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13.11.

2018 Laura Ewersbach, Nikolett Hodovan, Johanna Streubel


Gruppe 5

Überprüfung der Robustheit der Methode

Strukturformeln

Diazepam Propylparaben

Macrogol 400 Ethylenglykol


Versuchsdurchführung

Um die Robustheit der zuvor entwickelten Methode zu überprüfen, wurde die


Zusammensetzung der mobilen Phase leicht verändert und der Einfluss dieser
Veränderung auf die Messung untersucht.

Dazu wurde zunächst eine Messlösung hergestellt, die bezogen auf die in der
Methodenentwicklung und der Überprüfung der Spezifität genannten Konzentrationen je
100% Diazepam, Propylparaben und Matrix enthielt.
Zur Herstellung der Messlösung wurden auf einer Feinwaage 0,0153 g Diazepam,
0,0102 g Propylparaben und 1,6443 g der Matrix, deren Herstellung in dem Protokoll zur
Methodenvalidierung zu finden ist, eingewogen, zusammen in einen 100 mL Messkolben
überführt und mit mobiler Phase auf 100,0 mL gelöst.
Die genaue Zusammensetzung der mobilen Phase kann der finalen Methode der
Methodenentwicklung entnommen werden.
Vor der Vermessung dieser Lösung wurde eine Blankmessung durchgeführt, indem einmal
reines Fließmittel injiziert wurde. Die verwendeten chromatographischen Parameter
entsprachen denen, die bei der finalen Methode der Methodenentwicklung angegeben
sind.
Nach der Messung des Blanks wurde unter denselben chromatographischen Bedingungen
sechs Mal die Messlösung injiziert.

Anschließend wurde die Veränderung des Fließmittels vorgenommen. Die


Zusammensetzung der mobilen Phase wurde leicht von MeOH/Wasser 65/35 auf
MeOH/Wasser 67/33 geändert, um eine Verschiebung des Phasenverhältnisses
nachzuahmen, wie sie auch durch eine versehentliche Ungenauigkeit beim Abmessen
entstehen könnte.
Zur Herstellung der neuen mobilen Phase wurden 165,0 mL gereinigtes, gefiltertes
Wasser in einem 200 mL Messzylinder und 335,0 mL HPLC-grade MeOH in einem 500 mL
Messzylinder abgemessen und in eine 500 mL Braunglasflasche gegeben. Nach kräftigem
Schütteln wurde das Fließmittel für 10 min im Ultraschallbad entgast.

Bis auf die mobile Phase blieben alle chromatographischen Parameter gleich.
Nach 5-minütigem Purgen des Systems mit dem neuen Fließmittel wurde eine erneute
Blankmessung mit reinem Fließmittel durchgeführt. Im Anschluss daran wurde die oben
beschriebene Messlösung sechs Mal mit dem neuen Fließmittel vermessen.

Alle Chromatogramme sind im Anhang zu finden.

Ergebnisse

In der folgenden Tabelle sind die Flächen und Flächenverhältnisse der Peaks des Analyten
und des internen Standards in den Messungen aufgeführt, die mit dem ursprünglich
verwendeten Fließmittel mit einem Phasenverhältnis von MeOH/Wasser 65/35 (v/v)
durchgeführt wurden.
Messung Fläche Interner Fläche Flächenverhältnis
Standard Diazepam
1 2850288 3555692 1,2475
2 2791105 3593972 1,2877
3 2799693 3630596 1,2968
4 2786936 3634868 1,3043
5 2775486 3626030 1,3064
6 2789749 3648420 1,3078
Mittelwert 1,2917
Standardabweichung 0,02294
Varianz 5,2626E-04
Tabelle 1: Flächen und Flächenverhältnisse der Peaks des Analyten und des internen
Standards unter Verwendung des ursprünglichen Fließmittels

Auch die Flächen und Flächenverhältnisse von internem Standard und Diazepam aus der
Messreihe, für die das Fließmittel mit veränderter Zusammensetzung verwendet worden
war, wurden tabellarisch aufgetragen:

Messung Fläche Interner Fläche Flächenverhältnis


Standard Diazepam
1 2777416 3652214 1,3150
2 2770222 3655601 1,3196
3 2773340 3653365 1,3173
4 2778919 3664520 1,3187
5 2770970 3659222 1,3206
6 2771281 3664757 1,3224
Mittelwert 1,3189
Standardabweichung 0,002590
Varianz 6,7080E-06
Tabelle 2: Flächen und Flächenverhältnisse der Peaks des Analyten und des internen
Standards unter Verwendung des veränderten Fließmittels

Der durch die jeweiligen Messungen bestimmte Gehalt wurde über die Kalibriergeraden
ermittelt, die im Rahmen der Überprüfung der Linearität entstanden war.
Die so ermittelten Werte wurden mit dem tatsächlichen Gehalt unserer Probe, der aus der
Einwaage an Diazepam bestimmt worden war, verglichen und für jede Messung die
Wiederfindung berechnet. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 3 zu sehen.
MeOH/H2O 65:35 MeOH/H2O 67:33
Messung

Wiederfindung

Wiederfindung
(tatsächlich)

(tatsächlich)
(berechnet)

(berechnet)
Gehalt

Gehalt

Gehalt

Gehalt
1 97,7% 100,2% 97,5% 103,0% 100,2% 102,8%
2 100,8% 100,2% 100,6% 103,3% 100,2% 103,1%
3 101,5% 100,2% 101,3% 103,1% 100,2% 103,0%
4 102,1% 100,2% 101,9% 103,3% 100,2% 103,1%
5 102,3% 100,2% 102,1% 103,4% 100,2% 103,2%
6 102,4% 100,2% 102,2% 103,5% 100,2% 103,4%
Mittelwert 101,1% 100,2% 100,9% 103,3% 100,2% 103,1%
Standardabweichung 0,01804 0 0,01800 0,002036 0 0,002032
Varianz 3,253E-04 0 3,241E-04 4,147E-06 0 4,131E-06
Tabelle 3: Gemessener und tatsächlicher Gehalt der Probe und Wiederfindung bei
ursprünglicher bzw. veränderter Fließmittelzusammensetzung

Da die Werte sowohl von den Flächenverhältnisse als auch von den Gehalten recht nah
bei einander liegen, war hier kein Ausreißertest nötig.

Um die Ergebnisse der beiden Messreihen zu vergleichen, wurden sowohl mit der Werten
für die Wiederfindung aller Messungen der beiden Messreihen als auch für die Werte der
Flächenverhältnisse ein Zweistichproben F-Test und ein zweiseitiger Zweistichproben t-
Test durchgeführt.
Zunächst wurden auf diese Weise die Flächenverhältnisse von internem Standard und
Diazepam aus den beiden Messreihen miteinander verglichen. Die Formel für den F-Test
𝑠12
lautete: 𝐹 = .
𝑠22
Als Nullhypothese wurde H0: „Die Varianzen der Flächenverhältnisse der beiden
Messreihen sind nicht signifikant voneinander verschieden“ gewählt, als
Alternativhypothese H1: „Die Varianzen der Flächenverhältnisse der beiden Messreihen
sind signifikant voneinander verschieden“. Das Signifikanzniveau lag bei α = 0,025, die
Zahl der Freiheitsgrade betrug für beide Messreihen v = 5 und der kritische Wert lag bei
F = 7,146.
Da der berechnete F-Wert bei 78,4531 lag und damit größer ist als der kritische Wert,
muss die Nullhypothese mit einem Vertrauensbereich von 95% abgelehnt werden. Die
Varianzen der beiden Messreihen sind also signifikant voneinander verschieden.
Auf Grundlage dieser Erkenntnis wurde der zweiseitige t-Test unter Annahme
unterschiedlicher Varianzen mit der folgenden Formel durchgeführt:
|𝑥̅1 − ̅̅̅|
𝑥2 𝑛1 ∙ 𝑛2
𝑡= ∙ √
𝑛1 + 𝑛2
𝑠12 (𝑛1 − 1) + 𝑠22 (𝑛2 − 1)

𝑛1 + 𝑛2 − 2

Die Nullhypothese lautete H0: „Die Mittelwerte der Flächenverhältnisse der beiden
Messreihen sind nicht signifikant voneinander verschieden“, die Alternativhypothese H1:
„Die Mittelwerte der Flächenverhältnisse der beiden Messreihen sind nicht signifikant
voneinander verschieden“.
Das Signifikanzniveau lag bei α = 0,05, die Zahl der Freiheitsgrade betrug für beide
Messreihen v = 5. Der kritische Wert war t = 2,571.
Mit t = 2,885 lag der berechnete t-Wert also über dem kritischen Wert. Daher muss die
Nullhypothese mit einem Vertrauensbereich von 95% abgelehnt werden. Wie schon die
Varianzen sind auch die Mittelwerte der Flächenverhältnisse von Diazepam und internem
Standard der beiden Messreihen mit der ursprünglichen und der leicht veränderten
Fließmittelzusammensetzung signifikant voneinander verschieden. Das weist auf eine
eher geringe Robustheit der Methode gegenüber einer Veränderung des Verhältnisses von
organischer zu wässriger Phase im Fließmittel hin. Da aber bereits vorangegangene
Versuche die hohe Empfindlichkeit und Sensitivität der Methode gezeigt hatten, war ein
solches Ergebnis zu erwarten gewesen.

Die Nullhypothese für den Zweistichproben F-Test zum Vergleich der Varianzen der
Wiederfindungen der beiden Messreihen lautete H 0: „Die Varianzen der Wiederfindungen
der beiden Messreihen sind nicht signifikant voneinander verschieden“, die
Alternativhypothese H1: „Die Varianzen der Wiederfindungen der beiden Messreihen sind
signifikant voneinander verschieden“. Zur Berechnung des F-Werts wurde dieselbe Formel
wie oben angewendet. Wieder lag das Signifikanzniveau bei α = 0,025 und die Zahl der
Freiheitsgrade betrug für beide Messreihen v = 5. Der kritische F-Wert lag bei F = 0,140,
die Berechnung ergab einen Wert von F = 0,0127. Da der berechnete F-Wert unter dem
kritischen Wert liegt, ist im Folgenden mit einem Vertrauensbereich von 95% anzunehmen,
dass die Nullhypothese wahr ist und also die Varianzen der Wiederfindungen zwischen
den beiden Messreihen nicht signifikant verschieden sind.

Unter dieser Annahme wurde ein zweiseitiger Zweistichproben t-Test mit der
Nullhypothese H0: „Die Mittelwerte der Wiederfindungen der beiden Messreihen sind nicht
signifikant voneinander verschieden“ und der Alternativhypothese H1: „Die Mittelwerte der
Wiederfindungen der beiden Messreihen sind nicht signifikant voneinander
verschieden“ durchgeführt. Das Signifikanzniveau lag bei α = 0,05, die Zahl der
Freiheitsgrade betrug für beide Messreihen v = 5. Die Berechnung des t-Werts erfolgte mit
derselben Formel wie bereits beim t-Test für die Flächenverhältnisse und ergaben einen
Wert von t = 2,885. Da der kritische Wert bei t = 2,228 lag, ist der berechnete Wert größer
als der kritische t-Wert, was bedeutet, dass mit einem Vertrauensbereich von 95% die
Nullhypothese abgelehnt werden muss. Die Mittelwerte der Wiederfindungen der
Messungen mit dem ursprünglich verwendeten und dem veränderten Fließmittel
unterscheiden sich also signifikant voneinander. Wie bereits oben erläutert, weist das auf
eine geringe Robustheit der Methode gegenüber derartigen Veränderungen hin, was
jedoch aufgrund der Ergebnisse vorangegangener Versuche zu erwarten gewesen war.
Bei Betrachtung der Werte für die Wiederfindung fällt auf, dass die bei den Messungen mit
der ursprünglichen mobilen Phase mit einem Mittelwert von 100,9% wesentlich näher an
dem idealen Wert von 100% liegt als die der Messungen mit veränderter
Fließmittelzusammensetzung. Dort lag der Mittelwert der Wiederfindungen bei 103,1%.
Daraus ist zu schließen, dass die Messung mit der ursprünglichen Methode ein
vertrauenswürdigeres Ergebnis liefert als die mit anderer Zusammensetzung der mobilen
Phase.
Schlussfolgerung

Wie die Ergebnisse des t-Tests zeigen, weicht der gemessene Gehalt an Diazepam in der
Probe bereits bei geringer Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase
signifikant von dem Gehalt ab, der mit dem ursprünglich eingesetzten Fließmittel
gemessen wurde. Das zeigt, dass die Methode keine hohe Robustheit gegenüber
diesbezüglichen Veränderungen aufweist.