Departamento de Genética, Universidad de Granada

MANUAL DE PROBLEMAS Y
PRÁCTICAS DE INGENIERÍA
GENÉTICA

GRADO DE BIOTECNOLOGÍA

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 Departamento de Genética, Universidad de Granada

MANUAL DE PROBLEMAS Y
PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE GENÉTICA

Rafael Jiménez Medina

Departamento de Genética, Universidad de Granada

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ÍNDICE

Problemas 4

Prácticas

Subclonación de un fragmento de ADN 12

Genotipado de ratones transgénicos 15

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PROBLEMAS

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1) El plásmido pROC de Escherichia coli fue purificado y digerido con las 
endonucleasas AatI, BamHI, CspI y DraIII, en digestiones simples y dobles, con el fin 
de llevar a cabo su cartografía de restricción. Los fragmentos de restricción fueron 
sometidos a electroforesis en gel y las bandas obtenidas se muestran en la figura, en la 
que las enzimas se representan por su inicial, y M indica marcador de peso molecular. 
Dibuja un mapa de restricción de pROC (circular), indicando en kb las distancias entre 
las dianas de las restrictasas. No se requiere en este problema una precisión superior a 
0,5 kb. 

2) Dos enzimas que catalizan la síntesis de ARN a partir de ribonucleósidos 
trifosfatados se diferencian en su modo de acción, tal como se desprende de los datos de
la siguiente tabla, que muestra los resultados de diversos experimentos en los que las 
enzimas se incubaron por separado con una mezcla equimolecular de cuatro 
ribonucleósidos trifosfatados (A, G, C y U), en ausencia o presencia de ADN 
bicatenario extraído de dos organismos distintos, X e Y. El contenido en G+C del ADN 
de X es del 30%, y el de Y, del 70%. La tabla indica el tipo de ADN con el que se 
realizó cada experimento, si hubo (+) o no (­) síntesis apreciable de ARN, y en su caso, 
la composición de este último, en porcentaje. 

En experimentos de hibridación se comprobó que el ARN del experimento 2 
hibrida al 100% con ADN de X previamente disociado por calentamiento, pero no 
lo hace con ADN de Y. El ARN del experimento 3 hibrida al 100% con ADN de Y, 
pero no con el de X. Los ARN de los experimentos 4, 5 y 6 no hibridan ni con ADN 
de X ni con el de Y. a) Para cada una de las dos enzimas propón una hipótesis que 
explique su modo de acción. b) Indica un experimento que permita confirmar tu 
hipótesis sobre el modo de acción de la enzima 2. 

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3) En la siguiente tabla se indican los resultados de la caracterización de dos tipos de 
ácidos nucleicos extraídos de los bacteriófagos X e Y. Se dan los contenidos en tres de 
las bases, la sensibilidad a dos ribonucleasas y dos desoxirribonucleasas distintas, y la 
absorbancia a 260 nm (A260) de muestras de ácido nucleico antes y después de 
calentarlas a 100°C durante 15 minutos. El signo + indica que el ácido nucleico es 
degradado por la nucleasa correspondiente, y el signo ­, que no es degradado. a) Indica 
la naturaleza molecular de los ácidos nucleicos de los fagos X e Y, respectivamente, con
el mayor detalle que permitan los datos. b) Propón una explicación breve al hecho de 
que la desoxirribonucleasa 2 no actúe sobre el ácido nucleico Y. 

4) La empresa Promega distribuye el vector plasmídico pGEM­T Easy linearizado 
(figura), con el propósito de que facilite la clonación de productos de PCR con una A 
protuberante en sus extremos 3’. a) Indica qué tipo de enzimas y qué actividad 
enzimática son responsables de la presencia de estas colas A en 3’. b) Indica si los 
productos de PCR tienen un grupo hidroxilo o fosfato en 3’ y en 5’, respectivamente. c) 
¿Qué son y qué función tienen los elementos  T7 y SP6 situados en los extremos del 
sitio de multiclonación? d) ¿Qué función tiene el gen Ampr? e) ¿Y el gen Lac­Z?

5) El ADN obtenido en una minipreparación
realizada a partir de un clon transformante
seleccionado en un experimento en el que se
usó el vector pGEM­T Easy de Promega,
mostró una A260 de 0,8. a) Indica la
concentración de esta muestra de ADN.
Este plásmido recombinante fue sometido a
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%,
con los resultados que se muestran en la
figura. b) Explica a qué corresponde cada una
de las bandas de la calle 2. El ADN de la

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minipreparación se alicuotó y fue sometido a digestiones independientes con las 
endonucleasas de restricción SphI y BstZI. c) Empleando la información que se 
proporciona en la figura del problema 4, justifica las diferencias entre los productos de 
estas dos digestiones, que se manifiestan en las calles 3 y 4 del gel. d) Indica la 
longitud, en pares de bases, del fragmento de restricción más grande de los que aparecen
en la calle 4 del gel de la Figura.

6) La corea de Huntington es un proceso neurodegenerativo letal que presenta herencia 
monogénica. Dado que los síntomas característicos de la enfermedad se manifiestan 
usualmente en la tercera, cuarta o quinta década de vida, muchos de los afectados 
mueren después de haber dejado descendencia y de haber podido transmitir, en 
consecuencia, el alelo causante de la enfermedad. El diagnóstico de la enfermedad 
previo a la aparición de sus síntomas no fue posible hasta la década de los ochenta, 
cuando un grupo de investigadores efectuó una búsqueda de clones de ADN genómico 
humano que, utilizados como sondas, revelaron polimorfismos en la longitud de 
fragmentos de restricción (RFLP) ligados al gen de la corea de Huntington. De uno de 
tales clones, denominado G8, pudo obtenerse una sonda que hibrida con una región del 
genoma humano en la que se han detectado cuatro patrones de restricción diferentes 
para la enzima HindIII. La región homóloga a la sonda G8 y los patrones de restricción 
mediante HindIII de cada una de sus cuatro variantes polimórficas presentes en la 
población son los representados en esta figura.

Varias muestras de ADN genómico de diferentes individuos fueron (1) digeridas 
con HindIII, (2) sometidas a electroforesis en geles de agarosa, (3) transferidas a 
papel de nitrocelulosa, e (4) hibridadas con la sonda G8 marcada radiactivamente. 
a) Dibuja las bandas que se visualizarán mediante autorradiografía en individuos con los
genotipos AA, BB, AB, AC y AD. Dos diferentes familias, una venezolana y la otra
estadounidense, en las que la corea de Huntington ha aparecido en varias generaciones
sucesivas, fueron estudiadas para establecer la eventual cosegregación de cada uno de
los cuatro RFLP antes descritos y el alelo causante de la enfermedad. Los resultados se
muestran en la siguiente figura. Los símbolos de color negro destacan a los enfermos de
la corea de Huntington, y las barras diagonales indican muertes anteriores al comienzo
del estudio. 

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Debajo de cada individuo se muestra, en los casos en que fue posible, su genotipo, 
deducido de la autorradiografía obtenida tras hibridar con la sonda G8 su ADN, 
previamente digerido con HindIII. b) ¿Existe ligamiento en la familia venezolana entre 
el alelo causante de la enfermedad y alguno de los cuatro RFLP? c) Si la respuesta es 
afirmativa, indica qué alelo (A, B, C o D) está ligado. d) Respeonde de igual modo con 
respecto a la familia estadounidense. e) ¿Existe alguna excepción a tus respuestas en los
cuatro apartados anteriores? f) Explica sucintamente, en su caso, una hipótesis que lo 
justifique. 

7) La fibrosis quística es una enfermedad autosómica
recesiva, que reduce la esperanza de vida de quienes la
padecen a seis meses en los países más pobres y a unos
35 años en los más ricos. La figura muestra los mapas
de las dianas de EcoRI (R) en los alelos silvestre y
mutante del gen de la fibrosis quística. Se obtuvieron
muestras de ADN de un feto (F) y sus padres (M y P),
que fueron sometidas a una electroforesis en gel de
agarosa seguida de una transferencia a membrana por
el método de Southern. La membrana fue hibridada
con una sonda FQ marcada radiactivamente,
obteniéndose la autorradiografía de la figura. a)
¿Padecerá el feto la enfermedad? b) Justifica tu
respuesta. 

8) Una variante poco común de la enfermedad de Parkinson está asociada a una 
mutación puntual G­>A en una diana de Tsp45I [5’­GT(C/G)AC­3’] en el cuarto exón 
del gen de la alfa­sinucleína 
humana. Se dispone de cebadores (al1 y al2) para la amplificación por PCR de la 
totalidad de dicho exón. En el producto de la amplificación del alelo silvestre del gen de
la aalfa­sinucleína, que tiene 200 pb, la diana de Tsp45I dista 40 pb de uno de los 
extremos de la molécula. a) Describe sucintamente los pasos de un experimento 
diseñado para comprobar si una persona que padece la enfermedad de Parkinson es 
portadora de la mutación en el gen de la aalfa­sinucleína descrita en el párrafo anterior, 
haciendo uso de los cebadores al1 y al2. b) Indica qué resultados obtendrías aplicando 
el método que has descrito a los individuos homocigóticos para el alelo silvestre, los 
homocigóticos para el alelo mutante y los heterocigóticos. c) ¿Cómo averiguarías si se 
transcribe el alelo mutante en un tejido concreto de un individuo heterocigótico?

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9) La huella molecular (genetic fingerprint) tiene
entre otros usos el de intentar identificar niños
robados, con el propósito de devolverlos a sus
padres biológicos. Éste fue el caso de Sarah Sting,
que fue vista por última vez en el aparcamiento
de un supermercado de Bon Temps (Luisiana)
cuando tenía 4 años. Doce años después, se acusó
del secuestro de Sarah a Eric y Kristin Neman,
que vivían con Betty, su supuesta hija de 16 años,
en Pasadena (California). Se tomaron muestras de
ADN del padre (PS) y la madre (MS) de Sarah
Sting, así como de Betty (BN), Eric (EN) y
Kristin (KN) Neman, y se obtuvieron sus huellas moleculares empleando una sonda 
multilocus para una familia de VNTR, con los resultados que muestra la figura. a) 
Indica si la autorradiografía permite afirmar que Betty no es hija de Eric y Kristin 
Neman y justifícalo. b) Indica también si la autorradiografía permite concluir que Betty 
Neman es Sarah Sting con mucha probabilidad o con total certeza, y justifícalo . 

10) Varias de las polimerasas termoestables de uso
común en Ingeniería Genética rinden productos de
amplificación por PCR con extremos romos. La
polimerasa Taq, sin embargo, presenta actividad
desoxinucleotidil transferasa terminal y rinde
productos de amplificación con una A protuberante
en 3’. El vector pCR­Blunt II­TOPO (figura) fué
diseñado por Invitrogen para facilitar la clonación de
productos de PCR con extremos romos. Se
suministra linearizado, con una molécula de la
Topoisomerasa I del virus Vaccinia unida
covalentemente a cada uno de sus dos extremos 3’. 
a) ¿Es pCR­Blunt II­TOPO un vector lanzadera? b)
Interpreta el mapa del vector pCR­Blunt II­TOPO,
explicando sucintamente la función de las secuencias
Plac, lacZ, MCS, Kanamycin, Zeocin y pUC ori. c) Explica el uso del gen ccdB en este 
vector. Los oligonucleótidos sintetizados por el método de la fosforamidita presentan un
grupo hidroxilo en su extremo 5’. Pueden ser fosforilados empleando para ello una 
polinucleótido quinasa, modificación que los encarece en un 300%. Explica por qué 
Invitrogen recomienda expresamente que no se fosforilen los oligonucleótidos que 
servirán de cebadores en las amplificaciones en las que se pretende obtener productos 
de PCR con extremos romos para su clonación con pCR­Blunt II­TOPO.

11) Se ha cortado con PstI un plásmido bacteriano circular que contiene un gen de resistencia a la 
ampicilina. Tras la electroforesis se observa una banda de 30 Kb. ¿Qué deducirías de los resultados 
que se plantean a continuación?
a) Con EcoRI, el plásmido se corta en dos fragmentos: uno de 21.5 Kb y otro de 8.5 Kb
b) La digestión PstI+EcoRI genera tres fragmentos de: 11 Kb, 10.5 Kb y 8.5 Kb
c) El ADN del plásmido cortado con PstI se ha mezclado y ligado con fragmentos de ADN cortados
con PstI. Todos los clones recombinantes son resistentes a la ampicilina.
d) Tras cortar uno de los clones recombinantes con PstI se obtienen dos fragmentos: 30 Kb y 6 Kb.

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e) El clon anterior se corta con EcoRI y se obtienen 14 Kb, 13.5 Kb y 8.5 Kb.

12)  Se conoce un gen autosómico con tres alelos Pa, Pb y p que se diferencian en una diana para la 
enzima de restricción EcoRI (↓ sitio de corte):   

                        Pa                                                   Pb                                                        p

Diseñar un experimento para diferenciar los genotipos de los diferentes individuos que pudieren 
existir en una población si utilizamos como sonda el fragmento homólogo de ADN señalado en el 
esquema. ¿Qué resultados daría cada genotipo?

13) Se extrae ADN genómico de los miembros de una familia en la que existen afectados para una 
enfermedad autosómica dominante. Se digiere con PvuII y los fragmentos se separan en gel. Tras 
hibridación tipo Southern­blot con una sonda que detecta un RFLP se obtienen los resultados de la 
figura. ¿Está ligado el RFLP al gen causante de la enferemedad? Explicar la respuesta.

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PRÁCTICAS DE
LABORATORIO

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Subclonación de un frgamento de ADN

1. OBJETIVO
El objetivo que se persigue al realizar una subclonación es pasar un fragmento de
ADN, previamente insertado en un vector de clonación, a otro distinto que contenga
herramientas moleculares distintas del primero.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO
La clonación de fragmentos de ADN, que consitutyó uno de los primeros hitos de la
Ingeniería Genética, fue posible gracias a la utilización de los enzimas de restricción,
que permiten cortar el ADN en puntos definidos en los que encuentran las dianas
específicas de dichos enzimas. Así, dos fragmentos de ADN de distinto origen pueden
ser fácilmente unidos entre sí siempre que hayan sido cortados con el mismo enzima
de restricción. De esta forma, si una de esos fragmentos es un vector de clonación (un
plásmido, por ejemplo) y el otro es el que deseamos clonar, podremos insertar este
último en el vector. Ya sólo tendríamos que transformar bacterias competentes con
esta molécula recombinante para llevar a cabo la clonación.

Una vez clonado un fragmento de ADN, nos puede interesar traspasarlo a otro vector
distinto que permita, por ejemplo, clonarlo en otro microorganismo o transcribir
cualquiera de las dos hebras del inserto (vector de expresión). En esos casos se
realiza un proceso de subclonación, que es el objeto de esta práctica (ver figura).

Se denomina vector donante al que contiene originalmente el inserto y vector receptor

al que lo contendrá una vez realizada la subclonación. Tal como se observa en la
figura, en este ejemplo se utilizaron los enzimas EcoRI y NotI para insertar el
fragmento de ADN en el sitio de multiclonación (MCS) del vector donante. Por tanto,
podemos utilizar esos mismos enzimas para escindirlo de nuevo, realizando una
digestión doble. Terminada la digestión, el fragmento clonado y el inserto pueden ser
separados mediante electroforesis y podemos purificar el ADN de este último
recortando el taquito de gel que contiene la banda correspondiente y sometiendolo a
un proceso de extracción de ADN específico. Una vez purificado el inserto, podemos

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mezclarlo con el vector receptor previamente digerido también con EcoRI y NotI. Los
extremos cohesivos propocionados por el corte de estos enzimas nos permitirán
insertar el fragmento de nuevo en la orientación deseada en el vector receptor. A
continuación utilizaríamos ligasa para unir covalentemente los extremos de las hebras
de ADN de vector e inserto. Ya sólo nos quedaría transformar bacterias competentes
con este nuevo vector recombinante, con lo que habremos concluído el proceso de
subclonación.

3. METODOLOGÍA
Digesión del plásmido donante recombinante

En un microtubo Eppendorf, añadir los siguientes reactivos en el orden indicado para

conseguir un volumen de reacción final de 10μl:

 Agua estéril 7,6 μl

 ADN plasmídico recomb. 1,0 μl (a una concentración de 1μg/μl)
 Enzima EcoRI HF 0,2 μl
 Enzima NotI HF 0,2 μl
 Buffer de restricción 1,0 μl

A continuación se colocan los microtubos en un termomixer y se incuba a 37ºC

durante unos 15-20 min. Los modernos enzimas High Fidélity (HF) permiten tiempos
de incubación muy inferiores a los tradicionales sin pérdida en su eficiencia de corte.
Pasar las muestras brevemente por el frigorífico para que se enfrien antes de realizar
la electroforesis.

Electroforesis

En un gel de agarosa al 1,5% y con cuidado de no romper los pocillos, cargar las
diferentes digestiones correspondientes a cada uno de los grupos de trabajo. Para
ello, añadir 5 μl de tampón de carga a los tubos en los que se realizó la digestión y,
una vez mezclado con el ADN, con la ayuda de una micropipeta, cargar la mezcla en
un pocillo del gel (una muestra por pocillo). Cargar en otro pocillo 4 μl de la mezcla ya
preparada de marcador de peso molecular, que nos servirá de referencia para
determinar el tamaño de los fragmentos del vector y del inserto. Conectar la fuente de
alimentación al gel durante 30 minutos a 50V. Analizar los resultados mediante la
observación en un transiluminador.

Extracción del ADN de la banda correspondiente al inserto

Una vez terminada la electroforesis e identificada en el transiluminador la banda

correspondiente al inserto, procederemos a purificar el ADN de la misma realizando el
siguiente protocolo:

 En el transiluminador y utilizando un escalpelo, recortamos un pequeño taco de

gel que contenga exástamente la banda (no incluir un exceso de gel de
agarosa), con cuidado de no dañar el filtro del transiluminador.
 Retiraremos al taquito de gel con la banda del inserto y lo colocaremos en un
tubo Eppendorf con el que previamente habremos tarado una balanza de
precisión.
 Pesamos el tubo con el gel para calcular su volumen (el número de microlitros
será aproximadamente igual al de miligramos de gel).
 Añadimos un volumen de tampón QG igual al triple del volumen de gel
calculado.

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 Incubar a 50ºC durante 10 min. O hasta que el gel se haya disuelto por
completo. Mezclar en el vortex cada 2-3 min. para ayudar a la disolución del
gel)
 Una vez disuelto el gel, comprobar que el color de la solución continúa siendo
amarillo, lo que indica que el pH permanece por debajo de 7,5 (a pH superior el
ADN no se adherirá a la membrada silícea de la columna que utilizaremos en el
paso siguiente). Si la solución se ha tornado naranja o violeta, añadir 10μl de
solución 3M de acetato sódico a pH=5.
 Añadir un volumen de isopropanol igual al volumen del gel y mezclar invirtiendo
el tubo varias veces.
 Pasar la solución a una columna QG con filtro sílíceo colocada sobre un tubo
de recogida de 2ml y centrifugarla durante 1 min. A 10.000 rpm. o más.
 Descartar el líquido que ha pasado al tubo inferior y poner la columna de nuevo
en él.
 Añadir 500μl de tampón QG y volver a centrifugar como antes.
 Descartar el líquido que ha pasado al tubo inferior y poner la columna de nuevo
en él.
 Para lavar, añadir 750μl de tampón PE y volver a centrifugar de igual forma.
 Descartar el líquido que ha pasado al tubo inferior y poner la columna de nuevo
en él.
 Volver a centrifugar en seco y de igual manera.
 Colocar la columna en un tubo Eppendorf nuevo y añadir 10μl de agua estéril
para eluir el ADN.
 Centrifugar de nuevo. La solución de ADN estará contenida en el tubo inferior.

Esta solución de ADN del inserto así obtenida se puede utilizar para ser insertada de
nuevo en el vector receptor de nuestra elección, utilizando el procedimiento seguido en
la práctica de clonado realizada el curso anterior en la asignatura de Genética.

4. CUESTIONES
1.- Indique un ejemplo en el que puede interesarnos llevar a cabo la subclonación de
un fragmento de ADN.

2.- Para realizar la subclnación, ¿es absolutamente imprescindible usar exáctamente

los dos enzimas de restricción utilizados en la clonación original?

3.- ¿En que casos se puede incubar la reacción de digestión durante un tiempo corto
(15 min. por ejemplo)?

4.- Durante el protocolo de extracción del ADN de la banda correspondiente al inserto,

¿como podemos saber que el tampón QG no ha variado su pH?

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Genotipado de ratones mutantes

condicionales

1. OBJETIVO

El objetivo que se persigue al realizar un genotipado de ratones mutantes

condicionales es identificar qué ratones poseen en su genoma la mutación condicional
y cuáles no, para poder así realizar posteriormente los cruces pertinentes que nos
permitan obtener el genotipo deseado.

2. INTRODUCCIÓN

Una de las estrategias más usadas en Genética para estudiar la función de los genes
es la de generar organismos en los que existe una pérdida de la función del gen. En
organismos modelo como la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, el gusano,
Caenorhabditis elegans, o el ratón, Mus musculus, las herramientas actuales de
ingeniería genética nos permiten generar organismos mutantes con cierta facilidad. En
ratón, tradicionalmente se ha usado la recombinación homóloga para eliminar el marco
de lectura abierta, o una parte de él, de un gen concreto. Con esta tecnología se
produce la pérdida de función del gen de interés en todo el organismo, lo que puede
ser un problema para estudiar la función de un gen en determinados casos. Por
ejemplo, cuando los genes son pleiotrópicos, es decir, cuando tienen funciones
diferentes en tejidos diferentes. Así, si un organismo mutante para un gen pleiotrópico
muere durante el desarrollo embrionario temprano, debido que es necesario para el
correcto desarrollo de un órgano esencial, no se podría estudiar la función del gen en
otros órganos que se desarrollasen en un momento posterior a su muerte, o la función
que pudiera tener en el órgano adulto. Para solventar estas situaciones, hoy día
existen diversas estrategias en ingeniería genética que nos permiten estudiar la
función de un gen en un tejido concreto y en un momento determinado. Una de esta
estas estrategias consiste en generar un ratón mutante condicional. Este sistema usa
la recombinasa Cre del fago P1 que, cuando está presente en el núcleo celular,
reconoce dos secuencias bien definidas y conocidas como LoxP y elimina el fragmento
de ADN que hay entre ambas (ver figura).

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 Departamento de Genética, Universidad de Granada

Teniedo en cuenta esto, podemos generar por un lado ratones en los que nuestro gen
de interés, o parte de él, esté flanqueado por secuencias LoxP, lo que se conoce como
mutante condicional y por otro lado ratones transgénicos en los que la expresión de la
recombinasa Cre esté bajo el control de un promotor específico de tejido. Al cruzar
ambos ratones eliminamos el gen solo en los tejidos donde se exprese la proteína Cre,
es decir, en aquellos donde se expresaría el gen del que se ha obtenido el promotor,
pero no se expresaría en el resto del cuerpo (ver figura).

Una vez generado un ratón mutante condicional, tenemos que distinguirlos de los
ratones salvajes. Para ello se suelen emplear técnicas de genética molecular que nos
permitan “genotipar” los ratones mutantes, es decir, distinguir qué ratones portan los
alelos condicionles, y en caso positivo, si lo hacen en heterocigosis u homocigosis. En
esta práctica vamos a genotipar ratones mutantes condicionales para el gen Sox9
mediante el uso de la PCR. El gen Sox9 posee tres exones y dos intrones (ver figura).
Los ratones mutantes condicionales para Sox9 que vamos a usar tienen flanqueados
el segundo y el tercer exón por dos sitios LoxP (triángulos blancos). Para distinguir los
ratones mutantes de los salvajes, se han diseñado dos primers, F2 y R, que están
flanqueando el segundo sitio LoxP. El ratón salvaje no tiene sitio LoxP, por lo tanto, el
tamaño de la banda amplificada en los ratones salvajes será menor que en los ratones
mutantes.

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Esto nos permitirá saber si un ratón es homocigoto para el alelo mutante condicional
(un banda de mayor tamaño), heterocigoto (dos bandas) u homocigoto salvaje (una
banda de menor tamaño; ver figura).

3. METODOLOGÍA
Para llevar a cabo el genotipado vamos a seguir los siguientes pasos:

Extracción de ADN a partir de colas de ratón

Para el genotipado, se le proporcionará a alumno un tubo eppendorf conteniendo un

trozo de cola de ratón, y seguiremos el siguiente protocolo:

 En un tubo Eppendorf, añadir 100 μl tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8.0,

100 mM EDTA pH 8.0, 100 mM NaCl 1% SDS, Proteínasa K 0.5 mg/ml)
 Incubar a 55ºC en un “termomixer” con agitación hasta el día siguiente
 Centrifugar y pasar el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo
 Añadir un volumen de isopropanol (100 ul aproximadamente) y mezclar por
inversión 10 veces
 Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min.
 Descartar el sobrenadante y añadir 300 μl de 70% EtOH.
 Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 min.
 Descartar el sobrenadante y dejar secar el tubo Eppendorf abierto e invertido
durante 10 min
 Añadir 50μl de H20 esteril y calentar en el termomixer durante 5 min.
 Medir la concentración de ADN en el espectrofotómetro.

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PCR de genotipado

En un tubo de PCR se añadirán los siguientes reactivos:

 5.5 μl H20
 1,0 μl ADN (50 ng)
 1,0 μl Tampón de reacción 10x
 1,0 μl Primer F2 (5 μM)
 1,0 μl Primer R (5 μM)
 0.5 μl Taq-Polimerasa

Se colocarán los tubos en el termociclador con el siguiente programa:

 94º C 1 min
 94º C 30 seg
 57º C 30 seg
 72º C 30 seg
 40 ciclos
 72º C 3 min

Observación de los resultados

Tras la PCR, añadiremos 2 μl de tampón de carga a cada uno de los tubos de reacción
y cargaremos 10 μl en un pocillo de un gel de agarosa. Se aplicará un voltaje de 100
voltios y trancurrido el tiempo necesario observaremos los resultados en un
transiluminador.

4. CUESTIONES
1.- ¿Qué es un ratón mutante condicional?

2.-¿Cómo podemos generar ratón un mutante para un gen que sea específico de
tejido?

3.- Cuando genotipamos ratones mutantes condicionales para Sox9 mediante PCR,
¿por qué los individuos heterocigótios muestran 2 bandas?

4.- Imagine el por qué de usar un trocito de la cola del ratón para genotiparlo.

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