UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Química
0141 Bioquímica Experimental
Estructura, Propiedades y Función de Ácidos Nucleicos
Transferencia de Material Genético: Transformación, Aislamiento y Ensayo de
Restricción de Plásmido
Escribió: Ramírez Lugo Marcela

Resumen

Al poner en contacto células de E. coli competentes con un plásmido que tiene genes de resistencia a
kanamicina, las bacterias adquieren y expresan los genes contenidos en dicho plásmido. Se demuestra la
resistencia a este antibiótico al crecer en un medio que lo contenga. Además, cuando tal plásmido se aísla e
interactúa con enzimas de restricción se observan fragmentos más cortos que el plásmido en una
electroforesis en gel de agarosa.

Introducción

La transformación es el proceso mediante el cual fragmentos de DNA genómico de una bacteria huésped
puede entrar a una célula receptora e incorporarse a su área homóloga.
La competencia es la capacidad de una célula de aceptar DNA y ser transformada; esta capacidad está
determinada genéticamente. Algunos géneros como Streptococcus y Bacillus son competentes por
naturaleza, pero la cepa de E. coli , que se utilizará en este ensayo, no lo es. A fin de hacerse competente, la
cepa recibe un tratamiento con altas concentraciones de iones calcio y posterior baja de temperatura a fin de
hacer a su membrana más permeable para ingresar macromoléculas.

El avance de la biología molecular ha permitido manipular la estructura genética de un organismo y

combinarlo con el de otro. A menudo esta tecnología de DNA recombinante comienza al aislar un plásmido y
DNA exógeno, y cortarlos con la misma enzima de restricción. El DNA exógeno se inserta en el plásmido y el
plásmido recombinante se introduce a una bacteria. Las bacterias luego se cultivan y se detectan para
seleccionar al gen de interés. Un ejemplo del uso de esta tecnología es la exploración de la estructura
genética humana para identificar y aminorar padecimientos genéticos, particularmente a través del diagnóstico
prenatal.

Las enzimas de restricción como endonucleasas son enzimas capaces de diferenciar DNA exógeno,
normalmente de virus, (y secuencias palindrómicas), y cortarlo al romper enlaces fosfodiéster.

La electroforesis en geles de agarosa se utiliza para estudiar tamaños de moléculas de ácidos nucleicos. Su
funcionamiento es similar al de electroforesis en gel de poliacrilamida para separar muestras de proteínas por
masa molecular. Se aplica un campo eléctrico a una muestra de ácido nucleico en un poro de gel de dicho
polisacárido. Como los grupos fosfatos están cargados negativamente van a migrar hacia el electrodo positivo,
las moléculas más ligeras, es decir las que tengan menos pares de bases y por lo tanto menor peso
molecular, van a estar menos impedidas para migrar hacia el electrodo.
Objetivos

Conocer el fundamento y realizar la técnica para transformar células bacterianas

Identificar células transformantes mediante su fenotipo
Conocer la definición de organismo transgénico y las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos.
Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA genómico.
Realizar el aislamiento del DNA plasmídico
Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la biotecnología

Hipótesis

Después de que células competentes que se mezclen con plásmido de resistencia a kanamicina, crecerán al sembrarse
en un medio que lo contenga.

Después de mezclar el plásmido aislado con enzimas de restricción se observará en geles de agarosa corridos con
electroforesis, bandas de menor peso molecular que el plásmido sin enzima.

Método

Transformación de células competentes

Se realizó el procedimiento acorde a lo indicado en el Manual de Prácticas de Bioquímica Experimental (0141) (2013-1)
de la Facultad de Química pp43-46

Aislamiento de plásmido
Se realizó según el protocolo experimental de GenElutePlasmid MiniPrep Kit. Este kit producido por Sigma Aldrich
contiene las instrucciones para centrifugar, lisar y resuspender y pasar por una columna que va a retener el DNA. Se
utiliza isopropanol en vez de álcali.

Resultados
Se observó crecimiento de E.coli transformado sin colonias aisladas en medio kanamicina

Gráfico 1: Revelado de geles de agarosa con bromuro de etidio a luz UV comparado con marcador de peso molecular.
Plásmido pBSII KS 2961 pb(Inserto 1100 pb )(Plásmido + inserto = 4061 pb) SD= Sin digerir. D= Digerido. PM= Marcador
de Peso Molecular
Absorbancia 260 nm 280 nm
0.178 0.153
Abs260/Abs280= 1.163

Tabla 1.Proporción de absorbancias a 260 y 280 nm de la muestra de plásmido purificada.

Análisis de Resultados

Se comprobó que las células de E.coli ya habían recibido un tratamiento adecuado para hacerse
competentes y además se transformaron por la técnica de choque térmico, ya que ingresaron el
plásmido y lo expresaron para poder crecer en medio de kanamicina.

No se pudo calcular la eficiencia de transformación, ya que no se obtuvieron colonias aisladas.

Como el DNA absorbe significativamente en el rango ultravioleta por la presencia de grupos

aromáticos de adenina, guanina, citosina y timina, se puede determinar una medida de su
concentración a 260 nanómetros. En cambio, las proteínas, que son el contaminante principal en la
purificación de DNA, tiene una absorción máxima a 280 nanómetros. La proporción de absorbancias
a 260/280 comunmente se usa como como medida relativa del contenido de ácido nucleico y
proteína en una muestra de DNA. Una muestra de DNA puro con muy poca o nada de proteína tiene
un cociente de absorbacncias a dichas longitudes de onda de 1.8. Aunque se logró una proporción
un poco mayor de la unidad, las impurezas causadas con proteínas pudieron haber interferido en los
siguientes pasos experimentales.

Como se observa en el Gráfico 1, Para todos los equipos se observa que tanto el plásmido sin digerir como el
digerido hay bandas en 3 mil pares de bases, lo que indica que las enzimas no lograron cortar completamente
todas las moléculas de plásmido. Sólo en la mitad de los equipos (1D, 4D, 5D) se observan bandas en mil
pares de bases, por lo cual se puede decir que se logró una restricción parcial.

Sólo en el equipo 5 se observa que la banda de mayor peso molecular es de 3 mil pares de bases, lo que
corresponde al plásmido sin digerir. Esto se traduce en que sólo este equipo logró una buena purificación de
plásmido, mientras que el resto tenía sus muestras de plásmido aún contaminadas con DNA cromosómico de
la bacteria (bandas de 4 mil pares de bases y más)

En el procedimiento no se logró resuspender el botón de precipitado de manera correcta, lo que pudo haber
causado que la enzima de restricción no tuviera el contacto adecuado con el DNA y por lo tanto no se logró
escindir la molécula(no se cumplió la hipótesis).

También es posible que se obtuvieron bandas de mayor peso molecular que el de plásmido debido a que las
enzimas de restricción efectivamente escindieron al plásmido pero quizás dejaron extremos adhesivos que se
unieron con DNA que no se separó bien en el aislamiento y que también tenía extremos pegajosos. Al unirse
dieron una moléculas del orden de 4 kilopares de bases.

Conclusiones
La transformación es una manera de recibir DNA exterior, como el de células lisadas. Las bacterias que
lleguen a estar en contacto con restos de células virulentas pueden llegar a adquirir tal virulencia y se vuelven
transgénicos, ya que adquirieron nuevo material genético, y en particular les confiere una ventaja en su medio.

Conocer el principio de transformación es de suma importancia para la industria de la salud porque

cuando se desinfectan objetos y áreas contaminadas con microorganismos patógenos, se debe
asegurar de destruir no sólo la vida bacteriana sino las moléculas contenidas en estas células, ya
que otros microorganismos pueden tomar este material genético que sigue siendo útil, y usarlo para
seguir causando virulencia.
Para aislar a un plásmido es necesario lisar a la célula, precipitar su contenido y centrifugarlo. Purificar
plásmidos tiene mucha importancia en el área de la biotecnología porque son usados ampliamente como
vectores de clonación para preparar DNA recombinante.

La digestión con endonucleasas acoplada con electroforesis en gel de agarosa es una herramienta valiosa
para mapear plásmidos y para experimentos de recombinación de DNA.

Bibliografía

Cappuccino James G, Sherman Natalie, Microbiology: a laboratory manual, 10° edición Pearson, pp 389-390

Boyer, Rodney F, Biochemistry laboratory: modern theory and techniques, 2° edición 2012, Pearson, pp71, 180, 277