Replicación del DNA

Watson y Crick supusieron que la replicación

se daba por la separación gradual de la doble
hélice; como las dos cadenas son
complementarias, cada una sirve como
plantilla para la síntesis de la cadena
complementaria y restaurar el estado de
doble cadena.

Replicación semiconservadora:

La replicación semiconservadora se refiere a

que cada dúplex hijo debe consistir en una
cadena completa heredada del dúplex
parental y una cadena completa sintetizada
de nueva cuenta.

Se consideraron otras propuestas:

 Replicación conservadora: las dos cadenas

originales debían permanecer juntas; al igual que las
dos cadenas sintetizadas. Es decir, un dúplex hijo
debía contener solo el DNA parental y el otro dúplex
hijo debía tener solo el DNA resintetizado.
 Replicación dispersa: las cadenas parentales
deben cortarse en fragmentos y las nuevas cadenas
sintetizarse en segmentos cortos. Los fragmentos
parentales y los sintetizados deben unirse para
formar cadenas complementarias. Por lo tanto
ambos dúplex hijos tendrían cadenas constituidas
por DNA nuevo y antiguo.

Para decidir entre estas 3 posibilidades en 1957

Matthew Meselson y Franklin Stahl hicieron estudios
donde utilizaron bacterias e isótopos de nitrógeno
pesado y ligero para distinguir entre las cadenas de
DNA parenterales y las resintetizadas. En Karp está
bien explicado el experimento pero no creo que sea
necesario poner aquí.

Replicación en células bacterianas

La replicación en procariotas y eucariotas tiene lugar

por mecanismos muy similares; la mayor parte de información de la replicación bacteriana
también se aplica a las células eucariotas.

Horquillas de replicación y replicación bidireccional:

 La replicación comienza en un sitio específico del cromosoma bacteriano, conocido como

origen.
 El origen de replicación del cromosoma de E.
coli es una secuencia específica llamada
oriC. A esta secuencia se unen varias
proteínas para iniciar el proceso de
replicación.
 El proceso de replicación se aleja del origen
en ambas direcciones (bidireccional).
 Los puntos donde se une el par de
segmentos replicados con los segmentos no
replicados se llaman horquillas de
replicación. Cada horquilla corresponde al
sitio donde:
- La doble hélice parental se separa.
- Los nucleótidos se incorporan en las
cadenas complementarias
resintetizadas.
 Cada horquilla se mueve en dirección
opuesta y llega a un punto donde la
replicación concluye (opuesto al origen); y
las dos cadenas dúplex se separan una de la
otra.

Desenrollamiento del dúplex y separación de

las cadenas:

La separación de las dos cadenas de una molécula de DNA circular (o una molécula que no pueda
girar con libertad, como el DNA eucariota) es como tener un extremo de la molécula fijado a una
pared. La tensión que se desarrolla dentro de la molécula no puede liberarse por rotación de
toda la molécula. Como vemos en la imagen; mientras más avanza la maquinaria de replicación
y por lo tanto más se va desenrollando; al otro extremo se crea una tensión que causa
superenrollamientos.

Una molécula de DNA sobreenrollada adquiere un superenrollamiento positivo en la porción no

replicada del DNA por delante de la horquilla.
Las células tienen enzimas topoisomerasas capaces de cambiar el estado de superenrollamiento
de la molécula de DNA. En E. coli participa una topoisomerasa tipo II llamada DNA girasa. Las
moléculas de DNA girasa se desplazan a lo largo del DNA por delante de la horquilla de
replicación eliminando los superenrollamientos positivos.

La DNA girasa elimina los superenrollamientos al cortar las dos cadenas del DNA; un segmento
del DNA pasa a través de la rotura de la doble cadena hacia el otro lado y entonces se ligan los
cortes de nueva cuenta. Este proceso requiere de energía obtenida por hidrólisis de ATP. Las
células eucariotas poseen enzimas similares que realizan esta función.

Propiedades de las DNA polimerasas:

 DNA polimerasas  enzimas que sintetizan nuevas cadenas

de DNA.
 Para la síntesis de DNA la enzima requiere de dTTP, dATP,
dCTP, dGTP.
 El DNA original sirve como plantilla para la reacción de
polimerización.
 En una doble cadena intacta de DNA no se estimula la
replicación debido a que no está desenrollada. El DNA
monocatenario circular no sirve como plantilla para la DNA
polimerasa ya que esta enzima no puede iniciar la
formación de una cadena de DNA.
 La DNA polimerasa puede agregar nucleótidos en el
hidroxilo 3’ terminal de una cadena preexistente. Esta
cadena se denomina iniciador (cebador).
 Todas las DNA polimerasas tienen 2 requerimientos básicos.
- Una cadena de DNA plantilla.
- Una cadena iniciadora.

Estas enzimas solo sintetizan DNA en dirección 5’  3’.

Replicación semidiscontinua:

La ausencia de la actividad de
polimerización en dirección 3’  5’ tiene
una explicación: ambas cadenas de DNA
se sintetizan en dirección 5’  3’.
Durante la reacción de polimerización, el
grupo OH del extremo 3’ del cebador
lleva a cabo un ataque nucleofílico en el
fosfato α 5’ del trifosfato de nucleótido
que entra.
Las DNA polimerasas se mueven en una
dirección 3’  5’ a lo largo de la plantilla y
construyen la cadena desde su extremo 5’
fosfato terminal. En consecuencia una de las
cadenas crece en dirección de la horquilla de
replicación, mientras que la otra cadena
crece y se aleja de la horquilla.

La cadena que crece en dirección de la

horquilla de replicación se puede construir
mediante adición continua de nucleótidos a
su extremo 3’. Esta se llama cadena
adelantada o de replicación continua.

La cadena que crece y se aleja de la horquilla

sintetiza de manera discontinua (en fragmentos “de
Okazaki”). Antes de que la síntesis de un fragmento
pueda iniciarse, se debe exponer un tramo
adecuado del DNA plantilla para el desplazamiento
de la horquilla de replicación. Una vez que se tiene
un tramo del DNA plantilla, cada fragmento crece y
se aleja de la horquilla de replicación hacia el
extremo 5’ de un fragmento previamente formado
al cual se une después. Esta se llama cadena
retrasado o de replicación discontinua.

La enzima que une los fragmentos de Okazaki en una

cadena continua se conoce como DNA ligasa.

El inicio de la replicación no lo lleva a cabo

una DNA polimerasa, sino un tipo distinto de
RNA polimerasa llamada primasa.

Esta primasa sintetiza una secuencia corta de

RNA en el extremo 5’ de la futura cadena
adelantada y en el extremo 5’ de cada
fragmento de Okazaki. Esta secuencia corta
sirve como el iniciador que requiere la DNA
polimerasa para la síntesis de DNA. Estos
iniciadores de RNA después se eliminan y los
espacios resultantes en la cadena se llenan y
entonces se ligan por medio de una DNA
ligasa.

La formación de cebadores de RNA puede

ser un mecanismo que elimina la inclusión de bases erróneas (evita cometer errores).
La maquinaria que opera en la horquilla de replicación:

El desenrollamiento del dúplex y la separación de las cadenas requieren la ayuda de proteínas

que se unen al DNA:

 Helicasa: enzima que desenrolla el DNA. Lo hacen en una reacción que utiliza energía
liberada por hidrólisis de ATP. Separa los puentes de hidrógeno que mantienen juntas las
cadenas y expone las plantillas de DNA monocatenario. La principal helicasa de E. coli es la
helicasa DnaB que contiene 6 subunidades que forman un “anillo” que encierra una sola
cadena de DNA.

El inicio de la replicación en E. coli sucede cuando múltiples copias de la proteína DnaA se unen
al origen (oriC) y separan las cadenas de DNA de este sitio. Posteriormente la helicasa DnaB se
une al oriC de DNA monocatenario de la cadena rezagada o retrasada gracias a la proteína DnaC.
Luego la helicasa DnaB se desplaza en dirección 5’  3’ de la cadena retrasa desenrollando la
doble hélice.

 SSB: proteínas que se unen al DNA monocatenario. El desenrollamiento del DNA hecho por
la helicasa se mantiene gracias a la unión de estas proteínas a las cadenas separadas de DNA.
Las proteínas SSB se unen de manera selectiva al DNA monocatenario manteniéndolo en un
estado extendido y evitando que se vuelva a enrollar o que se dañe.

Nota: los iniciadores de RNA tienen un tamaño aproximado de 10 nucleótidos.

En las bacterias, la primasa y la helicasa se relacionan de manera transitoria para formar un

“primosoma”. La helicasa se mueve a lo largo de la plantilla de la cadena retrasada sin separase
de esta durante el tiempo que dura la horquilla de replicación. Conforme la helicasa se desplaza
a lo largo de la plantilla, la primasa se una a esta de manera periódica y sintetiza los iniciadores
cortos de RNA de cada fragmento de Okazaki.

Luego a estos cebadores de RNA se unen nucleótidos de DNA por medio de una DNA polimerasa
III. La misma DNA polimerasa III sintetiza los diferentes fragmentos. Así esta DNA polimerasa III
se recicla del sitio donde ha terminado un fragmento de Okazaki y pasa al próximo sitio a lo largo
de la cadena retrasada. Una vez en el próximo sitio, esta polimerasa se une al extremo 3’ OH del
iniciador de RNA y comienza a incorporar desoxirribonucleótidos en este extremo.
Se cree que la DNApol III se desplaza gracias a la DNApol III que actúa en la cadena adelantada.
Aunque las dos polimerasas se mueven en direcciones opuestas pueden actuar a manera de
complejo. Esto lo logran formando un asa en el DNA de la cadena retrasada sobre sí misma, lo
que causa que esta plantilla tenga la misma orientación que la cadena adelantada (a).

Una vez que las polimerasas que ensamblan la cadena retrasada alcanzan el extremo 5’ de un
fragmento de Okazaki sintetizado previamente, la plantilla de la cadena retrasada se libera (b) y
la polimerasa comienza a trabaja en el extremo 3’ del próximo iniciador de RNA (c).

Este modelo se refiere a menudo como el “modelo del trombón” porque el asa de DNA crece de
manera repetida y se acorta durante la replicación de la cadena retrasada, lo que semeja el
movimiento del “asa” de un trombón.

Estructura y funciones de las DNA polimerasas:

La enzima que sintetiza las cadenas de DNA durante la replicación en E. coli es la DNA polimerasa
III, que es parte de una maquinaria de replicación llamada holoenzima DNA polimerasa III o
replisoma.
 Pinza beta (abrazadera): es uno de los componentes no catalíticos del replisoma. Mantiene
la polimerasa relacionada con la plantilla de DNA. Las DNA polimerasas poseen 2
propiedades importantes:
- Deben permanecer vinculadas con la plantilla sobre largos tramos.
- No se deben fijar con tanta fuerza para poder desplazarse de un nucleótido al siguiente.

Estas propiedades se deben a la

pinza beta que rodea al DNA y se
desplaza de manera libre a lo
largo de este.

La polimerasa de la cadena
adelantada permanece unida a
una sola pinza beta durante la
replicación; en cambio la
polimerasa de la cadena
retrasada completa la síntesis de
un fragmento de Okazaki, se
desengancha de la pinza beta y
otra vez se una a una pinza beta
ensamblaba entre el iniciador de
RNA y el DNA plantilla cerca de la
horquilla de replicación.

El ensamblaje de la pinza beta alrededor del DNA y cebador requiere de un cargador de pinza
multisubunitario (parte del replisoma). El cargador de pinza está unido a ATP; este complejo se
une a la unión cebador-plantilla y también mantiene la pinza beta en una conformación abierta.
Cuando el DNA pasa a través de esta abertura en la pinza beta, el ATP se hidroliza con lo que se
libera la pinza de su cargador y la pinza beta se cierra alrededor del DNA quedando lista para
unirse con la polimerasa III.

La DNApol-1 interviene en la reparación del DNA; también elimina los iniciadores de RNA en el
extremo 5’ terminal de cada fragmento de Okazaki y reemplaza estos con DNA.

Actividades de exonucleasa de las DNA polimerasas:

La DNA polimerasa I tiene actividad de exonucleasa, es decir, es capaz de degradar polímeros de

DNA al elimina uno o más nucleótidos del extremo de la molécula.
Luego se supo que todas las polimerasas bacterianas poseen actividad de exonucleasa. Las
actividades de exonucleasas pueden dividirse según la dirección en la cual degrada la cadena,
osea, 5’  3’ y/o 3’  5’.

La DNA polimerasa I tiene ambas actividades de exonucleasa, además de su actividad de

polimerización. De este modo, la DNApol I posee tres enzimas en una:

 Exonucleasa 5’  3’: puede degradar los dos tipos de ácido nucleico. Remueve el cebador
de RNA de cada fragmento de Okazaki.
 Polimerasa: a medida que remueve el cebador también tiene su actividad de polimerasa y
rellena los espacios resultantes con desoxirribonucleótidos.

El último desoxirribonucleótido incorporado se liga de manera covalente al extremo 5’ del

fragmento de DNA antes sintetizado por medio de una DNA ligasa.

 Exonucleasa 3’  5’: desplaza los nucleótidos mal apareados del extremo 3’ de la cadena
en crecimiento del DNA.

Aseguramiento de la alta fidelidad durante la replicación del DNA:

La incorporación de un nucleótido en particular en el extremo de una cadena naciente depende

de que este puede formar una complementación correcta con el nucleótido de la cadena
plantilla. En cada sitio a lo largo del molde, la DNA polimerasa debe discriminar entre los 4
diferentes precursores potenciales conforme se mueven dentro y fuera del sitio activo de la
enzima. Entre estos precursores solo uno, con una geometría apropiada, puede encajar
perfectamente con el DNA plantilla y ello produce un apareamiento de bases A-T o G-C.

Si la enzima percibe que el nucleótido entrante es incorrecto, sufre un cambio conformacional

en el cual el “dedo” de la polimerasa gira hacia la “palma” evitando la unión del nucleótido
entrante. Si el apareamiento de bases recién formado presenta una geometría inadecuada, el
sitio activo no puede adquirir la conformación requerida para la catálisis y el nucleótido
incorrecto no se incorpora. Si el apareamiento de bases presenta una geometría adecuada, el
nucleótido entrante se une de manera covalente al extremo de la cadena que está en
crecimiento.

Se estima que la frecuencia de apareamiento incorrecto es una vez cada 105 a 106 nucleótidos.
Esta baja frecuencia de mutaciones se debe en parte a las actividades de exonucleasa 3’  5’
de la DNA polimerasa I. Cuando la DNA polimerasa incorpora un nucleótido incorrecto, la enzima
se detiene y el extremo de la cadena tiende a separase de la plantilla y formar una cadena
sencilla 3’ terminal. Cuando esto sucede, la enzima sufre un cambio conformacional para dirigir
esta cadena sencilla 3’ terminal hacia el sitio de exonucleasa 3’  5’, el cual remueve el
nucleótido erróneo. Esto es trabajo de “lectura y corrección”.
Además la bacteria posee un mecanismo de reparación del apareamiento erróneo que opera
después de la replicación y corrige casi todas las uniones erróneas. Así, la fidelidad de la
replicación del DNA se base en 3 actividades distintas:

1. Selección precisa de nucleótidos.

2. Lectura y corrección inmediata.
3. Reparación del apareamiento erróneo después de la replicación.

La replicación de un cromosoma bacteriano completo se da en unos 40 min a 37°C (1000

nucleótidos por segundo; longitud equivalente a un fragmento de Okazaki completo). Así la
síntesis de un fragmente de Okazaki, la elongación del DNA, la lectura y corrección simultánea
por medio de la DNA polimerasa, la eliminación del RNA, su reemplaza con DNA y la ligación de
las cadenas, ocurre alrededor de 1 segundo.

En E. coli un nuevo ciclo de replicación puede iniciar antes de que el ciclo previo se complete.
Por lo tanto estas bacterias replican su cromosoma a una máxima velocidad de 20 minutos.

Replicación en eucariotas

Iniciación de la replicación en células eucariotas:

Las células eucariotas replican su genoma en pequeñas porciones denominadas replicones. Cada
replicón tiene su propio origen de replicación desde el cual avanza bidireccionalmente la
horquilla de replicación.

En las células humanas, la replicación inicia en alrededor de 10 mil a 100 mil diferentes orígenes
de replicación. Alredor de 10 a 15% de los replicones se dedican activamente a la duplicación en
cualquier momento dado durante la fase S del ciclo de celular.

En células de mamíferos, el tiempo de la replicación de una región cromosómica se correlaciona

de manera regular con la actividad de los genes en la región o el estado de compactación. La
presencia de histonas acetiladas es un factor común en la determinación de la replicación
temprana de locus génicos activos. Las regiones más compactadas (heterocromatina), que son
las menos acetiladas, son las últimas en replicarse.

La diferencia en el tiempo de replicación no se relaciona con la secuencia del DNA.

Las secuencias que promueven la replicación del DNA (osea las secuencias origen) se conocen
como secuencias de replicación autónoma (ARS). El elemento central de una ARS consiste en
una secuencia conservada de 11 pares de bases, que funcionan como sitio de unión específico
para el complejo multiproteico esencial llamado complejo de reconocimiento de inicio (ORC).

La replicación se restringe a una por ciclo celular:

Es esencial que cada porción del genoma se replique solo una vez durante el ciclo celular. Por lo
tanto deben existir mecanismos que eviten el reinicio de la replicación en un sitio que ya se ha
duplicado. Por lo tanto durante el inicio de la replicación, el origen debe pasar por una serie de
pasos:

1. Al origen (ARS) se une un complejo ORC. Al ORC se unen varias proteínas necesarias para los
siguientes pasos.
2. Proteínas llamadas factores permisivos se unen al ORC para ensamblar un complejo
proteínico-DNA, llamado complejo de prerreplicación (pre-RC); este complejo pre-RC es
competente para iniciar la replicación. Dentro de los factores permisivos se han encontrado
 un grupo de 6 proteínas MCM
relacionadas (Mcm2 – Mcm7). Estas
proteínas MCM son ensambladas
en el punto de origen en la fase
tardía de la mitosis o poco después,
gracias a la ayuda de factores
accesorios que se ligaron
previamente al ORC. Las 6 proteínas
forman un complejo MCM que
posee actividad de helicasa
(encargada de desenrollan el DNA
en la horquilla de replicación). En
cada origen se unen 2 complejos
MCM (helicasas). Cada una de las
replicasas se desplaza en
direcciones contrarias alejándose
del origen cuando inicia la
replicación.
3. El ensamblado de estos complejos
proteicos marca un sitio en el
genoma como potencial origen de
replicación, aunque no garantiza
que en realidad lo sea. Durante casi
todos los ciclos celulares se
ensambla un número mucho mayor
de complejos de replicación previos
del que se utilizará. Sea cual sea el
mecanismo de selección de este
complejo, poco antes de comenzar
la dase S del ciclo celular, la
activación de las cinasas de
proteínas decisivas fosforilan el
complejo MCM y otras proteínas y
así comienza la replicación. Una de estas cinasas es dependiente de ciclina (Cdk). La actividad
de las Cdk es importante desde la fase S hasta la mitosis, la cual suprime la formación de
nuevos complejos de pre-RC. Por ello cada origen puede activarse una sola vez por ciclo
celular. En la última parte de la mitosis, las Cdk posibilitan el ensamble del pre-RC para iniciar
un próximo ciclo celular.
4. Una vez que la replicación comienza en la parte inicial de la fase S, las proteínas MCM se
desplazan con la horquilla de replicación.

La horquilla de replicación eucariota:

Los procesos que ocurren en la horquilla de replicación de células eucariotas es muy similar a
las ya descritas en la bacteria E. coli. Algunas proteínas cambian pero su función es la misma;
esto se describe en el cuadro de más abajo.
Por lo tanto todos los mecanismos de replicación requieren: helicasas, proteínas de unión con
DNA monocatenario, topoisomerasa, primasa, DNA polimerasas, pinza deslizante, cargador de
la pinza y DNA ligasa. Para el estudio de replicación de eucariotas in vitro se emplea la helicasa
viral llamada antígeno R grande del virus SV40. Por lo tanto el siguiente gráfico es la replicación
eucariota pero interviene la helicasa viral.

Como en las bacterias, el DNA eucariota se sintetiza de manera semidiscontinua (los fragmentos
de Okazaki son más pequeños en comparación con los de una bacteria; son de unos 150
nucleótidos). Al igual que en las bacterias; las DNA polimerasas de eucariotas están presentes
en un dímero que sugiere una replicación coordinada por un complejo de replicación o
replisoma (osea lo que se forma un asa con la cadena retrasada).

Cinco polimerasas típicas de células eucariotas:

 DNApol α: está muy relacionada con la primasa y juntas inician la síntesis de cada fragmento
de Okazaki.
El complejo polimerasa α-primasa reconoce y se une al segmento desenrollado, en forma de
DNA monocatenario cubierto por una proteína de unión al DNA, llamada RPA. La primasa
comienza la síntesis del cebador de RNA, el cual se amplía por la adición de unos 20
desoxirribonucleótidos por medio de la polimerasa α.

 DNApol β: funciona en la reparación del DNA.

 DNApol γ: realiza la replicación mitocondrial.
 DNApol δ: principal enzima sintetizadora de DNA durante la replicación de la cadena
retrasada.
 DNApol ε: principal enzima sintetizadora de DNA durante la replicación de la cadena
adelantada.

La pinza deslizante que mantiene unido la DNApol δ y ε en células eucariotas se conoce como
PCNA. El cargador de pinza que coloca la PCNA sobre el DNA se llama RFC.

Después de sintetizar el iniciador RNA-DNA, la polimerasa α se sustituye de la plantilla por el

complejo PCNA-polimerasa δ que completa la síntesis del fragmento de Okazaki.

La polimerasa δ desplaza el cebador del extremo 5’ del fragmento de Okazaki previo. Una
endonucleasa llamada FEN-1 corta el DNA recién sintetizado al iniciador desplazado, y una DNA
ligasa sella el espacio en el DNA.

Se cree que la FEN-1 y la DNA ligasa se atraen a la horquilla gracias a la PCNA. De hecho se cree
que PCNA tienen participación importante en diferentes fenómenos durante la replicación,
reparación y recombinación del DNA debido a su capacidad de unirse a diversas proteínas. Por
esto se lo ha llamado “cinturón de herramientas moleculares”.

Las polimerasas eucariotas construyen las cadenas de DNA en una dirección 5’  3’ al agregar
nucleótidos a los grupos hidroxilos 3’ y ninguna de estas es capaz de iniciar la replicación sin un
cebador.

Las polimerasas γ, δ, ε poseen una exonucleasa 3’  5’, cuya actividad de lectura y corrección
garantiza que esta replicación ocurra con una gran eficiencia.

Existen otras DNA polimerasas (como ƞ, κ, ι) que poseen una función especializada que permite
a las células la replicación del DNA dañado.