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Cruz Lady, Guerrero Daniela, Guevara Angélica & Pedraza Yiham (2018). (Práctica No.

1)

MÉTODOS PARA AISLAMIENTO, ENUMERACIÓN E


IDENTIFICACIÓN DE HONGOS Y LEVADURAS
PRESENTES EN MUESTRAS DE ALIMENTO
(PRÁCTICA No. 1)

Lady Cruz
ladystephanie97@gmail.com
Daniela Guerrero
dannguerrero23@gmail.com
Angélica Guevara
angelika_0916@hotmail.com
Yiham Pedraza
yihams@hotmail.com
Universidad Santiago de Cali

Resumen
En el presente laboratorio se realizaron siembras por medio de diferentes técnicas: Plaqueo directo y superficie
con diluciones 10-1 a 10-3. Para el plaqueo directo se distribuyó 23 semillas de trigo alrededor de la placa, dos en
agar DRBC donde sólo se pudo observar la presencia de una semilla cubierta de un hongo sin esporular y una en
agar PDA donde se obtuvo un recuento de 4 semillas con presencia de hongos sin esporular y una colonia con
características pertenecientes al género Aspergillus. Mientras que para superficie se utilizó harina para concentrado
de animales, donde se tuvo en cuenta la misma proporción de cajas Petri del procedimiento anterior. En agar
DRBC se obtuvo el crecimiento de Aspergillus fumigatus y de la Levadura Rhodotorula spp en la dilución 10-1. En
agar PDA se obtuvo una pequeña colonia con características similares al género Cladosporium spp, dando como
resultado una gran variedad fúngica presente en el ambiente y en diferentes productos de consumo humano y
animal que son vulnerables a la contaminación por estos.

Palabras Clave: Contaminación, hongos, levaduras, Aspergillus, Rhodotorula, esporular.

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USDA, 2010).
I. INTRODUCCIÓN
El objetivo de esta práctica fue aislar hongos de
Los hongos no son plantas ni animales, son diferentes alimentos con el fin de observar sus
organismos eucariotas que se encuentran agrupados estructuras microscópicas y desarrollar la capacidad
en un reino aparte, el Reino Fungi (Kuhar, Castiglia, de identificarlos.
& Papinutti, 2013).
Son organismos portadores de esporas, aclorofílicos,
que por lo general se reproducen sexual y
II. PARTE EXPERIMENTAL
asexualmente y cuyas estructuras somáticas,
ramificadas y filamentosas, están rodeadas por La práctica se desarrolló inicialmente con la
paredes celulares que contienen quitina o celulosa, o preparación de los medios de cultivo los cuales
ambas sustancias, junto con otras moléculas fueron PDA y DRBC, a cada grupo le correspondió
orgánicas complejas. En otras palabras, esto significa realizar un medio de cultivo diferente de los
que los hongos poseen núcleos verdaderos típicos en mencionados anteriormente, después de que se
células, que se reproducen por medio de esporas y prepararon, se dejaron enfriar para servir en las cajas
que no poseen clorofila. La mayoría de los hongos Petri. Luego cada grupo se les asignó diferentes tipos
poseen un mecanismo sexual (Universidad de muestras, en este caso nos correspondió los
Autónoma de Ciudad de Juárez, 2012). granos de trigo y la harina para concentrado de
Los hongos se encuentran prácticamente en todo el animales.
medio ambiente y pueden ser detectados, tanto en Para el plaqueo directo se realizó una dilución al
los interiores como en exteriores, durante todo el 0,4% de hipoclorito de sodio, un vez se preparó
año. El crecimiento de hongos es promovido por dicha solución, se colocó una pequeña cantidad de
condiciones cálidas y húmedas. En el exterior, grano de trigo en una caja Petri plástica y se agregó
pueden encontrarse en áreas oscuras, húmedas o en la solución hasta que los granos de trigo se
lugares donde hojas y otra vegetación se sumergieron en su totalidad, se dejó actuar
descomponen. En el interior, éstos pueden aproximadamente por dos minutos, una vez
encontrarse donde los niveles de humedad son transcurrido ese tiempo se procedió hacer tres
elevados, ejemplo, algunos alimentos (Food Safety lavados con agua estéril, después, con ayuda de una
and Inspection Service USDA, 2010). pinza se distribuyó por toda la caja Petri con 23
Los hongos comúnmente encontrados en carnes y granos de trigos en los medios de cultivo: una caja
aves son Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, de agar PDA y dos cajas de agar DRBC
Fusarium, Geotrichum, Monilia, Manoscus, Mortierella, (Ver figura 1 y tabla 1).
Mucor, Neurospora, Oidium, Oosproa, Penicillium,
Rhizopus y Thamnidium. Estos hongos pueden
encontrarse también en otros alimentos (Food
Safety and Inspection Service USDA, 2010).
Algunos hongos producen micotoxinas. Estas son
sustancias venenosas producidas por hongos que se
encuentran mayormente en las siembras de granos y
nueces, pero también pueden ser encontradas en el
apio, jugo de uvas, manzanas y en otras frutas Figura 1. Granos de trigo lavados con hipoclorito al
0,4% y distribuidos en agar PDA y agar DRBC.
y vegetales (Food Safety and Inspection Service

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Por otra parte, también se procedió a realizar dos III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
tipos de siembra en superficie, inicialmente se pesó
Según (Prescott, y otros, 1986), los hongos al ser
10g de la muestra de harina para concentrado de ambientales se propagan en muchas formas, estos
animales, la cual se macero con ayuda de un mortero pueden ser transmitidos por semillas, suelo, viento,
y se agregó al frasco de vidrio que contenía 90mL de agua (lluvia, agua de riego), insectos, animales y el
agua peptonada obtiene así la dilución 10-1, de esta hombre. Algunos hongos atacan sólo a una o algunas
se tomó 1mL y se transfirió a un tubo de ensayo que especies huéspedes, pero otros atacan a muchas
contenía 9 mL de agua peptonada obteniendo así la otras. Los síntomas y el desarrollo de la enfermedad
dilución 10-2 (Ver figura 2). De igual manera, se dependen de la interacción entre el parásito y el
repitió este mismo procedimiento para finalmente huésped. Los síntomas pueden ser similares o
obtener la dilución 10-3. distintos según los hongos involucrados y, en
consecuencia, una identificación categórica de éstos
debe basarse en su morfología.

El Trigo (Triticum aestivum L.) en Colombia es


considerado un alimento básico y con su
movilización de una región a otra del país, se pueden
transportar organismos que llegarían a ocasionar
serios problemas al cultivo en campo o podrían
afectar la calidad al procesar la semilla (grano)
(Sandoval Martínez, Leyva Mir, Villaseñor Mir,
Rodríguez García, & Mariscal Amaro, 2012). Los
hongos transmitidos por semilla pueden sobrevivir
hasta 10 años como esporas o estructuras de reposo
dentro y sobre la semilla (OMAFRA, 2009); por lo
Figura 2. Dilución seriada de la muestra de harina para tanto son fuente de inóculo para el siguiente ciclo de
concentrado de animales en agua peptonada. cultivo. En campo, la semilla es invadida por hongos
como Fusarium spp., y Helminthosporium spp., que
causan enfermedades de importancia agrícola
No obstante, el primer tipo de siembra por
(Fakhrunnisa & Ghaffar , 2006). (Ivić, Domijan,
superficie se basó en tomar de la dilución 10-1,
Peraica, Miličević, & Cvjetković, 2010) encontraron
volúmenes de 1mL, 100µL y 10µL, se agregaron a
que 5 al 69 % de las semillas de trigo estaban
tres diferentes cajas Petri que contenía agar PDA y
contaminadas con varias especies de Fusarium
dejando las cajas incubar por varios días a
causantes de pudriciones de raíz y tallo, y además
temperatura ambiente. Por otro lado, el segundo tipo
productoras de toxinas nocivas. En almacén, la
de siembra por superficie se llevó a cabo tomando
semilla es invadida principalmente por Aspergillus
de la dilución 10-1, volúmenes de 1mL y 100µL y se
spp., y Penicillium spp., que ocasionan pudriciones,
agregaron a dos diferentes cajas Petri que contenía
disminución de la calidad física, reducen la
agar DRBC. Finalmente, de la dilución 10-2 se tomó
germinación, producen decoloraciones, ocasionan
100µL, se agregó en una caja que contenía el mismo
otros cambios bioquímicos, y sintetizan toxinas
agar. Todos estos volúmenes mencionados con
nocivas (Fakhrunnisa & Ghaffar , 2006). En campo,
anterioridad en el segundo tipo de siembra se
los daños por hongos transmitidos por semilla son
emplearon por duplicado.
la disminución del porcentaje de germinación y

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emergencia, muerte de plántulas poco después de la En el Agar PDA se obtuvo un recuento de 4 semillas
germinación, y las que sobreviven tienen menor con presencia de hongos sin esporular (sin registro
vigor y son susceptibles a otras enfermedades fotográfico), y además se observó una red de micelio
(González & Trevathan, 2006). sin estructuras reproductoras aislada en este medio,
también se pudo visualizar una colonia con
características pertenecientes al género Aspergillus.
En el cultivo de trigo y especialmente en sistemas de
En cuanto al Agar DRBC, solo se pudo ver la
producción con expectativas de elevados
presencia de una semilla cubierta de un hongo sin
rendimientos, debe realizarse un adecuado manejo
esporular (sin registro fotográfico).
de las enfermedades más frecuentes en las semillas
con el propósito de evitar que, en determinadas A continuación, en la tabla 1, se relaciona los
condiciones ambientales, su presencia limite el resultados de crecimiento en cuanto a hongos o
potencial productivo (Prioletta, 2015). levaduras descritas anteriormente:

PLAQUEO DIRECTO EMPLEANDO Tabla 1. Recuento colonias en agar DRBC y PDA,


SEMILLAS DE TRIGO: empleando el método de plaqueo directo.
En el laboratorio se realizó un plaqueo directo AGAR DRBC AGAR PDA
empleando semillas de trigo, con el fin de visualizar Caja
Caja A Caja C
la biodiversidad fúngica propia de este producto. B
Para favorecer el crecimiento de los hongos, se 1 UFC (Aspergillus niger)
ocupó antibioticos para frenar la proliferacion de 1 UFC (Moho
5 UFC (Mohos sin
bacterias no deseadas en este proceso, además no esporulado)
0 esporular- sin registro
Sin evidencia
realizó una limpieza previa a cada semilla con fotográfico)
fotográfica
hipoclorito de sodio al 0,4% para disminuir la carga
de microorganismos y la suciedad que pudiera haber
tenido. En la Figura 3 se puede observar el
crecimiento de hongos y levaduras en las semillas Debido al poco crecimiento de colonias en los agares
utilizadas días después del plaqueo. correspondientes y que no entran dentro del
parámetro de conteo establecido por la Norma
Técnica Colombiana (NTC)- 4092, (ICONTEC,
2009). En este caso especial, se debe hacer un conteo
estimado, según los datos, se reporta que la muestra
analizada presenta < 1x101 UFC/g de alimento. Al
comparar los resultados experimentales con la
norma NTC 604 para trigo en granos (ver tabla 2)
(ICONTEC 2016), la cual establece un rango
permisible entre 5x103 – 8x103 UFC para mohos y
levaduras, se puede afirmar que la muestra de
alimento cumple con los parámetros permitidos para
su distribución y posterior consumo.

Figura 3. Crecimiento de colonias de hongos y


levaduras en las semillas de trigo.

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Tabla 2. Requisitos microbiológicos para el trigo en la colonia parece una tela gamuzada de color gris-
granos. amarillento. Entre sus características microscópicas
encontramos conidióforos lisos o ligeramente
Requisitos Mínimo Máximo
granular, con una pared gruesa. Las vesículas son
Recuentro de aerobios mesófilos, globosas y produce fiálides alrededor de ella, pueden
250000 350000
UFC/g
ser hialinas o manchadas de pardo oscuro, que
Recuentro de Escherichia coli, miden 75 µm de diámetro. Por lo general no son
<10 -
UFC/g
observables, debido a lo denso de la acumulación de
Recuentro de mohos y levaduras, las conidias negras (Ministerio de Salud del Perú &
5000 8000
UFC/g
Instituto Nacional de Salud, 2010).
Recuentro de Bacillus cereus,
500 1000
UFC/g

El crecimiento en las placas, aunque fue poco, no


obstante, manifestó una gran variedad de
organismos vivos presentes en el trigo,
corroborando que los hongos son organismos
cosmopolitas y pueden sobrevivir en gran número
de hábitats. Los hongos al ser heterótrofos pueden
absorber mediante la producción de enzimas
generalmente extracelulares la materia orgánica
presente en el medio, favoreciendo su desarrollo.
Además del crecimiento de hongos también se pudo Figura 4. Morfología de Aspergillus niger- Agar PDA.
evidenciar el crecimiento de la plántula de trigo en el (a) Estructura macroscópica, (b, c, d) Estructura
agar y su viabilidad para el cultivo en los campos. microscópica 40X.
En la Figura 5 se pueden observar
macroscópicamente el crecimiento de solo micelio
ESTRUCTURAS MACROSCÓPICAS Y sin presencia de estructuras reproductoras, en el
MICROSCÓPICAS OBTENIDAS DEL microscopio se pudo observar una red de hifas
PLAQUEO DIRECTO CON TRIGO: hialinas septadas.
La observación macroscópica de cada uno de los
hongos y levaduras se realizó mediante la ayuda de
un estereoscopio y para la microscópica se hizo
empleo del microscopio. A continuación, se
muestran las diferentes colonias que presentaron
crecimiento en el agar PDA y sus diferentes
estructuras.
En la Figura 4 se pueden observar el crecimiento de
una colonia joven de Aspergillus niger ya que presenta
un color blanco a amarillo, pero luego se va Figura 5. Morfología hongo con micelio no
tornando oscuro y finalmente adquieren diversos esporulado- Agar PDA. (a) Estructura macroscópica, (b)
colores, que van del negro azabache al pardo oscuro. Estructura microscópica 40X.
La textura de las colonias es polvosa. El reverso de Además de las colonias de hongos que se pudieron

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observar en el trigo, también se observó dos tipos de levaduras, allí se evidencia el poco crecimiento de
colonias pertenecientes a bacterias que lograron colonias fúngicas en los agares DRBC y PDA, por
crecer en el agar DRBC, la primera colonia tenía una tanto, estos datos no entran dentro del parámetro de
consistencia mucosa de color blanco-opaco y la conteo establecido por la Norma Técnica
segunda colonia presentaba una consistencia Colombiana (NTC)- 4092, (ICONTEC, 2009). En
cremosa brillante y transparente. No se pudieron este caso especial, se debe hacer un conteo estimado,
apreciar las verdaderas formas bajo el microscopio, según los datos, se reporta que la muestra analizada
debido a que se necesitaba la ayuda del aceite de presenta < 1x101 UFC/g de alimento. Al comparar
inmersión para poder observarlas completamente, los resultados experimentales con la norma NTC
además de una tinción especial (tinción de Gram) 685 harinas de subproducto de origen animal (ver
para poder clasificarlas. tabla 5) (ICONTEC 2004), la cual establece un rango
máximo 1,0x102 UFC/g de alimentos para mohos y
levaduras, se puede afirmar que la muestra de
SIEMBRAS EN SUPERFICIE AGAR DRBC Y alimento analizada, cumple con los parámetros
AGAR PDA A PARTIR DE UNA MUESTRA permitidos para su distribución y posterior consumo
DE HARINA PARA CONCENTRADO DE animal.
ANIMALES:
Tabla 5. Requisitos microbiológicos para la harina de
Se realizó diluciones seriadas hasta 10-3 de una subproductos de origen animal.
muestra de harina para concentrado de animales en
donde se obtuvo los siguientes resultados de Requisitos Máximo
crecimiento en cuanto a hongos o levaduras Aislamiento de E. coli Ausencia
presentes por gramo de alimento: Recuento de Clostridium sulfito reductor, UFC/g 20 x 101
Detección de salmonella /25g Ausencia
Tabla 3. Recuento colonias en agar DRBC en las Recuentro de mohos y levaduras, UFC/g 10 x 102
diluciones 10-1,10-2 y 10-3.
Recuentro de mesófilos y levaduras, UFC/g 10 x 104
AGAR DRBC
Coliformes, UFC/g 10 x 102
Dilución Caja 1 Caja 2
10-1 1 UFC (Aspergillus 3 UFC (Levadura
fumigatus) Rhodotorula spp.) ESTRUCTURAS MACROSCÓPICAS Y
MICROSCÓPICAS OBTENIDAS EN LAS
10-2 0 0
DILUCIONES CON HARINA PARA
10-3 0 0 CONCENTRADO DE ANIMALES:
A continuación, se muestran las diferentes colonias
Tabla 4. Recuento colonias en agar PDA en las que presentaron crecimiento en el agar DRBC y sus
diluciones 10-1,10-2 y 10-3. diferentes estructuras.
AGAR PDA En la Figura 6 se puede observar el crecimiento de
Dilución Caja 1 una colonia típica de Aspergillus fumigatus, entre sus
10-1 1 UFC (Cladosporium no esporulado) características macroscópicas encontramos colonias
Sin evidencia fotográfica planas, de aspecto aterciopelado, de color verde
10-2 0 olivo con la periferia con un halo claro. El análisis
10-3 0 microscópico teñido con azul de lactofenol, permite
visualizar micelio septado, hialino, con conidióforos
La tabla 3 y 4 muestran los recuentos de mohos y

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cortos cenocíticos, cabezas aspergilares con fiálides Finalmente se observó el crecimiento de una
que sólo ocupan la parte superior de la vesícula pequeña colonia joven con características similares al
(Méndez Tovar, 2015). género Cladosporium spp. (sin registro fotográfico) en
el agar PDA, según la literatura estos presentan
colonias con textura aterciopeladas, pulverulentas
con pliegues radiales, de color blanco o crema que
tienden a oscurecerse en tonos verde oliva y, a veces,
gris verdoso o marrones (INSHT, 2014). En cuanto
a su visualización microscópica, se podría decir que,
debido a su etapa temprana de crecimiento, no se
pudieron encontrar estructuras de reproducción que
permitieran rectificar esta afirmación.

IV. CONCLUSIONES

Figura 6. Morfología de Aspergillus fumigatus- Agar Con esta práctica se cumplió con el objetivo de
DRBC dilución 10-1 placa A. (a) Estructura apreciar algunas de las diferentes características de
macroscópica, (b, c, d) Estructura microscópica 40X. las colonias, tanto macroscópicas como
microscópicas en las cuales tenemos el color, textura
y tamaño de la biodiversidad fúngica propia de cada
En la Figura 7 se puede observar un crecimiento
típico de Levadura Rhodotorula spp., entre sus uno de los alimentos analizados.
características macroscópicas encontramos colonias
Por otro lado, comparando el resultado estimado
de crecimiento rápido, con un tamaño de 2 a 3cm de
diámetro, con un color rosa coral, aunque pueden obtenido en la parte experimental (<1,0x101 UFC/g
llegar a ser rojas o naranjas; suaves, lisas, húmedas y de alimento), con la norma NTC 685 harinas de
algunas veces de aspecto mucoide. Al ser teñidas con subproducto de origen animal (máximo 1,0x102
azul de lactofenol se pueden observar los UFC/g) no es representativa al presentar poco
crecimiento de mohos y levaduras, por lo tanto, se
blastoconidias aproximadamente de 2 a 4µm de
diámetro, ovoides o ligeramente alargados concluye que la muestra analizada cumple con los
(Rodríguez, 2016). parámetros exigidos por la norma para mohos y
levaduras, indicando que es un producto apto para la
distribución y el consumo animal.
Finalmente, para la muestra de trigo en granos se
puede deducir que la cantidad de colonias estimadas
según lo obtenido en la parte experimental (1,0x101
UFC/g alimento), al compararla con la norma NTC
604 trigo en granos (5x103 – 8x103 UFC/g alimento)
no es representativa al presentar poco crecimiento
de mohos y levaduras, por lo que se puede concluir
que la calidad del producto cumple con los
Figura 7. Morfología de Levadura Rhodotorula spp. - parámetros establecidos en alimentos para el
Agar DRBC dilución 10-1 placa B. (a) Estructura consumo humano.
macroscópica, (b) Estructura microscópica 40X.

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V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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