คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ

เลขที่ 18/18 ถ.บางนา-ตราด กม.18 ต.บางโฉลง อ.บางพลี

จ.สมุทรปราการ 10540
โทรศัพท์ : 0-2312-6300 โทรสาร : 0-2312-6458
เว็บไซต์ : http://sci.hcu.ac.th

คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรั งสิต

เลขที่ 52/347 หมู่บ้านเมืองเอก ถ.พหลโยธิน ต.หลักหก อ.เมือง
จ.ปทุมธานี 12000
โทรศัพท์ : 0-2997-2200 ต่ อ 1412-14 โทรสาร : ต่ อ 1417
เว็บไซต์ : http://www.rsu.ac.th/science/

วิทยาลัยการแพทย์ แผนไทย มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี

เลขที่ 8 ถนนพหลโยธิน 87 ซอย 2 ต.ประชาธิปัตย์ อ.ธัญบุรี
จ.ปทุมธานี 12130
โทรศัพท์ : 0-2592-1999 โทรสาร : 0-2592-1900
เว็บไซต์ : http://www.tmc.rmutt.ac.th

คณะเทคโนโลยีการเกษตร มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์
ในพระบรมราชูปถัมภ์
เลขที่ 1 กม. 48 ถ.พหลโยธิน ต.คลองหนึ่ง อ.คลองหลวง
จ.ปทุมธานี 13180
โทรศัพท์ : 0-2529-3002 ต่ อ 10,12
โทรสาร: 0-2529-3002 ต่ อ 30
เว็บไซต์ : http://agri.vru.ac.th/

คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์

ในพระบรมราชูปถัมภ์
เลขที่ 1 กม. 48 ถ.พหลโยธิน ต.คลองหนึ่ง อ.คลองหลวง
จ.ปทุมธานี 13180
โทรศัพท์ : 0-2909-3029
โทรสาร : 0-2909-3029
เว็บไซต์ : http://sc.vru.ac.th/
 รายงานสืบเนื่องการประชุมวิชาการ
วิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยีระหว่ างสถาบันครั ง้ ที่ 1
Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference 2013
ASTC2013

“วิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยีเพื่อการพัฒนาคุณภาพชีวิต”

วันจันทร์ ท่ ี 18 มีนาคม 2556

ณ โรงแรมแอมบาสซาเดอร์ สุขุมวิท 11 กรุ งเทพมหานคร

จัดโดย

คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ

คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรั งสิต
วิทยาลัยการแพทย์ แผนไทย มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี
คณะเทคโนโลยีการเกษตร มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์ ในพระบรมราชูปถัมภ์
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์ ในพระบรมราชูปถัมภ์
 สารคณบดีคณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
ประธานคณะกรรมการฝ่ ายอํานวยการ
วิทยาศาสตร์ แ ละเทคโนโลยี เป็ นพื น้ ฐานที่ สําคัญต่อการพัฒนาประเทศ และการวางรากฐานความคิดทาง
วิทยาศาสตร์ ให้ แ ก่เ ยาวชนจะนํา ไปสู่ก ารพัฒนาประเทศอย่างมั่น คงและยั่ง ยืน อี กทัง้ ในปั จ จุบันการนํ าความรู้ ด้ า น
วิทยาศาสตร์ หลาย ๆ ด้ าน มาประยุกต์รวมกันก่อให้ เกิดองค์ความรู้ หรื อนวัตกรรมใหม่ ๆ ที่เป็ นประโยชน์ต่อประเทศชาติ
อย่างมากมาย ดังนันการพั้ ฒนาความรู้ด้านวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี จึงเป็ นสิ่งสําคัญที่จะต้ องมีการศึกษาค้ นคว้ าวิจยั
อย่างต่อเนื่องเพื่อเป็ นพื ้นฐานในการพัฒนาประเทศ และให้ ก้าวทันกับการเปลีย่ นแปลงที่เกิดขึ ้นในโลกปั จจุบนั
ด้ วยตระหนักถึงความสําคัญของการพัฒนาความรู้ ด้ านวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ และ
เทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ ร่ วมกับคณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรังสิต วิทยาลัยการแพทย์แผน
ไทย มหาวิ ท ยาลัย เทคโนโลยี ร าชมงคลธั ญ บุรี คณะเทคโนโลยี ก ารเกษตร และคณะวิ ท ยาศาสตร์ แ ละเทคโนโลยี
มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์ ในพระบรมราชูปถัมภ์ ได้ ร่วมกันจัดประชุมวิชาการทางวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี
ระหว่างสถาบันครัง้ ที่ 1 ในหัวข้ อ “วิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยีเพื่อการพัฒนาคุณภาพชีวิต” เมื่อวันที่ 18 มีนาคม 2556 ณ
โรงแรมแอมบาสซาเดอร์ สุขมุ วิท 11 กรุงเทพมหานคร ซึง่ มีการนําเสนอผลงานวิจยั ด้ านวิทยาศาสตร์ พื ้นฐาน วิทยาศาสตร์
และเทคโนโลยี และวิทยาศาสตร์ การแพทย์ ทัง้ ในรู ปแบบของการบรรยายและแบบโปสเตอร์ โดยมีผ้ ูเข้ าร่ วมประชุม
วิชาการประกอบด้ วยคณาจารย์ นิสติ นักศึกษา นักวิชาการและผู้สนใจทัว่ ไปจํานวนมากกว่า 300 คน ซึ่งผู้เข้ าร่ วมประชุม
นอกจากจะได้ ร่วมแลกเปลีย่ นเรี ยนรู้ประสบการณ์ด้านงานวิจยั ซึง่ กันและกันแล้ วยังได้ มีโอกาสในการสร้ างเครื อข่ายความ
ร่วมมือทางวิชาการอีกด้ วย
จากการจัด ประชุ ม วิ ช าการ ฯ ดัง กล่า วข้ า งต้ น ก่ อ ให้ เ กิ ด รายงานสื บ เนื่ อ งการประชุ ม วิ ช าการฉบับ นี ซ้ ึ่ ง
ประกอบด้ วยบทความวิจัยฉบับสมบูรณ์จํานวน 41 บทความ ซึ่งมีเนื ้อหาวิชาการสามด้ านได้ แก่ วิทยาศาสตร์ พื ้นฐาน
วิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี และวิทยาศาสตร์ การแพทย์ ทังนี ้ ้ในแต่ละบทความมีเนื ้อหาวิชาการที่น่าสนใจ มีองค์ความรู้
ใหม่ ๆ ที่สามารถนําไปประยุกต์ใช้ ในการพัฒนาการเรี ยนการสอนและการวิจัยด้ านวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยีได้ ใน
ปั จจุบนั และอนาคต
ในนามผู้จดั การประชุมวิชาการ ฯ และจัดทํารายงานสืบเนื่องการประชุมวิชาการ หวังเป็ นอย่างยิ่งว่า รายงาน
สืบเนื่องการประชุมวิชาการฉบับนีจ้ ะเป็ นประโยชน์ต่อผู้อ่านหรื อผู้สนใจตามสมควร หากมีข้อสงสัยหรื อมีข้อบกพร่ อง
ประการใด คณะผู้จดั การประชุมวิชาการ ยินดีรับฟั งข้ อเสนอแนะและจะนํามาแก้ ไขปรับปรุ งในโอกาสต่อไป และสุดท้ ายนี ้
ขอขอบคุณ ผู้นําเสนอผลงานวิจัย คณะทํางาน ผู้ประเมินผลงานวิจัยทังภายในและภายนอก ้ และหน่วยงานที่ร่วมจัด
ประชุมวิชาการ ฯ ทุกหน่วยงาน โดยหวังเป็ นอย่างยิ่งว่า จะได้ รับความร่ วมมือจากทุกท่านและทุกหน่วยงานอีกครัง้ ใน
โอกาสต่อไป

(อาจารย์ ดร.ศิริวรรณ ตันตระวาณิชย์)

คณบดีคณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
ประธานคณะกรรมการฝ่ ายอํานวยการ
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
ที่ปรึกษา
อาจารย์ ดร.ศิริวรรณ ตันตระวาณิชย์
รองศาสตราจารย์ ดร.ทัศนีย์ ปั ญจานนท์
อาจารย์พรทิพย์ ตันติวงศ์
อาจารย์ ดร.กันภา สุขลิ ้ม
อาจารย์ ดร.ปั ณณ์รภัส ถกลภักดี
บรรณาธิการ
อาจารย์ ดร.ประยูรศักดิ์ เปลื ้องผล
อาจารย์ ดร.สุรีย์พร หอมวิเศษวงศา
กองบรรณาธิการ
รองศาสตราจารย์ ดร.บังอร ฉางทรัพย์
อาจารย์ ดร.ชัชวาลย์ ช่างทํา
อาจารย์ ดร.ปิ ยาภรณ์ สุภคั ดํารงกุล
อาจารย์ ดร.สุกญ
ั ญา เพชรศิริเวทย์
อาจารย์ ดร.พนนา กิติไพศาลนนท์
อาจารย์จนั เพ็ญ บางสํารวจ
อาจารย์เปรมรัตน์ พูลสวัสดิ์
อาจารย์วิภาพรรณ ชนะภักดิ์
ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ธเนศ พงศ์ธีรัตน์
อาจารย์ ดร.สิริภทั ร ชมัฒพงษ์
ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ศศมล ผาสุข
อาจารย์ ดร.สุภณิดา พัฒธร
ปก – ศิลปกรรม
ว่าที่ร้อยตรี เทพสุรีย์ จันสามารถ
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรังสิต
วิทยาลัยการแพทย์แผนไทย มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี
คณะเทคโนโลยีการเกษตร มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์
ในพระบรมราชูปถัมภ์
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์
ในพระบรมราชูปถัมภ์
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรังสิต
วิทยาลัยการแพทย์แผนไทย มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์
ในพระบรมราชูปถัมภ์
คณะเทคโนโลยีการเกษตร มหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์
ในพระบรมราชูปถัมภ์
คณะวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

สารบัญ

ชื่อเรื่ อง หน้ า
1. Free radical scavenging and antioxidant properties of Molineria latifolia Herb. extracts 1

2. In vitro anti-melanogenesis on murine melanoma cell line (B16F10) and tyrosinase inhibition activity of 5

Hypoxis aurea Lour. leave extracts

3. Phytochemical screening and antioxidant activities of Thai betel quids 9

4. Antioxidant activities of Vernonia cinerea and Murraya siamensis 13

5. องค์ประกอบทางเคมีและฤทธิ์การกระตุ้นการงอกของเมล็ดพืชของสารสกัดจากเปลือกต้ นเคี่ยม 16

6. การทดสอบความเป็ นพิษแบบเฉียบพลันของตํารับยาสมุนไพรรักษาโรคความดันโลหิตสูงตํารับหมอชุบ 20

7. การศึกษาสารพฤกษเคมีและฤทธิ์ต้านอนุมลู อิสระของสารสกัดเหง้ าจากว่านตาลเดี่ยว (Hypoxis aurea Lour.) 27

8. การจัดทําฐานข้ อมูลตํารับยาสมุนไพรในเขตจังหวัดปทุมธานี 32

9. Chromatographic fingerprint analysis and antioxidant activities of herbal ingredients in Thai betel 38

quid

10. การศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมลู อิสระ และการตังตํ

้ ารับครี มที่มีสว่ นผสมขิงสารสกัดจากใบชา 42

11. Penicillium spp. isolated from soil from Surat Thani province and their antimicrobial activity 47

12. การตรวจพบเชื ้อสกุล Staphylococcus aureus ในแหล่งนํ ้าจังหวัดภูเก็ต 52

13. การสกัดแอสตาแซนทินจากหัวกุ้ง โดยใช้ เอนไซม์ปาเปนร่วมกับนํ ้ามันพืช 57

14. การวิเคราะห์หาปริมาณของวิตามินซีในนํ ้าผลไม้ สดและนํ ้าผลไม้ บรรจุกล่อง โดยใช้ เครื่ องไฮเพอร์ ฟอร์ มานซ์- 65

ลิควิดโครมาโทกราฟี

15. ความกระด้ างของนํ ้าดื่มจากตู้นํ ้าดื่มหยอดเหรี ยญและเครื่ องกรองบริเวณมหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระ 69

เกียรติและชุมชมใกล้ เคียง

16. Quantity of fluoride ion in drinking water from school in PathumThani district 74
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

ชื่อเรื่ อง หน้ า
17. Comparative high alcohol production in the fermentation of durian peels and jackfruit wastes 78

18. การศึกษาการใช้ สารเรื องแสง BaMgAl10O17: Eu2+ กับรอยลายนิ ้วมือ 82

19. การตรวจวัดไพโรฟอสเฟตแอนไอออนด้ วยเทคนิคการถูกแทนที่ของอินดิเคเตอร์ โดยใช้ สารประกอบ 89

ไดนิวเคลียร์ สงั กะสี (II) กับลิแกนด์ที่เป็ นอนุพนั ธ์ของคาลิกซ์[4]แอรี น

20. Comparative studies of an in vitro anti-acute graft versus host disease and placenta extract 95

growth culture effect of human postnatal organ- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells

21. Prevalence of toxigenic Clostridium difficile isolated from diarrhea patients in King Chulalongkorn 104

Memorial Hospital

22. Mutation analysis of Filaggrin in Thai patients with atopic dermatitis 109

23. Screening of human-derived Lactobacillus Thai isolates with potential hypocholesterolemic effects 113

24. Searching for human-derived Lactobacillus Thai isolates that enhance intestinal barrier function 116

25. การพัฒนาผลิตภัณฑ์ไส้ อวั่ ปลาดุกและความสัมพันธ์ของคุณภาพทางประสาทสัมผัสต่อการยอมรับของ 120

ผู้บริโภค

26. สมบัติทางความร้ อนและทางกลของยางผสม NR/SBR และ NR/NBR เมื่อเติมสารช่วยผสม 125

27. ผลของอัตราการไหลต่อความเข้ มข้ นทางออกด้ านบน ด้ านล่าง และประสิทธิภาพการแยกของไฮโดรไซโคลน 134

ขนาด 50 มิลลิเมตร

28. การศึกษาการออกแบบและสร้ างเครื่ องทดสอบความปลอดภัยทางไฟฟ้าสําหรับเครื่ องมือแพทย์ 141

29. การจัดการพลังงานไฟฟ้าในอาคารของมหาวิทยาลัยราชภัฏวไลยอลงกรณ์ ในพระบรมราชูปถัมภ์ 154

30. Path of transformation from Fm-3m to Cmcm phases 158

31. การเพิ่มผลผลิตของมันสําปะหลังโดยการใช้ เครื่ องตัดท่อนพันธุ์ 161

32. โลหะหนักตกค้ างบางประการในผักบางชนิดของจังหวัดปทุมธานี 165

 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

ชื่อเรื่ อง หน้ า
33. การศึกษาพฤติกรรมสุกรจากการใช้ อปุ กรณ์เสริมต่อสมรรถภาพการผลิตสุกรระยะเล็ก-ขุน 168

34. การศึกษาการออกแบบและสร้ างเครื่ องรักษาด้ วยแสง 171

35. ความสัมพันธ์ระหว่างทัศนคติของนักศึกษาและผลสัมฤทธิ์ทางการเรี ยนสถิติที่เน้ นการใช้ งานโปรแกรม 178

สําเร็จรูป

36. การจําแนกกลุม่ นักศึกษาที่มีผลสัมฤทธิ์ทางการเรี ยนตํ่ารายวิชาแคลคูลสั 1 สาขาเทคโนโลยีสารสนเทศ 186

37. สํารวจความพึงพอใจของนักศึกษาที่มีตอ่ การใช้ iPad ประกอบการเรี ยนวิชาคณิตศาสตร์ และสถิติสําหรับ 192

ชีวิตประจําวัน

38. ระบบแนะนําการเลือกซื ้อกองทุนรวมบนสมาร์ ตโฟน 200

39. ระบบนําเสนอข้ อมูลสถานที่บนระบบปฏิบตั ิการ Android 204

40. เว็บไซต์ข้อมูลเพื่อสุขภาพที่รองรับการใช้ งานของกลุม่ ผู้ใช้ ที่ไม่สามารถใช้ อปุ กรณ์เมาส์ได้ ด้วย OpenCV 210

41. ระบบโลกเสมือนจริงภายในมหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ (HCU 3D Virtual Tour) 214

 st
Proceedings of the 1 Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Free Radical Scavenging and Antioxidant Properties of Molineria latifolia Herb.

Extracts
Rungnapa Kiewyot, Sirisak Yonchai, Kanittha Nakklaing, Orasa Chaichumporn and
Siriphatr Chamutpong*

Thai Traditional Medicine College, Rajamangala University of Technology Thanyaburi,

Pathumthani 12130, Thailand
*Corresponding author. E-mail: siriphatrc@gmail.com

Abstract
Molineria latifolia Herb. is an edible medicinal palm grass. It is widely used in traditional medicine in
many countries. Each part of M. latifolia provides an important function in medical professional. In this
study, the 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH) free radical scavenging and the ferric reducing antioxidant
power (FRAP) assays of different M. latifolia extracts were assessed. All extracts demonstrated eminent
antioxidant properties, which can be used as a potent source of natural antioxidants. The obtained results
determined by DPPH and FRAP assays showed positive correlation. Hot water extract of leaves (L-HWE)
has the highest antioxidant activity compared to ethanolic extract of leaves (L-EE) and roots (Rt-EE) which
has also high commensurate activities. In addition, the total amounts of phenolics and flavonoids were
measured by using gallic acid and quercetin as standards, respectively. The highest phenolics content was
found in Rt-EE (121.09  4.64 g GAE/mg) while L-HWE contains the lowest amounts (39.81  1.89 g
GAE/mg). The amount of flavonoids was highest in L-EE (1.550.03 g QE/mg) and not observed in the
water extraction at room temperature of root (Rt-RWE). In conclusion, we were able to assess the
antioxidant activities and phenolic and flavonoid amounts in Molineria extracts; however, the results of
antioxidant activities and phenolic and flavonoid contents were not related. To further investigate the
property of M. latifolia, the determination of other bioactive substances such as tannins or alkaloids is
required.

Keywords: Molineria latifolia, Free radical scavenging, Antioxidant, DPPH, FRAP

Introduction disorders; fruits which have sweet-tasting and taste-

Antioxidants play important function in cellular
protection from the damage caused by fluctuating
molecules known as free radicals or reactive oxygen
species (ROS). They can trap free radicals that might
have harmful actions to cellular system [1]. Free radicals
generated by oxidation during metabolism processes and
other activities in the body may lead to oxidative stress
[2]. This oxidative stress can trigger numerous human
diseases, such as cancer, cardiovascular diseases,
neurological diseases, inflammatory diseases,
hemochromatosis and many others [3, 4]. Plants are rich
source of antioxidants that possess diversify group of
physical and chemical compounds, including phenolics,
nitrogen containing compounds, carotenoids, alkaloids
and organosulfur compounds [5].
Molineria latifolia Herb. belongs to the family
Hypocedaceae [6]. It is predominantly grown in
Indochina and the Malay Archipelago regions and widely
used in folk medicine in many countries. Each part of M.
latifolia has an essential role in preventing many
metabolic diseases, for example, decoction of the
rhizome drunk for menorrhagia and fever; flowers and
roots are used as stomachic and diuretic in genito-urinary
modifying activities are used for diabetes control and
poultice of the leaves is exerted on inflammations and
wounds. Therefore, based on the evidences above, we
aimed to investigate the free radical scavenging and
antioxidant properties of M. latifolia extracts in this
study.
Materials and Methods
Preparation of plant extracts
Fresh leaves and roots of M. latifolia were collected
from Phuang-Thong District, Chonburi Province,
Thailand in December 2012. Leaves and roots were
cleaned with tap water and dried at 50C for 12-18 hrs.
Then they were separately fine powdered and passed
through 80 mm mesh sieve.
One part each of powdered plant material was
mixed with twelve parts of distilled water or ethanol
(1:12 w/v ratio). At room temperature, both water and
ethanol mixtures were shaken individually at 250 rpm on
an orbital shaker for 24 hrs. At 100°C, only water
mixtures boiled at 100°C for 2 hours. The extracts were
filtered using Whatman No. 1 filter paper and

1
 st
Proceedings of the 1 Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

subsequently concentrated under vacuum evaporation at quercetin calibration curve. The results were expressed in
50C and freeze-drying into powders. mg quercetin (QE)/g extracts.

2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazil free radical scavenging Statistical analysis

assay (DPPH Assay) The results obtained were conducted in triplicate
and reported as mean ± SD. Statistical analysis was
DPPH free radical scavenging assay was
performed using SPSS statistical program with the one
conducted using the method of Schlesier et al. [8] with
way ANOVA using Turkey method. A significance level
some modification. Briefly, various concentrations of
of P < 0.05 was considered statistically significant.
each extracts were added to 0.1 mM ethanolic solution of
DPPH at an equal volume. The mixture was incubated in
the dark place at room temperature for 20 min and the Results and Discussion
absorbance was recorded at 517 nm using the Biomate 6 Determination of antioxidant activities
UV/Vis- spectrophotometer (Thermo Scientific, USA).
Vitamin C was used for the standard control. The activity Antioxidants are important substance which plays a
was presented as the percentage inhibition against DPPH crucial role in cellular protection from the damage
and was calculated using the following equation: caused by unstable molecules known as free radicals.
% inhibition = [1- (sample OD/ control OD)] x 100 The activities of hydrogen donating capability to a free
radical make it stable and become unreactive species [1,
Ferric Reducing Power Assay (FRAP) 2]. In this study, DPPH free radical scavenging and
FRAP assays of Molineria latifolia extracts are shown in
FRAP Assay was performed using the protocol of Table 1. The results revealed that M. latifolia extracts
Benzie and Strain [9]. FRAP reagent was freshly have high antioxidant properties. Both DPPH and FRAP
prepared by mixing 300 mM acetate buffer, pH 3.6; 10 assays showed related results. The ferric reducing ability
mM TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine, ACROS of the extracts was in the range of 363.46 – 1,414.29 m
Organics, USA) in 40 mM HCl (Merck, Germany); and Fe2+/mg. Hot water extract of leaves (L-HWE) had the
20 mM FeCl3.6H2O (BDH, England) in the ratio of highest antioxidant activity. Its capability to reduce Fe3+
10:1:1. It was incubated at 37°C for 30 min. to Fe2+ was 5 times lower than vitamin C standard and L-
Subsequently, 1 ml of FRAP reagent was added to 1 ml HWE exhibited the inhibitory against DPPH radicals
of extracts and the reaction mixture was kept at 37°C for with EC50 of 139.22 g/ml. Of these, the water extracts of
10 min. The absorbance was read at 593 nm. The leaves at room temperature (L-RWE) had lower activity
calibration curve was done by using FeSO4.7H2O (10- than other extracts (DPPH EC50= 267.71  0.24, Frap
250 M, BDH) for standard control. Total reducing value= 363.46  3.47 m Fe2+/mg).
power of the electron donating antioxidants present in the
reaction mixture was expressed in M Fe2+/mg extract. Table 1: Antioxidant activities of M. latifolia extracts.
Determination of total phenolic content
DPPH
FRAP Value
The total phenolic content of the extracts was Scavenging
Extracts (m Fe2+/mg
measured as described by Singleton and Rossi [10] using Activity (EC50
extracts)
Folin-Ciocalteu method. Folin–Ciocalteu reagent was g/ml)
diluted 10 times with distilled water. The volume of 0.75 Water extraction at
room temperature
ml of the diluted reagent was mixed with 0.1 ml of 1
Leaves 267.71  0.24 363.46  3.47
mg/ml extracts which dissolved in the respective
Roots 178.95  0.76 434.31  11.45
solvents. The reaction mixture was placed at room
Hot water extract
temperature for 5 min. After that, 0.75 ml of 6% Na2CO3
Leaves 139.22  1.54 1,414.29  58.40
(BDH) was added and incubated at room temperature for
Roots 272.30  0.71 887.14  40.61
90 min. The absorbance was measured at 725 nm. Total
Ethanolic extract
phenolic content was expressed as mg gallic acid (Sigma,
Leaves 156.58  0.66 930.51  60.47
USA) equivalents (GAE)/g of extracts by comparison
Roots 165.21  0.30 990.96  68.67
with gallic acid standard curve.
Vitamin C 3.92  0.63 7,562.89  54.21
Determination of total flavonoid content
Dose response curve of DPPH free radical
The total flavonoid content was determined scavenging activity of the extracts (Figure 1) displayed
according to the method of Adedapo et al. [11]. One that the activity increased with increasing concentration
milligram of extract was dissolved in 1 ml of particular of all the extracts.
solvents. Then 1 ml of the each extract was added to 2%
ethanolic AlCl3 solution. The reaction mixture was
incubated for 1 hr at room temperature. The yellow color
was developed and the absorbance was estimated at 420
nm. The amount of flavonoids was calculated using

2
 st
Proceedings of the 1 Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Table 2: Total phenolic and flavonoid contents in

M. latifolia extracts.

Total phenolics Total flavonoids

Extracts (g GAE/mg (g QE/mg of
of extracts) extracts)
Water extraction at
room temperature
Leaves 68.33  1.21 0.10  0.02
Roots 55.00  1.44 n.d*
Hot water extract
Leaves 39.81  1.89 0.36  0.00
Roots 63.89  1.82 0.25  0.08
Ethanolic extract
Leaves 75.93  3.79 1.55  0.03
Roots 121.09  4.64 1.05  0.20

Figure 1. DPPH scavenging activity of the M. latifolia *n.d: not detected

extracts.
Determination of total phenolic and flavonoid
contents
Phenolic compounds, such as flavonoids, tannins,
and phenolic acids, are large and heterogeneous groups
in plant species. They possess good antioxidant
properties. Due to their chemical structures containing
one or more hydroxyl groups (-OH) bonded to an
aromatic ring, phenolic compounds have the ability of
phenoxide ion delocalize. The phenoxide ion can lose a
further electron to form the corresponding radical which
can also delocalize. Therefore, phenolic compounds have
radical scavenging and antioxidant property [1].
Therefore, the total amounts of phenolics and flavonoids
were investigated to correlate with antioxidant activities
of M. latifolia extracts. Table 2 shows the phenolic and
flavonoid contents that measured by using gallic acid and
quercetin as standards, respectively. The abundance of
phenolic compounds was found in the ethanolic extracts.
The highest phenolic content was detected in Rt-EE
(121.094.64 g GAE/mg) while L-HWE contained the
lowest amount (39.811.89 g GAE/mg). The amount of
flavonoids was highest in the ethanolic extract of leaves
(L-EE, 1.550.03 g QE/mg) and not observed in Rt-
RWE. The results of antioxidant activities and total
phenolic and flavonoid contents were not correlated. To
further investigate the relationship between antioxidant
activities and chemical compositions of M. latifolia, the
determination of other bioactive substances, such as
tannins or alkaloids, is required.
Conclusions
The results of this study indicated that Molineria
latifolia has high antioxidant activity using DPPH and
FRAP assays, and could be a potential natural
antioxidant. The relationship between antioxidant
activities and the total phenolic and flavonoid contents
were not observed. Further work is required to
determine other bioactive components that may have
contributed to the high antioxidant activities.
3
Acknowledgments
This project was supported by Thai Traditional
Medicine College, Rajamangala University of
Technology Thanyaburi (RMUTT), Thailand. We thank
the office of the Forest Herbarium, Department of
National Parks, Wildlife and Plant Conservation,
Thailand and the faculty of Science and Technology,
RMUTT for technical support.
References
[1] Maestri, D.M., Nepote, V., Lamarque, A.L. and
Zygadlo, J.A. (2006). Natural products as
antioxidants. In: Imperato, F. (ed.), Phytochemistry:
Advances in Research. Kerala: Research Signpost.
pp. 105.
[2] Hamid, A.A., Aiyelaagbe, O.O., Usman, L.A.,
Ameen, O.M. and Lawal, A. (2010). Antioxidants:
its medicinal and pharmacological applications.
African Journal of Pure and Applied Chemistry.
4(8): 142-151.
[3] Aruoma, O.I. (1998). Free radicals, oxidative stress,
and antioxidants in human health and disease.
Journal of the American Oil Chemists Society.
75(2): 199-212.
[4] Lobo, V., Patil, A., Phatak, A. and Chandra, N.
(2010). Free radicals, antioxidants and functional
foods: Impact on human health. Pharmacognosy
Reviews. 4(8): 118-126.
[5] Shyamala, S. and Vasantha, K. (2010). Free radical
scavenging and antioxidant activity of leaves from
Agathi (Sesbania grandiflora) (L.) Pers. American-
Eurasian Journal of Scientific Research. 5(2): 114-
119.
[6] Chong, K.Y., Tan, H.T.W. and Corlett, R.T. (2009).
A checklist of the total vascular plant flora of
Singapore: native, naturalised and cultivated
species. Raffles Museum of Biodiversity Research,
National University of Singapore, Singapore.
[7] US Patent Application No: 2011/0223, 270. (2011).
Uses of Curculigo latifolia (C. latifolia) extracts.
 st
Proceedings of the 1 Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

[8] Schlesier, K., Harwat, M., Bohm, V. and Bitsch, R.

(2002). Assessment of antioxidant activity by using
different in vitro methods. Free Radical Research.
36: 177-187.
[9] Benzie, I.F. and Strain, J.J. (1999). Ferric
reducing/antioxidant power assay: direct measure of
total antioxidant activity of biological fluids and
modified version for simultaneous measurement of
total antioxidant power and ascorbic acid
concentration. Methods in Enzymology. 299:15-27.
[10] Singleton, V.L. and Rossi, J.A. (1965).
Colorimetry of total phenolics with
phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagent.
American Journal of Enology and Viticulture. 16:
144-158.
[11] Adedapo, A.A., Jimoh, F.O., Afolayan, A.J and
Masika, P.J. (2009). Antioxidant properties of the
methanol extracts of the leaves and stems of Celtis
Africana. Records of Natural Products. 3: 23-31.

4
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

In vitro Anti-Melanogenesis on Murine Melanoma Cell Line (B16F10) and

Tyrosinase Inhibition Activity of Hypoxis aurea Lour. Leave Extracts

Korawinwich Boonpisuttinant1*, Ausa Sodamook1, Supassorn Keawklin1 Janyaporn Yuenying1,

Pakawadee Srisanga1, Khanitta Meepradit1 and Supanida Winitchai2

1
Thai Traditional Medicine College (TMC), Rajamangala University of Technology Thanyaburi,
Pathumthani 12130, Thailand
2
Kasetsart Agricultural and Agro-Industrial Product Improvement Institute (KAPI), Kasetsart University
Bangkok 10300, Thailand
*Corresponding author. E-mail: wataru_dream@hotmail.com

Abstract
Hypoxis aurea Lour. is the Thai traditional plant from genus Hypoxidaceae, which has been used to
treat acnes, dark spots and blemish. The yields of the leave extracts by macerations with distilled water (HW)
and 95%(v/v) ethanol (HE) were 25.47 and 4.83% respectively. At the concentration of 0.1 mg/ml, the HE
extract showed superior anti-melanogenesis on B16F10 murine melanoma cells when compared with the HW
(p < 0.05). The HE extracts showed the highest tyrosinase inhibition activity by the modified dopachrome
method, which was comparable with the standard vitamin C (p < 0.05), whereas demonstrated the moderate
free radical scavenging activity by the DPPH assay. This study has suggested that the leave from H. aurea
Lour. extracted by 95%(v/v) ethanol can be applied as a whitening agent for the development of cosmetic
production.

Keywords: Tyrosinase, Malanogenesis, Hypoxis aurea Lour., DPPH assay, Bioactivity

Introduction acnes, dark spots and blemish in Thailand. This present

study has investigated the in vitro anti-melanogenesis on
In melanogenesis, the tyrosinase which is an
enzyme-copper containing and catalyzes the two B16F10 cells and tyrosinase inhibition activity as well as
reactions, hydroxylation and oxidation, can change L- free radical scavenging activity of the H. aurea Lour.
tyrosine to L-dopa and L-dopa to o-dopaquinone-H+, and leave extracts, in order to evaluate the usability of the
then pass the intermediates finally to melanin [1]. extracts as a tyrosinase inhibitor for whitening products.
Melanin is the polyphenolic pigment, which is
responsible for the colour of eyes, hair and skin in
animals [2]. Melanin plays an important role in
protecting the skin from ultraviolet (UV) radiation
damages and removing reactive oxygen species (ROS).
However, the high melanin accumulation and
overproduction can cause the skin problems such as dark
spots, melasma, freckles and several hyperpigmentation
syndromes, which are the sign of aging [3]. In addition,
ROS play a significant role in the regulation of the Figure 1. Leaves and flower of the H. aurea Lour.
melanogenesis. Vitamin C and L-glutathione are a
tyrosinase inhibitor and ROS scavenger, which can
down-regulate melanogenesis [4]. As well, several a Materials and Methods
tyrosinase inhibitors and ROS scavengers from natural
Extraction of the H. aurea Lour. Leaves
products can inhibit melanogenesis such as Artocarpus
lakoocha heartwood extract which is the anti-tyrosinase The leaves of H. aurea Lour. were collected from
and improve skin whitening [5]. Kanchanaburi, Thailand during October 2012. The
Hypoxis aurea Lour. (or Star grass) is the plant from specimen was authenticated by Mr. Tanongsak
genus Hypoxidaceae (Figure 1), which is widely Jonganurak, a botanist at Forest Herbarium-BKF,
distributed in Torrid Zone in the world especially China, Department of National Parks, Wildlife and Plant
Japan and Southeast of Asian countries including Conservation, Thailand. The fresh leaves were dried,
Thailand. For the traditional medicine evidences, H. ground to powder and kept at dry place. The powder was
aurea Lour. has been used to treat hernia and warm macerated with distilled water or 95% (v/v) ethanol at
kidney in China [6], while it can be used for treatment of room temperature (25±2C) for 24 hr. The extract was
5
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
filtered through Whatman no.1 filter paper connected to a
vacuum pump. The filtrates were collected, pooled and
concentrated using a rotary evaporator. The dried extracts
were kept in an amber vial until use. The percentage
yields were calculated on the dry weight basis.
Anti-melanogenesis activity on murine melanoma
(B16F10) cell line
Cytotoxicity assay of the extracts at various
concentrations (0.001-10 mg/ml) on B16F10 cells (ATCC,
Virginia, USA) at 24 hr was determined by the MTT
assay [7] to evaluate for the appropriate concentration that
gave more than 80% cell viability in order to use in the
melanogenesis assay.
Melanogenesis assay: The melanin content was
measured according to the previously described method
with some slight modifications [8]. Briefly, cells at the
density of 105 cells/well were plated in 6-well plates and
incubated overnight. The extracts were then added and
incubated for 24 hr. The standard whitening agent,
vitamin C (Sigma-Aldrich, USA) was used as a positive
control. The cells were then washed with 1X PBS,
dissolved in 500 µl of 10% NaOH, and incubated at 60°C
for 1 h. The absorbance was measured at 450 nm using a
microplate reader (Z-TEK 340r, Austria) and the melanin
amount was determined in comparison with the standard
melanin. The percentages of the melanin content were
calculated as the following:
% Melanin content = (Mt/Mc) x 100
Where, Mt was the melanin content of the treated
samples, and Mc was the melanin content of the control.
Tyrosinase inhibition activity
Tyrosinase inhibition activity was assayed by the
modified dopachrome method using tyrosine as a
substrate as previously described [9]. Briefly, 50 µl of the
samples at various concentrations, 50 µl of 0.1 mg/ml L-
tyrosine (Sigma-Aldrich, USA), 50 µl of 0.1 mg/ml
mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich, USA), and 50 µl of
0.1mM phosphate buffer were added in 96-well
microplates. Vitamin C was used as a standard. The
mixture was incubated at 37C for 60 min. Before and
after incubations, the absorbances were measured at 450
nm by a microplate reader. The percentages of tyrosinase
inhibition were calculated according to the following
equation:
% Inhibition activity = [(A-B) - (C-D)]/(A-B) x 100
Where, A was the absorbance of the blank after
incubation, B was the absorbance of the blank before
incubation, C was the absorbance of the samples after
incubation, and D was the absorbance of the samples
before incubation. The concentrations providing 50%
inhibition (IC50) was calculated from the graph plotted
between % inhibition activity and the concentrations.
6
Free radical scavenging activity
Free radical scavenging activity of the extracts was
determined by DPPH assay as previously described [10].
Briefly, 50 µl of the samples at the various
concentrations and 50 µl of DPPH (Sigma-Aldrich,
USA) solution (0.5 mg/ml in ethanol) were put into each
well of a 96-well microplate. The absorbances were
measured by a microplate reader at 515 nm after 30 min
of the reaction at 25ºC. Vitamin C was used as a
standard. The percentages of the DPPH radical
scavenging activity were calculated as the following:
% Scavenging = [(A0 - A1)/Ao] x 100
Where, A0 was the absorbance of the control and A1 was
the absorbance of the treated sample. The concentrations
providing 50% scavenging (SC50) were calculated from
the graph plotted between the free radical scavenging
percentages and the sample concentrations.
Statistical analysis
The results were presented as the mean  SD of
three independent experiments. ANOVA was used for
the analysis of the test results (LSD test) at the
significance level of p-value <0.05.
Results and Discussion
The yields and characteristics of the leave extracts
The plant, H. aurea Lour. has been known as a
whitening agent in Thailand long times ago. The
extraction processes on this study were prepared
following the traditional methods with a slightly
modification. The yields and characteristics of the leave
extracts were shown in Table 1. The yield of the leave
extract by maceration with distilled water (HW) showed
the higher yield than by maceration with 95% (v/v)
ethanol (HE) of about 5 times.
Table 1: The percentages of yields and characteristics of
the H. aurea Lour. leave extracts.
Extracts Yields (%) Characteristics
HW 25.47 Deeply green
Viscous
Odorless
HE 4.83 Deeply green-Black
Viscous-oily
Slight odor
Note: HW was the leave extract of H. aurea Lour.
prepared by maceration with distilled water; and HE was
the leave extract of H. aurea Lour. prepared by
maceration with 95% ethanol
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Anti-melanogenesis of the leave extracts It has been reported that H. aurea Lour. contains
glycosides [6], which is an antioxidant and tyrosinase
The final concentrations of the leave extracts and
inhibitor [13, 14]. The decrease of tyrosinase activity as
vitamin C used as a positive control at 0.1 mg/ml showed
well as the presence of radical scavenging activity
no cytotoxicity on the B16F10 cells with the cell growth of
directly relates to down- regulate on the melanogenesis
>80% (data not showed). Therefore, the selected
[15].
concentration at 0.1 mg/ml of the extracts and the vitamin
C was used for determination of melanin content in the
cells. Figure 2 demonstrated the anti-melanogenesis by
the leave extracts on B16F10 cells compared with the
vitamin C.

* *

Figure 2. Anti-melanogenesis by the leave extracts on B16F10 cells. The HE was the leave extract from H. aurea Lour.
prepared by the maceration with 95%(v/v) ethanol; and the HW was the leave extract from H. aurea Lour. prepared by
the maceration with distilled water at ambient temperature (25 ± 2°C). The concentration of the extracts and the vitamin
C was 0.1 mg/ml. Each value is expressed in Mean ± SD (n = 3). Superscript asterisks (*) in the columns indicate
significant differences compared with the control (p < 0.05).

The H. aurea Lour. leave extracts at 0.1 mg/ml Table 2: Tyrosinase inhibition activity by the modified
demonstrated the anti-melanogenesis on the B16F10 cells dopachrome method (IC50 values) and free radical
at 24 hr. The HE extract showed superior anti- scavenging activity by DPPH assay (SC50 values) of the
melanogenesis to the HW extracts of about 3 times, and H. aurea Lour. leave extracts
comparable with the standard vitamin C (p < 0.05). This
might be due to some phytochemicals contents in the Extracts IC50 SC50
extracts that act as a tyrosinase inhibitor or anti-oxidant as
the standard vitamin C. It have been reported that (mg/ml) (mg/ml)
phytochemical containing in several plant extracts such as HW 1.34 ± 0.10a 1.19 ± 0.29a
tannins, phenolic compounds showed anti-melanogenesis
on B16F10 cell line [11, 12] HE 0.11 ± 0.03b 0.44 ± 0.02a
Vitamin C 0.13 ± 0.02b 0.05 ± 0.01b
Tyrosinase inhibition and DPPH radical scavenging
activities of the leave extracts Note: HW was the leave extract of H. aurea Lour.
Both leave extracts gave both the tyrosinase prepared by maceration with distilled water; and HE was
inhibition activity by the modified dopachrome method the leave extract of H. aurea Lour. prepared by
and free radical scavenging activity by DPPH assay maceration with 95% ethanol. Each value is expressed in
(Table 2). In addition, the tyrosinase inhibition activity of Mean ± SD (n = 3). Superscript letters (a and b) in the
the HE extracts was significant comparable with the same columns indicate significant differences (p < 0.05).
standard vitamin C (p < 0.05), while both extracts showed
moderate free radical scavenging activity.

7
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
Moreover, the HE extract showed higher the activities
than by the HW extract. This might be due to different
phytochemicals containing in these extracts. The
phytochemical contents in the leave extracts of H. aurea
Lour. will be further investigated.
Conclusions
The leave extract from H. aurea Lour. prepared by
the maceration with 95%(v/v) ethanol at ambient
temperature (25 ± 2°C) demonstrated the anti-
melanogenesis on murine malanoma (B16F10) cells
comparable to vitamin C via by the inhibition of
tyrosinase activity as well as the free radical scavenging
activity, This study has suggested that the HE extract can
be further developed as a tyrosinase inhibitor for
whitening products.
Acknowledgements
This work was financial supported by Thai
Traditional Medicine College (TMC), Rajamangala
University of Technology Thanyaburi (RMUTT),
Thailand.
References
[1] García-Molina, F., Fenoll, L.G., Morote, J.C.,
García-Ruiz, P.A., Rodríguez-López, J.N., García-
Cánovas, F. and Tudela, J. (2005). Opposite effects
of peroxidase in the initial stages of tyrosinase-
catalysed melanin biosynthesis. The International
Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37:
1179-1196.
[2] Hoogduijn, M.J., Cemeli, E., Ross, K., Anderson,
D., Thody, A.J. and Wooda, J.M. (2004). Melanin
protects melanocytes and keratinocytes against
H2O2-induced DNA strand breaks through its ability
to bind Ca2+. Experimental Cell Research. 294: 60-
67.
[3] Briganti, S., Camera, E. and Picardo, M. (2003).
Chemical and instrumental approaches to treat
hyperpigmentation. Pigment Cell Research. 16(2):
101-110.
[4] Huey-Chun, H., Wan-Yu, H., Yu-Lin, N. and
Tsong-Min, C. (2012). Inhibition of melanogenesis
and antioxidant properties of Magnolia grandiflora
L. flower extract. BMC Complementary and
Alternative Medicine. 12(72): 1-9.
[5] Tengamnuay, P., Pengrungruangwong, K.,
Pheansri, I. and Likhitwitayawuid, K. (2006).
Artocarpus lakoocha heartwood extract as novel
cosmetic ingredient: evaluation of the in vitro anti
tyrosinase and in vivo skin whitening activities.
International Journal of Cosmetic Science. 28: 269-
276.
8
[6] Zhong-Quan, C., Dan, Y., Yu-Qing, L., Jiang-
Miao, H., He-Zhong, J., Peng-Cheng, et al. (2009).
Two new phenolic glycosides from Hypoxis aurea
Lour. Bulletin Korean Chemistry Society. 30(10):
2446-2448.
[7] Boonpisuttinant, K., Manosroi, A., Rahmat, D., and
Monosroi, J. (2012). Enhancement of in vitro
membrane permeation and anti-proliferative on
cancer cell lines of aqueous extracts from Thai anti-
cancer medicinal plants by entrapping in chitosan
and chitosan-TGA nanoparticles. Journal of
Advance Science Letters. 17: 206-216.
[8] Oka, M., Iizuka, N., Yamamoto, K., Gondo, T.,
Abe, T., Hazama, S., et al. (1996). The influence of
interleukin-6 on the growth of human esophageal
cancer cell lines. Journal of Interferon Cytokine
Research. 16(12): 1001-1006.
[9] Manosroi, A., Boonpisuttinant, K., Winitchai, S.,
and Manosroi, J. (2010). Free radical scavenging
and tyrosinase inhibition activity of oil and sericin
extracted from Thai native silkworms Bombyx mori.
Pharmaceutical Biology. 48(8): 855-860.
[10] Manosroi, J., Boonpisuttinant, K., Manosroi, W.
and Manosroi, A. (2012). Anti-cancer activities on
HeLa cell lines of anti-cancer medicinal recipes
selected from Thai/ Lanna medicinal plant recipe
database MANOSROI II. Journal of
Ethnopharmacology 142: 422-431.
[11] Gomez-Cordoves, C., Bartolome, B., Vieira, W.
and Virador, V.M. (2001). Effects of wine
phenolics and sorghum tanninson tyrosinase activity
and growth of melanoma cells. Journal of
agricultural and food chemistry. 49(3): 1620-1624.
[12] Kawabata, T., Cui, M.Y., Hasegawa, T., Takano, F.
and Ohta, T. (2011). Anti-inflammatory and anti-
melanogenic steroidal saponin glycosides from
Fenugreek (Trigonella foenumgraecum L.) seeds.
Planta Medicine. 77(7): 705-710.
[13] Pujimulyani, D., Raharjo, S., Marsono, Y. and
Santoso, U. (2012). The effect of blanching on
antioxidant activity and glycosides of white saffron
(Curcuma mangga Val.). International Food
Research Journal. 19(2): 617-621.
[14] Khan, M.T.H., Choudhary, M.I., Rahman, A.,
Mamedova, R.P., Agzamova, M.A.,
Sultankhodzhaev, M.N., et al. (2006). Tyrosinase
inhibition studies of cycloartane and cucurbitane
glycosides and their structure–activity relationships.
Bioorganic and Medicinal Chemistry. 14: 6085-
6088.
[15] Chang, T.S. (2012). Natural melanogenesis
inhibitors acting through the down-regulation of
tyrosinase activity. Materials. 5: 1661-1685.
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Thai Betel Quids

Chernkwan Mookprom1, Philaslak Pooprommin1, Pattamawan Ruangdet1,
Khemjira Jarmkom1, Somnuek Suchaitanavanit2 and Chanai Noysang1*
1
Thai Traditionnal Medicine College, Ragamangala University of Technology Thanyaburi,
Pathumthani 12130, Thailand
2
Institute of Thai Traditional Medicine, Department for Development of Thai Traditional and
Alternative Medicine, Ministry of Public Health, BIOTEC Pilot Plant, Thailand Science Park,
Pathumthani 12130, Thailand
*Corresponding author. E-mail: c.noysang@yahoo.com

Abstract
The preliminary phytochemical screening of Thai betel quids was done and HPTLC studies were
carried out CAMAG HPTLC system. Antioxidative effects of ethanolic extracts from Thai betel quids
studied with the use of three in vitro assays - DPPH reduction spectrophotometric assay. The phytochemical
screening of The Thai betel quids showed the presence of carbohydrates, alkaloids, terpenoid, protein, fixed
oil, glycosides, flavanoids, and gum. HPTLC fingerprinting of ethanolic extracts of Thai betel quid mixed
red lime preparation revealed two main spots with hRf values of 79 and 86; Thai betel quid without red
lime preparation showed two main spot with hRf values of 31 and 59. In the screening of antioxidant
activities, concentration of the Thai betel quids (Thai betel quid mixed red lime preparation and Thai betel
quid without red lime preparation) required for 50 effective concentration radical scavenging effect (EC50)
were recorded as 0.180 ±0.020 and 0.089 ±0.001 μg/mL, respectively. All Thai betel quids showed potential
inhibition of scavenging activity on DPPH free radical.

Keywords: Thai betel quid, Antioxidant activity, HPTLC fingerprinting

Introduction fingerprint profile and evaluate the antioxidant activities

Reactive oxygen species (ROS) cause oxidative damage
to nucleic acids, proteins, and lipids and are known to be
associated with aging, carcinogenesis, and other diseases
[1-2]. Research are becoming steadily more interested in
discovering new antioxidants from natural sources.
Medicinal plants used in traditional medicine contain
many phytochemicals and play a major antioxidant role
in helping endogenous antioxidants to neutralize activity
to authenticate the medicinal properties of oxidative
stress. Betel quid has commonly been used in South and
Southeast Asia and Asia Pacific region including rural
areas of Thailand for a long time. Because of its ancient
history, its use is socially acceptable among all sections
of society [3]. Thai betel quid is a combination of betel
leaf, areca nut, catechu resin, and slaked lime (aqueous
calcium hydroxide paste). Tobacco is commonly used in
conjunction with Thai betel quid. Ingredients in betel
quid produce complex interactions during chewing. For
example, when betel quid is chewed with lime, arecoline
and guvacoline are metabolized into arecaidine and
guvacine, respectively [1]. Research evidence on the
effects of Thai betel quid towards oral cancer and oral
soft tissue lesions is ample [4-14]. However, only a
limited number of studies have been reported on
chemical constituents and pharmacological activity of
Thai betel quid. Therefore the aims of the present study
were to evaluate two main aims: to establish the
of ethanolic extracts of Thai betel quids.
Materials and Methods
Plant material
The plant material from following species was
studied: Acacia catechu (L.f) Wild (Catechu resin),
Areca catechu L. (Areca nut), and Piper betel L. (betel
leaf). The materials were purchased from local
indigenous market (Chachoengsao, Chiang Mai, and
Nakhon Pathom, Thailand) in November 2012. The
taxonomic identification was done by Dr. C. Noysang,
Thai Traditional Medicine College, Rajamangala
University of Technology. The voucher specimens have
been deposited in Royal Forestry Department, Bangkok,
Thailand. Thai betel quids information is shown in
Figure 1 and Table 1.
Chemicals and apparatus
2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl
(DPPH), and ascorbic acid were purchased from Sigma
Aldrich-Fluka. For absorbance measurements, Biochrom
Anthos Zenyth 340 Microplate Reader with Optional
Temperature Control was used. A HPTLC scanner with
computer system and WinCats Version Software were
obtained from Camag (Muttenz, Switzerland). Camag
Linomat V was used as applicator. Separation was done

9
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

on silica gel F254 HPTLC precoated plates purchased Table 1: Ingredients of Thai betel quids
from Merck (Germany).
Plants Botanical name Parts Weight
Samples preparation Use (g)
The samples of Thai betel quid mixed red lime (4 g) Catechu Acacia catechu Resin 0.25
and Thai betel quid mixed without lime (4 g) were Tree (L.f.) Willd.
extracted with 100 mL of 70%, and 95% ethanol, Betel Areca catechu L. Nut 0.86
respectively and filtrated. The solvents were completely nut
evaporated to dryness using rotary flash evaporator Betel leaf Piper betle L. Leaf 2.57
(Buchi type). Different extracts were prepared from the Red lime Calcium hydroxide - 0.48
resultant crude ethanol and used for further investigations
of HPTLC fingerprint and in vitro antioxidant activity. Table 2: Phytochemical screening of Thai betel quids.

Phytochemical screening Chemical Thai betel quid Thai betel quid

constituents mixed red lime without red lime
Preliminary phytochemical screening was done Alkaloids +ve +ve
following the method of Ayoola [15]. Carbohydrates +ve +ve
Flavonoids +ve +ve
HPTLC analysis Fix oil +ve +ve
Chromatography was performed on silica gel F254 Glycosides +ve +ve
HPTLC pre-coated plates. Samples were applied on the Gum +ve +ve
plates as band of 8-10 mm width using a Camag Lipids -ve -ve
Linomat V sample applicator at the distance of 8 mm Phenols +ve +ve
from the edge of the plates. The mobile phase composed Proteins +ve +ve
of toluene-ethyl acetate 93:7 (v/v). After development, Saponins -ve -ve
plates were dried and derivatised in Vanillin-sulphuric Tannins +ve +ve
acid reagents. The fingerprints were evaluated at 366 nm Terpenoids +ve +ve
in fluorescence mode with a WinCats and VideoScan +ve: presence, -ve: absence
software.
HPTLC analysis
Antioxidant activity assay
Thai betel quids were studied using HPTLC
The ethanolic extracts were diluted in ethanol fingerprinting. Phytochemical constituents such as
solution at the concentration of 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0.1 carbohydrates, alkaloids, terpenoid, protein, fixed oil,
mg/mL, and 0.01 mg/mL. 100 μl aliquots of the extract glycosides, flavanoids, and gum were identified through
were mixed with 900 μl of the ethanolic DPPH solution qualitative chemical analysis (Table 2). The fingerprint
(0.25g/L). The reduction of the DPPH free radical was of the constituents present in samples was recorded using
measured by reading the absorbance at 517 nm and Camag TLC visualizer and WinCats Software. The
related to the absorbance of the control without the HPTLC fingerprinting of ethanolic extracts of Thai betel
herbal drugs. Inhibition ratio (percent) was calculated quid mixed red lime preparation revealed two main spots
from the following equation: % inhibition [(absorbance with hRf values (chloroform-acetone-formic acid
of control – absorbance of sample)/absorbance of 75:16.5:8.5). Thai betel quid without red lime
control] x 100%. Ascorbic acid was used as positive preparation showed two main spot with hRf values of 31
controls. and 59 (Figure 2).

Results and Discussion

(a) (b) a b c d

Figure 1. Thai betel quids; (a) Thai betel quid mixed red Figure 2. HPTCL-fingerprint of the extracts; (a) 70%, (b)
lime; (b) Thai betel quid mixed without lime 95% ethanolic extracts of Thai Betel Quid with red
lime, (c) 70%, (d) 95% ethanolic extracts of Thai betel
quid without red lime at concentration 30 µL after

10
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

detected with UV-366 nm. The solvent systems Acknowledgments

(chloroform-acetone-formic acid 75:16.5:8.5)
Thanks is due to Dr.Winitchai Supanida from
Kasetsart Agricultural and Agro-Industrial Product
Free radical scavenging assay
Imprevent Institute (KAPI), Kasetsart University,
The DPPH antioxidant assay is based on the ability Thailand for DPPH inhibition assay.
of DPPH, a stable free radical, to decolorize in the
presence of antioxidants. Comparison of the antioxidant References
activity of the Thai betel quid extracts (at a dose of 1
mg/mL and reference standards (at doses of 1 mg/mL) is [1] Wo, I-C., Chien, P-H., Wang, C-J., Wu, D-C.,
shown in Figure 3 and Table 3. The 95% ethanolic Thai, S-M., Chao, M-R., et al. (2010).
extract of Thai betel quid without red lime exhibited an Quantification of blood betel quid alkaloids and
efficient 92.13±0.38% inhibition of DPPH free radical, urinary 8-hydroxydeoxyguanosine in humans and
which higher than ascorbic acid (90.88±4.42%). their association with betel chewing habits. Journal
of Analytical Toxicology. 34: 325-331.
[2] Dizdaroglu, M., Jaruga, P., Birincioglu, M. and
DPPH scavenging activity Rodriguez, H. (2002). Free radical-induced damage
to DNA: mechanisms and measurement. Free
100 Radical Biology and Medicine. 32: 1102–1115.
Inhibition (%)

80
60 [3] Gupta, P.C. and Ray, C.S. (2004). Epidemiology of
40
20
Betel quid usage. Annals Academy of Medicine
0 Singapore. 33: 31-36.
70% ethanolic 95% ethanolic 70% ethanolic 95% ethanolic
of Thai Betel of Thai Betel of Thai Betel of Thai Betel [4] Chatrchaiwiwatana, S. (2006). Dental caries and
Quid with red Quid with red Quid without Quid without
lime lime red lime red lime
periodontitis associated with betel quid chewing:
Ethanolic extracts
analysis of two data sets. Journal of Medicinal
Association of Thailand. 89: 1004-1010.
[5] Yang, Y.H., Lien, Y.C., Ho, P.S., Chen, C.H.,
Chang, J.S., Cheng, T.C., et al. (2005). The effects
Figure 3. DPPH scavenging activity of the ethanolic
of chewing betel quid with and without cigarette
extracts of Thai betel quids at 1mg/ mL; mean with 3
smoking on oral submucous fibrosis and oral
replicates each one (mean± S.D. (n=3))
mucosal lesions. Oral Diseases. 11: 88-94.
[6] Lee, C.H., Lee, J.M., Wu, D.C. Hsu, H.K., Kao,
Table 3: DPPH scavenging activity of ethanolic extract
E.L. Huang, H.L., et al. (2005). Independent and
of Thai Betel Quids (EC50 values).
combined effects of alcohol intake, tobacco
smoking and betel quid chewing on the risk of
Sample EC50 (µg.mL-1) esophageal cancer in Taiwan. International of
70% ethanolic of Thai betel 0.208(±0.018) Journal Cancer. 113: 475-482.
quid with red lime [7] Shieh, D.H., Chiang, L.C., Lee, C.H., Yang, Y.H.
95% ethanolic of Thai betel 0.180(±0.020) and Shieh, T.Y. (2004). Effects of arecoline,
quid with red lime safrole, and nicotine on collagen phagocytosis by
70% ethanolic of Thai betel 0.07(±0.002) human buccal mucosal fibroblasts as a possible
quid without red lime mechanism for oral submucous fibrosis in Taiwan.
95% ethanolic of Thai betel 0.089(±0.001) Journal of Oral Pathology and Medicine. 33: 581-
quid without red lime 587.
Values represent mean± S.D. of three replicates [8] Jacob, B.J., Straif, K., Thomas, G., Ramadas, K.,
Mathew, B., Zhang, Z.F., et al. (2004). Betel quid
Conclusions without tobacco as a risk factor for oral precancers.
Oral Oncology. 40: 697-704.
In the present study, HPTLC fingerprint profile and [9] Chang, K.C., Su, I.J., Tsai, S.T., Shieh, D.B. and
antioxidant activities of the ethanolic extracts of Thai Jin, Y.T. (2002). Pathological features of betel quid-
betel quid were investigated. The solvent systems related oral epithelial lesions in Taiwan with special
(toluene-ethyl acetate, 93:7 v/v) is suitable for the emphasis on the tumor progression and human
analysis of Thai betel quids. The antioxidant activities of papillomavirus association. Oncology. 63: 362-
the 95% ethanolic extract of Thai betel quid without red 369.
lime, possess very strong scavenging activity on DPPH [10] Shiu, M.N. and Chen, T.H. (2004). Impact of betel
free radical with EC50 values of 0.089 ±0.001. quid, tobacco and alcohol on three-stage disease
natural history of oral leukoplakia and cancer:
implication for prevention of oral cancer. European
Journal of Cancer Prevention. 13: 39-45.

11
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

[11] Wang, L.Y., You, S.L., Lu, S.N., Ho, H.C., Wu,
M.H., Sun, C.A., et al. (2003). Risk of
hepatocellular carcinoma and habits of alcohol
drinking, betel quid chewing and cigarette smoking:
a cohort of 2416 HBsAg-seropositive and 9421
HBsAg-seronegative male residents in Taiwan.
Cancer Causes Control. 14: 241-250.
[12] Reichart, P.A., Dietrich, T., Khongkhunthian, P.
and Srisuwan, S. (2003). Decline of oropharyngeal
cancer in Chiang Mai province, Thailand, between
1988 and 1999. Oral Oncology. 39: 569-573.
[13] Chiba, I. (2001). Prevention of betel quid chewers’
oral cancer in the asian-pacific area. Asian Pacific
Journal of Cancer Prevention. 2: 263-269.
[14] Lee, C.H., Ko, Y.C., Huang, H.L., Chao, Y.Y.,
Tsai, C.C., Shieh, T.Y., et al. (2003). The precancer
risk of betel quid chewing, tobacco use and alcohol
consumption in oral leukoplakia and oral
submucous fibrosis in southern Taiwan. British
Journal of Cancer. 88: 366-372.
[15] Ayoola, G.A., Coker, H.A.B., Adesegun, S.A.,
Adepoju-Bello, A.A. (2008). Phytochemical
screening and antioxidant activities of some
selected medicinal plants used for malaria. Therapy
in Southwestern Nigeria, 7: 1019-1024.

12
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Antioxidant Activities of Vernonia cinerea and Murraya siamensis

Suduangman Inpuron1, Luxana Musikachat1, Wanida Boonmark1
Khemjira Jarmkom1, Somnuek Suchaitanavanit2 and Pattaranut Eakwaropas1*
1
Thai Traditional Medicine College, Rajamangala University of Technology Thanyaburi,
Pathumthani 12130, Thailand
2
Thai Traditional Medicines Development Center, Pathumthani 12120, Thailand
*Corresponding author. E-mail: Patty_Natty_1@hotmail.com

Abstract
Vernonia cinerea has been used as herbal tea for cigarette withdrawal smoker. It was developed into
several formulations such as fast-dissolving film, chewing gum and lozenge. Aim of this study was to
investigate antioxidant activities of V. cinerea and Murraya siamensis. M. siamensis is a shrub in Rutaceae
family. It has specific volatile odor. It was studied for odor addition in V. cinerea formulations. V. cinerea
was extracted by maceration with alcohol, infusion and decoction. Volatile oil of M. siamensis was extracted
by water distillation. DPPH assay was used to study antioxidant activities of extracts and ascorbic acid was
used as positive control. Fifty percent inhibition concentration (IC 50) of V. cinerea was extracted by
maceration 5, 15 min infusion and 5, 10, 20 min decoction. The decoction for 5 min exhibited very strong
inhibition effects against DPPH radical with IC50 value of 100.92±3.61 µg/ml. Aqueous extract prepared by 5
min decoction had more effective than other extraction methods. The decoction 5 min extract was chosen for
further study with volatile oil. Extract of M. siamensis was investigated by the same method as V. cinerea.
IC50 of M. siamensis volatile oil was 1,431.56 ± 31.19 g/ml. Mixtures of V. cinerea and M. Siamensis
showed synergistic effect.

Keywords: Vernonia cinerea, Murraya siamensis, Antioxidant

Introduction M. siamensis and the mixtures of V. cinerea extract and

At present, cigarette smokers in Thailand increase
especially in young man and woman groups. Cigarette
contains many free radical substances which had bad
effect to the body.
Vernonia cinerea Less. is a herbaceous plant in
Asteraceae family. In Thai traditional medicine, it has
been used for treatment many diseases such as fever,
cough, jaundice, chronic wound and hypertension. It was
developed into several formulations for smoking
withdrawal such as herbal infusion, soft candy, fast-
dissolving film, chewing gum and lozenge [1]. Its clinical
uses were investigated in several hospitals [1-3].
Wongwiwatthananukit [2] found that V. cinerea might be
an alternative medicine for smoking cessation [2]. In
2010, Leelarungrayub evaluated benefit of V. cinerea
supplementation and exercise. They found that reduce
rate in smoker occurred in the group of V. cinerea
supplementation combined with exercise [3]. The
methanolic extract of V. cinerea showed antioxidant and
anti-choline esterase activities [4].
Murraya siamensis is a small shrub in Rutaceae
family. It has been used for treatment of blurred vision,
snake-poison and tuberculosis [5]. Many volatile oil
glands were seen in its leaves [5]. It was interesting for
odor improvement in V. cinerea formulations.
The objective of this study was to investigate the
antioxidant activities of V. cinerea extracts, volatile oil of
oil of M. siamensis.
Materials and Methods
Materials
The DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) was
purchased from Sigma Aldrich (USA). Vitamin C (L-(+)-
ascorbic acid) was purchased from Riedel-de Haën®
(China). Dried aerial parts of V. cinerea was purchased
from Vejpongosot, Thailand. Fresh leaves of
M. siamensis were purchased from a local market in
Ratchaburi, Thailand.
Methods
Plants Extraction
The dried aerial parts of V. cinerea was heated at
50C for 1 hour and ground into 60 mesh powder. The
powder (15 g) was macerated with 95% ethanol. The
sample was shaken for 30 min at room temperature.
Ethanolic extract was collected and evaporated.
Percentage yield was calculated.
The same powder of V. cinerea as ethanolic
extraction was weighed 50 g per sample. Five samples
were prepared by 5, 15 min infusion, and 5, 10 and 20
min decoction. Aqueous extracts were collected and
spray dried. Percentages yield were calculated.

13
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Fresh leaves of M. siamensis (30 g) were extracted

by water distillation. After 4 hours, oil was collected in
well-closed amber bottle and kept in a cool place.
Percentage yield was calculated.

Antioxidant activities
The antioxidant activities of V. cinerea and M.
siamensis extracts were investigated following the Haque
et al. [4]. DPPH solution and ascorbic acid solution were
used as free radical and positive control, respectively.
For antioxidant activities of V. cinerea extracts
concentrations between 2.5 - 40 mg/ml of ethanolic
solution and 1 - 18 mg/ml of aqueous solution were
prepared. In case of M. siamensis, solution Figure 1. The antioxidant activity of V. cinerea ethanolic
concentrations between 25 - 260 mg/ml were prepared. extract
50 l of each solution was mixed with 5 ml of 40 g/ml
DPPH ethanolic solution. The mixtures were mixed and The fifty percent of inhibition concentration (IC50)
kept in dark condition at room temperature for 30 min. of ethanolic extract was 293.49±24.48 g/ml. Ascorbic
Absorbances of the mixtures were measured by acid was used as positive control which had IC50 2.86±
spectrophotometer at 517 nm. The percentages of 0.22 g/ ml.
inhibitions were calculated by using equation (3). The five samples of V. cinerea aqueous extracts
were investigated. The IC50 of samples were shown in
% inhibition = 1 - ABS sample x 100% (3) Figure 2.
ABS control

Where - ABS sample is the absorbance of the sample

solution
- ABS control is the absorbance of the control
solution (containing all reagents except the extract)

The highest activity of V. cinerea extract was

chosen for mixing with oil of M. siamensis. Then,
antioxidant activities of the mixtures were investigated.
The inhibition values were plotted against
concentrations. The fifty percent of inhibition
concentration (IC50) was calculated from the graph.
Results and Discussion
Percentages yield
The colors of V. cinerea alcoholic extract and
aqueous extracts after spray drying were dark green and
dark brown, respectively. Average alcoholic extract yield
was 4.06 ± 0.37%. The decoction for 5 min had percent
yield which value of 4.12%. All extracts were kept in
desiccator at room temperature.
The volatile oil of M. siamensis was colorless and
its odor was strong. Total oil was 2.56% (w/w) The
extract was kept in refrigerator before further experiment
Antioxidant activities
Antioxidant activities of the extracts were
investigated by DPPH assay (n=3). Figure 1 shows the
percentages of inhibition activities of V. cinerea
ethanolic extract.
Figure 2. The antioxidant activities of V. cinerea aqueous
extracts. (1): 5 min infusion, (2): 15 min infusion, (3): 5
min decoction, (4): 10 min decoction, (5): 20 min
decoction
The aqueous extract which 5 min decoction had the
lowest IC50. It represented high antioxidant activity.
Thus, the sample was chosen for mixing with M.
siamensis.
The volatile oil of M. siamensis showed high
activity against DPPH. The percentages of inhibition
activities of M. siamensis extract solutions were shown in
Figure 3. The IC50 of oil was 1,431.56±31.19 g/ml.
The solution of 5 min decoction of V. cinerea (10
mg/ml) was mixed with M. siamensis oil solution (49.23
mg/ml) in several proportions to final volume 100 l.
The ratio of V. cinerea: M. siamensis; 20:80 30:70,
40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20. Antioxidant activities
of the mixtures were investigated. The inhibition
percentages were plotted against M. siamensis
concentrations (Figure 4)

14
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

[1]
[2] Wongwiwatthananukit, S., Benjanakaskul, P.,
[3] Leelarungrayub, D., Pratanaphon, S., othongsunun,
Figure 3. The antioxidant activity of oil M. siamensis
The IC50 of V. cinerea and M. siamensis in the
mixture were 49.81±2.98 g/ml and 242.28±14.73
g/ml, respectively. Both IC50 values showed synergistic
effect between two extracts. The inhibition activities of
two extracts in the mixture were higher than each extract
[4] Haque, A., Abdullah, C.S., Hassan, M., Parvin, N.,
activity.
[5]
References
อรลักษณา แพรัตกุล. (2553). องค์ประกอบทางเคมี
และฤทธิ์ ท างชี ว ภาพของหมอน้ อ ย และแนวทางการ
พัฒนาตารั บเพื่อใช้ ช่วยเลิกบุหรี่ . วารสารการแพทย์
แผนไทยและการแพทย์ทางเลือก. 8 (1): หน้ า 81-92.
Songsak, T., Suwanamajo S. and Verachai V.,
(2009). Efficacy of Vernonia cinerea for smoking
cessation. Journal of Health Research. 23(1): 31-
36.
P., Sriboonreung, T., Yankai, A. and Bloomer, R.J.
(2010). Vernonia cinerea Less. Supplementation
and strenuous exercise reduce smoking rate:
relation to oxidation stress status and beta-
endorphin release in active smokers. Journal of
International Society of Sports Nutrition 21(7): 1-
10.
Rafique, B. and Mostofa, A.G.M. (2005).
Evaluation of the antioxidant and anti-
cholineesterase activities of the stem, barks and
leaves of the plant Vernonia cinerea (Family:
Asteraceae). Journal of Applied Pharmaceutical
Science. 2(5): 174-176.
วุฒิ วุฒิ ธ รรมราช. (2552). เครื่ อ งยาไทย 1,
กรุ งเทพมหานคร: บริ ษัทศิลป์สยามบรรจุภณ
ั ฑ์และการ
พิมพ์จากัด.

Figure 4. The antioxidant activities of extract mixtures

(The inhibition percentages were plotted against M.
siamensis concentrations.)

Conclusions
The antioxidant activities of V. cinerea extract and
oil of M. siamensis were evaluated. Both plants had
inhibition activities against free radical. M. siamensis oil
not only improved smell of V. cinerea preparation but
also added antioxidant benefit to the preparation.

Acknowledgments
The authors were grateful to Thai Traditional
Medicine College, Rajamangala University of
Technology Thanyaburi for instrumental and financial
support.
15
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

การศึกษาสารพฤกษเคมี และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเหง้ า
จากว่ านตาลเดี่ยว (Hypoxis aurea Lour.)
กรวินท์วชิ ญ์ บุญพิสทุ ธินนั ท์* สุภสั สรณ์ แก้ วกลิน่ จรรยาพร ยืนยิ่ง ผกาวดี ศรี สง่า และขนิษฐา มีประดิษฐ์

วิ ทยาลัยการแพทย์แผนไทย มหาวิ ทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี จังหวัดปทุมธานี 12130

*ผูป้ ระสานงานหลัก อีเมล: wataru_dream@hotmail.com

บทคัดย่ อ
ว่านตาลเดี่ยว (Hypoxis aurea Lour.) เป็ นพืชสมุนไพรในวงศ์ Hypoxidaceae พบมากในไทย เกาหลี จีน เป็ นต้ น ในสมัย
โบราณได้ มีการนําส่วนเหง้ ามาใช้ เป็ นเครื่ องประทินผิว เช่น ฝนกับนํ ้าทาเพื่อแก้ สวิ ฝ้ า และทําให้ ผิวชุ่มชื ้น จากการตรวจสารพฤกษ
เคมีของสารสกัดจากเหง้ าว่านตาลเดี่ยว พบว่าสารสกัดด้ วยนํ ้าแบบร้ อนที่อณ ุ หภูมิ 80ºC (HRWH) มีสารกลุม่ glycoside ชนิด
deoxysugar ในขณะที่สารสกัดด้ วยนํ ้าแบบเย็นที่อณ ุ หภูมิ 27ºC (HRWR) มีสารกลุม่ glycoside ชนิด deoxysugar และ tannin
ชนิด condensed นอกจากนี ้ จากการตรวจหาปริ มาณสารฟี นอลิกทังหมดด้ ้ วยวิธี Folin-Ciocalteu พบว่า สารสกัด HRWR และ
HRWH เท่ากับ 98.70 ± 0.43 และ 63.15 ± 0.58 mg/g ของสารสกัด เมื่อเทียบกับ gallic acid ส่วนฤทธิ์ต้านอนุมลู อิสระด้ วยวิธี
DPPH พบว่า สารสกัดแบบเย็นให้ ฤทธิ์ต้านอนุมลู อิสระ (SC50 = 0.65 ± 0.06 mg/ml) ดีกว่าสารสกัดแบบร้ อน (SC50 = 8.60 ±
0.83 mg/ml) ประมาณ 13 เท่า จากการศึกษานี ้แสดงให้ เห็นว่าสารสกัดเหง้ าจากว่านตาลเดี่ยวน่าจะเป็ นสารที่สามารถนําไป
พัฒนาเป็ นผลิตภัณฑ์เครื่ องสําอางได้

คําสําคัญ: Hypoxis aurea Lour., DPPH assay, Total phenolic compound ว่านตาลเดี่ยว ฤทธิ์ต้านอนุมลู อิสระ

บทนํา ออกซิเดชัน ที่ทําลายปฏิกิริยาลูกโซ่ ได้ แก่ วิตามินอี เบต้ า-แค

อนุมูลอิสระ (free radical) หากอนุมลู อิสระเกิดขึ ้นใน
ร่ างกายส่ ง ผลให้ เซลล์ ใ นร่ างกายเสื่ อ มสภาพและมี
ประสิทธิ ภาพในการทํางานน้ อยลง อาจทําให้ เกิ ดโรคต่าง ๆ
ตามมา เช่น โรคมะเร็ ง ความดันโลหิตสูง เบาหวาน และโรค
รู มาตอยด์ เป็ นต้ น [1, 2] สารต้ านออกซิเดชัน (antioxidant)
เป็ นสารที่ทําหน้ าที่ยบั ยังหรื
้ อต่อต้ านปฏิกิริยาออกซิเดชันหรื อ
สารที่สามารถขจัดอนุมลู อิสระออกจากร่ างกายซึ่งแบ่งได้ เป็ น
2 กลุ่มใหญ่ ๆ คือ 1) สารที่ป้องกันการเกิดสารอนุมูลอิสระ
ได้ แ ก่ เอนไซม์ superoxide dismutase, glutathione
peroxidase, catalase, peroxidase, cytochrome C
peroxidase ทองแดง สัง กะสี ซี เ ลเนี ย ม และโปรตี น ซึ่ง มี
ทองแดงอยู่ในโมเลกุล (ceruloplasmin) และ 2) สารต้ าน
โรทีน วิตามินซี ubiquinone, uric acid, bilirubin, albumin,
sulfhydryl groups ในกรดอะมิโน cysteine ซึ่งมีอยู่ในโปรตีน
เช่น เนื ้อสัตว์ นอกจากนี ้ยังมีสารประกอบฟี โนลิก (phenolic
compounds) [3] และสารกลุม่ flavanoids จากพืชสมุนไพร
ที่สามารถเป็ นสารต้ านออกซิเดชันอีกด้ วย [4]
ว่า นตาลเดี่ ย ว (Hypoxis aurea Lour.; วงศ์
Hypoxidaceae) หรื อ star grass (รู ปที่ 1) เป็ นสมุนไพรที่พบ
ได้ ในป่ าเต็งรัง ป่ าเต็งรังผสมไผ่ และสามารถพบได้ ที่ความสูง
ถึง 2,600 เมตร จากระดับนํ ้าทะเล โดยพบพืชชนิดนี ้มากใน
ประเทศ จีน ไต้ หวัน ภูฎาน กัมพูชา อินเดีย อินโดนีเซีย ญี่ปุ่น
เกาหลี ลาว พม่า เนปาล ปากีสถาน ปาปั วนิวกิ นี ฟิ ลิปปิ นส์
เวียดนาม และทัว่ ทุกภาคของประเทศไทย ในประเทศไทยได้ มี

27
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
การใช้ สว่ นต่าง ๆ ของว่านตาลเดี่ยวเป็ นยาสมุนไพร เช่น ราก
นําไปต้ มนํ ้าดื่มเพื่อบํารุ งโลหิต และมีการใช้ ลําต้ นใต้ ดิน เป็ น
เครื่ องประทินผิวโดยการนําไปฝนนํา้ ทาแก้ สิวฝ้า หรื อตํากับ
เกลือผสมนํ ้าแล้ วพอกหน้ าทําให้ หน้ าลอก [5] ซึ่งแสดงให้ เห็น
ว่ามีความปลอดภัยในการใช้ พืชสมุนไพรชนิดนี ้มาแต่โบราณ
อย่ า งไรก็ ต ามในขณะนี ย้ ัง ไม่ มี ร ายงานเกี่ ย วกั บ ฤทธิ์ ท าง
ชี ว ภาพของสารสกั ด ว่ า นตาลเดี่ ย วและการประเมิ น ถึ ง
ศักยภาพในการบรรเทาหรื อรักษาโรคต่าง ๆ ดังนันในเบื ้ ้องต้ น
คณะผู้วิจัยจึงทําการศึกษาสารพฤกษเคมีที่เป็ นองค์ประกอบ
และฤทธิ์ต้านอนุมลู อิสระของสารสกัดว่านตาลเดี่ยว เพื่อที่จะ
นํามาประเมินความเป็ นไปได้ ในการพัฒนาเป็ นผลิตภัณฑ์ยา
เครื่ องสําอาง หรื อเสริ มอาหารที่มีประสิทธิภาพสูงได้
รูปที่ 1. เหง้ าของว่านตาลเดี่ยว (Hypoxis aurea Lour.)
วิธีการทดลอง
การสกัดว่ านตาลเดี่ยว
นําผงเหง้ าของว่านตาลเดี่ยว 50 g มาทําการสกัด ด้ วย
ใช้ นํ ้าปริ มาตร 400 ml ที่อณุ หภูมิห้อง 28°C (HRWR) เขย่า
บนเครื่ องกวนสารเป็ นเวลา 24 ชัว่ โมง และที่ควบคุมอุณหภูมิ
ระหว่าง 80ºC (HRWH) โดยใช้ hot plate เป็ นเวลา 2 ชัว่ โมง
จากนันกรองสารสกั
้ ดด้ วยกระดาษกรองเบอร์ 1 นําสารละลาย
ที่ได้ มาระเหยด้ วย เครื่ อง rotary evaporator ที่อณ
ุ หภูมิ 50ºC
ความดัน 80 psi และนําไปทําเป็ นผงแห้ งด้ วยเครื่ อง freeze
dryer และเก็บในขวดสีชาที่อณ ุ หภูมิ 4ºC ก่อนนําไปวิเคราะห์
ในขันตอนต่
้ อไป
28
การตรวจสอบเอกลักษณ์ ขนั ้ พืน้ ฐานของสารสกัด
การตรวจสอบเอกลักษณ์ ขัน้ พืน้ ฐานของสารสกัดจาก
สารพฤกษเคมีที่เป็ นองค์ ประกอบ ได้ แก่ กลุ่มแอลคาลอยด์
ตรวจสอบด้ วย Dragendorff’s reagent กลุม่ กลัยโคไซด์ ซึ่ง
ประกอบด้ วยสารกลุ่มคาร์ ดิแอคกลัยโคไซด์ตรวจสอบด้ วยวิธี
สารกลุม่ steroidal moiety, กลุม่ unsaturated lactone ที่ C17
(butenolide) และกลุม่ deoxy sugar กลุม่ แอนทราควิโนนก
ลัยโคไซด์ตรวจสอบด้ วยวิธี Modified Borntrager test และ
กลุม่ ไซยาโนเจเนติกกลัยโคไซด์ด้วยวิธี Grignard test กลุม่ ซา
โปนินตรวจสอบด้ วยวิธีการทดสอบปฏิกิริยาการเกิดฟอง และ
ปฏิกิริยาการแตกของเม็ดเลือดแดงด้ วยวิธี blood agar กลุม่ ฟ
ลาโวนอยด์ตรวจสอบด้ วยวิธี shinoda กลุม่ แอนโธไซยานิน
และลิ ว โคแอนโธไซยานิ น ตรวจสอบด้ วยวิ ธี ก ารทดสอบ
ปฏิกิริยา catechin กลุม่ แทนนินและโพลีฟีนอลตรวจสอบโดย
การนําสารสกัดมาสกัดด้ วย 50% (v/v) ethanol เก็บ filtrate
ละลายสารสกัดด้ วยนํ ้ากลัน่ เติม 10% sodium chloride แบ่ง
สารสกัดใส่หลอดทดลอง แบ่งเป็ น 9 หลอด (1) control (2)
เติม gelatin solution (3) เติม gelatin salt solution (4) เติม
1% ferric chloride (5) เติม bromine water (6) ตรวจสอบ
ด้ วยวิธี Formalin-HCl test (7) ตรวจสอบด้ วยวิธี Vanillin-HCl
test (8) เติม Lime-water (9) ตรวจสอบด้ วยวิธี lignin test
สังเกตสีของปฎิกิริยาและสรุปผล [6]
การวิเคราะห์ ปริมาณสารฟี นอลิกทัง้ หมด
ทําการวิเคราะห์ สารประกอบฟี นอลิกทัง้ หมดด้ วยวิธี
Folin-Ciocalteu [7] โดยเติ ม สารสกัด เข้ ม ข้ น 1 mg/ml
ปริ มาตร 200 µl และสารละลาย Folin-Ciocalteu reagent
ปริ ม าตร 1.5 ml เขย่ า ให้ เ ข้ า กัน ทิ ง้ ไว้ 5 นาที รอให้
เกิ ด ปฏิ กิ ริ ยาสมบู ร ณ์ จากนั น้ เติ ม สารละลาย sodium
carbonate เข้ มข้ น 60 g/l ปริ มาตร 1.5 ml บ่มที่อณ ุ หภูมิห้อง
เป็ นเวลา 90 นาที แล้ วนําไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลืน่
725 nm ด้ วยเครื่ อง spectrophotometer ทําการทดลอง 3 ซํ ้า
โดยใช้ นํ ้าเป็ นกลุม่ ควบคุม (blank) นําค่าดูดกลืนแสงของสาร
สกัดไปเทียบกับกราฟมาตรฐานของสารละลาย gallic acid
และคํานวณหาปริ มาณสารฟี นอลิกทังหมดจากสมการ
้
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

C = c * V/m การวิเคราะห์ ทางสถิติ (Statistic analysis)

โดย C = ปริ มาณสารฟี นอลิกทังหมดในสารสกั
้ ด
(mg/g ของสารสกัด)
c = ความเข้ มข้ นของ gallic acid ที่ได้ จาก
กราฟของสารสกัด (mg/ml)
V = ปริ มาตรของสารสกัด (ml)
m = นํ ้าหนักของสารสกัด (g)
การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้ วยวิธี DPPH
เตรี ย มสารสกั ด ที่ ค วามเข้ มข้ นต่ า ง ๆ จากนั น้ เติ ม
สารละลายตัวอย่างแต่ละความเข้ มข้ นปริ มาตร 50 µl ลงใน
96-well plate เติมสารละลาย 0.5 mg/ml DPPH ปริ มาตร 50
µl เขย่าเพื่อให้ สารละลายเข้ ากัน เก็บไว้ ในที่มืดนาน 30 นาที
นําไปวัดค่าการดูดกลืนแสงด้ วย เครื่ อง microplate reader ที่
ความยาวคลื่น 515 nm ทําการทดสอบ 3 ซํ ้า จากนันคํ ้ านวณ
ฤทธิ์การต้ านอนุมลู อิสระจากสมการ [8]
% free radical scavenging activity = (1- As/Ac) x100
โดยที่ Ac คือ ค่าการดูดกลืนแสงของ DPPH
As คือ ค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง
จากนัน้ คํานวณหาค่าความเข้ มข้ นของสารสกัดที่สามารถ
ต้ านอนุมลู อิสระที่ 50% (SC50) จากกราฟระหว่างเปอร์ เซนต์
การยับยังสารต้
้ านอนุมลู อิสระ (%) และความเข้ มข้ นของสาร
สกัด (mg/ml)
ตารางที่ 1: ร้ อยละผลผลิตที่ได้ และสารพฤกษเคมีของสารสกัดจากว่านตาลเดี่ยว
การวิเคราะห์คา่ ทางสถิติจะใช้ วิธี ANOVA และ LSD
Test ที่นยั สําคัญ p < 0.05
ผลการทดลองและอภิปรายผล
จากการสกัดว่านตาลเดี่ยวด้ วยนํ ้า พบว่า ผลผลิตร้ อยละ
ของสารสกัดจากว่านตาลเดี่ยวที่อณ ุ หภูมิห้อง 28°C และที่
อุณหภูมิ 80ºC เท่ากับ 11.84% และ 9.86% ตามลําดับ และ
สารสกัด ที่ ไ ด้ มี ลกั ษณะคล้ า ยกัน คื อ เป็ นผงแห้ ง เหนี ย ว สี
นํ ้าตาล มีกลิน่ ฉุน (ตารางที่ 1) จากการทดสอบสารพฤกษเคมี
เบื ้องต้ นพบว่า สารสกัด HRWR มีสารประกอบกลัยโคไซด์
ชนิด deoxy sugar และแทนนิน ชนิด condensed ขณะที่สาร
สกั ด HRWH มี ก ลัย โคไซด์ ช นิ ด deoxy sugar เป็ น
องค์ประกอบเพียงอย่างเดียว ดังตารางที่ 1 นอกจากนันยั ้ ง
พบว่าปริ มาณสารฟี นอลิกทังหมดที ้ ่เป็ นองค์ประกอบในสาร
สกัด HRWR (98.70 ± 0.43 µg/ml) มีมากกว่าสารสกัด
HRWH (63.15 ± 0.58 µg/ml) (p < 0.05) (ตารางที่ 2) ทังนี ้ ้
อาจเนื่องมาจากความร้ อนได้ ทําลายสารกลุ่มแทนนินและฟี
นอลิ ก ที่ เ ป็ นองค์ ป ระกอบในสารสกั ด HRWH [3] จาก
การศึก ษาฤทธิ์ ต้ า นอนุมูล อิ สระของสารสกัด ว่า นตาลเดี่ ย ว
พบว่าสารสกัด HRWR มีฤทธิ์ ต้านอนุมูลอิสระมากกว่าสาร
สกัด HRWH อย่างมีนยั สําคัญ (p < 0.05) ดังตารางที่ 2

การตรวจสอบเอกลักษณ์ ขนั ้ พืน้ ฐานของกลุ่มสารประกอบพฤกษเคมี

สารสกัด ร้ อยละ
ลักษณะสารสกัด แอนโธไซ กลัยโคไซด์ แทนนิน
ตัวอย่ าง ผลผลิต แอลคาลอยด์ ซาโปนิน ฟลาโวนอยด์ (ชนิด Deoxy (ชนิด
ยานิน
sugar) condensed)
HRWR 11.84 เป็ นผงแห้ ง เหนียว สี
- - - - + +
นํ ้าตาล มีกลิ่นฉุน
HRWH 9.86 เป็ นผงแห้ ง เหนียว สี
- - - - + -
นํ ้าตาล มีกลิ่นฉุน

หมายเหตุ HRWR คือ สารสกัดจากเหง้ าว่านตาลเดี่ยวด้ วยนํ ้าที่อณ

ุ หภูมิห้อง 28°C, HRWH คือ สารสกัดจากเหง้ าว่าน
ตาลเดีย่ วด้ วยนํ ้าที่อณ
ุ หภูมิ 80ºC, + คือ ผลบวกของปฏิกิริยา และ – คือ ผลลบของปฏิกิริยา
29
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

ตารางที่ 2: ปริ มาณสารฟี นอลิกทังหมดด้

้ วยวิธี Folin- กิตติกรรมประกาศ
Ciocalteu และฤทธิ์ ต้านอนุมูลอิสระ (SC50) ด้ วยวิธี DPPH งานวิ จัยนี ไ้ ด้ รั บการสนับสนุน จากวิ ทยาลัย การแพทย์
ของสารสกัดนํ ้าจากเหง้ าว่านตาลเดี่ยว แผนไทย มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี คุณณรงค์
สารสกัด ปริมาณสารฟี นอลิก SC50 ศักดิ์ นันทะแสน จากสํานักงานหอพรรณไม้ การไฟฟ้ าส่ว น
ตัวอย่ าง ทัง้ หมด (µg/g) (mg/ml) ภู มิ ภ าค เขื่ อ นศรี นคริ น ทร์ จั ง หวั ด กาญจนบุ รี และ
HRWR 98.70 ± 0.43a 0.65 ± 0.06a ดร.สุพนิดา วินิจนัย สถาบันวิจัยและค้ นคว้ าผลิตผลทางการ
HRWH 63.15 ± 0.58b 8.60 ± 0.83b แพทย์และอุตสาหกรรมเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์
Vitamin C - 0.05 ± 0.01c

ทังนี
้ ้อาจเนื่องมาจากปริ มาณสารพฤกษเคมีที่พบในสาร
สกัด HRWR ที่มากกว่าสารสกัด HRWH จากรายงานพบว่า
สารประกอบฟี นอลิก ทําหน้ าที่ในการยับยังการเกิ
้ ดออกซิเดชัน
ของไขมัน โดยการให้ ไฮโดรเจนอะตอมแก่อนุมลู อิสระและ
สารประกอบแทนนินมีฤทธิ์ต้านออกซิเดชันโดยกระตุ้นเอนไซม์
superoxide dismutase [3]การพบสารแทนนินและฟี นอลิก
ในสารสกัดจากเหง้ า ว่า นตาลเดี่ย วอาจจะช่ว ยป้ องกันและ
รักษาโรคที่มีสาเหตุมาจากการทําลายเซลล์และเนื ้อเยื่อต่าง ๆ
ในร่ างกายที่มาจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและอนุมูลอิสระได้
เช่น โรคมะเร็ ง ความดันโลหิตสูง และเบาหวาน เป็ นต้ น [2]
ดังนันสารสกั
้ ดจากว่านตาลเดี่ยวจึงน่าจะมีฤทธิ์ ทางชีวภาพ
อื่น ๆ ได้ อีกด้ วย
สรุ ปผลการทดลอง
จากการทดลองนีส้ ามารถสรุ ปได้ ว่า สารสกัดจากว่าน
ตาลเดี่ ย วที่ ส กั ด ด้ ว ยนํ า้ ที่ อุณ หภูมิ ห้ อ ง 28°C ให้ ฤ ทธิ์ ต้ า น
อนุมลู อิสระที่ดีที่สดุ และมีสารพฤกษเคมีที่มากกว่าการสกัดที่
อุณหภูมิ 80ºC ถึงแม้ ว่าสารสกัด HRWR มีฤทธิ์ น้อยกว่า
วิตามินซี 13 เท่า แต่อย่างไรก็ตามสารสกัดจากว่านตาลเดี่ยว
อาจมีฤทธิ์ทางชีวภาพ และฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาอื่น ๆ ซึ่งผู้วิจยั
ได้ ทําการศึกษาอย่างต่อเนื่อง เพื่อประเมินถึงความเป็ นไปได้
ในการพัฒนาสารสกัดจากว่านตาลเดี่ยวเป็ นผลิตภัณฑ์ ยา
เครื่ องสําอาง หรื อเสริ มอาหารได้ ตอ่ ไป
เอกสารอ้ างอิง
[1] วัลลภ วีชะรังสรรค์ และปราณีต โอปณะโสภิต. (2547).
ภาพรวมของอนุมลู อิสระและการทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมลู
อิ ส ระในสารสกั ด จากพื ช ในหลอดทดลอง. วารสาร
ศรี นคริ นทรวิโรฒเภสัชสาร. 9(1): 73-80.
[2] เจนจิรา จิรัมย์ และประสงค์ สีหา. (2554). สารต้ าน
อนุ มู ล อิ ส ระ: แหล่ ง ที่ ม าและกลไกการเกิ ด ปฏิ กิ ริ ย า
oxidants and antioxidants: sources and
mechanism. วารสารวิ ช าการมหาวิ ท ยาลัย ราชภั ฏ
กาฬสินธุ์. 1(1): 59-70.
[3] ชัย รั ต น์ พึ่ ง เพี ย ร. (2552) สมบัติ แ ละกิ จ กรรมการ
ต้ านอนุมูล อิสระของสารสกัด หยาบจากขิง ที่สกัดด้ ว ย
คาร์ บอนไดออกไซด์เหนือวิกฤตและการประยุกต์ใช้ สาร
สกัดในไอศกรี ม. วิทยานิพนธ์ วท.ม. (วิทยาศาสตร์ และ
เทคโนโลยี อ าหาร) สงขลา: บั ณ ฑิ ต วิ ท ยาลั ย
มหาวิทยาลัยสงขลานคริ นทร์ .
[4] Srisawat, U., Panunto, W., Kaendee N.,
Tanuchit S., Itharat, A., Lerdvuthisopon, N., et al.
(2010). Determination of phenolic compounds,
flavonoids, and antioxidant activities in water
extracts of Thai red and white rice cultivars.
Journal of the Medical Association of Thai. 9(7):
S83-S91.

30
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

[5] พวงผกา สุนทรชัยนาคแสง. (2552). พรรณไม้ เขื่อนศรี
นคริ นทร์ . กรุ งเทพมหานคร: สหมิตรพริ น้ ติ ้งแอนด์พบั
ลิสชิ่ง จํากัด.
[6] อ้ อมบุญ ลัวนรั ตน์ . (2536). การสกัดและตรวจสอบ
สารสําคัญจากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ. กรุ งเทพมหานคร:
คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล.
[7] Singleton, V.L. and Rossi, J.A. (1965). Colorimetry
of total phenolics with phosphomolybdic
phosphotungstic acid reagents. American Journal
of Enology and Viticulture. 16: 144-158.
[8] Manosroi, J., Boonpisuttinant, K., Manosroi, W. and
Manosroi, A. (2012). Anti-proliferative activities on
HeLa cancer cellline of Thai medicinal plan
recipes selected from MANOSROI II database.
Journal of Ethnopharmacology. 142: 422–431.

31
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

การจัดทําฐานข้ อมูลตํารั บยาสมุนไพรในเขตจังหวัดปทุมธานี

กรวินท์วชิ ญ์ บุญพิสทุ ธินนั ท์*, ศุภชัย ไกรเทพ, ธิรินทร์ ห่อหุ้ม, ณัฏฐิ กา อนุจิตรอนันต์
นภสร รัตนประเสริ ฐ และภูริชญา อินทร์ เนตร

วิ ทยาลัยการแพทย์แผนไทย มหาวิ ทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี

*ผูป้ ระสานงานหลัก อีเมล: wataru_dream@hotmail.com

บทคัดย่ อ
การรักษาโรคแบบการแพทย์แผนไทยด้ วยการใช้ ตํารับยาสมุนไพรที่เป็ นภูมิปัญญาของประเทศมีมาแต่โบราณทัว่ ทุก
ภาคของประเทศ และตํารายาสมุนไพรที่ใช้ ได้ ผล มักจะถูกจดบันทึกในใบลาน สมุดข่อย หรื อพับสา และได้ มีการถ่ายทอดสืบต่อ
กันในตระกูลหรื อผู้ใกล้ ชิด แต่ผ้ ทู ี่เก็บรักษาอาจไม่ได้ ตระหนักถึงความสําคัญ และอาจเก็บรักษาไม่ดีซึ่งอาจทําให้ ชํารุ ดและสูญหาย
ได้ ดังนัน้ คณะผู้วิจยั จึงมีแนวคิดรวบรวมองค์ความรู้ที่ได้ มีการบันทึกไว้ ในเอกสารต่างๆ เช่น หนังสือโบราณ ใบลาน สมุดข่อย และ
พับสา เป็ นต้ น โดยในเบื ้องต้ นได้ รวบรวมข้ อมูลตํารับยาสมุนไพรที่ใช้ รักษาโรคที่มีอบุ ตั ิการณ์สงู ได้ แก่ มะเร็ ง เบาหวาน ความดัน
โลหิตสูง รวมไปถึงตํารับลดความอ้ วน และตํารับยาอายุวฒ
ั นะจากหนังสือโบราณและ ตํารายาสมุนไพรไทย และประเมินถึงความ
น่าเชื่อถือของตํารับยา จากการรวบรวม พบว่า สมุนไพรที่พบมากในตํารับยารักษามะเร็ ง คือ ข้ าวเย็นเหนือ,ข้ าวเย็นใต้ และเหงือก
ปลาหมอ ตํารับยาเบาหวาน คือ ข้ าวเย็นเหนือ ข้ าวเย็นใต้ และเหงือกปลาหมอ ตํารับความดันโลหิตสูงคือ ขิง ขมิ ้นอ้ อย และระย่อม
ตํารับลดความอ้ วน คือ พริ กไทย หญ้ าแห้ วหมู และบอระเพ็ด และตํารับยาอายุวฒ
ั นะ คือ พริ กไทย บอระเพ็ด และข่อย ตามลําดับ
ทังนี
้ ้ สามารถนําตํารับยาสมุนไพรที่รวบรวมได้ มาจัดทําเป็ นหนังสือหรื อฐานข้ อมูลเพื่อใช้ ในการทําวิจยั และพัฒนาเป็ นผลิตภัณฑ์ยา
เครื่ องสําอาง และอาหารเสริ มได้ ตอ่ ไป

คําสําคัญ : ตํารายาสมุนไพร, การรวบรวม, คัมภีร์โบราณ, การวิจยั และพัฒนา

บทนํา ในการผลิตยาสมุนไพรไทย เพื่อใช้ รักษาโรคหรื อบรรเทา

การรั กษาโรคแบบการแพทย์ แผนไทยซึ่งเป็ นภูมิ
ปั ญญาของประเทศมาแต่โบราณ การนําสมุนไพรมาใช้
ในการรักษาโรคนันมี ้ มาเป็ นเวลายาวนานในทัว่ ทุกภาค
ของประเทศ การตังตํ ้ ารับยาสมุนไพรซึ่งอาจใช้ ทงแบบ
ั้
ชนิดเดี่ยวหรื อผสมกับสมุนไพรอื่นๆ ตํารั บยาสมุนไพร
ไทยมักอยู่ในรู ปแบบการนําสมุนไพรตังแต่ ้ สองชนิดขึ ้น
ไปมารวมกัน และอาจต้ อ งมีส มุน ไพรบางชนิด เข้ ามา
เสริ ม เพื่ อ ให้ ย านัน้ มี ป ระสิท ธิ ภาพในการรั ก ษาตามที่
ต้ องการ ซึง่ ถือว่าเป็ นองค์ความรู้ของคนไทย
32
อาการต่างๆ เช่น โรคมะเร็ ง โรคเบาหวาน อาการปวด
และอักเสบ เป็ นต้ น อีกทังสามารถนํ
้ ามารับประทานเพื่อ
เป็ นยาอายุวฒั นะได้ อีกด้ วย องค์ความรู้เหล่านี ้บางส่วน
ได้ มีการบันทึกไว้ ในเอกสารต่างๆ เช่น ใบลาน สมุดข่อย
และพับสา เป็ นต้ น (รู ปที่ 1) บางส่วนได้ มีการถ่ายทอด
สืบ ต่อ กัน ในตระกูล หรื อ ผู้ใ กล้ ชิ ด เท่า นัน้ ตํ า รายา
สมุนไพรเป็ นจํานวนมากทังที ้ ่เป็ นสมบัติสว่ นตัว วัด หรื อ
โรงเรี ยน ต่าง ๆ ซึ่งผู้ที่เก็บรักษาอาจไม่ได้ ตระหนักถึง
ความสําคัญของตําราสมุนไพรดังกล่าวดังนันบ่ ้ อยครัง้
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

ที่จะพบผู้นําคัมภีร์หรื อตําราสมุนไพรที่เป็ นสมุดข่อย ใบ เมื อ ง และอาจให้ ฤ ทธิ์ ท างชี ว ภาพที่ ดี ก ว่า ทัง้ นี ้ อาจ
ลาน หรื อ พับ สา มาขายให้ ร้ านรั บ ซื อ้ ของเก่ า หรื อ เนื่องมาจากมลภาวะจากสิ่งแวดล้ อม ซึ่งถื อว่าเป็ นข้ อ
วางขายทั่วไปหรื อแม้ แต่นําไปทําลายทิ ้งหรื อเผาไปกับ ได้ เปรี ยบในการใช้ ประโยชน์จากพืชสมุนไพร
เจ้ าของเมื่อเสียชีวิตลง บางส่วนอาจมีการเก็บรักษาไม่ดี งานวิจัยนี ้ มีวัตถุประสงค์ คือ การรวบรวมตํารั บ
ซึง่ อาจทําให้ ชํารุดและสูญหายได้ ยาสมุ น ไพรไทย จากหนัง สื อ โบราณ และ ตํ า รายา
สมุนไพรต่างๆ ซึง่ ได้ คดั เลือกตํารายาสมุนไพรที่ใช้ ในการ
รั ก ษาที่ มี อุบัติ ก ารณ์ ก ารเกิ ด สูง 5 โรค คื อ ตํ า รั บ ยา
สมุดข่อย มะเร็ ง ตํารับยาเบาหวาน ตํารับยาความดันโลหิตสูง
รวมไปถึ ง ตํ า รั บ ยาลดความอ้ ว น และ ตํ า รั บ ยา
พับสา
อายุวฒ ั นะด้ วย เพื่อนําไปวิจัยและพัฒนาผลิตภัณฑ์ยา
เครื่ องสําอาง และอาหารเสริ มต่อไป
ใบลาน
รูปที่ 1 การจดบันทึกตํารายาสมุนไพรไทยดังเดิ
้ ม ใน วิธีการดําเนินการวิจัย
การรวบรวมตํารับยาสมุนไพรได้ ถกู รวบรวม
ใบลาน สมุดข่อย และพับสา
จากหนังสือโบราณ และ ตํารายาสมุนไพรต่างๆ จาก
หมอพื ้นบ้ าน และ แพทย์แผนไทย ในจังหวัดปทุมธานี
การใช้ สมุนไพรมีการตื่นตัวขึ ้นเป็ นอันมาก ทัง้
เป็ นระยะเวลา 2 เดือน ทังนี ้ ้ทางคณะผู้วิจยั ได้ ทําการคัด
ในประเทศที่ กํ า ลัง พัฒ นาและประเทศที่ พัฒ นาแล้ ว
กรองตํารับยาสมุนไพรในเบื ้องต้ น จํานวน 5 โรค โดย
รวมทัง้ ประเทศไทย นอกจากนี ้ได้ มีการรวบรวมข้ อมูล
การใช้ หลักเกณฑ์ในการเทียบโรคหรื ออาการทางแพทย์
ตํารั บยาตามแหล่งความรู้ ต่างๆ และจัดทําเป็ นบันทึก
แผนปั จจุบนั กับโรคทางการแผนไทยนัน้ ได้ ประเมินจาก
หรื อหนังสือตํารายาสมุนไพรไทยขึ ้น เช่น หนังสือตํารับ
อาการทีค่ ล้ ายคลึงกับแผนปั จจุบนั โดยได้ อ้างอิงจาก
ยาสมุน ไพรของความรู้ หมอพื น้ บ้ า นจากเขื่ อนสิริ น ธร
หนังสือเวชกรรมแผนไทยที่ได้ รับการยอมรับ โดยตํารับ
หนังสือเพชรนํ ้าเอก และหนังสือแพทย์ศาสตร์ สงเคราะห์
ยาสมุนไพรที่นํามารวบรวมต้ องเป็ นสมุนไพรที่หาง่าย
เป็ นต้ น
เป็ นที่ร้ ูจกั และต้ องไม่มีตวั ยาที่เป็ นวัตถุธาตุ สัตว์วตั ถุ
ปั จจุบัน ได้ มีงานวิจัยด้ านสมุนไพรจากตํารั บยา
หรื อ สารอื่นที่เป็ นอันตราย เช่น สนิมเหล็ก เป็ นต้ น และ
หรื อ พื ช สมุน ไพรเพื่ อ รั ก ษาโรคหรื อ อาการเรื อ้ รั ง เช่ น
ตรวจสอบความน่าเชื่อถือโดยการพิจารณาพืชสมุนไพร
โรคมะเร็ ง [1] โรคเบาหวาน [2] และ อาการอักเสบ [3]
ที่ใช้ เป็ นองค์ประกอบในตํารับยา เช่น การใช้ ถวั่ เขียวต้ ม
อย่ า งกว้ างขวางทั ง้ ในประเทศและต่ า งประเทศ
กับนํ ้าตาลรับประทานเพื่อรักษาเบาหวาน เป็ นตํารับที่
โดยเฉพาะประเทศในแถบเอเชียที่มีภมู ิประเทศที่เหมาะ
ไม่นา่ มีความเชื่อถือ เนื่องจากใช้ นํ ้าตาลในการปรุงยา
แก่ ก ารเจริ ญ ของพื ช สมุ น ไพร ซึ่ ง ประเทศไทยเป็ น
จะเป็ นการกระตุ้นอาการของผู้ป่วยเบาหวานจึงไม่นํามา
ประเทศที่มีความหลากหลายทางชีวภาพ (biodiversity)
รวบรวมในงานวิจยั นี ้
สูงประเทศหนึ่งของโลกโดยมีถึง 7 % ของที่มีอยู่ในโลก
ทัง้ นี เ้ พื่ อ ประเมิ น ความปลอดภัย ในการใช้
โดยเป็ นพืช 15,000 ชนิดและสัตว์ 16,495 ชนิด [4] อีก
ตํารั บยา รวมถึงการจัดประเภทของตํารั บยาสมุนไพร
ทัง้ พื ช สมุน ไพรที่ ขึ น้ อยู่ต ามป่ าในที่ สูง มัก จะมี ค วาม
โดยการป้ อรหัส ให้ กับ ตํ า รั บ ยาดัง กล่า ว และการหา
หลากหลายทางพันธุกรรมมากกว่าพืชที่เจริ ญในเขต
ความถี่สมุนไพรอีกด้ วย

33
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

ผลการทดลอง ประเภท อัน สมุนไพรที่พบ ความถี่

จากการรวบรวมตํ า รั บ ยาสมุน ไพรจากตํ า รั บ ยา ตํารับยา ดับ (ตํารับ)
หลวงปู่ ศุข คัมภีร์วรโยคสาร หนังสือคัมภีร์ยาอายุวฒ ั นะ ตํารับยา 1 ขิง 4
และจากตํารายาโบราณที่ได้ จากใบลาน � เล่ม พับสา � แก้ ความ (Zingiber officinale )
เล่ ม และข่ อ ย � เล่ ม นอกจากนี ย้ ั ง ทํ า ได้ ทํ า การ ดันโล
สัมภาษณ์ หมอพืน้ บ้ านจากวัดนํา้ วนอีกด้ วยในจังหวัด หิตสูง 2 ขมิ ้นอ้ อย 3
ปทุมธานี พบว่า ตํารับที่รวบรวมได้ ทังหมด
้ 133 ตํารับ (Curcuma zedoaria )
โดยเป็ นตํารับยามะเร็ ง 40 ตํารับ ตํารับยาความดัน 3 ระย่อม 2
โลหิตสูง 21 ตํารับ ตํารับยาเบาหวาน 21 ตํารับ ตํารับ (Rauvolfia serpentina
ยาอายุวฒ ั นะ 30 ตํารับ และตํารับยาลดความอ้ วน 21 Benth)
ตํารับ ซึ่งแต่ละตํารับมีพืชสมุนไพรที่เป็ นองค์ประกอบ ตํารับยา 1 ข้ าวเย็นเหนือ 7
ต่า งกัน ออกไป ซึ่งเกิ ดจากการผสมผสานองค์ ค วามรู้ แก้ เบา (Smilax corbularia
และอาศัยภูมิปัญญาที่สงั่ สมมาช้ านาน หวาน Kunth.)
ตารางที่ 1 แสดงการตรวจสอบพืชสมุนไพรไทยที่เป็ น 2 ข้ าวเย็นใต้ 6
องค์ ป ระกอบในแต่ล ะตํา รั บ พบว่า พืช สมุน ไพรที่ พ บ (Smilax microchina T.
มากที่สดุ 3 อันดับแรกในตํารับยามะเร็ งคือ ข้ าวเย็นใต้ koyama)
3 เหงือกปลาหมอ 4
ตารางที่ 1: สมุนไพรไทยที่พบมากในตํารับยาสมุนไพร (A. illicifolius L.)
ไทยประเภทต่างๆ ตํารับยา 1 พริ กไทย 21
อายุ (Piper nigrum L.)
ประเภท อัน สมุนไพรที่พบ ความถี่ วัฒนะ 2 เหงือกปลาหมอ 8
ตํารับยา ดับ (ตํารับ)
(A. illicifolius L.)
ตํารับยา 1 ข้ าวเย็นใต้ 21
3 บอระเพ็ด 7
แก้ มะเร็ง (Smilax microchina T.
(Tinospora crispa L.)
koyama)
ตํารับยา 1 พริ กไทย 7
2 ข้ าวเย็นเหนือ 20
ลดความ (Piper nigrum L.)
(Smilax corbularia
อ้ วน 2 หญ้ าแห้ วหมู 6
Kunth.)
(Cyperus rotundus L.)
3 ทองพันชัง่ 10
3 บอระเพ็ด 4
(Rhinacanthus
(Tinospora crispa L.)
nasutus L. Kurz)

34
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

ประเภท อันดับ สมุนไพรที่พบ ความถี่

ตํารับยา (ตํารับ) ประเภท อันดั สมุนไพรที่พบ ความถี่
ตํารับยา 1 ข้ าวเย็นใต้ 21 ตํารับยา บ (ตํารับ)
แก้ มะเร็ง (Smilax microchina ตํารับยา 1 พริ กไทย 21
T. koyama) อายุวฒั นะ (Piper nigrum L.)
2 ข้ าวเย็นเหนือ 20
2 เหงือกปลาหมอ 8
(Smilax corbularia
(A. illicifolius L.)
Kunth.)
3 บอระเพ็ด 7
3 ทองพันชัง่ 10
(Tinospora crispa L.)
(Rhinacanthus
ตํารับยาลด 1 พริ กไทย 7
nasutus L. Kurz)
ความอ้ วน (Piper nigrum L.)
ตํารับยา 1 ขิง 4
แก้ ความ (Zingiber officinale ) 2 หญ้ าแห้ วหมู 6
ดันโลหิต 2 ขมิ ้นอ้ อย 3 (Cyperus rotundus L.)
สูง (Curcuma zedoaria ) 3 บอระเพ็ด 4
3 ระย่อม 2 (Tinospora crispa L.)
(Rauvolfia
serpentina Benth) จากการสรุ ปสมุนไพรที่พบบ่อยในตํารับ ไม่ได้
ตํารับยา 1 ข้ าวเย็นเหนือ 7 หมายถึ ง พื ช สมุ น ไพรชนิ ด นัน้ เป็ นยาหลัก หรื อ ยารอง
แก้ (Smilax corbularia เพี ยงแต่เป็ นการช่ วยในคัด เลือกตํา รั บยาที่ มีม าก เพื่ อ
เบาหวา Kunth.) นําไปศึกษาฤทธิ์ ทางชีวภาพและฤทธิ์ ทางเภสัชวิทยาใน
น 2 ข้ าวเย็นใต้ 6 ขันต่
้ อไปได้ สะดวกขึ ้น การคัดเลือกจะทําโดยเรี ยงลําดับ
(Smilax microchina พื ช สมุ น ไพรที่ พ บบ่ อ ยในแต่ ล ะตํ า รั บ ทั ง้ นี เ้ ป็ นการ
T. koyama) ประเมินในเบื ้องต้ นว่าพืช ชนิดนันน่
้ าจะมีความสําคัญไม่
3 เหงือกปลาหมอ 4 มากก็น้อย จึงนํามาเป็ นส่วนผสมในตํารับ จากนันจะให้ ้
(A. illicifolius L.) คะแนนสมุ น ไพรแต่ ล ะ ชนิ ด ตามลํ า ดั บ และนํ า มา
คํ า นวณว่ า ยาตํ า รั บ ใดมี ค ะแนนสู ง สุด ซึ่ ง จะทํ า การ
ข้ าวเย็นเหนือ และทองพันชัง่ ในตํารับยาความ ทดลองตํารับยานันก่ ้ อนตํารับอื่นๆ วิธีนี ้จะมีประโยชน์ใน
ดั น โลหิ ต สู ง คื อ ขิ ง ขมิ น้ และ ระย่ อ ม และตํ า รั บ ด้ านของการลดระยะเวลาและค่ า ใช้ จ่ า ยในการ
เบาหวาน คือ ข้ าวเย็นใต้ ข้ าวเย็นเหนือ และเหงือกปลา ดํ า เนิ น การวิ จั ย และอาจมี โ อกาสได้ ตํ า รั บ ยาที่ มี
หมอ ตามลําดับ นอกจากนีย้ งั พบว่า พืชสมุนไพรที่พบ ประสิทธิภาพสูงอีกด้ วย
มากในตํารับยาอายุวฒ ั นะ คือ พริ กไทย เหงือกปลาหมอ นอกจากนี ้ยัง พบว่า พริ กไทย เป็ นพืชสมุนไพร
ที่ พ บมากในตํ า รั บ ยาสมุน ไพรที่ ร วบรวมได้ (21.80%)
และบอระเพ็ด ส่วนในตํารับยาลดความอ้ วน คือ พริ กไทย
หญ้ าแห้ วหมูและบอระเพ็ด ตามลําดับ
35
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

รองลงมาคื อ ข้ า วเย็น เหนือ (21.05%) และข้ าวเย็ นใต้ อาหารหลายชนิ ด เช่ น มะม่ว งดอง เป็ นต้ น [5] และ
(20.30%) ตามลําดับ (ตาราง 2) การศึกษาฤทธิ์ ทางชีวภาพของพริ กไทย พบว่า สามารถ
กระตุ้นการหลัง่ กรดในกระเพาะอาหาร ลดภาวะท้ องเดิน
ตารางที่ 2: พืช สมุน ไพรที่ พบมากที่ สุด ในการรวบรวม ลดระดับนํ ้าตาลในเลือด ลดไขมัน มีฤทธิ์ต้านออกซิเดชัน
ตํารับยาสมุนไพรไทยดังเดิ
้ ม 10 อันดับแรก ลดการอักเสบ กดระบบประสาทส่วนกลางระงับอาการ
ชัก ยับยังการกระจายของเซลล์
้ มะเร็ ง ต้ านเชื ้อแบคทีเรี ย
อันดับ ชื่อสมุนไพร ความถี่ เชื อ้ รา ต้ า นเชื อ้ แบคที เ รี ย ในช่ อ งปาก ยับ ยัง้ เอนไซม์
(ตํารับ) acetylcholine esterase กําจัดยุง แมลงวัน ศัตรู พืช [6]
1 พริ กไทย 29 ฤทธิ์ ทางเภสัชวิทยาของข้ าวเย็นเหนือ พบว่า ใช้ หัว ใน
(Piper nigrum L.) การแก้ ประดง แก้ มะเร็ งคุดทะราด แก้ ร้อนในกระหายนํ ้า
2 ข้ าวเย็นเหนือ 28 แก้ นํา้ เหลือ งเสีย ฆ่าเชื อ้ หนอง แก้ เ ส้ น เอ็ นพิ การ แก้
(Smilax corbularia Kunth.) กามโรค เข้ าข้ อออกดอก ฝี แผลเน่าเปื่ อยพุพอง ทําให้
3 ข้ าวเย็นใต้ 27 แผลฝี ยุบแห้ ง แก้ ประดง แก้ เม็ดผื่นคัน ดับพิษในกระดูก
(Smilax microchina T. koyama) แก้ ปัสสาวะพิการ แก้ อกั เสบในร่ างกาย นิยมใช้ ค่กู ันทัง้
4 เหงือกปลาหมอ 23 ข้ าวเย็นใต้ ซึง่ เรี ยกว่า ข้ าวเย็นทังสอง
้ [7] และการศึกษา
(A. illicifolius L.) ฤทธิ์ทางชีวภาพของข้ าวเย็นเหนือและข้ าวเย็นใต้ พบว่า
5 ทองพันชัง่ 16 มีสารฟี นอลิกเป็ นองค์ประกอบ มีฤทธิ์ต้านออกซิเดชัน มี
(Rhinacanthus nasutus L. Kurz) ฤทธิ์ต้านเชื ้อ HIV-1 [8] และยังมีฤทธิ์ต้านการอักเสบอีก
6 แห้ วหมู 16 ด้ วย [9] ดังนัน้ การพบพืชสมุนไพรทัง้ 3 ชนิด นีเ้ ป็ น
(Cyperus rotundus L.) องค์ประกอบในตํารับยาสมุนไพรต่างๆ อาจจะเป็ นการ
7 บอระเพ็ด 14 เสริ มฤทธิ์ ทางเภสัชวิทยาในการรักษาโรคต่างๆ ที่กล่าว
(Tinospora crispa L.) มาได้
8 ขิงแห้ ง 11
(Zingiber officinale ) สรุ ปผลการทดลอง
จากการรวบรวมตํารับยาสมุนไพรครัง้ นี ้เป็ นการ
9 สมอพิเภก 10
รวบรวมตํ า รั บ ยา ซึ่ ง ถื อ ว่ า เป็ นองค์ ค วามรู้ และภู มิ
(Terminalia bellirica )
ปั ญญาของคนไทยมาตังแต่ ้ โบราณ ซึ่งคณะผู้วิจัยจะได้
10 สมอไทย 8
ทํา วิ จัย ต่อไปเพื่ อ ศึก ษาฤทธิ์ ท างชี ว ภาพ และประเมิ น
(Terminalia chebula )
ความเป็ นไปได้ ในการรักษาโรค พิษวิทยาของตํารั บยา
นอกจากนี ้ ยังสามารถหาสารสําคัญในการออกฤทธิ์ทาง
จากการศึกษาฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาของพริ กไทย
ชีวภาพ เพื่อใช้ รักษาโรคแต่ละชนิดได้ ดังนันการรวบรวม้
พบว่า ใบสามารถ แก้ ลมจุกเสียดแน่น ท้ องอืดเฟ้ อผลที่
ตํารับยาสมุนไพรไทยดังเดิมนี ้ จะสามารถใช้ ประโยชน์
ยัง ไม่สุก นํา มาเป็ นเครื่ อ งเทศ และ แต่งกลิ่นอาหารได้
เ พื่ อ ก า ร ทํ า วิ จั ย แ ล ะ พั ฒ น า เ ป็ น ผ ลิ ต ภั ณ ฑ์ ย า
เมล็ด ใช้ ขับลม ขับเสมหะ ขับเหงื่อ ขับปั สสาวะ บํารุ ง
เครื่ องสําอาง และอาหารเสริ มได้ ตอ่ ไป
ธาตุ อาหารไม่ย่อย และ ดอก ใช้ รักษาตาแดง ถนอม

36
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

กิตติกรรมประกาศ [7] ตํารับยา ตํารายาไทย; หน่วยปฎิบตั ิการงานวิจัย

งานวิจยั นี ้ได้ รับการสนับสนุนจากวิทยาลัย เคมีสารสนเทศ ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์
การแพทย์แผนไทย มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคล มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ .
ธัญบุรี [8] Itharat, A., Kejik, R., Tewtrakul, S. and
Watanaperomskul, C. (2007). Antioxidant and
เอกสารอ้ างอิง anti-HIV-1 integrase compounds from Smilax
[1] Zhanga, Y. and Li, P.P. (2010). Shu-Gan- corbularia Kunth. Planta Medica. 73: 559.
Liang-Xue Decoction, a Chinese herbal [9] Ruangnoo, S., Jaiaree, N., Makchuchit, S.,
formula, down-regulates the expression of Panthong, S.,Thongdeeying, P, Itharat, A.
steroid sulfatase genes in human breast (2012). An in vitro inhibitory effect on RAW
carcinoma MCF-7 cells. Journal of 264.7 cells by anti-inflammatory compounds
Ethnopharmacology. 127: 620–624. from Smilax corbularia Kunth. Asian Pacific
[2] Lu, J., Wang, J.S. and Kong, L.Y. (2011). Journal of Allergy and Immunology. 30(4): 268
Anti-inflammatory effects of Huang-Lian-Jie- -274.
Du decoction, its two fractions and four
typical compounds. Journal of Ethnopha-
macology.134 (3): 911-918.
[3] Ojekal, A.B., Kappo, M.A., Agbasoro, S. and
Kazee, A. (2008). Preliminary study into the
long term effects of a hypoglycaemic
polyherbal formula (Yem-Kem) on some
biochemical parameters in effects of a
hypoglycaemic normal rabbits. African
Journal of Biotechnology. 7 (10): 1581-1584.
[4] ศูนย์ศึกษาและวิจัยอุทยานแห่งชาติที่ 1. ความ
หลากหลายทางชีวภาพในประเทศไทย. แหล่งที่มา:
http://www.nprcenter.com/nprc1/modules/sm
artsection/item.php?itemid=6
[5] วุฒิ วุฒิ ธ รรมเวช. (2540). สารานุก รมสมุน ไพร
ไทย.พิ ม ลัก ษณ์ ,กรุ ง เทพมหานคร: สํ า นัก พิ ม พ์
โอเดียน สโตร์ .
[6] ฐานข้ อมูลเครื่ องยาสมุนไพร คณะเภสัชศาสตร์
ม ห า วิ ท ย า ลั ย อุ บ ล ร า ช ธ า นี . แ ห ล่ ง ที่ ม า :
http://www.thaicrudedrug.com/main.php?acti
on=viewpage&pid=90
37
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Chromatographic Fingerprint Analysis and Antioxidant Activities of Herbal

Ingredients in Thai Betel Quid
Chernkwan Mookprom1, Philaslak Pooprommin1, Pattamawan Ruangdet1, Khemjira Jarmkom1,
Somnuek Suchaitanavanit2, and Chanai Noysang1*
1
Thai Traditionnal Medicine College, Ragamangala University of Technology Thanyaburi,
Pathumthani 12130, Thailand
2
Institute of Thai Traditional Medicine, Department for Development of Thai Traditional and Alternative
Medicine, Ministry of Public Health, BIOTEC Pilot Plant, Thailand Science Park,
Pathumthani 12130, Thailand
*Corresponding author. E-mail: c.noysang@yahoo.com

Abstract
The preliminary phytochemical screening of Thai betel quid was done and HPTLC studies were carried
out CAMAG HPTLC system. Antioxidative effects of ethanolic extracts from ingredients in Thai betel quid
studied with the use of three in vitro assays - DPPH reduction spectrophotometric assay. HPTLC
fingerprinting of ethanolic extract of Acacia catechu (L.f.) Willd. (catechu resin) revealed four spots with hRf
values in the range of 12, 25, 36, and 47; Areca catechu L. (areca nut) showed one spot with hRf values in
the range of 73; Nicotiana tabacum L. (tobacco leaf) showed two spots with hRf values in the range of 50,
and 69; Piper betle L. (betel leaf) showed six spots with hRf values in the range of 7, 17, 24, 41, 59, 95. In
the screening, the most efficient antioxidant activity was exhibited by Acacia catechu, tested at 1 mg/mL
with inhibition values of 93.57±0.66% (EC50= 0.04±0.01 μg/mL.). It can be concluded that HPTLC
fingerprinting of herbal ingredients of Thai betel quid may be useful in the pharmaceutical industry and plant
systematic studies.

Keywords: Thai betel quid, Antioxidant, HPTLC fingerprinting

is ample [4-14]. However, only a limited number of

Introduction
Reactive oxygen species (ROS) cause oxidative
damage to nucleic acids, proteins, and lipids and are
known to be associated with aging, carcinogenesis, and
other diseases [1-2]. Research are becoming steadily
more interested in discovering new antioxidants from
natural sources. Medicinal plants used in traditional
medicine contain many phytochemicals and play a major
antioxidant role in helping endogenous antioxidants to
neutralize activity to authenticate the medicinal
properties of oxidative stress. Betel quid has commonly
been used in South and Southeast Asia and Asia Pacific
region including rural areas of Thailand for a long time.
Because of its ancient history, its use is socially
acceptable among all sections of society [3]. Thai betel
quid is a combination of betel leaf, areca nut, catechu
resin, and slaked lime (aqueous calcium hydroxide
paste). Tobacco is commonly used in conjunction with
Thai betel quid. Ingredients in betel quid produce
complex interactions during chewing. For example,
when betel quid is chewed with lime, arecoline and
guvacoline are metabolized into arecaidine and guvacine,
respectively [1]. Research evidence on the effects of Thai
betel quid towards oral cancer and oral soft tissue lesions
38
studies have been reported on chemical constituents and
pharmacological activity of Thai betel quid. Therefore
the aim of the present study were to evaluate two main
aims: to establish the fingerprint profile and evaluate the
antioxidant activities of ethanolic extracts of herbal
ingredients in Thai betel quid.
Materials and Methods
Plant material
The dried plant material from following species was
studied: Acacia catechu (L.f) Wild (catechu tree), Areca
catechu L. (betel nut), Nicotina tabacum L. (tobacco),
and Piper betel L. (betel leaf). The materials were
purchased from local indigenous market (Chachoengsao,
Chiang Mai, and Nakhon Pathom, Thailand) in
November 2012. The taxonomic identification was done
by Dr. C. Noysang, Thai Traditional Medicine College,
Rajamangala University of Technology. The voucher
specimens have been deposited in Royal Forestry
Department, Bangkok, Thailand. Plant information is
shown in Figure 1 and Table 1.
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Chemicals and apparatus Results and Discussion

2,2 - Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl
(DPPH), and ascorbic acid were purchased from Sigma
Aldrich-Fluka. For absorbance measurements, Biochrom
Anthos Zenyth 340 Microplate Reader with Optional
Temperature Control was used. A HPTLC scanner with
computer system and WinCats Version Software were
obtained from Camag (Muttenz, Switzerland). Camag a b
Linomat V was used as applicator. Separation was done
on silica gel F254 HPTLC precoated plates purchased
from Merck (Germany).

Samples preparation
The powdered raw material of Catechu resin,
Tobacco dried leaf, Betel fresh leaf (10 g) was extracted d
with 100 mL of 95% ethanol and the powdered raw c
material of Areca nut (10 g) was extracted with 100 mL
of 70% ethanol using shaker for 30 min at 25°C and
Figure 1. Herbal ingredients of Thai betel quid; (a)
filtrated. The solvent were completely evaporated to
Acacia catechu (L.f.) Willd.; (b) Areca catechu L.; (c)
dryness using rotary flash evaporator (Buchi type).
Nicotiana tabacum L.; (d) Piper betle L.
Different extracts were prepared from the resultant crude
ethanol and used for further investigations of HPTLC
fingerprint and in vitro antioxidant activity.
Table 1: Name and Thai indigenous use of plants studied
HPTLC analysis Botanical Common Family Indigenous use Parts
name name use
Chromatography was performed on silica gel F254
Acacia catechu LEGUMI- Used as a Resin
HPTLC pre-coated plates. Samples were applied on the catechu (L.f.) tree NOSAE mouthwash,
plates as band of 8-10 mm width using a Camag Linomat Willd. (MIMOSOI sore throats, and
V sample applicator at the distance of 8 mm from the DEAE) diarrhea.
Areca betel nut PALMAE Used fresh or it Nut
edge of the plates. The mobile phase composed of catechu L. may be dried
chloroform-acetone-formic acid (75:16.5:8.5), and cured
chloroform-ethanol (60:40), toluene- ethyl acetate- before use, by
diethyl amine (70:20:10), and toluene-ethyl acetate sun-drying,
baking or
(93:7). After development, plates were dried and
roasting.
derivatised in Dragendorff, KOH, Vanillin-sulphuric acid Nicotiana tobacco SOLANA- Used as Leaf
reagents. The fingerprints were evaluated at 366 nm in tabacum L. CEAE stimulation and
fluorescence mode with a WinCats and VideoScan relaxing
Piper betle L. betel leaf PIPERA- Used a Leaf
software.
CEAE stimulant, an
antiseptic and a
Antioxidant activity assay breath-
freshener.
The extracts were diluted in ethanol solution at the
concentration of 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0.1 mg/mL, and HPTLC analysis
0.01 mg/mL. 100 μl aliquots of the extract were mixed
with 900 μl of the ethanolic DPPH solution (0.25g/L). The fingerprint of the constituents present in
The reduction of the DPPH free radical was measured by samples was recorded using Camag TLC visualizer and
reading the absorbance at 517 nm and related to the WinCats Software. The chromatograms (Figure 2)
absorbance of the control without the herbal drugs. showed spots which are characteristic for several
Inhibition ratio (percent) was calculated from the medicinal plant species. In particular, HPTLC
following equation: % inhibition [(absorbance of control fingerprinting of ethanolic extract of Acacia catechu
- absorbance of sample)/absorbance of control] x 100%. (L.f.) Willd. (catechu Tree) revealed four spots with hRf
Ascorbic acid was used as positive controls. values in the range of 12, 25, 36, and 47; Areca catechu
L. (betel nut) showed one spot with hRf values in the
range of 73; Nicotiana tabacum L. (tobacco) showed two
spots with hRf values in the range of 50, and 69; Piper
betle L. (betel leaf) showed six spots with hRf values in
the range of 7, 17, 24, 41, 59, 95.

39
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

(93.57±0.66%, and 89.43±2.02%, respectively) inhibition

of DPPH free radical. Reference standards ascorbic acid
showed significant inhibition activity 90.88±4.42%.

Table 2: DPPH scavenging activity of ethanolic extract

of herbal ingredients in Thai Betel Quid (EC50 values)

10µl 20µl 30 µl 10µl 20µl 30 µl Sample EC50 (µg.mL-1)

(a) (b)
Acacia catechu (L.f.) Willd. 0.036(±0.010)
Areca catechu L. 0.042(±0.005)
Nicotiana tabacum L. 0.673(±0.261)
Piper betle L. 0.060(±0.002)
Ascorbic acid 0.065(±0.05)
Alpha – tocopherol 42.83(±8.46)
Gallic acid 0.07(±0.01)
Values represent mean± S.D. of three replicate
10µl 20µl 30 µl 10µl 20µl 30 µl
(c) (d)
Conclusions
In the present study, the ethanolic extracts of herbal
Figure 2. HPTLC-fingerprint of the ethanolic extracts
ingredients of Thai betel quid to investigate the HPTLC
(a) Acacia catechu under UV 366 nm; (b) Areca catechu
fingerprint profile and antioxidant activities. The solvent
under UV 366 nm; (c) Nicotiana tabacum before
systems (chloroform-acetone-formic acid (75:16.5:8.5),
derivatization under daylight; and (d) Piper betle under
chloroform-ethanol (60:40), toluene- ethyl acetate-
UV 366 nm. The solvent systems (chloroform-acetone-
diethyl amine (70:20:10), and toluene-ethyl acetate
formic acid (75:16.5:8.5), chloroform-ethanol (60:40),
(93:7)) are suitable for the analysis of Acacia catechu,
toluene- ethyl acetate-diethyl amine (70:20:10), and
Areca catechu, Nicotiana tabacum and Piper betle,
toluene-ethyl acetate (93:7)) are suitable for the analysis
respectively. The antioxidant activities of the ethanolic
of Acacia catechu, Areca catechu, Nicotiana tabacum
extract of Acacia catechu, possess very strong
and Piper betle, respectively.
scavenging activity on DPPH free radical with EC50
values of 0.036±0.010.
DPPH scavenging activity

100
Acknowledgments
Inhibition (%)

80
60 Thanks is due to Dr.Winitchai Supanida from
40 Kasetsart Agricultural and Agro-Industrial Product
20
0 Imprevent Institute (KAPI), Kasetsart University,
catechu areca nut tobacco leaf betle leaf Thailand for DPPH inhibition assay.
resin

Ethanolic extracts

References
[1] I, C.W., Ping, H.C., Chien, J.W., Deng C.W., Shih
Figure 3. DPPH scavenging activity of the herbal M.T., Bai H.C., et al. (2010). Quantification of
ingredients of Thai betel quid extracts and standards at blood betel quid alkaloids and urinary 8-
1mg/ mL; mean with 3 replicates each one (mean± S.D. hydroxydeoxyguanosine in humans and their
(n=3)) association with betel chewing habits. Journal of
Analytical of Toxicology. 34: 325-331.
[2] Dizdaroglu, M., Jaruga, P., Birincioglu, M. and
Free radical scavenging assay Rodriguez, H. (2002). Free radical-induced damage
to DNA: mechanisms and measurement. Free
The DPPH antioxidant assay is based on the ability Radical Biology and Meicine. 32: 1102–1115.
of DPPH, a stable free radical, to decolorize in the [3] Gupta, P.C. and Ray, C.S. (2004). Epidemiology of
presence of antioxidants. Comparison of the antioxidant betel quid usage. Annal Academy of Medicine
activity of the ethanolic extracts (at a dose of 1mg/ mL Singapore. 33: 31S-36S.
and reference standards (at doses of 1 mg/mL ) is shown
in Figure 3 and Table 2. The ethanolic extract of Acacia
catechu and Piper betel exhibited an efficient
40
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
[4] Chatrchaiwiwatana, S. (2006). Dental caries and
periodontitis associated with betel quid chewing:
analysis of two data sets. Journal of the Medical
Association of Thailand. 89: 1004-1010.
[5] Yang, Y.H., Lien, Y.C., Ho, P.S., Chen, C.H.,
Chang, J.S, Cheng, T.C., et al. (2005). The effects
of chewing betel quid with and without cigarette
smoking on oral submucous fibrosis and oral
mucosal lesions. Oral Diseases. 11: 88-94.
[6] Lee, C.H., Lee, J.M., Wu, D.C., Hsu, H.K., Kao,
E.L., Huang, H.L., et al. (2005). Independent and
combined effects of alcohol intake, tobacco
smoking and betel quid chewing on the risk of
esophageal cancer in Taiwan. International Journal
of Cancer. 113: 475-482.
[7] Shieh, D.H., Chiang, L.C., Lee, C.H., Yang, Y.H.
and Shieh, T.Y. (2004). Effects of arecoline,
safrole, and nicotine on collagen phagocytosis by
human buccal mucosal fibroblasts as a possible
mechanism for oral submucous fibrosis in Taiwan.
Journal of Oral Pathology and Medicine. 33: 581-
587.
[8] Jacob, B.J., Straif, K., Thomas, G., Ramadas, K.,
Mathew, B., Zhang, Z.F., et al. (2004). Betel quid
without tobacco as a risk factor for oral precancers.
Oral Oncology. 40: 697-704.
41
[9] Chang, K.C., Su, I.J., Tsai, S.T., Shieh, D.B. and
Jin, Y.T. (2002). Pathological features of betel quid-
related oral epithelial lesions in taiwan with special
emphasis on the tumor progression and human
papillomavirus association. Oncology. 63: 62-69.
[10] Shiu, M.N. and Chen, T.H. (2004). Impact of betel
quid, tobacco and alcohol on three-stage disease
natural history of oral leukoplakia and cancer:
implication for prevention of oral cancer. European
Journal of Cancer Prevention. 13: 39-45.
[11] Wang, L.Y., You, S.L., Lu, S.N., Ho, H.C., Wu,
M.H., Sun, C.A., et al. (2003). Risk of
hepatocellular carcinoma and habits of alcohol
drinking, betel quid chewing and cigarette smoking:
a cohort of 2416 HBsAg-seropositive and 9421
HBsAg-seronegative male residents in Taiwan.
Cancer Causes Control. 14: 241-50.
[12] Reichart, P.A., Dietrich, T., Khongkhunthian, P.
and Srisuwan, S. (2003). Decline of oropharyngeal
cancer in Chiang Mai province, Thailand, between
1988 and 1999. Oral Oncology. 39: 569-573.
[13] Chiba, I. (2001). Prevention of betel quid chewers’
oral cancer in the asian-pacific area. Asian Pacific
Journal of Cancer Prevention. 2: 263-269.
[14] Lee, C.H., Ko, Y.C., Huang, H.L., Chao, Y.Y.,
Tsai, C.C., Shieh, T.Y., et al. (2003). The precancer
risk of betel quid chewing, tobacco use and alcohol
consumption in oral leukoplakia and oral
submucous fibrosis in southern Taiwan. British
Journal of Cancer. 88: 366-372.
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Comparative High Alcohol Production in the Fermentation of Durian Peels

and Jackfruit Wastes
Siriphatr Chamutpong 1, Nednapit Noitim2, Chanya Wongjan2, and Duongruitai Nicomrat*2
1
Thai Traditional Medicine College, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, 8
Phahonyothin 87 Rd., Pathum Thani, 12130 Thailand, 2Faculty of Science and
Technology, Rajamangala University of Technology Phra Nakhon, 399 Samsen Road, Dusit,
Bangkok 10300
*Corresponding author. Email: Duongruitai@yahoo.com

Abstract
Thailand agricultural waste materials have been currently and acceptably used as a
carbohydrate source for fermentation process for ethanol. In this research, high contents of
starch of waste materials such as durian peels compared with the rind and pulp wastes from
the shell of the Jackfruit were comparatively tested for their cellulosic digestion. Either
natural habituating microorganisms on the waste itself or the isolated active strains, could be
successfully achieved in 25-30 days for the digestion (8-10 % Brix). There was no significant
difference between these two materials in terms of digestion speed and the ability to digest
cellulose and starch to sugar if the inoculums added were firstly activated at 109-1012 cells/ ml
of the culture. At this step, for 25- 30 days of the cellulose digestion from durian peels, many
varieties of microbial species were observed, especially fungi types white and black
Aspergillus spp. as well as bacilli. The rind and pulp wastes of jack fruit, oppositely, revealed
most bacteria types cocci and small rods as well as Aspergillus spp. Then, the second step of
alcohol production, in durian waste sample, the starch and sugar moieties could possibly be a
bit better retrieved for alcohol production than those of jack fruit (60 and 55% w/w of wastes,
respectively). It showed saturated 10-15% v/v of ethanol contents in about 15 days and 22
days in durian and jack fruit wastes, respectively. Moreover, jackfruit wastes could
comparably be a good source for ethanol production as same as durian peels if all optimizing
conditions at each step were considerably done.
For all these results, any biomaterial wastes could comparably be good sources for
ethanol production if all essential parameters such as sugar contents, microorganisms and
yeast strains, and pH were considerably optimized.

Keywords: Fermentation, Ethanol, Yeast, Cellulosic Materials

Introduction
Thailand with a significant agronomic-based
economy can use current technology for fuel ethanol
fermentation. Not only the molasses from sugar-cane
or sugar but the agricultural waste products can also
provide suitable substrates for ethanol production
(Aristidou and Penttila 2000). By ethanol production
via yeast fermentation, many investigations of the role
of fermentation parameters that might affect ethanol
productivity have been reviewed (Lin and Tanaka,
2006). The process of bioethanol production
composed of the steps of growing and harvesting the
microorganisms at their log phase, starch liquefaction
or saccharification and fermentation processes
(Banerjee et al., 1988).
78
Fermentation is carried out in an anaerobic
environment by microorganisms that can be bacteria
and/ or fungi to breaking down sugars first and then
use yeasts as most common species to carry out the
fermentation process (Benerji et al., 2010; Brethauer,
and Wyman, 2010; Alegre et al., 2003). To optimize
the condition to digest cellulosic materials and starch,
more selective fungal species have been
recommended to first test for their high potential
producing active extracellular enzymes in catalyst of
cellulosic materials as well as the starch to less
complex sugar moieties. The parameter of product in
the fermentation medium have been showed to reduce
the Saccharomyces cerivisae production of ethanol
(Al-Judaibi, 2011). In this study, it was an example
of the comparison of the application of common
microorganisms residing on the surface of two types
of waste of biomaterials; durian peel and jackfruit
rinds and pulp in digestive ability of fiber structures in
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
saccharification process. Finally, at the last step of
ethyl alcohol production with a selective high
resistant alcoholic yeast strain, the alcohol production
at short period of fermentation was estimated.
Materials and Methods
Common microorganisms and Sample Preparation
Either common microorganisms obtained
from the surfaces of durian peels or jackfruit wastes
were selected for the experiment. Approximately 20-
30 kg of the biowastes of durian peels or jackfruit
rinds, pulp and its surface were cut into small pieces
approximately 2 X 2 cm2 or even smaller pieces. They
were soaking in sterile distilled water for at least 3-5
days and only the liquid was taken for the next
saccharification step.
Lignocellulosic Digestion in Saccharification step
Both durian peels and jackfruit waste
samples were boiled in distilled water for 30 min
before pouring into sterile, dried bottles and then
added 300 mL of common microorganisms (10 10 cells/
mL) and adjust the volume of the fermentation to
1 liter with sterile distilled water and left at 25oC.
The control sample was these two wastes without
boiling in 1 liter of sterile water but adding the
common microorganisms to observe the growth of
microorganisms. The fermented liquid was taken for
recording of total sugar, pH values, and color-texture
of the starters during 30 day incubation.
Fermentation for Alcohol Production
At this second step done in batch
fermentation bottle using the feeding culture of S.
cerevisiae strain DistilaMaxTM RM, 493 EDV,
Denmark, was grown to the concentration of 1-10 X
1012 cells/ ml before inoculation. After the first step,
the fermented samples were all filtered for only liquid
and then transferred into a 20 liter bottles and adjust
for the total sugar content to 22% Brix with cane
molass and pH to 4.6 before inoculation with the
active yeast culture. The fermentation bottles were
later kept tightly seal at room temperature for 30 days
and regularly recorded for alcohol, total sugar, pH
values, and color-texture.
Culture Preparation for alcohol fermentation
The strain of Saccharomyces cerevisiae used
in this work was commercial yeast, DistilaMaxTM RM
493 ED, Denmark isolated in a tropical region from
cane molasses. It demonstrates high temperature
tolerance and provides the desirable production of
rum, aguardiente and rhum agricole. This yeast firstly
maintained at 4oC on agar slants was regrown in the
79
agar medium. The composition of the agar was yeast
extract (3 g/ L), malt extract (3 g/ L), peptone (5 g/ L),
glucose (10 g/ L) and agar (20 g/ L) at a pH of 4.5.
The cultures were maintained by sub-culturing every
20 days and the test tubes were then incubated at
30°C for 36 h. The culture on agar slants was stored
at 4°C before adding in a liquid medium. A liquid
medium composed of 2 g/ L), soluble starch (Merck
Co., Darmstadt, Germany) (2 g/ L), 0.20% (NH4) 2SO4
(20 g/ L), KH2PO4 (10 g/L), MgSO4.7H2O 5 g/L and
yeast extract (10 g/L) at pH 5.0 was used for growth
using 2% (v/v) inoculum in 50 mL of the sterile
medium contained in a 250-mL Erlenmeyer flask,
aerobically, in a rotary shaker (120 rpm) at 30°C.
Alcohol and Total Sugar Determination
The amount of alcohol produced in cell-free
fermentation broth was determined by alcohol
dehydrogenase (obtained from Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) (Banerjee et al., 1988). Total reducing
sugars were determined by the Benedict’s test (R.D.
Simoni et al., 2002).
Results and Discussion
At the first step, both samples showed the
variations of microbial community after reactivated
and well prepared and tested for their highly activity
in fiber digestion. For 25- 30 days of the cellulose
digestion from durian peels, there were many varieties
of microbial species observed than jackfruit wastes.
Large amount of sugar content were obtained from
both these cellulosic and high starch materials during
the fermentation process. Not only natural habituating
microorganisms on the waste itself but the isolated
active strains could also be successfully achieved in
25-30 days for the digestion (8-10 % Brix). There
was no significant difference between these two
materials in terms of digestion speed and the ability to
digest cellulose and starch to sugar if the inoculums
added were firstly activated at 109-1012 cells/ ml of
the culture (unpublished data).
At this first step, most microorganisms in
durian samples as shown in table I were white fungi
(Aspergillus spp,) more than bacteria (rod bacilli and
cocci) and yeast. Whereas most microorganisms in
jackfruit wastes were bacteria (rod and cocci) and
black fungi (Aspergillus niger). These common
microorganisms could convert xylose to ethanol by
cellulase enzyme utilized in the hydrolysis of
lignocellulosic materials from These different
microbial communities could affect the values of total
sugar contents because of higher sugar contents from
the digested durian peels than that of the jack fruit
wastes (12-14 Brixs of sugar contents, 40-60% w/w of
waste, in approximately 20 days and 30-35 days,
respectively).
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Table 1: The observation of common microorganism saturated 10-15% w/w of ethanol contents about 15
growth at the first step of (A) durian peel or (B) days whereas 25 days in jackfruit waste sample.
jackfruit wastes (rind, surface, and pulp) digestion
that were counted under microscopy.

(A) (B)

nd= not detectable, F = Few numbers of the microbes (< 10 4

cells/ mL), Md = medium numbers of the microbes (1-10 X 108
cells/ mL), H = high numbers of the microbes (1-300 X 1010 cells/
mL).
Figure 1. The result of durian peel fermentation for
We found that after 30 days, these common alcohol production during 30 day inculbation. The
microorganisms were not suitable for alcohol sample was inoculated with S. cerevisiae
production since only 5-6 % alcohol production could DistilaMaxTM RM, 493 EDV. The initial total
be obtained if the fermentation was kept longer reducing sugar (cane molass) concentration was of
(unpublished data). Much longer incubation time was 22% Brix
performed but even less numbers of these microbes
were detected (from 108 cells/ml to 103 cells/ml. It
was possible that these microorganisms could not
stand high concentration of alcohol. As known that
ethanol produced is toxic to many competing
microorganisms including bacteria. Therefore, the
inoculums have to be controlling with a large charge
of strong yeast to overwhelm any competing
organisms that may be introduced.
Then, the second step, all solid waste was
removed out and the liquid with high contents of total
sugar (approximately 7-12% Brix sugar) was adjusted
with either cane molass or sucrose to obtain 22% Brix
sugar. After inoculation of S. cerevisiae strain
DistilaMaxTM RM, 493 EDV, from Fig. 1 and Fig 2,
ethanol production was initially observed in only 5-8 Figure 2. The result of durian peel fermentation for
days of incubation in both material samples. High alcohol production during 30 day inculbation. The
alcohol concentration (13-16% (v/v)) could be sample was inoculated with S. cerevisiae
observed in ten to 15 days and then be further distilled DistilaMaxTM RM, 493 EDV. The initial total
for the alcohol. From total 20 liters of fermented reducing sugar (cane molass) concentration was of
liquid, 2.5 liters of 95-97% pure ethanol could be 22% Brix
obtained. In this study, same as the report done by So from these two figures, the present
Alshiyab et al. (2009), the use of big size 20 liter size investigation has demonstrated the importance of
of the fermentation tank could reduce the effect of fermentation parameters that can help improve the
gaseous products in fermentation medium and this alcoholic fermentation. These factors are the total
enhanced biomass concentration. sugar contents that should be fast decreased to
In durian waste sample, the starch and sugar indicate high alcohol production together with the
moieties could possibly be a bit better retrieved for constant low pH and yeast strain. This alcohol
alcohol production than those of jack fruit (60 and fermentation experiment showed such a manageable
55% w/w of wastes, respectively). These could typical batch of the microorganisms passed 4 stages
possibly be due to less complex constitution of that took nearly 30 day incubation for their growth.
cellulose connecting with the starch nearby in durian The suitable yeast strains had affected the fast alcohol
peels than that of jack fruit rind and pulp wastes. production as well as the waste sample types, for
Therefore, this durian waste was better biomass example, in durian samples when using commercial
source for bacterial fermentation since it showed yeasts, the concentration of the alcohol could be up to

80
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
14-16% in 15 days but the isolated species was to 12-
14% in 20 days. Numbers of isolated yeast were
reduced (from 1010 to 106-7 cells/mL). In the test, a
number of isolated yeast strain in our laboratory could
not well resist alcohol at high concentration as well as
the commercial yeast can (unpublished data),
however, finally they could provide high alcohol
production (14-15%) even but needed longer time.
Conclusions
This work provided a practical example of
the current status of ethanol fermentation using
various biomass resources. In the fermentation, all the
processes were carried out in an anaerobic (no
oxygen) environment by natural microorganism
communities that grow and thrive the cellulosic
materials as well as starch. These microorganism
communities were fluctuated in numbers of fungi,
bacteria, and yeasts that have to be assorted in certain
function for high sugar production. Whereas at the
alcohol fermentation process, a good strong yeast
strain was essential in high alcohol production. Any
biomaterial wastes could comparably be good sources
for ethanol production if all essential parameters such
as sugar contents, microorganisms and yeast strains,
and pH were considerably optimized.
Acknowledgments
I am gratefully acknowledging the financial
support of the National Research Council of Thailand
(NRCT).
References
[1] Al-Judaibi, A. A. (2011). Effect of Some
Fermentation Parameters on Ethanol Production
from Beet Molasses by Saccharomyces cerevisiae
CAIM13. American Journal of Agricultural and
Biological Science. 6: 301-306.
[2] A. Aristidou, and M. Penttila,.(2000). Metabolic
engineering applications to renewable resource
utilization. Current in Opinion Biotechnology.
11: 187–198.
81
[3] Benerji, D. S. N., Rajini, K., Srinivasa Rao, B.,
Banerjee, D. R. N., Swaroopa Rani, K.,
Rsjkumar, G. et al. (2010). Studies on
physicochemical and nutritional parameters for
the production of ethanol from mahua flower
(Madhuca indica) using S.cerevisiae-3090
through submerged fermentation (SMF).
Journal of Microbial and Biochemical
Technology. 2: 46-50.
[4] Alshiyab, H. S., Kalil, M. S., Hamid, A. A. and
Yusoff, W.W. (2009). Improvement of
biohydrogen production under increased the
reactor size by C.acetobutylicum NCIMB
13357. American Journal of Environmental
Sciences. 5: 33-40.
[5] Banerjee, M., Debnath, S. and Majumdar, S. K.
(1988). Production of alcohol from starch by
direct fermentation. Biotechnology and
Bioengineering. 32: 831-834.
[6] Simoni, R. D., Hill, R. L. and Vaughan,
M. (2002). Benedict's Solution, a Reagent for
Measuring Reducing Sugars: the Clinical
Chemistry of Stanley R. Benedict.
The Journal of Biological Chemistry. 277: 10 -
11.
[7] Alegre, R. M., Rigo, M. and Joekes, I. (2003).
Ethanol Fermentation of a Diluted Molasses
Medium by Saccharomyces cerevisiae
Immobilized on Chrysotile. Brazilian Archives
of Biology and Technology. 46: 751-757.
[8] Brethauer, S. and Wyman, C.E. (2010). Review:
Continuous hydrolysis and fermentation
forcellulosic ethanol production. Bioresource
Technology. 101: 4862-4874.
[9] Lin, Y. and Tanaka, S. (2006). Mini-Review:
Ethanol fermentation from biomass resources:
current state and prospects. Applied
Microbiology and Biotechnology. 69: 627-642.
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Comparative Studies of an in vitro Anti-Acute Graft Versus Host Disease and

Placenta Extract Growth Culture Effect of Human Postnatal Organ-and Bone
Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.

Supadej Rojphaisarn1, 2*, Montree Toso2 , Ruchaira Ucharoen2, Sirikul Manochantr3, Pakpoom
Kheolamai 3, Chairat Tantrawatpan3, Surapol Issaragrisil 4

1
Clinical research department, Thai traditional medicine college, Ragamangala University of Technology
Thanyaburi, Pathumthani 12130, Thailand
2
Stem cell research department, greater pharma stem cell for life Co.,Ltd. BIOTEC, NSTDA,
Pathumthani 12120, Thailand
3
Stem Cell Culture laboratory, Faculty of Medicine, Thammasart University,
Pathumthani 12121, Thailand
4
Stem Cell Culture laboratory at Department of Heamatology, Faculty of Medicine, Siriraj Hospital,
Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand
*Corresponding author. E-mail: supadej_buta@hotmail.co.th

Abstract
Objective: To compare the study of the in vitro anti-acute graft of MSCs derived from postnatal
organ with MSCs derived from bone marrow and used of placenta extract (PE) addition in culture
media.Methods: MSCs derived postnatal organ (umbilical cord, wharton’s jelly amnion, placenta) were
isolated by using digestive enzyme and culture in complete media. The MSCs derived bone marrow was
Ficoll-Hypaque isolated by using density gradient. Those MSCs derived postnatal organ and bone marrow
were compare in growth capacity, differentiating capacity be adipogenic and osteogenic lineages, cell surface
specific markers (including CD73, CD90, and CD105) by using flow cytometry, immune responses in mixed
lymphocyte reactions (MLR) assays and effect of placenta extract media in culture media. Result: Our
results indicated that MSCs isolated from those five sources [MSCs from umbilical cord (UC-MSCs),
Wharton’s jelly (WJ-MSCs), Placenta (PL-MSCs), Amnion (AM-MSCs) as well as bone marrow (BM-
MSCs)] have fibroblast-like morphology and homogeneously expressed cell surface markers (including
CD73, CD90, and CD105). In contrast, the expression of CD45 and CD34, markers of hematopoietic cells in
these MSCs populations were negative. However, our UC-MSCs, WJ-MSCs, AM-MSCs and PL-MSCs also
have an ability to differentiate toward osteocyte and adipocyte-lineages in a manner similar to those of BM-
MSCs. Furthermore, our UC-MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs expanded in vitro can inhibit PB-
MNCs immune responses by using mixed lymphocyte reactions (MLR) assays. Our results indicated that
MSCs derived postnatal organ had similar characteristic as in MSCs derived bone marrow. Most of MSCs
were used fetal bovine serum added in culture media for xenograft. In the present study, we used added in
culture media, the results indicated that most MSCs can growth in 5%PE and express MSCs characteristics.
Conclusion: Our results indicated that the MSCs derived postnatal tissues may be the attractive alternative
sources for clinical application in the future.

Keywords: Umbilical cord MSCs, Wharton’s jelly MSCs, Amnion MSCs, Placenta MSCs, Bone marrow
MSCs

Introduction specific differentiation patterns[3, 4]. Expression of a

Mesenchymal stem cells (MSCs) are defined as
adult immature cells, capable of self-renewing and of
differentiating into various tissues in vivo and in vitro
[1]. Systemic administration of autologous or allogeneic
MSCs in healthy animals has been reported to lead to the
migration and engraftment of them in nonhematopoietic
tissues [2], whereas in injury models, they migrate
specifically to the site of damage and undergo tissue-
95
variety of adhesion molecules on MSCs may account for
their potential multi-organ homing capacity [5]. The
multilineage differentiation ability, together with their
extensive capacity for in vitro expansion, led to
important approaches of utilizing MSCs for tissue
engineering as well as for gene therapy for a variety of
congenital and acquired diseases [3]. Clinical trials
involving MSCs concern distinct disorders, such as
facilitation of hematopoietic recovery in hematopoietic
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
stem cell transplantation [6], osteogenesis imperfecta [7],
metabolic diseases [8], and myocardial infarction [9].
MSCs are not inherently immunogenic, being unable to
be recognized by allogeneic T or natural killer cells [10].
They express negligible levels of major
histocompatibility complex (MHC) class II and
intermediate levels of MHC class I molecules [11].
Induction of MHC class II on MSCs by interferon-γ
(IFN-γ) does not stimulate alloreactivity [12]. Moreover,
MSCs seem to be natural immunosuppressive elements,
being able to inhibit in vitro T cell proliferation and
function of both naive and memory T cells [13] or to
suppress the development of monocyte-derived dendritic
cells in an in vitro system [14]. The ability of MSCs to
modulate immune responses implies their potential role
in cellular immunoregulatory therapy by facilitating
engraftment in organ transplantation [15] and re-
introducing tolerance in autoimmune diseases [16]. To
this end, MSCs have already been used in a clinical trial
for the effective treatment of acute graft-versus-host
disease [17]. Although bone marrow (BM) has been the
main source for the isolation of multipotent MSCs, the
harvest of BM is a highly invasive procedure and the
number, differentiation potential, and maximal life span
of MSCs from BM decline with increasing age [18-20].
Therefore, the search for alternative source of MSCs for
autologous and allogenic is of significant value. It has
been reported that MSCs could be isolated from various
tissues, including adipose tissue [21], umbilical cord
blood [22], umbilical cord tissue [23-25], Wharton’s jelly
[26], placenta [27] and amnion [28]. Among those,
postnatal tissue including umbilical cord, Wharton’s
jelly, placenta and amnion are accessibility, painless
procedures to donors, promising sources for autologous
cell therapy and lower risk of viral contamination [21].
As BM-MSCs are best characterized, we asked whether
MSCs derived from other sources share the
characteristics of BM-MSCs. Previous study
demonstrated that PE have more growth factor better for
cell culture [29, 30], then, we try to use PE addition for
replace FBS used in the future.
Therefore, the first goal of the present study was
to verify whether cells from those MSCs derived
postnatal organ including umbilical cord, Wharton’s
jelly, placenta and amnion under the same in vitro
conditions as BM-MSCs. Second, those cells were
compared their morphology, immune-phenotype,
expansion potential, immune-suppressive properties with
BM-MSCs. Third, to be compared the viability and
growth curve of MSCs derived placenta organ in the
placenta extract (PE) addition culture media with fetal
bovine serum (FBS) added xenograft culture media. The
results obtained from this study might be provide a novel
sources of MSCs for future cell-base therapeutic
application.
96
Materials and Methods
Collection of human specimen
The collection of human specimen was approved by
the Ethical Committee of the Faculty of Medicine,
Thammasat University. Human bone marrow was
obtained from sternum or iliac crest of normal healthy
volunteers (age between 18-80 years). The samples of
umbilical cord, Wharton’s jelly, placenta and amnion
were obtained from pregnanted women after normal
deliveries at Siriraj Hospital, Mahidol University.
Peripheral blood samples were collected from healthy
adult inform consent volunteer.
Isolation and culture of MSCs from bone marrow
40 ml. of bone marrow were collect by aspiration of
normal healthy volunteers (n=5) in 50 ml sterile Falcon
tube (Becton Dickinson, CA) containing 2 ml heparin
(LEO 5,000 i.u./u.i./ml). Mononuclear cells (MNCs)
were isolated by using density gradient (Ficoll-Hypaque
solution, Robbins, Sciencetific Corporation, USA). After
density gradient centrifugation MNCs were removed
from the interphase layer and washed twice with 1X
PBS. Bone marrow-derived MNCs were cultured in
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
(GibcoBRL, NY) containing 2 mM L-glutamine
(GibcoBRL, NY), 10% fetal bovine serum (FBS)
(BioWhittaker, USA), 100 U/ml penicillin and 100
g/ml streptomycin (complete media) at a density of
1X106 cells/cm2 in 25-cm2 tissue culture flasks (Costar,
Corning, NY). After 3 days incubation non-adherent
cells were removed and fresh medium was added to the
flasks. Cultures were maintained in this condition with
complete exchange of culture medium every 3-4 days.
After culture for 7-12 days when the cells density was
reached at 90% confluence, they were passaged by
incubation with 0.25% trypsin-EDTA (GibcoBRL, NY)
and replaced for further expansion (Figure 1).
Isolation and culture of MSCs from umbilical cords
Umbilical cords were obtained from pregnant
women after normal delivery under aseptic conditions
and were carried in sterile 1X PBS with antibiotic. The
umbilical cords were minced into small pieces and then
washed with PBS containing antibiotic and incubated in
0.25% trypsin-EDTA (GibcoBRL, NY) 37°C with
agitation for 30 min. Then tissue washed with PBS
containing antibiotic and re-suspended in complete
media and maintained at 37°C in a humidified
atmosphere containing 5% CO2, with a culture medium
changing for every 3-4 days.After well-developed
fibroblast-like cell colonies and cell density reached at
90% confluence, they were passaged by incubation with
0.25% trypsin-EDTA and replaced cell for further
expansion (Figure 2A).
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
Isolation and culture of MSCs from Wharton’s jelly
Umbilical cords were obtained after birth and
stored in PBS containing antibiotic. After removal of
blood vessels, the mesenchymal tissue was scraped off
from the Wharton’s jelly with a scalpel. After that the
jelly tissue was washed with PBS, containing antibiotic
and then minced into small pieces. The tissue was then
treated with 0.5% trypsin-EDTA for 30 min at 37°C with
agitation. After, washing with PBS, the pellet was re-
suspended in complete media and seeded in noncoated
25-cm2 tissue culture flasks (Costar, Corning, NY).
Culture was maintained at 37°C in a humidified
atmosphere containing 5% CO2, with a change of culture
medium every 3-4 days. When well-developed colonies
of fibroblast-like cell appeared and the cell density reach
at 90% confluence, they were passaged by incubation
with 0.25% trypsin-EDTA and replaced cell for further
expansion (Figure 2B).
Isolation and culture of MSCs from placenta
Decidua basalis tissue was macroscopically
dissected from the central region of the maternal-facing
surface of the placenta under aseptic conditions in PBS
containing antibiotic. The placental tissue was minced
into small pieces and extensively washed with PBS.
Subsequently, the tissue was digested with 0.5% trypsin-
EDTA for 30 min at 37°C with agitation. The pellet was
washed with 1XPBS and then centrifuged at 100 g for 5
min. The pellet were then resuspended in complete
media and plated into noncoated 25-cm2 tissue culture
flasks (Figure 2C). Culture was maintained at 37°C in a
humidified atmosphere containing 5% CO2, with a
change of culture medium every 3-4 days. When well
developed colonies of fibroblast-like cell appeared and
the cell density reach 90% confluence, they were
passaged by incubation with 0.25% trypsin-EDTA and
replaced at density cell for further expansion (Figure
2C).
Isolation and culture of MSCs from amnion
Term amnion was obtained by mechanically peeled
off from chorion under aseptic conditions. It was carried
to PBS containing antibiotic. The amnion was rinsed
with PBS and minced into small pieces. The tissue was
then treated with 0.5% trypsin-EDTA for 30 min at 37°C
with agitation. After, washing with PBS, the pellet was
resuspended in complete media and seeded in noncoated
25-cm2 tissue culture flasks. Culture was maintained at
37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2,
with a change of culture medium every 3-4 days. When
well-developed colonies of fibroblast-like cell appeared
and the cell density reach 90% confluence, they were
passaged by incubation with 0.25% trypsin-EDTA and
replaced at density cell for further expansion (Figure
2D).
97
Immunophenotyping of culture cells
The culture cells were immunophenotypically
characterized using flow cytometer (FACScaliburTM,
Becton Dickinson). Primary cultures cells from bone
marrow, umbilical cord, Wharton’s jelly, placenta and
amnion (passage 3) were trypsinized and fixed with 1%
paraformadehyde. After washing twice with PBS, 4X105
cells were resuspended in 50 l PBS and incubated with
10 l of fluorescein isothiocyanate (FITC) or
phycoerythrin (PE) -conjugated antibodies against CD34,
CD45, CD73 (BD Bioscience, USA), CD90, CD105 and
CD106 (AbD Serotec, USA) for 30 min at 4°C in the
dark. The positive cells were then identified by
comparison with isotypic controls [FITC-conjugated
human immunoglobulin G1 (IgG1) and PE-conjugated
human immunoglobulin G2a (IgG2a)]. At least ten
thousand labeled cells were acquired and analyzed using
FACScaliburTM with CellQuest® solfware (Becton
Dickinson, USA).
Proliferation studies
For the assessment of growth characteristics of
MSCs derived from umbilical cord, Wharton’s jelly,
placenta and amnion in comparison to bone marrow
derived MSCs, 6x103 culture-expanded MSCs (passage
3) were seeded in 24-well cell culture plate in complete
media. The cells from one well were then harvested at
culture day 2, 4, 6 and 8 to determine cell number by
hemocytometer. The mean of the cell counts was
calculated and plotted against culture time to generate a
growth curve.
Adipogenic differentiation testing
The adipogenic differentiation potential of MSCs
were examined using passage 3 cells. Culture expanded,
MSCs from another source were re-suspended in 1.5 ml
NH AdipoDiff Medium (MACS® Media, USA) and
plated with a density of 8x103 cells/cm2 in the 6-well
plated for adipogenic differentiation. The cells were
cultured at 37°C in with 5% CO2 humiditied atmosphere
with complete exchange of medium every 3 days. After 3
weeks of culture, cells were washed with PBS and fixed
with 40% formalin vapor for 10 min at room
temperature. The cells were washed with distilled water
and stained with 0.5% Oil Red-O (Sigma-Aldrich, USA)
in 60% isopropanol for 20 min with agitation at room
temperature. Thereafter, the cells were washed twice
with distilled water and examined under inverted
microscope (Olympus, CKX40).
Osteogenic differentiation testing
The osteogenic differentiation potential of MSCs
was examined in the passaged-3 cells. Culture-expanded
MSCs (passaged 3) from another source were seeded at a
density of 5x103 cells/cm2 , re-suspended in 1.5 ml in NH
OsteoDiff Media (MACS® Media, USA) into 6-well
plate for osteogenic differentiation and cells were culture
at 37°C in an incubator with 5% CO2 at saturating
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

humidity. The medium was replaced every 3 days. After

10 days of culture, cells were washed with PBS and fixed Labeling Responder cells with CFSE
with 10% formalin-methanol for 5 min at -20oC. To
Peripheral blood mononuclear cells (PB-MNCs)
visualize osteogenic differentiation, cells were stained
from responder were labeled with 0.5 µM 5(6)-
for alkaline phosphatase (AP) activity. The positive cells
carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester
were observed under inverted microscope (Olympus,
(CFSE; Sigma) for 15 min at 37°C with continuous
CKX40).
shake. After washing the cells with RPMI 1640 medium
(GibcoBRL, NY) supplemented with 10% FBS
Mixed lymphocyte reaction assays (MLR assays)
(BioWhittaker, USA), 2 mM L-glutamine (GibcoBRL,
Preparation of peripheral blood mononuclear cells
NY) with antibiotic for 3 times, the labeled cells were
50 ml of peripheral blood (one serve as a then resuspended in the same medium and kept at 4oC in
stimulator, another as a responder) was obtained from the dark until required for furture experiment.
allogeneic healthy volunteers (n=5) and placed in 50 ml
Falcon tube (Becton Dickinson, CA) containing 2 ml Irradiating stimulator cells
heparin (LEO 5,000 i.u./u.i./ml). Mononuclear cells
PB-MNCs from stimulator were irradiated at 3000
(MNCs) were isolated by using density gradient (Ficoll-
rad. for 2.5 min. After washing the irradiated cells with
Hypaque solution, Robbins, Sciencetific Corporation,
RPMI 1640 medium (GibcoBRL, NY) supplemented
USA) method. After centrifugation, MNCs were
with 10% FBS (BioWhittaker, USA) ), 2 mM L-
harvested from the interphase layer and washed twice
glutamine (GibcoBRL, NY), 100 U/ml with antibiotic for
with PBS containing antibiotic and the MNCs count was
3 times, the cells were then resuspended in the same
determined by using an automatic cell analyzer (Cell-
medium and kept at room temperature.
DYN®1800, Abbott, Germany).

Figure 1. Isolation and culture of MSC derived from Bone Marrow

A B C D

Figure 2. Isolation and culture of MSC derived from A:Umbilical cord, B: Wharton’s jelly, C: Placenta, D: amnion

Mixed lymphocyte reaction assay donor without MSCs added. In assays of mitogen-
induced proliferation, 1 x 105 PB-MNCs were cultured
To test the potential of MSCs in suppressing
with phytohemagglutinin (PHA; 2 µg/ml) without the
proliferation of activated T-lymphocyte, a mix
presence of MSCs. After 5 days of MLR culture, the
lymphocyte reaction (MLR) assay was performed using
MNCs were harvested and washed twice with PBS
peripheral blood MNCs (PB-MNCs) obtained from two
containing 1% FBS (BioWhittaker, USA). MNCs were
allogenic volunteers (n=5 pairs). CSFE-labeled
resuspended in 1X PBS containing 1% FBS
responder’s PB-MNCs and irradiated PB-MNCs from an
(BioWhittaker, USA). 7-aminoactinomycin D (7-ADD)
allogeneic donor were co-cultured at a ratio of 1:1 in 24-
staining was used to exclude dead cells, and analysis of
well flat-bottomed plate containing RPMI-1640 medium
cell division was performed using flow cytometer
(GibcoBRL, NY) supplemented with 10%FBS
(FACScaliburTM, Becton Dickinson) and Cell Quest
(BioWhittaker, USA) ), 2 mM L-glutamine (GibcoBRL,
software. The data was presented as a proliferative index
NY) with antibiotic. The effectors cells (MSCs derived
which was calculated by the following formula:
from umbilical cord, Wharton’s jelly, placenta, amnion
and bone marrow) were also plated into the same wells.
The positive control was CSFE-labeled responder PB-
MNCs and irradiated PB-MNCs from an allogeneic
98
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
Proliferative index = A x 100
A+B
A= number of cell division
B= number of cell in original population
Placenta extract
Fresh full-term human placenta was section
placental cotyledons with scissors. Take pieces of
placenta place them in dry ice for separate blood vessels
from tissue and use scissors to finely mince tissue in
beaker and place it in a large plastic centrifuge bottle on
ice which contains ice-cold 1 X PBS with antibiotic.
After all tissue is minced and shack in 1 X PBS for 1
min. to wash out blood cells (Figure 3A). Spin and
collect pellet. Then the tissue were freezed in liquid
nitrogen for 1 day and then the tissue were trawed in 37
o
C water bath replete 2 times for break the cell. The
tissue were centrifuge and collect supernatant and stored
in-20 oc before to use (Figure 3B).
A B
Figure 3. Isolation of Placenta extract. A: placenta
extract tissues. B: Placenta extracts growth factor
Placenta extract cultivation
Both MSCs derived postnatal organ and bone
marrow were trypsinized and the cells were collected the
cell. The 5x103 MSC were cultured in 10% FBS, 5%PE,
10%PE complete media with antibiotic. Culture was
maintained at 37°C in a humidified atmosphere
containing 5% CO2, with a change of culture medium
every 3-4 days. The MSC were counted every day for 1
week and plotted growth curve. After 1 week the MSC
were characterized for Immunophenotyping and
differentiation.
Statistical analysis
The data are presented as mean ± standard error of
mean (SEM). The ANOVA test was used to assess the
significance of differences between observed data. P-
value of less than 0.05 was considered to be statistically
significant.
99
Results and Discussion
The characteristics of culture UC-MSCs, WJ-MSCs,
PL-MSCs, AM-MSCs in comparison to BM-MSCs
Mononuclear cells (MNCs) isolated from bone
marrow after plating, MNCs had spherical shape and
floated over the culture flask. The adherent cells had a
heterogeneous characteristic. Cultures were monitored
daily and between 7-10 days of culture, small outgrowth
colonies of approximately 20-50 cells were observed
(Table 1). After 10 day the cell were rapidly proliferated
from spindle shape (Figure 6A). The cells isolated from
human umbilical cords (UC), Wharton’s jelly (WJ),
placenta (PL) and amnion (AM) after plating, only a few
cells attached to the plastic culture flasks (Figure 6B-6F).
Cultures were monitored daily and the onset of colony
formation could be observed at first in UC-culture
(7.6±0.88 days) (Table 1). MSCs derived from umbilical
cords (UC-MSCs), Wharton’s jelly (WJ-MSCs), placenta
(PL-MSCs) and amnion (AM-MSCs) show spindle-
shaped fibroblast-looking morphology (Figure 6B-6F)
similar to bone marrow derived MSCs (BM-MSCs)
(Figure 6A). UC-MSCs were reached confluence after
approximately 10 days of culture (Figure 6B). In
contrast, culture of cells isolated from placenta and
amnion took a significantly longer period of time to
develop MSCs colonies than bone marrow (18.6±1.05
days, 11.8±1.19 days vs. 8.2±0.75, P<0.05) (Table 1).
The proliferation characteristics of UC-MSCs, WJ-
MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs in comparison to BM-
MSCs
The growth characteristics of UC-MSCs, WJ-
MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs and BM-MSCs were
compared during 8 days. The results showed that UC-
MSCs has a higher expansion potential than BM-MSCs,
WJ-MSCs, PL-MSCs and AM-MSCs (Figure 4). The
growth characteristic of UC- MSCs during early period
(passage 2 and 3) was similar to WJ-MSCs (Figure 4).
The growth velocity of PL-MSCs and AM-MSCs were
significantly lower than BM-MSCs in all passages
(P<0.05).
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

100.00

% (Expression)
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
Bone Umbilical Wharton's Placenta Amnion
marrow cord jelly

Figure 4. Figure 5. Percentages of BM-MSCs, UC-MSCs, WJ-

Cell surface marker characteristics of UC-MSCs,
WJ-MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs in comparison to
BM-MSCs
Immunophenotype of UC-MSCs, WJ-MSCs, PL-
MSCs, AM-MSCs and BM-MSCs (passage 3) were
characterized using phycoerythrin (PE) -conjugated or
fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated antibodies
against CD34, CD45, CD73, CD90 and CD 105. UC-
MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs and AM-MSCs exhibit
similar cell surface marker characteristics when
compared to BM-MSCs. Flow cytometric analysis
showed that UC-MSCs, WJ- MSCs, PL-MSCs and AM-
MSCs expressed high levels of MSC markers (CD73,
CD90, and CD105) but did not expressed hematopoietic
lineage markers (CD34, CD45) (Figure 5) similar to BM-
MSCs (Figure 7).
MSCs, PL-MSCs and AM-MSCs that were tested for
each cell surface antigen expression by flow cytometry at
passage 3.
Osteogenic differentiation potential of UC-MSCs,
WJ-MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs in comparison to
BM-MSCs
The osteogenic differentiation potential of UC-
MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs and AM-MSCs were
compared to BM-MSCs. MSCs from passage 3 were
cultured under condition that is favorable for an
osteogenic differentiation. After 10 days of induction,
most of UC-MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs and AM-
MSCs became alkaline phosphatase-positive similar to
BM-MSCs (Figure 8A: B, D, F, H, J). Untreated control
cultures growing in regular medium without any
osteogenic differentiation.

Figure 6. Morphology of mesenchymal stem cells derived from A: bone marrow (BM), B: umbilical cords (UC), C:
Wharton’s jelly (WJ), D: placenta (PL) and F: amnion (AM). All MSC were spherical-shaped cells at day 0 after
the initial seeding; Adherent cells at day 3; Spindle-shaped cells at day 7; MSCs was reached sub-confluence
at day14; 100% confluence

Figure 7. Flow cytometric analysis of surface-marker expression on A: BM-MSCs, B: UC-MSCs, C: WJ-MSCs

(UCM-MSCs), D: AM-MSCs, E: PL-MSCs. The cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS. At
passage 2, the cells were analyzed by flow cytometry. The green line shws the profile of negative control. The data
shown are representative of those obtained in three different experiments.

100
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013

Adipogenic differentiation potential of UC-MSCs,

WJ-MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs in comparison to
BM-MSCs 60

The adipogenic differentiation potential of UC- 50

Proliferation index (%)

MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs and AM-MSCs were 40
compared to BM-MSCs. MSCs from passage 3 were
30
cultured under condition that is favorable for an
adipogenic differentiation. After 3 weeks of induction, 20
UC-MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs and AM-MSCs had 10
the appearance of larger round cells presenting numerous
0
fat vacuoles in the cytoplasm similar to BM-MSCs.

SC

SC

SC
SC
r

SC
+R

+S
These lipid droplets were oil red-O-positive (Figure 8B:

M
M
JM
R*

R*
+P

BM

PL
W
R*

r+
r+

r+
r+

r+
B, D, F, H, J) while untreated control cultures did not

+S
+S

+S
+S

+S

R*
R*

R*
R*

R*
have lipid droplets in their cytoplasm (Figure 8B: C, E,
F, G, I).
Figure 9. Mean value of proliferation index of CFSE
labeled responder T-lymphovcytes co-cultured with
irradiated stimulator T-lymphovcytes and MSCs from
various sources. Data are presented as mean±SEM.
*P<0.05: significantly different compared to control
(R*+Sr). (R* : Radiated responder, Sr: Stimulator)

10%FBS 5%PE 10%PE 15%PE

Figure 8. A: Representative photomicrographs of

osteogenic differentiation of BM-MSCs (A, B), UC-
MSCs (C, D), WJ-MSCs (E, F), PL-MSCs (G, H) and
AM-MSCs (I, J) was evidenced by the formation of
alkaline phosphatase-positive aggregates in cytoplasm
after osteogenic induction. B: Representative
photomicrographs of adipogenic differentiation of BM-
MSCs (A, B), UC-MSCs (C, D), WJ-MSCs (E, F), PL-
MSCs (G, H) and AM-MSCs (I, J) was evidenced by the C
formation of lipid droplet (oil red-O-positive) in
cytoplasm after adipogenic induction.

Effect of UC-MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs

in comparison to BM-MSCs in MLR cultures
The effect of UC-MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs,
AM-MSCs compared to BM-MSCs on proliferation of T-
lymphocytes in MLR assays is summarized in figure 9.
UC-MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs and BM-
MSCs significantly reduced proliferation of T-
lymphocytes (P < 0.05) compared to control experiments
(no MSCs added) (Figure 9). UC-MSCs, WJ-MSCs were
showed higher immunosuppressive potency than BM-
MSCs, while PL-MSCs and AM-MSCs exhibited lower
immunosuppressive effect in comparison to BM-MSCs.
Figure 10. A: The MSCs derived from postnatal organ
were cultivated in 10%FBS, 5%PE, 10%PE, 15%PE
culture media, the cell were perform spindle shape. B:
The MSCs were characterized for Immunophenol-
typing. The MSCs were expressed of MSC markers
(CD73, CD90, and CD105). C: The MSCs can
differentiated in osteocyte and adipocyte.

101
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
Placenta extract cultivation
The MSC derived from postnatal organ and bone marrow
were cultivated in 10%FBS, 5%PE, 10%PE, 15%PE
culture media, the cell were perform spindle shape
(Figure 10A). The MSCs in 10%FBS culture were grown
spindle shape faster than 5%PE, 10%PE, 15%PE culture
media (Figure 11). If the growth of postnatal MSCs were
compared between in 5%PE, 10%PE, 15%PE, the result
shown that the MSCs in 5%PE culture media were
growth than 10%PE, 15%PE culture media (Figure 11).
After 1 week the MSC were characterized for
Immunophenotyping and differentiation. The MSCs were
expressed high levels of MSC markers (CD73, CD90,
and CD105) but did not expressed hematopoietic lineage
markers (CD34, CD45) (Figure 10B) and differentiated
in osteocyte and adipocyte (Figure 10C). This result
shown that if we want to use PE replace FBS, 5%PE will
be suitable for cultivation .
Figure 11. The growth curve of MSCs derived from
postnatal organ were cultivated in 10%FBS, 5%PE,
10%PE, 15%PE media.
In the present study, we demonstrated the
successfully isolated MSCs derived postnatal organ as
well as bone marrow. This study comprehensively
compared several characteristics of MSCs derived
postnatal organ with bone marrow in aspects of cell
morphology, immune-phenotype and growth kinetics and
differentiation capacity to be adipogenic and osteogenic
lineages. Our results indicated that MSCs isolated from
those five sources [MSCs from umbilical cord (UC-
MSCs), Wharton’s jelly (WJ-MSCs), Placenta (PL-
MSCs), Amnion (AM-MSCs) as well as bone marrow
(BM-MSCs)] have fibroblast-
like morphology and homogeneously expressed cell
surface markers (including CD73, CD90, and CD105). In
contrast, the expression of CD45 and CD34, markers of
hematopoietic cells in these MSCs populations were
negative. However, our UC-MSCs, WJ-MSCs, AM-
MSCs and PL-MSCs have an ability to differentiate
toward osteocyte and adipocyte-lineages in a manner
similar to those of BM-MSCs. Furthermore, our UC-
MSCs, WJ-MSCs, PL-MSCs, AM-MSCs expanded in
vitro can inhibit PB-MNCs immune responses by using
mixed lymphocyte reactions (MLR) assays. Our results
indicated that MSCs derived postnatal organ had similar
characteristic as in MSCs derived bone marrow. Most of
MSCs were used fetal bovine serum added in culture
media for xenograft. In the present study, we used added
102
in culture media, the results indicated that most MSCs
can growth in 5%PE and express MSCs characteristics.
Conclusions
Our results indicated that the MSCs derived
postnatal tissues may be the attractive alternative sources
for clinical application in the future.
Acknowledgements
The authors thank all advisors and gratefully
acknowledge the assistance of the Stem cell research
department, greater pharma stem cell for life Co., Ltd.
The Stem Cell Culture laboratory, Faculty of Medicine,
Thammasart University and the Stem Cell Culture
laboratory at Department of Heamatology, Faculty of
Medicine, Siriraj Hospital, Mahidol University.
References
[1] Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S. and Robey,
P.G. (2001). Bone marrow stromal stem cells:
nature, biology, and potential applications. Stem
Cells. 19(3): 180-192.
[2] Devine, S.M, Cobbs, C., Jennings, M.,
Bartholomew, A. and Hoffman, R. (2003).
Mesenchymal stem cells distribute to a wide range
of tissues following systemic infusion into
nonhuman primates. Blood. 101(8): 2999-3001.
[3] Barry, F.P. and Murphy, J.M. (2004). Mesenchy-
mal stem cells: clinical applications and biological
characterization. The International Journal of
Biochemistry and Cell Biology. 36(4): 568-584.
[4] Chapel, A., Bertho, J.M., Bensidhoum, M.,
Fouillard, L., Young, R.G., Frick, J., et al.
(2003). Mesenchymal stem cells home to injured
tissues when co-infused with hematopoietic cells
to treat a radiation-induced multi-organ failure
syndrome. The Journal of Gene Medicine. 5(12):
1028-1038.
[5] Zhao, R.C., Liao, L. and Han, Q. (2004).
Mechanisms of and perspectives on the
mesenchymal stem cell in immunotherapy. Journal
of Laboratory and Clinical Medicine. 143(5): 284-
291.
[6] Koç, O.N., Gerson, S.L., Cooper, B.W., Dyhouse,
S.M., Haynesworth, S.E., Caplan, A.I., et al.
(2000). Rapid hematopoietic recovery after
coinfusion of autologous-blood stem cells and
culture-expanded marrow mesenchymal stem cells
in advanced breast cancer patients receiving high
dose chemotherapy. Journal of Clinical Oncology.
18(2): 307-316.
[7] Horwitz, E.M., Prockop, D.J., Fitzpatrick, L.A.,
Koo, W.W., Gordon, P.L., Neel, M., et al.
(1999). Transplantability and therapeutic effects of
bone marrow-derived mesenchymal cells in
children with osteogenesis imperfecta. Nature
Medicine. 5(3): 309-313.
 Proceedings of the 1st Academic Science and Technology Conference ASTC2013
Science and Technology for Better Life 18 March 2013
[8] Koç, O.N., Day, J., Nieder, M., Gerson, S.L.,
Lazarus, H.M. and Krivit, W. (2002). Allogeneic
mesenchymal stem cell infusion for treatment of
metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler
syndrome (MPS-IH). Bone Marrow
Transplantation. 30(4): 215-222.
[9] Chen, S.L., Fang, W.W., Ye, F., Liu, Y.H., Qian, J.,
Shan, S.J., et al. (2004). Effect on left ventricular
function of intracoronary transplan-tation of
autologous bone marrow mesenchymal stem cell in
patients with acute myocardial infarction. The
American Journal of Cardiology. 94(1): 92-95.
[10] Rasmusson, I., Ringdén, O., Sundberg, B. and Le
Blanc, K. (2003). Mesenchymal stem cells inhibit
the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not
activated cytotoxic T lymphocytes or natural killer
cells. Transplantation. 76(8): 1208-1213.
[11] Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K.,
Zetterberg, E. and Ringdén, O. (2003). HLA
expression and immunologic properties of
differentiated and undifferentiated mesenchymal
stem cells. Experimental Hematology. 31(10): 890-
896.
[12] Le Blanc, K. (2003). Immunomodulatory effects of
fetal and adult mesenchymal stem cells.
Cytotherapy. 5(6): 485-489.
[13] Di Nicola, M., Carlo-Stella, C., Magni, M.,
Milanesi, M., Longoni, P.D., Matteucci, P., et al.
(2002). Human bone marrow stromal cells suppress
T-lymphocyte proliferation induced by cellular or
nonspecific mitogenic stimuli. Blood. 99(10):
3838-3843.
[14] Zhang, W., Ge, W., Li, C., You, S., Liao, L., Han,
Q., et al. (2004). Effects of mesenchymal stem
cells on differentiation, maturation, and function of
human monocyte-derived dendritic cells. Stem
Cells and Development. 13(3): 263-271.
[15] Bartholomew, A., Sturgeon, C., Siatskas, M.,
Ferrer, K., McIntosh, K., Patil, S., et al. (2002).
Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte
proliferation in vitro and prolong skin graft
survival in vivo. Experimental Hematology. 30(1):
42-48.
[16] Ikehara, S. (2003). New strategies for BMT, organ
transplantation, and regeneration therapy.
Hematology. 8(2): 77-81.
[17] Le Blanc, K., Rasmusson, I., Sundberg, B.,
Götherström, C., Hassan, M., Uzunel, M., et al.
(2004). Treatment of severe acute graft-versus-host
disease with third party haploidentical
mesenchymal stem cells. Lancet. 363(9419): 1439-
1341.
[18] Nishida, S., Endo, N., Yamagiwa, H., Tanizawa, T.
and Takahashi, H.E. (1999). Number of osteo-
progenitor cells in human bone marrow markedly
decreases after skeletal maturation. Journal of Bone
and Mineral Metabolism. 17(3): 171-177.
[19] Mueller, S.M. and Glowacki, J. (2001). Age-related
decline in the osteogenic potential of human bone
marrow cells cultured in three-dimensional collagen
103
sponges. Journal of Cellular Biochemistry. 82(4):
583-590.
[20] Stenderup, K., Justesen, J., Clausen, C. and
Kassem, M. (2003). Aging is associated with
decreased maximal life span and accelerated
senescence of bone marrow stromal cells. Bone.
3(6): 919-926.
[21] Tzu-Lei, C.C.H. and Kung-Kai, K. (2011). Human
adipose-derived stem cells: Isolation, charac-
terization and current application in regeneration
medicine. Genomic Medicine Biomarkers, and
Health Sciences. 3(2): 53-62.
[22] Shin, K.S., Lee, H.J., Jung, J., Cha, D.H. and Kim,
G.J. (2010). Culture and in vitro hepato- genic
differentiation of placenta-derived stem cells, using
placental extract as an alternative to serum.
Blackwell Publising Ltd. 43: 435-444.
[23] Lu, L.L., Liu, Y.J., Yang, S.G., Zhao, Q.J., Wang,
X., Gong, W., et al. (2006). Isolation and
characterization of human umbilical cord
mesenchymal stem cells with hematopoiesis
supportive function and other potentials.
Haematologica. 91(8): 1017-1026.
[24] Cao, F.J. and Feng, S.Q. (2009). Human umbilical
cord mesenchymal stem cells and the treatment of
spinal cord injury.Chinease Medical Journal.
112(2): 225-231.
[25] Kocaefe, C., Balci, D., Hayta, B.B. and Can, A.
(2010). Reprograming of Human Umbilical Cord
Stromal Mesenchymal Stem Cells for Myogenic
Differentiate and Muscle Repair. Stem Cell
Reviews and Reports. 6(4): 512-522.
[26] Mitchell, K.E., Weiss, M.L., Mitchell, B.M.,
Martin, P., Davis, D., Morales, L., et al. (2003).
Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and
glia. Stem Cells. 21(1): 50-60.
[27] Miao, Z., Jin, J., Chen, L., Zhu, J., Huang, W.,
Zhao, J., et al. (2006). Isolation of mesenchymal
stem cells from human placenta: comparison with
human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell
Biology International. 30(9): 681-687.
[28] Alviano, F., Fossati, V., Marchionni, C., Arpinati,
M., Bonsi, B., Franchina, M., et al. (2007). Term
amniotic membrane is a high throughput source for
multipotent mesenchymal stem cells with the
ability to differentiate into endothelial cells in vitro.
BMC Developmental Biology. 7: 11.
[29] Mannello, F. and Tonti, G.A. (2007). Concise
review: no breakthoughs for human mesen- chymal
and embryonic stem cells culture: conditioned
medium, feeder layer, or feeder-free; medium with
fetal calf serum, human serum, or enriched plasma;
serum-free, serum replacement non-conditioned
medium, or ad hoc formula? all that glitters is not
gold. 25: 1603-1609.
[30] Shin, K.S., Lee, H.J., Jung, J., Cha, D.H. and Kim,
G.J. (2010). Culture and in vitro hepatogenic
differentiation of placenta-derived stem cells, using
placental extract as an alternative to serum.
Blackwell Publising Ltd. 43: 435-44.