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Determinación Espectrofotométrica de la Constante de Michaelis-Menten

Calispa Christian; Calderón Gabriel2; Salgado Mario Paulo3; Sisalema Jessica4



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Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Química y Agroindustria, Quito, Ecuador

Resumen: En el presente documento se informan de los resultados alcanzados en la determinación


espectrofotométrica de la constante de Michaelis-Menten y la velocidad máxima inicial, por medio de la reacción de
proteólisis de un sustrato específico. Para lo cual se utilizó la cinética enzimática, la misma que estudia la velocidad
de las reacciones cuando presentan enzimas como catalizadores. El modelo cinético enzimático de Michalis-Menten
está basado en la formación del complejo enzima-sustrato, con lo cual se explica la relación entre la velocidad inicial
y la concentración inicial del sustrato. Se prepararon soluciones de BApNA de diferentes concentraciones y una
solución de la enzima con una concentración especifica. Se realizó un blanco y luego, se colocó la alícuota de la
solución tampón, de sustrato y de enzima en la celda, y se colocó en el espectrofotómetro para medir la absorbancia.
Se obtuvo como resultado que gracias a que el sustrato BApNA se hidroliza formando un complejo coloreado que se
puede medir en un espectrofotómetro, sin el catalizador enzimático la absorbancia del sustrato permaneció constante
mientras que el aumentar el catalizador enzimático la absorbancia aumentó linealmente con respecto al tiempo.
Finalmente se comprobó que una enzima proteolítica permite aumentar la reacción de degradación de una proteína,
y la reacción de proteólisis estudiada en la experimentación no se ajustaba al modelo lineal propuesto por Lineweaver-
Burk debido a que la reacción no presenta un comportamiento Michaeliano con un valor R2 de 0,203 y con una
pendiente negativa.
Palabras clave: Catalizador enzimático, Constante de Michelis-Menten, Enzima proteolítica, D

1 1. INTRODUCCIÓN se podía explicar la relación entre la velocidad inicial y la


concentración inicial de sustrato, a través de la idea de que las
La cinética enzimática estudia la velocidad de reacciones en reacciones se desarrollaban en dos etapas: una etapa de
las cuales intervienen enzimas como catalizadores, de esta formación del complejo enzima-sustrato (ES), y la segunda en
manera se puede determinar los mecanismos de reacción y la la cual el complejo libera la enzima y el producto, como se
especifidad de las enzimas. La velocidad de estas reacciones indica en la ecuación 1. (Delgado, 2015).
se puede medir de manera sencilla tanto con la aparición de
productos o la desaparición de los reactivos, sin embargo,
existen muchos factores que afectan a dicha velocidad como: [1]
el pH, la temperatura, presencia de cofactores, concentraciones La ecuación 1 se conoce como la ecuación cinética de
de enzima y sustrato. (González, 2007). Michaelis-Menten, en donde 𝑘2 [𝐸]0 es la velocidad máxima
Al medir la concentración de los reactivos o productos en una 𝑘−1 +𝑘2
(𝑟𝑚á𝑥 ), y se conoce como la constante de Michaelis-
reacción enzimática se obtiene la curva de avance de reacción. 𝑘1
En la figura 1 se puede observar una cinética de reacción en Menten (𝐾𝑀 ). (Izquierdo et al, 2004, p. 272).
donde la velocidad con la cual aparece el producto va
disminuyendo debido a que con el paso del tiempo el sustrato 𝑘 [𝐸] [𝑆]
𝑟2 = 𝑘−12 +𝑘20 [2]
se consume. No obstante, este problema se puede evitar al +[𝑆]
𝑘1
considerar la velocidad inicial v0, la cual se obtiene de la En la figura 2 se puede observar una forma de linealizar la
pendiente de a tiempos cercanos a cero, ya que en estas ecuación cinética de Michaelis-Menten propuesta por
condiciones la concentración del sustrato se puede considerar Lineweaver-Burk en donde se grafica el inverso de la
constante. (Halvor y Graham, 1980, p. 5). velocidad inicial versus el inverso de la concentración de
sustrato, y de la cual se puede obtener los valores de la
velocidad máxima y la constante 𝐾𝑀 . (Peña et al, 2004, p. 198).

Figura 1. Avance de la reacción enzimática. (González,


2007).
Para explicar el comportamiento cinético de las enzimas, Figura 2. Representación de Lineweaver-Burk. . (González,
Michaelis y Menten, en 1913, desarrollaron una teoría basada 2007).
en el concepto del complejo enzima-sustrato. Con esta teoría

christian.calispa@epn.edu.ec, gabriel.calderon@epn.edu.ec,
mario.salgado@epn.edu.ec, jessica.sisalema@epn.edu.ec
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2. METODOLOGÍA Al agregar la enzima la hidrólisis empezó a formar el producto


coloreado. Se debe tener en cuenta que únicamente se
Se preparó soluciones de BApNA de 3, 5, y 8 11 mg/mL y la utilizaron los datos que seguían una tendencia lineal ya que a
solución de la enzima con una concentración de 5 mg/mL. En tiempos mayores a un límite dado para cada concentración, la
un espectrofotómetro UV-visible HITACHI U-1900 se midió absorbancia se mantuvo constante. Mediante regresión lineal
la absorbancia del blanco, para lo cual se colocó 1000 μL de se obtuvo la ecuación de ajuste óptimo. La pendiente de esta
solución tampón y 200 μL del sustrato en la celda. Luego, se recta corresponde a la velocidad inicial de la reacción de
colocó 900 μL de tampón, 200 μL de sustrato y 100 μL de proteólisis tal como lo menciona Muller (2004).
enzima en la celda, y se colocó en el espectrofotómetro para
Con los datos de velocidad inicial se calculó la actividad
medir la absorbancia. Para ambos procesos se tomó el valor de
proteolítica de las muestras. Este valor y la concentración de
absorbancia cada 15 segundos hasta completar 3 minutos.
sustrato se utilizaron para realizar la gráfica de la ecuación
Todo el proceso anterior se repitió para las distintas
linealizada de Michaelis y Menten por el método Lineweaver
concentraciones de sustrato BApNA.
– Burk la misma que se presenta en la figura 5.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1200
1000
La proteólisis es un proceso por el cual una proteína se degrada
para producir aminoácidos. Esta biodegradación es importante 800
y = -223.27x + 786.95

1/AB
dentro de los seres vivos pues permite mantener un equilibrio 600
R² = 0.203
entre la producción y eliminación de proteínas dentro de una 400
célula. Para agilitar este proceso existen enzimas denominadas
proteasas que reducen la energía de activación necesaria para 200
romper el enlace peptídico de la proteína (Rodríguez J, 2000, 0
p. 4). BAPNA es un sustrato sintético que se degrada por 0 1 2 3
1/[S]
enzimas proteolíticas (especialmente con la tripsina) como se
muestran en la figura 3. Figura 5. Ecuación linealizada de Michaelis y Menten
La figura 3 muestra que la reacción de proteólisis estudiada no
sigue un comportamiento Michaeliano. Esto se puede observar
debido al bajo coeficiente de correlación lineal (R2) y en el
hecho de que la pendiente obtenida debería ser positiva ya que
es una relación entre KM y VMax, valores que nunca pueden ser
Figura 3. Degradación de BAPNA (Sigma, 2006, p. 1)
menores a cero (Teijón y Garrido, p.72, 2008). Este error pudo
Para la experimentación se utilizó un blanco que contenía ocurrir al momento de la toma de datos pues tal como lo
únicamente el sustrato y otro que contenía el sustrato y la mencionan Chow y Peticolas (1948), al trabajar con enzimas
enzima. Los resultados obtenidos para la absorbancia en proteolíticas se ha observado que a mayor cantidad de sustrato
función del tiempo para la muestra de 3[mg/L] se detallan en la actividad enzimática es mayor, algo que no ocurrió en la
la figura 4. presente experimentación. Se deberían realizar más pruebas
con diferentes concentraciones para reconocer al dato atípico
que causó esta incongruencia.

4. CONCLUSIONES

Se comprobó que una enzima proteolítica permite aumentar la


reacción de degradación de una proteína. Esto sucede sin
importar la cantidad de sustrato y enzima presente en el
sistema.
No se pudo obtener los valores de las constantes de la ecuación
de Michaelis y Menten ya que la reacción de proteólisis
Figura 4. Absorbancia vs tiempo para 3 [mg/L] de BApNA estudiada en la experimentación no se ajustaba al modelo
lineal propuesto por Lineweaver – Burk. El error pudo surgir
El sustrato BApNA se hidroliza formando un complejo en la toma de datos pues a mayor concentración de sustrato la
coloreado que se puede medir en un espectrofotómetro a una actividad enzimática debería haber sido mayor cosa que no
longitud de onda de 400 nm. Como se puede observar en la sucedió.
figura 2, sin actividad enzimática la absorbancia del sustrato
permaneció constante mientras que al agregar 3[mg/L] de
enzima la absorbancia aumentó linealmente con respecto al
tiempo. Este comportamiento fue similar para la absorbancia
con concentraciones de BApNA de 8 [mg/L] y 11 [mg/L].
Esto muestra que sin la enzima la proteólisis no se llevó a cabo.
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REFERENCIAS

Chow y Peticolas. 1948. A rapid method for the determination


of proteolytic activities of enzyme preparations.
Recuperado de https://goo.gl/HiuknM Diciembre,
2017)
Delgado, F. (2015). Cinética Enzimática. Recuperado de:
https://goo.gl/zXvD8j (Diciembre, 2017).
Gonzalez, J. (2007). Cinética enzimática. Recuperado de:
https://goo.gl/Fg68ST (Diciembre, 2017).
Halvor y Graham. (1980). Cinética Enzimática. Barcelona,
España: Reverte.
Izquierdo, Cunill, Tejero, Iborra y Fité. (2004). Cinética de las
reacciones químicas. (1ra. ed.). Barcelona, España:
Universitat de Barcelona.
Muller W. 2004. Bioquímica. Fundamentos para medicina y
ciencias de la vida. Recuperado de
https://goo.gl/EvxS5h (Diciembre, 2017)
Peña, Arroyo, Gómez, Tapia y Gómez. (2004). Bioquímica.
(2da. ed.). México D.F., México: Limusa.
Rodríguez J. 2000. Proteólisis celular: intercambio proteico.
Recuperado de https://goo.gl/FbfVFK (Diciembre,
2017)
Sigma. 2006. Nα-Benzoyl-D,L-arginine 4-nitroanilide
hydrochloride. Recuperado de https://goo.gl/Qucqgn
(Diciembre, 2017)
Teijón y Garrido. 2008. Bioquímica estructural. Recuperado
de https://goo.gl/am2Gmg (Diciembre, 2017)