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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

INFORME N°2:
PRECIPITACION

CURSO: Procesos de Bioseparación


INTEGRANTES: Sebastián Trejos
Cristian Valdés
Carol Vidal
PROFESOR: Andrea Mahn
AYUDANTE: Gabriela Riveros
FECHA EXPERIENCIA: 26 de Noviembre del 2018
FECHA DE ENTREGA: 10 de Diciembre del 2018
ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 3
2. OBJETIVO ................................................................................................................. 5
3. APARATOS Y ACCESORIOS ................................................................................... 6
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ......................................................................... 8
5. DATOS ....................................................................................................................... 9
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................. 10
7. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 14
8. BIBLIOGRAFÌA ........................................................................................................ 15
APÉNDICE

2
1. INTRODUCCIÓN

Es de especial interés en la industria de bioprocesos la obtención de las proteínas de forma pura,


sin contaminación de otras proteínas o sustancias celulares, por lo que es necesario el uso de
técnicas de precipitación. Una de las técnicas más simple y eficaz se basa en la solubilidad que
tienen las proteínas en soluciones salinas concentrada, siendo el sulfato de amonio la sal más
utilizada para este proceso.

Lo que hace que una proteína se disuelva en un medio acuoso se debe a la capacidad que tiene de
formar puentes de hidrógeno con el agua, por lo que a mayor cantidad de puentes de hidrógeno,
mayor será la solubilidad1. Debido a que una proteína tiene varios grupos cargados, la solubilidad
depende de la concentración de sales disueltas, polaridad del solvente, pH y temperatura. La
manipulación de las variables anteriormente nombradas, hacen que se pueda precipitar de manera
selectiva ciertas proteínas mientras otras se mantienen disueltas.

Existen métodos de precipitación selectivos y no selectivos, ésta última se realiza mediante un


agente precipitante, el cual puede ser una sal neutra, un agente que altere el pH de la solución, un
solvente orgánico o algún polímero como el polietilenglicol. En la precipitación selectiva ocurren
cambios en la conformación de las proteínas contaminantes, de forma que en solución quede la
proteína de interés2.

La precipitación por adición de sales cosmotropicas, tales como el sulfato de amonio, se rigen por la
ecuación:

𝜇𝑝𝑝𝑡 = 𝜇𝑙𝑖𝑞

Con:

𝜇𝑝𝑝𝑡 : Potencial químico del soluto precipitado.

𝜇𝑙𝑖𝑞 : Potencial químico del soluto disuelto.

Esta forma de precipitación consiste en llevar el potencial químico del soluto disuelto al punto de
igual al que tiene en su forma de precipitado agregando las sales a la solución, y de manera de
ayudar a que esto ocurra se usa la temperatura para la solubilidad.

1 Quesada S. (2007). "Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica". Editorial Universidad


Estatal a Distancia. Pág.: 26.
2 Tejeda A. Montesinos R.M. Guzmán R. (2011) “Bioseparaciones” 2° Edición. Editorial Pearson.

Pág.: 422.
3
La solubilidad de una proteína en una concentración baja de iones aumenta a medida que se agrega
sal, a este fenómeno se le llama salting in. Los iones adicionales ocultan las numerosas cargas
iónicas de la proteína, debilitando así las fuerzas de atracción entre moléculas individuales de
proteína, estas fuerzas pueden llevar a la agregación y precipitación. Si se agrega más sal, en
especial si se usan sales de sulfato, la solubilidad de la proteína disminuye. Este efecto de salting
out resulta de la competencia entre los iones de sal agregados y los otros solutos disueltos por las
moléculas del solvente. Cuando las concentraciones de sal son muy elevadas, los iones agregados
están solvatados, por lo que hay una cantidad mucho menor de solvente disponible para disolver
otras sustancias como las proteínas3.

El efecto salino sobre la precipitación en las proteínas esta descrito empíricamente por la ecuación
de Cohn, la cual se expresa como:

ln 𝑆 = ln 𝑆0 − 𝑚 [𝑠𝑎𝑙]

Con:

𝑆 : Solubilidad de la proteína en la solución salina.

𝑆0 : Solubilidad de la proteína en agua pura, depende del pH y la temperatura.

𝑚: Constante que depende del tipo de sal y de la proteína, independiente de la temperatura.

Al trabajar con sulfato de amonio, se le denomina “corte de sulfato de amonio” al porcentaje de


saturación que tendría la sal en la solución que se desea trabajar.

En este práctico se busca determinar el corte de sulfato de amonio al cual precipita la seroalbúmina
de bovino.

3Voet D., Voet J. (2006). "Fundamentos de bioquímica", 2ª Edición. Editorial Médica Panamericana.
Pág.: 101.
4
2. OBJETIVO

2.1 Determinar el porcentaje de corte usando sulfato de amonio, para la precipitación de


seroalbúmina de bovino (BSA)

5
3. APARATOS Y ACCESORIOS

Aparatos

3.1.1.Balanza Analítica

Fabricante SPROUT

Modelo HS1000BC

Capacidad 220 g

Error 0,0001 g

3.1.2.Espectrofotómetro

Fabricante SPECTROQUANT

Modelo PHARO 100

Longitud de Onda 320-1100 nm


Rango fotométrico ± 3.3 A
Resolución de absorbancia 0.001 A

3.1.3.Micro Centrifuga

Fabricante SPROUT

Modelo HS1000BC

Velocidad 6000 RPM

3.1.4.Placa de Agitación Magnética

Fabricante LABTECH

Modelo LMS – 2001D

Temperatura 25 - 350 ºC
Velocidad 60 – 1500 RP

6
3.2. Accesorios

3.2.1. Barra Magnética


3.2.2. Buffer TRIS PH 8 20 mM
3.2.3. Cronometro
3.2.4. Cubetas de absorbancia
3.2.5. Kit Medición de Bradford
3.2.6. Micropipetas p200 y p1000
3.2.7. Puntas para micropipetas
3.2.8. Sulfato de Amonio
3.2.9. Termómetro
3.2.10. Tubos eppendorf
3.2.11. Vaso Precipitado de 1L

7
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. Precipitación de proteínas


4.1.1.Se colocaron 100 mL de la solución de proteína fría en el vaso precipitado.
4.1.2. Se colocó el vaso precipitado en una fuente con hielo.
4.1.3. La fuente y el vaso fueron puestos sobre el agitador magnético.
4.1.4. Se añadió al vaso precipitado la barra magnética y se encendió el agitador magnético.
4.1.5. Mediante un termómetro, se midió la temperatura de la solución.
4.1.6. Una vez que la temperatura alcanzada fuese inferior a 10ºC, se procedió a la
precipitación de BSA.
4.1.7. Se tomó una muestra y un duplicado de 1 mL de la solución.
4.1.8. Se midió en la balanza, la cantidad de sal de amonio necesaria para producir un
corte del 10% en la solución.
4.1.9. Se añadió la sal a la solución de proteína.
4.1.10. Una vez disuelta la solución, se repitió el paso 4.1.7.
4.1.11. Se repitió el paso 4.1.8 para un 10% adicional del corte
4.1.12. Se repitieron los pasos 4.1.7 a 4.1.11, hasta llegar a un corte del 100%
4.1.13. Las muestras y los duplicados se centrifugaron por 5 min.
4.1.14. Se extrajeron 100 µL del sobrenadante de las muestras en tubos eppendorf
4.1.15. A los tubos, se les añadió 900 µL del reactivo Bradford.
4.1.16. Se dejaron los tubos en oscuridad por 2 min.
4.1.17. Se traspasó la solución de los tubos eppendorf a las cubetas.
4.1.18. Se midió la absorbancia de las cubetas a 595 nm.

8
5. DATOS
Tabla 5.1 Datos de absorbancia obtenidos por el espectrofotómetro, para la precipitación de BSA en
la solución utilizando sal de amonio.

% corte Abs1 Abs2


0 1,182 1,218
10 1,085 1,076
20 1,398 1,383
30 1,084 1,085
40 1,398 1,469
50 1,215 1,232
60 1,431 1,500
70 1,244 1,199
80 1,493 1,494
90 0,782 0,697
100 0,415 0,49

9
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 6.1 Concentración de proteína [mg/ml] obtenida en el sobrenadante con su % de


corte de sulfato de amonio respectivo.

En la figura 6.1 podemos observar la descripción de un comportamiento aleatorio a distintas


cantidades de sal, esto puede ser atribuido a la división de la toma de datos, ya que mientras un
grupo tomó los valores impares de porcentaje de corte de sal (10, 30, 50, 70, 90) el otro utilizó los
pares (0,20, 40 ,60 ,80 ,100), lo que conlleva a una posible fuente de error en el manejo y medición.
Otra causa de las variaciones en la figura 6.1 podrían deberse a que la cantidad de sal antes del
porcentaje de corte del 80% no genera diferencias significativas de concentración en la solución
tendiendo más bien a un valor constante. Según la figura antes mencionada, a partir de un 80% de
corte de sal la proteína precipita. De acuerdo con la teoría sabemos que las albuminas precipitan
con sulfato de amonio al 100% de saturación por lo nuestro resultado estaría dentro lo esperado 4. El
valor al cual empieza nuestro precipitado correspondería a una concentración de 3,2 M de sulfato de
amonio (80% de saturación) justamente donde se inicia el fenómeno de salting out5. Sabemos que
este proceso ocurre debido a que los iones de amonio y sulfato son atraídos por las cargas opuestas

4Vejar R. Eva. (2005). “Prácticas de bioquímica descriptiva”. Editorial UniSon. Pág.: 178-180
5
Tejeda A., Montesinos R.M., Guzmán R., (2011). “Bioseparaciones”. Segunda Edición. Editorial
Pearson. Pág.: 175-182
10
del compuesto que se busca precipitar, de esta forma se evita que las moléculas de agua interactúen
con el compuesto en solución permitiendo la precipitación 6.

0
0 20 40 60 80 100
Concentración promedio BSA [mg/mL]

-0,5

-1

-1,5

-2

-2,5
Sulfato de amonio[% corte]

mg
Figura 6.2 Concentración promedio BSA( ) respecto al porcentaje de corte.
ml

En el corte 80% se observa una disminución de la proteína en solución, por lo que el resto de la
proteína fue precipitada debido al aumento continuo de la concentración de sal. Hasta antes del corte
80% la sal está ejerciendo efecto salting in, lo que implica que los contraiones están recubriendo las
zonas de carga iónica de la proteína BSA aportando mayor solubilidad. Por sobre el corte 80% se
produce el efecto salting out por lo que la proteína comienza a precipitar.

6Wingfield, Paul. (2016) “Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate”. www.ncbi.nlm.nih.gov.


PMC 4817497.
11
0
70 75 80 85 90 95 100

Concentración promedio BSA


-0,5

-1

[mg/mL] -1,5

-2

-2,5

-3

Sulfato de amonio[% de corte]

mg
Figura 6.3 Logaritmo natural de la concentración promedio BSA( ) respecto al % corte
ml
cuando se produce la precipitación.
Tabla 6.1 Regresión lineal obtenida de figura 5.3

Ecuación 𝑦 = −0,0831 · 𝑥 + 5,9155

Coeficiente de correlación, 𝒓𝟐 0,9985

Rango de Tiempo[s] [80, 100]

Tabla 6.2 Ecuación de Cohn descrita para nuestro proceso.

𝑳𝒏[𝑩𝑺𝑨]𝟎 5,9155 Solubilidad de la proteína a


fuerza iónica cero.

m 0,0831 Constante dependiente del tipo


de sal y proteína

[𝑺𝒂𝒍] - Concentración de sal

𝑳𝒏[𝑩𝑺𝑨] - Solubilidad de la proteína en la

12
solución salina

Ecuación Ln[BSA] = −0,0831 · [Sal] + 5,9155

En la figura 6.3, se observa una línea recta representando el logaritmo de la concentración de BSA
respecto al porcentaje de corte, mediante una regresión, se obtienen los parámetros de la ecuación
de Cohn (Tabla 6.2), donde se aprecia que la concentración de proteína ideal es un valor alto, esto
se debe a una alta interacción entre la proteína y el agua, requiriéndose altas concentraciones de
sales, para lograr una separación de la capa de solvatación que recubre a la proteína y conseguir su
precipitación.

Esta alta interacción entre la proteína y el agua se debe a una alta presencia de aminoácidos
cargados, como el ácido aspártico, la cisteína, lisina y acido glutámico que interactúan fuertemente
con los polos del agua.

13
7. CONCLUSIONES

7.1 El corte de sulfato de amonio al cual comienza a precipitar la BSA es al 80%, en dónde a través
de la evidencia gráfica se observa una caída brusca en la concentración de BSA disuelta.

14
8. BIBLIOGRAFIA

 Quesada S. (2007). "Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica". Editorial


Universidad Estatal a Distancia. Pág: 26.
 Tejeda A. Montesinos R.M. Guzmán R. (2011) “Bioseparaciones”, 2° Edición. Editorial
Pearson. Pág.: 175 - 201.
 Vejar R. Eva. (2005). “Prácticas de bioquímica descriptiva”. Editorial UniSon. Pág.: 178-180
 Voet D., G. Voet J. (2006). "Bioquímica", 3º Edición. Editorial Médica Panamericana. Pág:
166.
 Wingfield, Paul. (2016) “Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate”.
www.ncbi.nlm.nih.gov. PMC 4817497.

15
APÉNDICE

Apéndice A: Datos

1,60

1,40

1,20
Absorbancia 595nm

1,00

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60
BSA [mg/mL]

Figura A.1 Curva de calibración BSA.

Tabla A.1 Ecuación y coeficiente de determinación para curva de calibración.


Ecuación 𝑚𝑔
𝐴𝑏𝑠595𝑛𝑚 = 2,6262 ⋅ 𝐵𝑆𝐴( ) + 0,2079
𝑚𝑙

Coeficiente de correlación, 𝒓𝟐 0,992

Rango de Tiempo[s] [0,01, 0,1]

16
Tabla A.2 Valores de absorbancia a 595 [nm] para cada % de corte con su réplica respectiva.
% Corte 𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂𝟏 𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂𝟐

0 1,182 1,218

10 1,085 1,076

20 1,398 1,383

30 1,084 1,085

40 1,398 1,469

50 1,215 1,232

60 1,431 1,500

70 1,244 1,199

80 1,493 1,494

90 0,782 0,697

100 0,415 0,490

Apéndice B: Datos intermedios

Tabla B.1 Porcentaje de corte a la absorbancia de 595 nm con su respectivo promedio y


desviación estándar.
% 𝑪𝒐𝒓𝒕𝒆 Absorbancia [𝒏𝒎]

0 1,200 ± 0,025

10 1,081 ± 0,006

20 1,391 ± 0,011

30 1,085± 0,001

40 1,434± 0,050

17
Continuación Tabla B.1

% 𝑪𝒐𝒓𝒕𝒆 Absorbancia [𝒏𝒎]

50 1,224 ± 0,012

60 1,466 ± 0,049

70 1,222 ± 0,032

80 1,494 ± 0,001

90 0,740 ± 0,060

100 0,453 ± 0,053

Tabla B.2 Porcentaje de corte para las concentraciones de BSA [𝑚𝑔/𝑚𝑙] con su
respectivo promedio y desviación estándar.

% 𝑪𝒐𝒓𝒕𝒆 [𝑩𝑺𝑨]𝟏 [𝑩𝑺𝑨]𝟐 Concentraciones


[𝒎𝒈/𝒎𝒍]

0 0,371 0,385 0,378 ± 0,010

10 0,334 0,331 0,332 ± 0,002

20 0,453 0,447 0,450 ± 0,004

30 0,334 0,334 0,334 ± 0,000

40 0,453 0,480 0,467 ± 0,019

50 0,383 0,390 0,387 ± 0,005

60 0,466 0,492 0,479 ± 0,019

70 0,395 0,377 0,386 ± 0,012

80 0,489 0,490 0,490 ± 0,000

90 0,219 0,186 0,202 ± 0,023

100 0,079 0,107 0,093 ± 0,020

18
Tabla B.3 Porcentaje de corte con la función logaritmo para cada concentración de
𝐵𝑆𝐴 [𝑚𝑔/𝑚𝑙].

% 𝑪𝒐𝒓𝒕𝒆 𝑳𝒏[𝑩𝑺𝑨]

0 -0,973

10 -1,103

20 -0,799

30 -1,097

40 -0,761

50 -0,949

60 -0,736

70 -0,952

80 -0,713

90 -1,599

100 -2,375

Tabla B.4 3 Porcentaje de corte con la función logaritmo para cada concentración de
𝐵𝑆𝐴 [𝑚𝑔/𝑚𝑙] ocurrida la precipitación.
% 𝑪𝒐𝒓𝒕𝒆 𝑳𝒏[𝑩𝑺𝑨]

80 -0,713

90 -1,599

100 -2,375

19
20