CONJUGACION ARTICULO

ransferencia de ADN se produce durante una fase de contacto de superficie celular F Sexo Factor-
Mediated conjugación bacteriana

La conjugación es el proceso por el cual el ADN es transferido de un donante a un receptor

bacteria por un mecanismo que implica el contacto entre las células. La conjugación de la mayoría
de los estudios se han realizado con bacterias gram-negativas y, en particular, se han centrado en
Escherichia coli y su factor sexo, F. Una característica central de F-mediada: La conjugación es la
función de la F pilus, un filamento extracelular ciliadas que se produce en uno o pocos ejemplares
por un plásmido F-conteniendo bacteria donante .Una característica central de F-mediada: La
conjugación es la función de la F pilus, un filamento extracelular ciliadas que se produce en uno o
pocos ejemplares por un plásmido F-conteniendo bacteria donante (9). Si bien existe una fuerte
evidencia de que el F pilus es esencial para la formación del contacto inicial entre un donante y un
receptor bacteria (4, 7), existe todavía un grado de incertidumbre en cuanto a la función que
desempeña en este orgánulo conjugativo de transferencia de ADN. Las primeras observaciones(5,
16) indica la posibilidad de contacto entre la superficie celular directo conjugando las bacterias,
pero desde estos estudios precedió al descubrimiento de F pili, no se realizaron experimentos
críticos en ese momento para distinguir entre las funciones posibles para el sexo pilus. Los
estudios de BRINTON F pili le llevó a proponer una clase de modelos en los que el F pilus
conjugativo está directamente involucrado en la transferencia de ADN (6). Sin embargo, no hay
pruebas directas de que demuestra una asociación entre F pili y ADN que está siendo transferido
conjugatively ha sido reportada en la literatura. Como alternativa, Curtiss(10) y Marvin y Hohn (18)
han sugerido que podría funcionar F pili retrayendo el dibujo y, por lo tanto, el donante y el
receptor las superficies celulares juntos, punto en el que se produciría la transferencia de ADN.
Esta idea es central para el

modelo favorecido actualmente por transferencia conjugativo F-como plásmidos.

Las características centrales de este modelo han sido recientemente

revisadas por Willetts y Skurray (26) y son presentados en la

Fig. 1.

El modelo contempla la conjugación como proceder a través de una serie de etapas ordenadas de
la superficie celular y metabolismo de ADN eventos. La mayor parte de la evidencia para este
modelo se basa en los fenotipos de plásmido F mutantes que son deficientes en la transferencia
(TRA) (26). Mutantes de traA,L,E,K,B,V,W,C,U, F,H, o la primera parte de traG no sintetizar F pili y
son defectuosas en todas las fases de conjugación. Mutantes de traN y la segunda parte de
sintetizar traG F pili y hacer inestable, pero no estable (resistente al cizallamiento), contactos de la
superficie celular.
Destinatario de las bacterias que carecen de la membrana externa de proteína ompA también son
incapaces de formar parejas estables (21). Mutantes en traM,D,I,Z, (y probablemente tra 1) son
piliated y son capaces de formar parejas estables (26); los productos de genes han sido implicados
en la síntesis del DNA conjugativo de donantes y la transferencia.

Una deficiencia genética de estos estudios es que no

permitan un pedido definitivo de las etapas inferido de conjugación.

Como se indicó anteriormente, una esfera de especial preocupación es la

colocación de la etapa de transferencia de ADN en un momento en que el donante

y el receptor las superficies celulares están en contacto, y el punto en el cual

extendió F pili son presumiblemente ya no es necesaria. Quizás

el mejor intento para demostrar este punto requirió tratamiento de

mezclas de apareamiento con bajas concentraciones de detergente

dodecil sulfato de sodio (SDS), que depolymerizes F pilus

filamentos (24). Achtman et al. (3) encontraron que SDS tratamiento

no cause la desagregación de las parejas preformado que

incluía un Hfr donantes, y que la cantidad de recombinantes

siguió aumentando durante más de incubación en presencia

de SDS. Este resultado es claramente consistente con la noción de

que el extendido F pili no son esenciales para la transferencia de ADN, una vez

se establece el contacto de superficie celular. Sin embargo, las parejas estables

no se encontraban aisladas como intermediario, ni era la

transferencia de ADN posteriores demostraron. El uso de

formación recombinante como ensayo para la transferencia de ADN más presentó

una complicación no presente en un plásmido F el apareamiento

Desde un punto de vista genético, el más poderoso método

de analizar el orden de los eventos en un sendero biológico es el

ideado por Jarvik y Botstein (13). Sus test utiliza

un par de mutantes condicionales, uno sensible a la temperatura y

el otro frío sensibles; por

experimentos de cambio de temperatura adecuado es posible determinar inequívocamente el

tiempo relativo en el que las funciones de los genes correspondientes son

necesarios. Para aplicar este enfoque a F-mediada la

conjugación bacteriana, hemos empleado SDS y una F lac traD

mutante(Ts) como la necesaria par de bloques condicionales. Como en los

experimentos de Achtman et al. (3), SDS se usa para eliminar

extended F pilus filamentos. Análisis de los fenotipos

de las diversas tra mutantes que afectan el

metabolismo de DNA conjugativo sugiere que la traD producto desempeña un papel directo

en la transferencia de ADN (15). Materiales y métodos

plásmidos y cepas. Los plásmidos utilizados fueron JCFLO (F

lac tra ), JCFL8 [F lac traD8(Am)], y [F39 JCFL lac

traD39(ts)] de la colección Achtman et al. (4). Estos

se utilizaron en un JC3272 de fondo (F- lac gal su prt lys Ar

str) para dar el donante cepas JC3273, JC6129, y JC6140,

respectivamente (4). La cepa receptora utilizada fue XK1502 (FAlacUJ69

nalA) (19).

Determinaciones de eficiencia de acoplamiento en los 32 y 42°C. JC6140,

JC3273 y XK1502 fueron cultivadas por duplicado en los 32 y 42°C

como culturas noche permanente en 10 ml de caldo LB en

matraces Erlenmeyer de 125 ml. Las muestras (0,1 ml) de las culturas de los donantes

(JC6140 o JC3273) fueron subcultivadas en 2,4 ml de caldo LB

y dejar reposar durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación

0,4 ml de estas culturas donantes eran suavemente mezclado

con 0,4 ml de la noche permanente de culturas XK1502

(crecido a 32 o 42°C), y el apareamiento se mezcla se deja

reposar durante 2 horas a 32 o 42°C. Al inicio de apareamiento,

las muestras fueron diluidas y chapada en

placas de agar-agar MacConkey lactosa ,que contiene 100 µg de estreptomicina por mililitro

de recuentos de células de donantes. Al final del apareamiento, muestras de la

mezcla de acoplamiento se diluye y chapada en lactosa-minimal,

placas de agar conteniendo 20 ,ug/ml de ácido nalidíxico para

determinar el número de transconjugants

Materiales y métodos

plásmidos y cepas. Los plásmidos utilizados fueron JCFLO (F

lac tra ), JCFL8 [F lac traD8(Am)], y [F39 JCFL lac

traD39(ts)] de la colección Achtman et al. (4). Estos

se utilizaron en un JC3272 de fondo (F- lac gal su prt lys Ar

str) para dar el donante cepas JC3273, JC6129, y JC6140,

respectivamente (4). La cepa receptora utilizada fue XK1502 (FAlacUJ69

nalA) (19).

Determinaciones de eficiencia de acoplamiento en los 32 y 42°C. JC6140,

JC3273 y XK1502 fueron cultivadas por duplicado en los 32 y 42°C

como culturas noche permanente en 10 ml de caldo LB en

matraces Erlenmeyer de 125 ml. Las muestras (0,1 ml) de las culturas de los donantes

(JC6140 o JC3273) fueron subcultivadas en 2,4 ml de caldo LB

y dejar reposar durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación

0,4 ml de estas culturas donantes eran suavemente mezclado

con 0,4 ml de la noche permanente de culturas XK1502

(crecido a 32 o 42°C), y el apareamiento se mezcla se deja

reposar durante 2 horas a 32 o 42°C. Al inicio de apareamiento,

las muestras fueron diluidas y chapada en

de recuentos de células de donantes. Al final del apareamiento, muestras de la

mezcla de acoplamiento se diluye y chapada en lactosa-minimal,

placas de agar conteniendo 20 ,ug/ml de ácido nalidíxico para

determinar el número de transconjugants