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se aisló ARN de levadura mediante un protocolo que incluyó dos etapas: homogenización y purificación. En la
primera etapa, se disolvió la levadura en agua, calentando hasta 37 ȗC y agregando una solución de lisis, en este caso se
utilizó fenol concentrado. La posterior centrifugación de la solución obtenida, contenía el ARN como sobrenadante, este
sobrenadante se aisló y se le adicionó etanol frio para precipitar y purificar el ARN, lo que constituyó la segunda etapa
del proceso.
En la determinación cualitativa y cuantitativa del ARN aislado, se recurrió a una técnica espectroscópica. Se preparó
una curva de calibración utilizando soluciones de ARN estándar y adicionando orcinol- FeCl 3 en medio caliente, el
resultado fué una solución de color verde fácilmente cuantificable por espectroscopía en el rango visible (a una
longitud de onda de 665 mn), al ARN aislado también se le hizo reaccionar con estos mismo reactivos en iguales
condiciones y se le tomó la absorbancia; con este resultado y la ecuación de la recta obtenida por mínimos cuadrados,
se determinó una concentración de 0.133 % de ARN en 5 g de levadura. Por otro lado, se tomó un espectro ultravioleta
del ARN de levadura aislado, en el cual se observan 2 bandas, a 207.0 y 269.0 nm, propias de los sistemas de dobles
enlaces conjugados presentes en la molécula de las purinas y pirimidinas del acido nucleíco analizado.
Luego de la lisis celular, se encuentran los Desde el punto de vista de la molécula de RNA, las
componentes intracelulares en la solución que fuerzas responsables de las conformaciones de las
contiene ADN, ARN, proteínas, lípidos y carbohidratos, estructuras de los ácidos nucléicos son lo
constituyendo una solución turbia. suficientemente resistentes como para mantener la
integridad estructural, pero a la vez son tan débiles
Al centrifugar la solución turbia producto de la lisis
como para exhibir una flexibilidad conformacional. Los
celular con el fenol, aparecen dos fases: la fase inferior
enlaces covalentes, las fuerzas de Van der Waals, los
de fenol o fase orgánica, que contiene el ADN (el ADN
enlaces de hidrógeno y las interacciones electrostáticas
es precipitado debido a que el fenol utilizado no estaba
se ven afectadas durante todos los tratamientos
tamponificado), proteínas desnaturalizadas, lípidos de
realizados a la muestra de levadura. Se tiene que los
membrana, polisacáridos y otros restos celulares, en la
efectos electrostáticos son los que determinan
fase superior acuosa contiene glúcidos y ARN. La
estructura y la forma de la cadena, a la vez los efectos
proteína desnaturalizada se halla presente en ambas
hidrofílicos estabilizan los apareamientos de las bases
fases y es removida ulteriormente por centrifugación.
de RNA en solución acuosa.
La remoción de proteínas es importante, para evitar
que puedan interferir con los procedimientos
La purificación, incluyó una disolución de la fase acuosa soluciones estándar de ARN. La reacción colorida, fue
en una solución de acetato de sodio pH 5, y una producto de la reacción entre la solución de ARN y una
precipitación con etanol frio durante treinta solución de Orcinol con un acido de Lewis, el FeCl3
minutos,para obtener un mayor rendimiento en la como acido catalizador.
obtención de un ARN mas limpio, todo esto con el
objetivo de eliminar trazas de ribunucleasas (ARNasa) El ácido catalizador FeCl 3, hidroliza las uniones
fosfodiester y N-glicosídicas, liberando ribosa, bases
que son enzimas (nucleasas) que catalizan la hidrólisis
púricas, pirimidínicas y acido fosfórico. La ribosa, que
de ARN en componentes más pequeños; estas enzimas es una pentosa, en medio ácido se deshidrata
pueden ser introducidas a lo largo del proceso, originando furfural que reacciona con el orcinol por
generándose por bacterias u otros factores propios de medio de una condensación, dando un producto verde
la manipulación. Este proceso de purificación también que demuestra la presencia de ARN, cabe resaltar que
permite separar el ARN de materiales contaminantes, para el ADN o para cualquier pentosa, también se
como ADN y proteínas. obtiene un mismo resultado, sin embargo,
interferencias por este tipo se descartan debido al
Esta es una técnica muy empleada para purificar ácidos proceso de extracción y purificación llevado a cabo.
En las siguientes ilustraciones se muestra las
nucléicos de oligonucleótidos, nucleótidos, sales y
reacciones llevadas a cabo:
otras impurezas. Bajo estas condiciones, el polímero de
ARN se agrega y precipita mientras que los Ú
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