MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

HISTORIA
Este instrumento fue inventado en Alemania por el físico Ruska en 1931. La óptica
electrónica había sido construida por el físico alemán Busch en 1924. El microscopio se
patentó en 1932, un año más tarde Ruska y Knoll obtenían aumentos de 12.000 con una
resolución de 40 nanómetros.

Estos modelos experimentales eran aún muy imperfectos, y sólo después de la II Guerra
Mundial se superaron los problemas técnicos del microscopio y de los cortes de tejido. El
microscopio electrónico de fines del siglo XX tiene una resolución del orden de 1.000
veces la del microscopio de luz (0,2 y 200 nanómetros, respectivamente).

FUNCIONAMIENTO
Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible
para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten
alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales
(hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios ópticos)
debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones.

Un microscopio electrónico funciona con un haz de electrones generados por un cañón

electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas
(todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire).

Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificación se

produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa
fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la
imagen formada a la pantalla de un ordenador.

Los microscópios electrónicos sólo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no
utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su
funcionamiento es semejante a un monitor monocromático.
La resolución teórica del microscopio electrónico es
CLASIFICACIÓN DE MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos:

Microscopio electrónico de transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM)

Microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)

El microscopio electrónico de transmisión
emite un haz de electrones dirigido hacia
el objeto que se desea aumentar. Una
parte de los electrones rebotan o son
absorbidos por el objeto y otros lo
atraviesan formando una imagen
aumentada de la muestra. Para utilizar un
microscopio electrónico de transmisión
debe cortarse la muestra en capas finas,
no mayores de un par de miles de
angstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto
hasta un millón de veces. Permite la observación de muestra en cortes ultrafinos.

Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de
los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una
imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas
finas, no mayores de un par de miles de angstroms.
Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para
registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden
aumentar un objeto hasta un millón de veces. Reemplaza la luz visible por un haz de
electrones que produce un muy alto poder de resolución.

En este sistema se reemplazan los lentes (cristales) por campos electromagnéticos, estos
producen la amplificación de la imagen. Este haz de electrones viaje en un tubo de alto
vacío, la imagen formada es registrada en la pantalla (monitor) o en una placa fotográfica.
La formación de la imagen depende de la dispersión de los electrones. La imagen se debe
a la ausencia de esos electrones. Depende del número atómico (de los átomos presentes
en el objeto) y del grosor del objeto.

Los cortes son de 1/40 micras (250 Armstrong) de espesor. Se pueden obtener aumentos
de hasta 160.000 veces.

PARTES DEL INSTRUMENTO

El sistema óptico-electrónico del microscopio electrónico de transmisión está constituído
por las siguientes partes:

1. Cañón de electrons
2. Sistema de lentes
3. Pantalla fluorescente

Estos componentes están ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en

alto vacío. El cañón de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se
encuentra ubicado en la parte superior de la columna. Está constituido por un filamento
(cátodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al
filamento y tiene un potencial ligeramente más negativo que éste. El ánodo se encuentra
por debajo del cilindro de Wehnelt.

El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones
emitidos termoiónicamente por el cátodo son acelerados hacia el ánodo, pasan por la
apertura circular central de éste y un haz de alta energía es emitido hacia la columna del
microscopio.

El sistema de lentes está formado por lentes condensadores objetivos, intermedios y

proyectores. Las lentes condensadoras, en los microscopios, más modernos son dos. La
primera, proyecta la imagen punto de entrecruzamiento de magnificada (spot size),
mientras que la segunda controla su diámetro y el ángulo de convergencia en que incide
sobre la muestra. Limita al haz que incide sobre la muestra.

La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especímen. Es

considerada el componente más importante del microscopio electrónico. Cualquier
defecto en ésta, será magnificado y transmitido al resto del sistema óptico. Por lo tanto,
de ella dependen, en gran medida, la resolución final y la corrección de las aberraciones.
Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la
lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente.

La pantalla del microscopio electrónico de transmisión está recubierta por una pintura de
fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando
una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y
termina con el tejido virtualmente libre de agua y
preservado en una matriz de resina.

Existen muchos caminos para la preparación de tejidos para Microcopia electrónica de

transmisión, pero los métodos siguen básicamente ocho pasos:

Fijación Primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos.
Se realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su acción se centra en las proteínas así:

(COOH-proteína-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO

Entonces:

COOH-proteína-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O

La penetración del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en
una hora por el glutaraldehido.

Lavado: Normalmente se hace con un buffer.

Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drásticamente durante el
proceso de fijación. El uso de buffer mantiene el pH fisiológico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer
más comunes son: fosfato, s-collidine, tris-maleato y cacodylate.

Fijación secundaria: es llevada a cabo por la acción del tetróxido de osmio, el cual reacciona
principalmente con los lípidos. El tetróxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en
una hora.
Deshidratación: La filosofía de la deshidratación es el reemplazo del agua usando etanol en series
70% 85% 95% y etanol absoluto.

Infiltración con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisión de fluidos
gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes
deshidratantes, la mayoría de los protocolos emplean un solvente transicional entre el
deshidratante y la resina.

Infiltración con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando
dentro de los tejidos después de la deshidratación. La concentración del solvente es minimizada
gradualmente incrementando las concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.

Inclusión: sumergir el tejido en la resina pura.

Polimerización de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerización aumentando la

temperatura.
¿Que podemos estudiar con MET?

Mediante el microscopio electrónico de transmisión podemos estudiar la ultraestruacura de un

material orgánico oinorgánico. Para esto, existen diferentes formas de operación que posibilitan el
estudio de una característica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de
materiales no- biológicos y biológicos podemos nombrar :

1. Determinación de estructura cristalina en minerales, metales, etc.

2. Estudio de catalizadores.

3. Determinación de impurezas, precipitados,etc.

4. Identificación de bordes de grano e interfaces en metales.

5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.

6. Determinación de tamaño de partícula en catalizadores, minerales,etc.

7. Identificación de planos cristalinos.

8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos.

9. Realización de estudios de histoquímica para identificxar compuestos específicos.

10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales.

11. Reconocimiento de virus.

12. Estudios de citoquímica.

13. Estudios de estructuras moleculares.

Ventajas y desventajas

•Los elevados costos de los equipos y la debida adecuación de una infraestructura para el buen
funcionamiento hacen que esta técnica , se convierten en acceso de investigadores privilegiados .
Si embargo, es común contratar estos servicios por horas o por fotografías requeridas.

•Los costos de reactivos también dan un factor decisivo para la elección de esta técnica. Aun
cuando este proceso de investigación sea costoso , proporciona resultados muy precisos de amplia
resolución y magnificación.

•La técnica de preparación de las muestras cumple con protocolos establecidos, pero son
vulnerables y variados al tipo de investigación que se realice ,contandomas con la experiencia del
investigador.
•La complejidad de los equipos , lo hacen susceptibles a la des calibración. Nuevamente encontrar
las condiciones óptimas requiere de un proceso tedioso y prolongado.

•La manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos.

•Las imágenes obtenidas son moncromáticas y planas siendo necesario, en algunos casos, un
tratamiento posterior mediante análisis de imágenes con un software especializado.
GALERIA DE FOTOS DEL MET

 Se han desarrollado otros tipos de microscopios electrónicos: Un microscopio

electrónico de barrido y transmisión (Scanning Trasnmission Electron Microscope,
STEM) combina los elementos de un SEM y un TEM, y puede mostrar los átomos
individuales de un objeto.
 El microanalizador de sonda de electrones, un microscopio electrónico que cuenta
con un analizador de espectro de rayos X, puede analizar los rayos X de alta
energía que produce el objeto al ser bombardeado con electrones. Dado que la
identidad de los diferentes átomos y moléculas de un material se puede conocer
utilizando sus emisiones de rayos X, los analizadores de sonda de electrones no
sólo proporcionan una imagen ampliada de la muestra, como hace un microscopio
electrónico, sino que suministra también información sobre la composición
química del material.
BIBLIOGRAFIA

 http://www.biologia.edu.ar/microscopia/meb.htm