citoesqueleto, que representan impurezas. Las partículas de un tamaño y
densidad menores que las del núcleo se pueden aislar del sobrenadante de la primera
centrifugación incrementando gradualmente la velocidad de la centrifugación.” Con esto
podemos justificar que, en lo que observamos (ejemplo en fig. 3) serían efectivamente
detritos celulares (conjunto de paredes celulares fragmentadas) ya que por la aplicación de
las rpm inferirá en los resultados que nosotros observemos en las muestras. Así mientras se
aumenta las rpm, en el sobrenadante serán componentes de la célula con menor densidad o
tamaño de lo que nosotros podríamos observar en el microscopio, por ende no
observaremos algún otro componente como en la fig.9.
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CONCLUSIÓN
El fraccionamiento celular permite al investigador preparar componentes celulares
en cantidades masivas para estudiar su composición y funciones. Utilizando este
método, los biólogos han sido capaces de asignar funciones a los diferentes
orgánulos de la célula. La citología y la bioquímica se complementan para
estableces la correlación entre estructura y función celular.
Después de haber realizado todo el procedimiento se procedió a observar a
microscopio todas las muestras, se tomó unas gotas del concentrado y se
observó. Los resultados fueron que, en las muestras centrifugadas de acuerdo al
sobrenadante de la primera, se dificultó encontrar ya sea una célula completa, su
núcleo o algún otro componente celular como orgánulos. Solo una excepción fue
al visualizar lo que serían cloroplastos y fragmentaciones de la célula en una
centrifugación mínima, posterior a esto se sabe que los componentes restantes
tienen un tamaño menor, por lo que sería imposible visualizarlo en el microscopio
óptico.

CUESTIONARIO
1- ¿Cuál es el principio de la centrifugación?

Separa los componentes celulares sobre la base de su tamaño y su densidad. Los

componentes de mayor tamaño y de densidad más elevada experimentan la mayor
fuerza centrífuga y se mueven con mayor rapidez.
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2- ¿Cuáles son las diferencias entre los distintos métodos de centrifugación?

En la centrifugación diferencial es la más común en la puficacion de unas

proteínas

Mientras que en la centrifugación por zonas de velocidades, las bases de las

diferencias de masa

3- ¿Cómo podría Usted confirmar diferencias entre orgánulos?

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BIBLIOGRAFÍA
Harvey Lodish, 2005, “Biología celular y molecular”, Ed. Médica Panamericana, Pág. 181.

Neil A. Campbell,Jane B. Reece, 2007, “Biologia”, Ed. Médica Panamericana, Pág. 97

Bruce Alberts, Dennis Bray , 2004. “introducción a la biología celular” Ed. Medica
Panamericana S.A Pag.161

Harvey Lodish, 2005, “Biología celular y molecular”, Ed. Médica Panamericana, Pág. 87

Universidad Autónoma de San Luis Potosí, 22 de Mayo del 2008, Protocolos Y Métodos,
Laboratorio De Genómica Viral Y Humana, PÁG. 1-2

Jan Koolman,Klaus-Heinrich Röhm, 2005, “Bioquimica: texto y atlas”, editorial

Panamericana, pág. 198.