Practica

Pruebas Cruzadas de Compatibilidad Sanguínea

Objetivo: El alumno al finalizar la práctica determinará si dos sangres; del donador y del
receptor, son compatibles, para practicar la transfusión sanguínea.

Generalidades: En todo banco de sangre y ante la inminencia de transfundir sangre a un

individuo, es obligatorio efectuar la determinación del tipo sanguíneo y el factor Rh del
receptor; al seleccionar la sangre a transfundir, deberá ser del mismo tipo sanguíneo y factor
Rh del paciente, cumpliendo con esta premisa, se efectuará en el laboratorio un análisis que
nos permita en “vitro” detectar si en ellas, tenga un anticuerpo anormal, que pueda causar
aglutinación o hemólisis de los glóbulos rojos en la circulación sanguínea del receptor. La
identificación correcta de la sangre elegida para la donación, la del paciente que ha de recibir
la transfusión, la exactitud, velocidad, prevención y de control de calidad y omisión de
errores, son aspectos que al realizar las pruebas cruzadas, revisten gran importancia, pues
errores humanos descubiertos después de iniciada una transfusión son imposibles de corregir
y ponen en peligro la vida del paciente.

Fundamento: Las pruebas cruzadas deben:

A. Detectar anticuerpos IgM de carácter aglutinante o hemolizante que fijan

complemento, por lo que se debe trabajar con sangre recién extraidas y coaguladas.
B. Investigar Anticuerpos IgG que por su naturaleza no producen aglutinación y se
deben utilizar distintos “medios“ que permitan demostrar su presencia, produciendo
aglutinación o hemólisis.

Material y equipo:
 1 gradilla
 4 tubos 13x 100
 12 tubos 10 x 75
 6 pipetas Pasteur con bulbo
 2 centrifugas Serofuge
 Baño maría a 37°C
 Sólucion salina en pizetas
 Albúmina bovina al 22%
 Suero Antiglobulina Humana (Coombs)

Técnica:

 Separar los sueros de los globulos rojos

 Realizar una suspensión de globulos rojos del disponente y del receptor al
5% previamente lavado
 Se colocan 7 tubos en línea recta y se marcan:
 1 2 3 4 5 6 7
Er Sr Ed Sd FM fm C

1. A la Fase mayor se le pone una gota de suero del receptor más una gota de globulos
rojos al 5% del disponente
2. A la fase menor se le pone una gota de suero del disponente más una gota de globulos
rojos al 5% del receptor
3. Al tubo control se le pone una gota de suero del receptor más una gota de globulos
rojos al 5% del receptor
4. Se centrifugan a 2500 rpm por 30″ y se lee desprendiendo suavemente el sedimento
en busca de aglutinacion de no existir aglutinación, se continuará
5. Se agregan dos gotas de Albúmina Bovina al 22% y se centrifuga a 2500 rpm por 30″
y se lee
6. Se incuban a 37°C durante 30 minutos, se extrae los tubos.
7. Se centrifuga a 2500 rpm por 30″ y se leen.
8. Se llenan con solución salina 3/4 de ambos tubos (fase mayor y menor) se mezclan y
se centrifugan a 2500 rpm por 30″, se sacan de la centrífuga y se decantan y se vuelve
a aplicar solución salina (ésta operación se repite tres veces) en el último lavado, se
decantan completamente el tubo
9. Al sedimento residual se le agregan dos gotas de reactivo de Coombs a ambos tubos y
se centrifugan a 2500 rpm por 30″, se leen cuidadosamente para buscar que no haya
hemólisis ni aglutinación.
10. Se le agrega a cada tubo una gota de células control se centrifuga a 2500 rpm por 30″
y se leen en busca de aglutinación.

Conclusión:

La prueba mayor, menor y control contienen:

 Prueba mayor: suero del receptor con globulos rojos del disponente (2 gotas de suero
del receptor más 1 gota de suspención de eritrocitos del disponente)
 Prueba menor: suero del disponente con globulos rojos del receptor (2 gotas de suero
del disponente más 1 gota de suspención de eritrocitos del receptor)
 Control: suero del recpetor y globulos rojos del receptor (2 gotas del suero del
receptor más 1 gota de suspención de e ritrocitos del receptor )
 Si en todos los pasos no existió aglutinación o hemólisis, las pruebas son 100%
compatibles y la sangre puede transfundirse, en caso de existir aglutinación o
hemólisis, en cualquiera de los pasos se considera incompatibilidad, las pruebas se
suspenden y se comienza a investigar otra bolsa de sangre del mismo tipo sanguíneo y
factor Rh, siguiendo los mismos pasos.
 Si la incompatibi lidad, se encuentra en los tubos con salina (1 y 2) probablemente se
trata de una IgM y hay una equivocación en el tipo sanguíneo, por lo tanto se debe
ratificar el tipo del donador.
 Si la aglutina ción es en el tubo menor en salina se trata de una IgM del donante y es
de esperarse, en el caso de emplearse sangre “O”.
 Cuandose efectua el cruce con receptores de tipo sanguneo distinto esta sangre puede
emplearse, de preferencia el paquete globular. Es de hacerse notar que tanto la
 aglutinación como la hemólisis son macroscópicas y que en muy pocos casos es
necesario utilizar el microscopio.

Este método por los numerosos pasos que hay que efectuar, al parecer es complicado, pero la
práctica continua del mismo se vuelve simple y automatizado y en muchas ocasiones de
acuerdo con la urgencia se puede reducir la incubación, con primera lectura a los 20 minutos,
si se reporta negativo, enviar la sangre a transfundir, continuando con el método hasta
cumplir con los tiempos señalados.

Las investigaciones de métodos más sencillos y gran confiabilidad, han llevado a buscar que
la velocidad de algunas reacciones antígeno anticuerpo de grupos sanguíneos, aumentan
considerablemente si la incubación se lleva a cabo en condiciones de ba ja fuerza iónica entre
sus ventajas, se encuentra el acortamiento de los tiempos de incubación, la posibilidad de
detectar algunos anticuerpos débiles que no pueden detectarse por otros métodos y la
formación de aglutinados más fuertes que los producidos por otras técnicas en la fase de
Antiglobulina, aumentan un tanto las reacciones débiles, probablemente debido a la unión
inespecifica de los componentes del complemento. Los reactivos que han de utilizarse en las
técnicas deben prepararse y controlarse con esmero, y las condiciones de las reacciones deben
ser tan precisas para evitar resultados positivos falsos no cabe duda de que los métodos
con LISS, si se efectuan adecuadamente son excelentes, siempre y cuando lo empleen
pesonal debidamente entrenados este recurso no es de uso común y su uso está restringido a
muy pocos centros especializados.

Interpretación de Resultados:

 Para el corrector manejo de los resultados se deberá anotar después de cada

observación
 Aglutinación en cualquiera de las pruebas mayores no sera necesario proseguir con
los siguientes pasos, pués demuestra in compatibilidad
 Las anotaciones se pueden realizar en tarjetas diseñadas exprofeso y de las cuales
cada laboratorio contará con un modelo, cualquiera que éste sea debe contener los
datos generales, de receptor y donador, cada tarjeta debe ser adherida a la bolsa de
sangre correspondiente y al enviarse a la aplicación del paciente, se guardará en el
expediente del mismo.
 Practica
Prueba de Coombs

Objetivo: El alumno conocerá los eritrocitos sensibilizados por anticuerpos incompletos, que
son capaces de ser aglutinados por la Antiglobulina Humana.

Generalidades: El suero de Coombs permite establecer la presencia de globulina y por lo

tanto de anticuerpos, ya que son de la misma naturaleza, los anticuerpos incompletos como
son los que producen la eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica adquirida, se absorben
sobre la superficie del glóbulo rojo; pero no los aglutinan, el suero Antiglobulina permite
reconocer estos glóbulos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulínicos que
ya cubren.

Es util reconocer estos globu1os sensibilizados al combinarse con los anticuerpos

globulínicos que ya cubren su superficie el suero de coombs es ideal pues tiene anticuerpos
contra las globulinas séricas humanas que abarcan cuatro grandes alfa1, alfa2, beta y gamma,
y dentro de estos grupos se en cuentan anticuerpos Anti Rh incompletos, Anti-Duffi, Anti
Kell el suero de Coombs se obtiene por inyecciones repetidas de sueros humanos del grupo
“O” a conejos el animal sensibilizado de esta manera produce anticuerpos contra la fracción
globulinica de las proteínas séricas y contra anticuerpos incompletos que pueden encontrarse
revistiendo a los hematíes o bien es suspensión en el plasma, por lo que se llama
Antiglobulina Humana, se preparan reactivos de amplio espectro mediante la mezcla de
sueros obtenidos de distintos animales.

La IgG no produce aglutinación de los eritrocitos, pero se fijan sobre ellos y permanecen sin
soltarse, al agregar el suero de Coombs se forman puentes entre los fragmentos cercanos y es
posible ver la aglutinación, revelando que esos eritrocitos estaban en realidad cubiertos de
anticuerpos.

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA.

Fundamento: La prueba directa se realiza cuando el Anticuerpo se ha fijado sobre el

eritrocito “in vivo”, permite establecer la sensibilizaci6n de los glóbulos rojos que tuvo lugar
en el organismo. Se usa para el diagnóstico de eritroblastosis fetal, anemia hemolítica y
reacciones hemolíticas postrasfusionales por sangre incompatible

Material y equipo:

 1 gradilla
 4 tubos de 13 x 100
 2 tubos de 10 x 75
 2 pipetas Pasteur c/bulbo
 1 centrifuga Serofuge
 1 baño maría 37°C
 Solución salina en pizetas
  Suero de coombs
 Glóbulos rojos problema
 Glóbulos rojos “O” Rh negativos

Técnica:

1. Para identificar los glóbulos rojos sensibilizados es necesario remover la totalidad del
suero de los eritrocitos, mediante lavadas repetidas con suero salino. Este proceso es
importante, pués si se dejan residuos proteicos se neutraliza el suero de Coombs y se
obtendrán falsos negativos
2. Se prepara una suspensión de glóbulos rojos al 5% de lacuál se colocan dos gotas en
un tubo de ensaye y se procede al lavado por tres ocasiones
3. Después del último lavado se resuspenden los glóbulos rojos nuevamente con una
gota de solución salina, agregar dos gotasde suero de coombs y mezclar
4. Incubar por 30 minutos a 37°C, extraer el tubo cuidadosamente y observar si existe
aglutinación en el fondo del tubo con leves movimientos de inclinación,
5. Se aconseja como testigo utilizar hematíes de adulto no sensibilizados del mismo
grupo del paciente. El testigo se prepara en un tubo poniendo una gota de
sangre “O” Rh negativa y cuatro gotas de solución salina más una gota de suero anti
Rh, incubar media hora, lavar por tres veces estos glóbulos y después se adiciona una
gota de suero de Coombs

Interpretación de resultados:

1. La aglutinación en el tubo testigo no debe existir,

2. Si el tubo problema presenta aglutinación, los glóbulos rojos están sensibilizados por
algún anticuerpo incompleto

PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

Fundamento: En esta prueba la sensibilización se realiza in vitro, en la primera etapa se

sensibilizan los glóbulos rojos testigos con el anticuerpo que se desea investigar (Rh
negativo, factor Kell, Diego, etc.) y en la segunda etapa por medio de reactivo de Coombs se
hace visible la sensibilización por medio del fenómeno de aglutinación macroscópica.

Técnica:

1. En tubo poner cuatro gotas del suero problema y una gota de glóbulos rojos
sensibilizados, suspendidos en solución salina al 5%, si se investigan anticuerpos Rh
se usan glóbulos rojos tipo ”O” Rh positivos
 2. Se incuba a 37°C por una hora, se centrifuga el tubo a baja velocidad 2500 rpm x 1
minuto
3. Se lavan los glóbulos rojos sensibilizados tres veces con solución salina, desechando
el sobrenadante completamente en el último lavado, dejando solo el boton de
eritrocitos en el fondo
4. Agregar dos gotas de suero de Coombs, mezclar perfectamente y poner en baño María
a 37°C, durante cinco minutos,
5. Centrifugar a baja velocidad 2500 rpm y buscar aglutinación en el fondo del tubo

Interpretación de resultados:

1. Si se encontró aglutinación después del paso número 2, indica la presencia de

aglutininas anti Rh en el suero problema
2. Si la prueba es negativa, se puede presumir la existencia de anticuerpos incompletos o
bloqueadores, y se comprueba prosiguiendo con la técnica.
3. Se puede realizar diluciones del suero problema para conocer el titulo del aglutininas
anti-Rh que existen en el paciente
 Practica
Investigación con Células Control de Coombs en la Prueba Cruzada Pretransfusional

Objetivo: Que el alumno aprenda a fijar un anticuerpo en la membrana del eritrocito. Al

utilizar estos eritrocitos sensibilizados en las pruebas cruzadas que hayan resultado
compatibles, convertirá una prueba negativa en positiva.

Fundamento: En esta prueba se fija sobre el determinante Antigénico de eritrocitos “O”,

anticuerpo (anti-D). Estos eritrocitos al encontrarse en un medio con reactivo de Coombs,
este forma un puente entre los eritrocitos cercanos, produciendo aglutinación.

Generalidades: Esta prueba fué descrita por primera vez en 1908 por Mc. Reschi y años
más tarde en 1945 por Coombs, Mourat y Race, aplicándola en la identificación de
aglutininas Rh débiles e incompletas. El suero de coombs es una Antiglobulina Humana,
preparada por inmunización de animales (conejos o cabras a los que se les inyecta suero
humano o las fracciones de éste, los anticuerpos incompletos, entre ellos los que explican la
eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica adquirida, se adsorbe o se une al antígeno Rh fijos
en la membrana del eritrocito, pero no los aglutina, el suero Antiglobulina Humana, permite
reconocer estos glóbulos sensibilizados, al combinarse con los anticuerpos incompletos que
ya cubren en superficie con lo cual se produce la aglutinación.

Puesto que el suero humano contiene anticuerpos que pueden interferir en la prueba y puede
neutralizar el suero de Coombs, es necesario eliminar totalmente el suero de la muestra
sanguínea, mediante lavados repetidos con solución salina.

No se utilizan los sueros de sujetos “A” o “B” porque las substancias especficas de estos,
tendrían suero de Coombs con anticuerpos contra las aglutininas a y b, los anticuerpos
recubren con frecuencia los eritrocitos, pero no forman la malla necesaria que produce la
aglutinación; como es el caso de anticuerpos dirigidos a los determinantes Rh sobre los
eritrocitos humanos sin embargo la adicición de un antisuero Antiglobulina producido por
una especie heteróloga, produce marcada aglutinación.

La prueba de Antiglobulina se usa principalmente para identificar cantidades subaglutinantes

o no aglutinantes de los anticuerpos antieritrocitos.

Material y equipo:

 1 gradilla
 4 tubos 10 x 75
 2 pipetas Pasteur c/bulbo
 1 centrifuga Serofuge
 1 baño maría a 37°C
 Suero de Coombs
 Suero anti-D
  Solución salina en pizetas
 Glóbulos rojos tipo “O”

Tecnica:

1. En un tubo de ensaye, se ponen dos gotas de glóbulos rojos “O”, cuatro gotas de
solución salina y dos gotas de suero anti-D.
2. Se incuba el tubo a 37°C durante 30 minutos,
3. Lavar en tres ocasiones con solución salina a 3, 400 r p m, durante 15 segundos en
cada ocasión.
4. Para probar que los eritrocitos se encuentran sensibilizados, se toma una gota de la
mezcla en otro tubo y se le agrega una gota del reactivo de Coombs, se centrífuga a
3400 y si se aglutinan, están listos para usarse.
5. Se agrega una gota de los glóbulos rojos O” sensibilizados a cada uno de los tubos en
que se realizó el Coombs en las pruebas cruzadas.
6. Se centrifugan y se observa si existe aglutinación.

Interpretación de resultados:

1. Si las pruebas cruzadas resultaron compatibles y estuvieron correctamente realizadas,

al agregar las células control de Coombs se observará aglutinación
2. En caso de no encontrar aglutinación, se procederá a repetir todas las pruebas
cruzadas, pues existió un error en la manipulación o en la agrupación sanguínea.