APÉNDICE A

A.1. CARACTERIZACIÓN DEL AGAVE TEQUILANA WEBER.

A.1.1. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD.

Procedimiento:

1. Poner a peso constante una cápsula de porcelana (2 horas a 105°C) enfriar en un

desecador y pesar.
2. En una cápsula tarada pesar 5 g de muestra llevarlos al horno eléctrico por un
tiempo de 2 a 4 horas a 105°C. Tener cuidado de no quemar la muestra. Enfriar
en un desecador y pesar.

Cálculos:

(𝑃2 − 𝑃1 )
% 𝑑𝑒 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 =
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

donde: P1 = peso de la cápsula

P2 = peso de la cápsula + muestra seca

(𝑃2 − 𝑃1 )
% 𝑑𝑒 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

donde: P1 = peso de la cápsula + muestra seca

P2 = peso de la cápsula + muestra húmeda

P2 = peso de la cápsula + cenizas

A.1.3. DETERMINACIÓN DE GRASAS

Reactivos:

1. Ácido clorhídrico concentrado

2. Éter etílico

Procedimiento:
 1. En un vaso de precipitado de 600 ml se colocan 5 g de muestra, 100 ml de agua
destilada y 60 ml de reactivo 1.
2. Agitar con una varilla de vidrio, añadir unos trozos de piedra pómez y calentar
con llama débil hasta ebullición y agitando de vez en cuando, cubrir con un vidrio
de reloj y mantener el conjunto hirviendo durante 45 min.
3. Lavar con agua caliente el vidrio de reloj y filtrar a través de un filtro con pliegues
humedecido, lavar cuidadosamente con agua caliente y secar completamente en
una estufa a 105°C durante 2 horas.
4. Extraer ahora en Soxhlet según el siguiente procedimiento: Colocar el filtro que
contiene el residuo seco en el cartucho de extracción. Extraer con el reactivo 2; si
el matraz Soxhlet es de 250 ml se usan 120 ml de éter, si es de 100 ml se usan 50
ml de éter y si es de 150 ml se usan 75 ml de éter.
5. Por último el extracto es evaporado en baño maría o en plancha caliente. Se pone
a peso constante, se enfría en el desecador y se pesa. El matraz Soxhlet deberá
estar tarado al inicio de la prueba.

Cálculos:

(𝑃2 − 𝑃1 )(100)
% 𝑑𝑒 𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎 =
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

donde: P1 = peso del matraz

P2 = peso del matraz + grasas

NOTA: Es conveniente que del total de solvente agregado, la mitad sea de Éter Etílico y
la otra mitad de Cloroformo, esto con el fin de que el cloroformo que es más pesado
retenga el éter y evite la evaporación de este durante la extracción de las grasas. El tiempo
de extracción varía dependiendo de la velocidad de condensación; así, cuando ésta sea de
5 a 6 gotas/segundo, extracción se considera completa en un tiempo de 4 horas, y cuando
dicha velocidad sea de 3 gotas/segundo puede requerir hasta 16 horas.

A.1.4. DETERMINACIÓN DE FIBRA CRUDA

Reactivos:

1. H2SO4 al 1.25% (P/V)

2. NaOH al 1.25% (P/V)
Procedimiento:

1. Pesar de 3 a 5 g de muestra seca y finamente molida que pase por un tamiz de

mallas de 1mm de separación.
2. Se hierve en un vaso de precipitado con señal de enrase 200 ml con 50 ml de ácido
(1). La ebullición debe durar exactamente 30 min, durante los cuales a medida que
el agua se evapora se añade una cantidad equivalente a la evaporada; el residuo se
recoge en un papel filtro y se lava con agua caliente hasta que el filtrado no de
reacción ácida.
3. Pasar a un vaso de precipitado y se hierve del mismo modo con 50 ml de solución
neutra y después con Acetona, se pasa a una cápsula de platino o crisol de
porcelana, se deseca durante 30 min a 105°C, se enfría en un desecador, se pesa y
se calcina a 450-525°C (aproximadamente 20 min) para eliminar toda la materia
orgánica.

NOTA: Las proyecciones del líquido que ocurren sobre todo al hervir con la sosa, se
pueden impedir cubriendo el fondo del vaso de precipitado con perlas de vidrio. Tapar
con recipiente con agua a manera de condensador durante la digestión.

Cálculos:

(𝑃𝑟 − 𝑃𝑐 )(100)
% 𝑑𝑒 𝐹𝑖𝑏𝑟𝑎 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑎 =
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

donde: Pr = peso del residuo de la muestra en gramos

Pc = peso del residuo calcinado en gramos

A.1.5. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS (MÉTODO KJENDHAL

MODIFICADO)

Reactivos:

1. Ácido Sulfúrico concentrado

2. Solución de Ácido Sulfúrico 0.5 N
3. Solución de Hidróxido de Sodio 0.5N
 4. Solución indicadora de Wesseslow
5. Mezcla reactiva catalítica de Selenio
6. Zinc en polvo

Solución indicadora de Wesseslow:

Rojo de metilo al 2% en etanol con 0.1% de Azul de metileno en Etanol.

Procedimiento:

1. En un matraz Kjendhal colocar 1 g de muestra y 3 g de mezcla catalítica de

Selenio, añadir 30 ml de reactivo 1.
2. Calentar hasta diluir por completo la materia orgánica, esto se logra cuando la
solución presenta un color verde esmeralda (la ventaja de usar como catalizador
la mezcla de selenio es que el tiempo de digestión se reduce a una tercera parte
del tiempo que se utiliza con otros catalizadores), dejar enfriar y agregar50 ml de
agua destilada lentamente por las paredes del matraz, de 2 a 3 g de reactivo 6 y 15
ml del 2, conectar inmediatamente el aparato de destilación para evitar pérdidas.
3. El destilado se recibe en un matraz Erlenmeyer que contenga 15 ml de reactivo 2,
antes de empezar a destilar se homogeniza la mezcla. Destilar hasta obtener un
volumen de 25 ml. Valorar el exceso de ácido agregando al matraz 3 gotas de
indicador (reactivo 4) y titular con el reactivo 3 hasta ver el cambio de color de
naranja a verde.
4. Hacer un blanco titulando con reactivo 4 una solución de15 ml de reactivo 2 más
25 ml de agua destilada, agregando indicador de Wesseslow.

Cálculos:

(𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑁𝑎𝑂𝐻𝐵𝑐𝑜. − 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑁𝑎𝑂𝐻𝑝𝑟𝑜𝑏. )(𝑁)(𝐹)(100)

% 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 =
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

donde: N = Normalidad de la sosa

F = 0.014 (meq. de nitrógeno)

% 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 = % 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜 ∗ 𝐹1

donde: F1 = Factor de conversión a proteínas (para nuestro caso usaremos un factor de

6.25)
NOTA: En lugar de mezcla reactiva de Selenio se puede usar como catalizador una
mezcla de 0.5 g de Sulfato de Cobre (CuSO4) y 15 g de Sulfato de Potasio (K2SO4) por
gramo de muestra, siguiendo el mismo método.

A.1.6. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Para la determinación de carbohidratos se hace una sumatoria de los porcentajes de las

determinaciones anteriores (desde al apéndice A.1.1 al A.1.5), dependiendo si se quiere
el porcentaje en base seca o base húmeda se le agrega el porcentaje de humedad, por lo
tanto al 100% se le resta esa sumatoria.

% 𝑑𝑒 𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 = 100% − 𝑆𝑢𝑚𝑎𝑡𝑜𝑟𝑖𝑎

A.1.7. FIBRA DETERGENTE ÁCIDO.

Con esta técnica se hace una aproximación del grado de digestibilidad de las fibras en el
material lignocelulósico. La muestra es digerida por medio de Cetil-trimetil-amonio en
ácido sulfúrico y el residuo es considerado como la fibra no digerible.

Tabla A.1.7.1 Reactivos necesarios para la determinación de fibra no digerible.

Compuesto Cantidad
Acido Sulfúrico 56 ml
Cetil-trimetil-amonio 20 g
Antiespumante 2 ml
Acetona 200 ml

Soluciones:

Solución de detergente ácido (1 % p/v).

Agregar lentamente 56 ml de Ácido Sulfúrico concentrado a 1 l de agua, lleve la solución

a un volumen final de 2 l con agua y agregar 20 g de Cetil-trimetil-amonio.

Procedimiento:
 1. Moler la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1 mm.
2. Tomar una submuestra y secarla durante una noche en un horno a 105°C.
3. Enfriar la muestra en un desecador.
4. Pesar 1 g de la muestra seca y colocarla en un matraz Erlenmayer de 500 ml.
5. Adicionar 100 ml de la solución de detergente ácido y 2 ml del antiespumante.
6. Colocar el matraz en la mantilla con el condensador instalado.
7. Llevar rápidamente a ebullición (3 a 5 minutos) y continuar el calentamiento por
2 horas.
8. Filtrar el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente pesado.
9. Enjuagar el matraz con agua destilada caliente y filtrar nuevamente.
10. Enjuagar el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente. Usar vacio.
11. Enjuagar el residuo con acetona y secar.
12. Colocar el crisol en el horno a 105°C durante 12 horas.
13. Enfriar en un desecador la muestra e inmediatamente después pesar.

Cálculos:

Contenido de Fibra (%) = 100 (W2/W1)

Donde:

W1 = Peso de muestra (g).

W2 = Peso del residuo (g).

A.1.8. FIBRA DETERGENTE NEUTRO.

Con esta técnica se puede separar los componentes nutricionales solubles de aquellos que
no son totalmente aprovechables o que dependen de la fermentación biológica para su
aprovechamiento.

Tabla A.1.8.1. Reactivos necesarios para la determinación de fibra detergente neutro.

Compuesto Cantidad
Sulfato lauril sódico 30 mg
EtilenDiamino -tetra acetato disódico dihidrogenado 18.61 g
Borato de Sodio decahidratado 6.81 g
 Fosfato Ácido Disódico anhidro 4.56 g
Amilasa 2g
Etilenglicol 10 ml
Acetona 200 ml

Soluciones:

1. Solución detergente neutra. Agregar a un litro de agua destilada 30 mg de Sulfato

lauril sódico, 18.61 g de EtilenDiamino-tetra acetato disódico dihidrogenado, 6.81
g de Borato de sodio decahidratado y 4.56 g del reactivo Fosfato ácido disódico
anhidro. Agitar hasta disolver y mantener el pH entre 6.9 y 7.1.
2. Amilasa. Disolver 2 g de Amilasa en 90 ml de agua y 10 ml de Etilenglicol.

Procedimiento:

1. Pesar aproximadamente 1 g de muestra molida que pasé por el tamiz de 1 mm y

depositarla en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo.
2. Agregar en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de
amilasa por muestra y calentar para que la solución este en ebullición de 5 a 10
minutos; en el momento de iniciar la ebullición reduzca la temperatura para evitar
la formación de espuma. Ajustar la temperatura para que la solución esté en
ebullición suavemente y mantener en reflujo por 60 minutos.
3. Agitar el matraz para suspender y decantar la muestra en un crisol previamente
pesado y preparado para succión al vacío. Pasar toda la muestra al crisol utilizando
agua caliente (80°C) para el lavado del matraz. Eliminar el vacío, aflojar con
cuidado la capa de muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregar agua
caliente, repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lavar dos veces con acetona
sin remover la muestra del filtro y secar con vacío.
4. Secar los crisoles a 105°C durante 12 h y pesarlos en caliente (esta operación no
debe durar más de 30 seg). Si no se puede pesar de inmediato, enfriar los crisoles
en un desecador.
5. El residuo de fibra recuperado se registra en términos de paredes celulares.
6. Calcular el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100.
Cálculos:

1. Paredes celulares (%) en “base seca” o “como se ofrece”. 100(((peso del crisol +
paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra.
2. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de
paredes celulares.

% contenido celular = 100 - % paredes celulares.

A.1.9. DETERMINACIÓN DE LIGNINA INSOLUBLE.

Esta técnica permite calcular la cantidad de lignina presente en un material

lignocelulósico.

Tabla A.1.9.1. Reactivos necesarios para la determinación de ligninas.

Compuesto Cantidad
Etanol absoluto 1l
Tolueno 427 ml
Acido sulfúrico 665 ml
Hidróxido de sodio Solución estándar.

Soluciones:

Solución. Etanol-tolueno. Mezclar 1 l de etanol absoluto y 427 ml de tolueno.

Acido sulfúrico al 72%. Cuidadosamente verter 665 ml de Acido sulfúrico en 300 ml de

agua, después de enfriar, diluir a 1 l. Estandarizar con solución de NaOH, usando naranja
de metilo como indicador.

Procedimiento.

1. Pesar por duplicado 1 g de muestra en un frasco tarado previamente. Secar en un

horno por 2 horas a 105ºC, sacar y pesar hasta conseguir peso constante.
2. Pesar en los crisoles de extracción 1 g de muestra seca, y ponerlo en un aparato
de extracción Soxhlet. Extraer con alcohol al 95 % por 4 horas. Después realizar
la extracción con la solución Etanol-tolueno.
 3. Remover lo más que se pueda de solvente por succión y lavar con 50 ml de etanol
para remover el Tolueno.
4. Quitar el exceso de Etanol y transferir a un vaso, para digerir con agua caliente
(400 ml) aproximadamente 100 ºC por 3 horas.
5. Filtrar el residuo con agua caliente y finalmente con 50 ml de Etanol.
6. Transferir la muestra restante en un matraz previamente o vaso previamente
tarados y con tapa, y agregar poco a poco 15 ml de Acido sulfúrico frio (72%)
mientras se mantiene en agitación. Dejar en agitación por 2 horas a una
temperatura de 18-20 ºC.
7. Lavar el material en un matraz Erlenmeyer, diluir a 3% la concentración de a acido
agregando 560 ml de agua y hervir por 4 horas manteniendo un volumen
constante.
8. Después de permitir que el material insoluble se precipite, filtrar en un crisol de
filtración, lavar el residuo con 500 ml de agua caliente y secar el crisol con la
muestra por 2 horas a 105 ºC.
9. Pasar el crisol a un desecador y llevar a peso constante. Reportar el peso restante
como lignina.

A.2. HIDRÓLISIS Y FERMENTACIÓN.

A.2.1. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES (A.R. MILLER,

1959).

Los azúcares reductores se calculan por el método de Miller.

Solución DNS. Agregar agua destilada, Acido 3,5dinitrosalicílico (DNS), Hidróxido de

Sodio, agitar muy bien hasta disolver. A esta mezcla se le adiciona Fenol (se licúa en
baño maría a 50°C para poder emplearlo) y Metabisulfito de Sodio.

Tabla A.2.1.1. Reactivos necesarios para realizar la técnica de Miller.

Compuesto Cantidad
Agua destilada (aforo) 500 ml
Hidróxido de Sodio 5g
Ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) 5g
Fenol 1g
 Metabisulfito de Sodio anhidro 0.25 g

Sal de Rochelle. Se prepara pesando 40 g de Tartrato de Sodio y Potasio, calentando un

poco para disolver completamente y una vez que se enfría, se afora con agua destilada a
un volumen de 100 ml.

Procedimiento:

Curva de calibración. Este método tiene un intervalo lineal de 0 a 1 mg de Glucosa por

ml. Se elabora una curva de calibración para la determinación de azucares reductores de
la siguiente manera: se prepara una solución madre de Glucosa de 1 mg/ml y se hacen
disoluciones que van desde 0.1 mg/ml hasta 1 mg/ml.

Se toma 1 ml de cada estándar y se colocan en tubos de ensaye de 20 ml, se agrega 1.5 ml

de reactivo DNS y se mezcla perfectamente. Se ponen en baño maría durante 10 minutos,
después se retiran y se colocan en agua helada durante 5 minutos para detener la reacción,
se agrega 1 ml de sal de Rochelle para fijar el color y una vez que los tubos alcanzan
temperatura ambiente se agregan 2 ml de agua destilada, se agitan con ayuda de un vortex
y se leen en el espectrofotómetro UV-VIS a 575 nm, para el blanco se utiliza agua
destilada. Una vez que se tienen las lecturas de absorbancia de todos los estándares, se
construye una gráfica de concentración contra absorbancia que debe dar por resultado una
línea recta, la cual se muestra en la siguiente figura.

Curva de calibración (AR)

1.2
y = 1.0505x + 0.0757
1 R² = 0.9983
0.8
AR (g/l)

0.6
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Absorbancia

Figura A.2.1.1 Curva de calibración para la determinación de azucares reductores.

Determinación en la muestra. Si las concentraciones de la muestra exceden de 1
mg/ml, realizar las diluciones adecuadas. La muestra no debe presentar biomasa en
suspensión. Hay que filtrar para evitar interferencia al momento de leer en el
espectrofotómetro. Se sigue el mismo procedimiento que el que se realizó con los
estándares.

A.2.2. PROPAGACIÓN DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES C.

Preparación del medio de cultivo (YPDA)

Tabla A.2.2.1. Reactivos para la propagación de la levadura Saccharomyces c.

Compuesto Cantidad
Extracto de levadura 10 g
Peptona 20 g
Glucosa 20 g
Agar bacteriológico 20 g
Agua 1000 ml

Procedimiento:

Dependiendo del volumen que se desea preparar se pesa la cantidad necesaria de Extracto
de levadura, Peptona, Glucosa, y Agar bacteriológico.

1. Calentar agua destilada (aproximadamente la mitad del volumen total) en un

matraz Erlenmeyer y se agregan los reactivos en el siguiente orden: Peptona,
Extracto de levadura, Agar bacteriológico y por último la Glucosa. Se debe agitar
para evitar la formación de grumos. La solución se retira del fuego cuando los
reactivos estén completamente disueltos y por último se afora al volumen deseado.
2. El medio se esteriliza en una autoclave durante 20 min a 15 lb/plg2 y se deja
enfriar, posteriormente cuando esta aproximadamente a 30ºC se vierte en cajas
petri en un lugar estéril (campana de flujo laminar).
3. Propagación de la cepa:

La levadura se siembra en cajas petri que contienen el medio cultivo YPDA y se

incuban por 1 día a 27° C.
A.2.3. MEDIO PARA EL DESARROLLO DEL INOCULO (THATIPAMALA
1992).

Tabla A.2.3.1. Reactivos necesarios para la preparación del medio para el inoculo.

Compuesto Cantidad
Extracto de levadura 10 g
Glucosa 100 g
NH4Cl 2.5 g
Na2HPO4 2.91 g
KH2PO4 3g
MgSO4 0.25 g
CaCl2 0.08 g
Ácido cítrico 4.3 g
Citrato de sodio 3g
Aforo 1000 ml
pH 4.0 – 4.8

Procedimiento:

1. Dependiendo del volumen que se desea preparar se pesan los reactivos, se vierten
en un matraz Erlenmeyer. Se agrega agua destilada y se afora al volumen deseado.
Una vez preparado se esteriliza en la autoclave durante 20 minutos a 15 lb/plg2.
2. Preparación de inoculo:

La preparación del inoculo se realiza en una campana de flujo laminar para asegurar
la esterilidad del lugar de inoculación y evitar contaminaciones.

Con una pipeta estéril se adicionan 10 ml de solución salina estéril ( NaCl al 9 %

p/v) a una caja petri que contiene microorganismo propagado y éste se suspende en
la solución a fin de obtener una suspensión homogénea, esta solución con el
microorganismo en suspensión se vierte a un matraz que contiene medio para el
desarrollo del inoculo y se incuba a 28°C con agitación de 280 rpm durante 16
horas.

A.2.4. SOLUCIÓN DE OLIGOELEMENTOS.

Los siguientes compuestos se utilizan para preparar la solución de oligoelementos que se
adicionan al medio de fermentación como forma de micronutrientes para el desarrollo de
la levadura (1 ml de solución de oligoelementos por l l de medio).

Tabla A.2.4.1. Reactivos para la preparación de la solución de oligoelementos.

Compuesto Cantidad
MnSO4 0.10 g
ZnCl2 0.01 g
Na2MoO4.2H2O 0.05 g
FeCl3 0.01 g
CuSO4 0.01 g
Aforo 100 ml

A.2.5. CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA EN LOS MEDIOS DE CUTLTIVO

CON SACCHAROMYCES CEREVISIAE.

La determinación de biomasa se realiza por la técnica de Peso Seco.

Procedimiento:

1. Enumerar con ayuda de pinzas al menos 50 membranas de 0.22 micras de poro y

47 mm de diámetro, evitando tocarlas con las manos.
2. Colocarlas en cajas petri, y ponerlas en horno a una temperatura aproximada de
90°C durante 4 horas y enfriarlas en un desecador hasta peso constante, cuando
llegan a peso constante se registra el peso de cada membrana Como P1, se debe
mantener las membranas en la caja petri dentro del desecador para evitar
contaminación por polvo.
3. Para filtrar las muestras se usa un matraz Kitasato (vidrio grueso) de 500 ml donde
se pone inicialmente un tubo Eppendorf de 50 ml el cual esta previamente lavado
y estéril.( En este tubo se recibe la muestra filtrada que posteriormente se le hacen
otras determinaciones)
4. Colocar el sistema de microfiltración Millipore colocando una de las membranas,
se conecta el vacio y una vez que se hace pasar la muestra a través de la membrana,
se retira el tubo Eppendorf y se refrigera la muestra, mientras que el residuo de la
 muestra original se vuelve a filtrar en la misma membrana para asegurar que toda
la biosama quede retenida.
5. Cuando se termina el proceso de filtración, se desmonta el sistema Millipore y
con ayuda de una espátula se retira la membrana y se pone sobre una hoja blanca
dentro del horno a 90 ºC durante 6 horas, para llevarlas a peso constante.
6. Cuando las membranas están a peso constante, se registra el peso como P2

Nota: Es necesario cuidar el secado y el pesaje, debido a que el error aumenta

drásticamente al no hacer el mismo procedimiento para todas las membranas, es decir;
horas de secado, temperatura y tiempo en el desecador.

𝑃2 − 𝑃1
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 (𝑔/𝑙) = ∗ 1000
𝑉

donde:

P1 = peso de la membrana sin muestra (g)

P2 = peso de la membrana más la muestra (g)

V = volumen de la muestra utilizada (ml)

A.2.6. CUANTIFICACIÓN DE NITRÓGENO AMONIACAL RESIDUAL

(SOLÓRZANO, 1969, AND PRESLEY, 1971).

El Nitrógeno amoniacal se determina mediante un método colorimétrico por la formación

de un color azul intenso (indofenol), este color se genera por la reacción del Amonio,
Fenol e Hipoclorito.
Preparación de soluciones:

Solución madre de Nitrógeno: Disolver 2.6745 g de Cloruro de Amonio, secar durante

una noche a 100 °C, en un litro de agua destilada (50 mM es la concentración de esta
solución). Preparar estándares de 25, 50, 100, 150 y 250 μM.

Solución A: Pesar 4 g de Fenol y se disuelve en 500 ml de Etanol absoluto.

Solución B: Pesar 0.375 g de Nitroferricianuro de Sodio (Nitroprusido de Sodio) y se

disuelve con 500 ml de agua destilada en un matraz aforado. Almacenar en un envase de
plástico obscuro. Es estable una semana.
Solución C: Pesar 15 g de Citrato de Sodio Tribásico hidratado y 0.8 g de Hidróxido de
Sodio y disolver en un litro de agua destilada en un matraz aforado.

Solución D: Es la solución oxidante, disolver 4 ml de Hipoclorito de Sodio en 100 ml de

la solución alcalina C. Se recomienda prepararla cuando vaya a ser utilizada.

Curva de calibración.

Preparar una solución madre de Cloruro de amonio 5 mM que equivale a 70 mg/l de

Nitrógeno amoniacal. Hacer diluciones a partir de la solución madre para obtener
estándares que vayan de 0.35 hasta 4.2 mg/l de Nitrógeno amoniacal.

Procedimiento para la reacción

1. Tomar 1 ml de cada estándar y colocar en un tubo de ensaye.

2. Agregar 1 ml de la solución A que es una solución de fenol, después se agita en el
vortex.
3. Se toma 1 ml de la solución B, que es una solución de Nitroferricianuro de Sodio.
4. Agregar 2 ml de la solución D y se agitan. Después, esperar 30 minutos para leer
en el espectrofotómetro a 650 nm. Teniendo las lecturas y las concentraciones
correspondientes, se construye una gráfica de concentración contra absorbancia
que debe dar por resultado una línea recta. La curva de calibración resultante es:

4.5 Nitrógeno amonical (mg/l) = 3,6527*(A) - 0,0101

R² = 1
Nitrógeno amoniacal (mg/l)

4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Absorbancia

Figura A.2.6.1. Curva de calibración para la cuantificación de Nitrógeno amoniacal.

Para la determinación de Nitrógeno amoniacal en la muestra se pipetea un determinado

volumen y se afora según la dilución que se necesite, asegurándose que entre en la curva.
La muestra no debe presentar biomasa en suspensión. Hay que filtrar para evitar
interferencia al momento de leer en el espectrofotómetro. Después tomar 1 ml de la
muestra en un tubo de ensaye y se sigue la metodología de los estándares en la curva de
calibración.

A.2.7. DETERMINACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES.

Se utiliza un cromatografo de gases marca Varian, modelo 3800 con

automuestreador (modelo 8200). El detector es de ionización de flama; la columna
empleada fue Alltech Econo-Cap EC-WAX de 30 metros de longitud con 0.53
mm de diámetro interno.

El cromatografo se manipula mediante un sistema de control denominado Star

Chromatografy Workstation versión 6.30. Los gases empleados son: aire, hidrógeno y
nitrógeno como gas acarreador. El inyector se trabaja a 200 °C y el detector a 230 °C. La
columna se opera a 200 °C, empleando una rampa de temperatura para una mejor
separación entre los picos; la temperatura inicial fue de 50°C durante 2 minutos y
hasta 200°C durante 5 minutos a una velocidad de 20°C/min, haciendo un tiempo
total de la corrida de 14.50 minutos.

Las muestras a analizar se deben tratar para eliminar los sólidos suspendidos, se utiliza
una microcentrifuga modelo Micro CL 17 a 13,300 rpm durante 30 minutos; esto
para evitar daños a la columna. El volumen de inyección es de 1 microlitro.

Para conocer la concentración de etanol en las muestras se hace una curva de calibración
preparando una solución madre de etanol y haciendo diluciones con la misma, el rango
que se maneja para la concentración de las soluciones estándar va de l hasta 10 g/l,
después de esta concentración los picos no son finos. Una vez que se tienen los estándares
se analizan en el cromatografo por triplicado y se obtienen las respetivas áreas de los
picos de cada estándar, después se construye una curva de calibración de concentración
contra área obteniéndose un ajuste lineal representado en la siguiente figura:
 Curva de calibración (Etanol)
12
Etanol= 2E-06*Area - 0,0016
10 R² = 0,9998

Etanol (g/l)
8
6
4
2
0
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000
Área

Figura A.2.7.1. Curva de calibración para la determinación de Etanol por cromatografía

de gases.

A.2.8. CONCENTRACIÓN CELULAR (TURBIDIMETRÍA).

La cantidad total de biomasa presente en una muestra se mide en términos de peso seco
por unidad de volumen. Las células se separan del líquido por filtración. Se expresan en
g.m.s/mL. La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas
de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida, en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al peso seco, debe realizarse una curva de
calibración, de esta forma es posible relacionar absorbancia (Densidad Óptica) con el
número de microorganismos.

Para obtener las muestras con diferente concentración celular y peso seco, se prepara un
medio para el inoculo y se siguen los pasos explicados en el Apéndice A.2.3, se toman
muestras desde la hora 0 hasta la hora 24, se deben tener suficientes muestras para
analizarlas por peso seco, medir su absorbancia y su concentración celular con una cámara
de Neubauer.

Una muestra se congela para analizar su absorbancia y concentración celular, mientras

tanto se mide el peso seco, cuando se tienen estos resultados se grafica el peso seco contra
el tiempo, para seleccionar que muestras están en el intervalo de crecimiento exponencial.
Una vez elegidas las muestras se sigue el siguiente procedimiento:

Conteo en Cámara de Neubauer

1. El primer paso consiste en preparar la muestra es decir que no exceda los limites de
concentración (mayor a 2.5 millones de células/ml) por lo tanto se deben hacer diluciones
suficientes para no aumentar el error en los conteos.

2. Cuando se tiene la dilución correcta se toman 10 microlitros de muestra y se colocan

en la cámara de Neubauer cubriendo esta con un cubre objetos.

3. Se coloca la cámara en el microscopio y se enfoca para localizar uno de los cuadros

donde se vaya a medir, una vez que se enfoca ya no se modifica y solo se desplaza de un
lado a otro a la cámara para ubicarse en diferentes cuadros, esto para evitar errores al
contar.

4. Cuando se tienen los conteos se realizan cálculos utilizando los factores de dilución
usados, para conocer la concentración real de las muestras.

5. Realizados los pasos anteriores, se utilizan las muestras donde el crecimiento es

exponencial. (De las muestras originales, se toma 1 ml y se centrifuga a 4000 rpm por 10
minutos a 5 ºC, después se quita el sobrenadante y la biomasa se resuspende en 10 ml de
agua)

6. Se lee la absorbancia de cada muestra y se grafica contra la concentración celular. El

ajuste lineal obtenido se muestra en la siguiente figura.

Curva de calibración (Concentración celular)

4.00E+08
Concentración celular = 3E+08*A - 6E+07
Concentración celular (células/ml)

3.50E+08 R² = 0,9858

3.00E+08
2.50E+08
2.00E+08
1.50E+08
1.00E+08
5.00E+07
0.00E+00
0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3
Absorbancia

Figura A.2.8.1. Curva de calibración para la determinación de la concentración celular.