I.

INTRODUCCIÓN
La citoquímica tiene como propósito la identificación y utilización de los diferentes
componentes químicos dentro de la célula en forma cualitativa o cuantitativa. Para la
determinación citoquímica de una sustancia deben cumplirse dos condiciones: 1. Que la
sustancia sea inmovilizada en su localización original.2. Que la sustancia sea
identificada por un procedimiento que sea específico para ella o para el grupo químico
al cual pertenece. En las reacciones histoquímicas en las que se usa el reactivo de
Schiff, por ejemplo, pueden considerarse tres tipos de aldehídos: a) aldehídos presentes
en forma natural en los tejidos (reacción plasmal), b) aldehídos producidos por
oxidación selectiva (reacción PAS) y c) aldehídos producidos por hidrolisis selectiva
(reacción de Feulgen).
La reacción de Feulgen (1884-1955), es una técnica histoquímica de coloración
desarrollada por Roberto Feulgen, químico alemán en 1924, para detectar
selectivamente la presencia de ADN. Es una de las más importantes reacciones
químicas tanto por su sencillez como por su reproductividad.
El material a procesar puede ser de diversa naturaleza, pudiendo utilizarse monocapas
de cultivos celulares, frotis de biopsias de aspiración con aguja fina, preparados
exfoliativos, citocentrifugados de ascitis, orina, liquido obtenido por punción de la
pleura, o liquido cerebroespinal, así como cortes de tejidos fijados con formalina
incluidos en parafina.
Los tejidos se someten a una hidrolisis acida y luego se tratan con el reactivo de Schiff
para aldehídos. En la preparación del reactivo, la fucsina básica se trata con anhídrido
sulfuroso, transformándose en un compuesto incoloro (ácido bis-N aminosulfonico o
reactivo de Schiff) que luego es recoloreado por los grupos aldehído presentes en el
tejido. El análisis cualitativo en microscopia de campo claro revela la presencia de un
color rojo purpúreo o magenta del que se tiñen los cromosomas de preparados
citológicos, permaneciendo las otras áreas relativamente incoloras. En el núcleo las
áreas de cromatina condensada son positivas, y el nucléolo es Feulgen negativo. El
análisis cualitativo revela la presencia de DNA midiendo la cantidad trasmitida a través
de núcleos teñidos con la presencia técnica.
Dentro del fundamento de la técnica, se pueden resumir dos etapas:
1. Si el DNA se trata con un ácido caliente (hidrolisis), las bases puricas se separan
(extracción de purinas a nivel de la unión desoxirribos-purinas del DNA,
obteniéndose un DNA apúrico, sin afectarse esencialmente el eje de la molecula
desaoxirribosa -fosfato-desaoxirribosa-fosfato…) por lo tanto la desaxirribosa
presente en el DNA es la responsable de la reacción de Feulgen.
2. Los grupos aldehídos ( CHO), del azúcar libres en todos los lugares donde se
hidrolizó una purina (por adición de moléculas de agua, en puntos específicos ),
al añadir el reactivo Schiff, reacciona con la fucsina decolorada del reactivo,
dando un compuesto de color rojo magenta o rojo purpúreo característico.
 La reacción de Feulgen como se puede advertir es específica para DNA, y ni el RNA ni
cualquier otra sustancia celular dará el tipo preciso de respuesta coloreada. En el caso
del RNA, este no libera aldehídos, pues el eje de su molécula (ribosa-fosfato- ribosa-
fosfato…) es más sensible a la hidrólisis que la unión entre la desoxirribosa y su base
correspondiente, por esta razón la mayor parte del RNA se degrada a nucleótidos
durante la hidrolisis.
II. OBJETIVOS
 Determinar la importancia de la reacción de Feulgen y cuál es su aplicación
fundamental en el ADN.
 Reconocer las diferencias y métodos que se aplican en la reacción de Schiff.
 Identificar los tipos de aldehídos en las reacciones histoquímicas.

III. MATERIALES

 Bulbo de cebolla con meristemos en desarrollo

 HCL 5N
 Reactivo de Schiff
 Agua sulfurosa (metabisulfito 10%, 5ml; HC 1N 5ml; 90 ml de agua destilada)
 Pisetas con agua destilada
 Lunas de reloj
 Beackers de 250 ml
 Microscopios
 Laminas, laminillas
 Hojas de afeitar
 Pipetas Pasteur, goteros

IV. MÉTODO

1. Dejar desarrollar el sistema radicular de bulbos frescos de allium cepa

2. Cortar 1 a 2 ml del ápice y colocarlo en una luna de reloj con una solución de
HCL 5N a 20 °C (temperatura ambiente) por espacio de 10 a 15 minutos. Lavar
con agua destilada
3. Colocar gotas del reactivo Schiff y colocar por espacio de 15 a 19 min. A
temperatura ambiente
 4. Eliminar el colorante y lavar con agua sulfurosa 2 a 3 veces 5 minutos
5. Lavar con agua corriente
6. Realizar un aplastado en una gota de agua sulfurosa con ácido acético 50%
7. Observar los preparados a mediano y mayor aumento
8. Las preparaciones permanentes pueden realizarse por el método de nieve
carbónica, congelando la muestra y retirando la laminilla con una hoja de afeitar,
luego deshidratando en alcohol en 7%, 96% y absoluto para después montar en
bálsamo de Canadá o euparal.
Reactivo de Schiff: componentes: fucsina básica 1 gr, bisulfito de sodio 1 gr,
ácido clorhídrico QP. 1,2, agua destilada 200 ml, carbón vegetal 1.5 gr.
HCL 5 N: medir 20.75 ml. De HCL concentrado y completar a 50 ml con agua
destilada.

IV. RESULTADO

Los resultados son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teñido color fucsia y fondo
incoloro, en el caso de que de que se utilice una coloración de contraste como el Fast
Green FCF el fondo sería verde.

V. CONCLUSIONES

 Solamente el método de Feulgen puede considerarse estequiométrico en donde

es posible observar una intensidad de coloración proporcional a la concentración
de DNA, por lo que es posible determinar cuantitativamente el DNA presente en
el núcleo de las células, lo que se aplica en patología a la cuantificación de
células que contienen cantidades anormales de DNA en tumores malignos. La
hidrólisis ácida rompe los puentes de hidrógeno separando las hebras de DNA
produciendo una depurinización, por lo tanto, para obtener un mayor número de
grupos aldehído reactivos, identificables con reactivo de Schiff, es necesario
realizar una hidrólisis que libere mayor cantidad de bases púricas.
  El reactivo de Schiff es el producto de una reacción que incluye colorantes tales
como la fucsina y bisulfito de sodio; pararosanilina (que carece de un grupo
metilo aromático) y la nueva fucsina son otras dos alternativas para la detección
química de aldehídos.En su uso como una prueba cualitativa para aldehídos, se
añade la muestra desconocida con el reactivo de Schiff decolorado; cuando el
aldehído está presente se desarrolla un color fucsia característico. Reactivos del
tipo de Schiff se utilizan para diversos métodos de tinción de tejidos biológicos,
por ejemplo, tinción de Feulgen y tinción de ácido periódico de Schiff. La piel
humana también contiene grupos funcionales de aldehídos en el término de
sacáridos y así se tiñe de igual forma.
 En el reactivo de Shiff los aldehídos presentes van a clasificarse de tres tipos:
uno en forma natural en los tejidos, el segundo en aldehídos producidos por
oxidación selectiva y aldehídos producidos por hidrolisis selectiva; siendo estos
conocidos también como reacción plasmal, de PAS, y reacción de Feulgen,
respectivamente.

VI. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de PAS o Periodic Acid Schiff?

La reacción de PAS nos revela todo tipo de carbohidratos (polisacáridos, como el

glucógeno, mucopolisacáridos, glucolípidos, glucoproteínas, etc.). Se basa en la
reacción con el reactivo de Schiff de los grupos aldehído liberados de los grupos vic-
glicol presentes en los carbohidratos tras su oxidación con ácido peryódico.
La tinción de PAS (ácido periódico-de Schiff) permite la determinación del glucógeno,
de las mucinas, de los mucopolisacáridos neutros así como de los filamentos y esporas
micelianos. El ácido periódico transforma los glicoles en aldehído.

2. ¿Qué es la citofotometría y en qué consisten los métodos citofotométricos para

analizar cuantitativamente el ADN?

Representa un método rápido objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos,

cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión.

El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer pasar células u otras
partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso.

La información producida puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por

la dispersión de la luz y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos
presentes en la célula o partícula al ser excitados por el rayo luminoso.
 Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se
amplifican y se convierten en señales digitales que son procesadas por una
computadora.

La citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula. Éstos se

dividen en:

 Parámetros nucleares
 Parámetros citoplásmicos
 Parámetros de superficie
 Parámetros extracelulares

3. Que aplicaciones tiene la reacción de Feulgen como técnica de citodiagnóstico

en medicina

Técnica utilizada en histología para teñir selectivamente el DNA de las células. Esta
técnica consiste en la hidrolización del DNA mediante una dilución débil de ácido
clorhídrico que libera las bases púricas, quedando libres los radicales aldehídos de
las pentosas, y en la coloración con leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos
aldehído.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Ramírez B, María L, Serrano D, Elisa M, Pérez Ramos J, Espuñes S, et al.

CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA
Y LA APLICACIÓN CLÍNICA. Revista del Instituto Nacional de Enfermedades
Respiratorias. marzo de 2004;17(1):42-55.

2. PAS (REACCIÓN DEL ÁCIDO PERYÓDICO- REACTIVO DE SCHIFF)

[Internet]. prezi.com. [citado 26 de marzo de 2017]. Disponible en:
https://prezi.com/i0i1z1wvnxnk/pas-reaccion-del-acido-peryodico-reactivo-de-
schiff/

3. Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third
Edition, 1999.

3. ¿Qué es método de tinción de Feulgen? [Internet]. [citado 26 de marzo de 2017].

Disponible en: http://www.cun.es/diccionario-medico/terminos/metodo-tincion-feulgen

4. Método de Feulgen y Rossenberg (1921) [Internet]. [citado 26 de marzo de 2017].

Disponible en: http://morfoudec.blogspot.com/2008/10/mtodo-de-feulgen-y-
rossenberg-1921.html