Evaluación de la producción de nitritos en la línea celular de macrófagos Raw 264

mediante el método de Griess y cálculo de la IC50 de la quercetina

En esta practica estudiamos el posible efecto antiinflamatorio de un compuesto de naturaleza flavonoide,

llamado quercetina, sobre una linea celular establecida de macrófagos murinos, Raw 264.

La quercetina se encuentra en frutas y verduras y tiene propiedades biológicas que pueden mejorar el
rendimiento físico y mental y reducir el riesgo de infección. En diversos estudios se ha comprobado que tiene,
además, actividad anticancerígena, antiinflamatoria, antiviral, antioxidante y psicoestimulante, así como la
capacidad de inhibir la peroxidación de lípidos, la agregación plaquetaria y la permeabilidad capilar, y estimular
la biogénesis mitocondrial [1].

Para estudiar su potencial antiinflamatorio recurrimos a macrófagos M1 que intervienen en la respuesta

inflamatoria produciendo diversas sustancias proinflamatorias. Cuando estas células reconocen a través de los
receptores de membrana TLR4 al LPS (señal de infección), van liberar estas sustancias y una de ellas es el óxido
nítrico (NO), el cual fue el que medimos. En realidad, no fue el NO el que medimos sino que fueron los nitritos
(NO2-) resultantes de la descomposición del NO a pH fisiológico.

El método usado para detectar los nitritos fue el método de Griess que se basa en el uso de dos reactivos en
condiciones ácidas, la sulfanilamida y NED, y que dará lugar, si reaccionan con el NO2- , a un compuesto
azólico con color, cuyo pico de absorción es 550nm.

Para el ensayo, usamos placas de 96 pocillos, con los macrófagos, a las que le añadimos medio DMEN con
distintas concentraciones de nuestro compuesto a testar (1 µM, 5 µM, 10 µM, 25 µM y 50 µM). Además usamos
como control las células sin añadirle compuesto y, además, añadimos DMSO (disolvente de la quercetina) a una
de las filas sin compuesto para asegurarnos de que no fuese el DMSO quien llevara acabo el efecto. Tras incubar
con la quercetina, le añadimos LPS a la mitad de nuestras células para provocar inflamación.

Tras incubar 1 día, se tomó los sobrenadantes, añadimos los reactivos del método de Griess, hicimos la curva
patrón con nitritos y medimos la absorbancia a 550 nm. Tras obtener la curva patrón, calculamos la
concentración de nitritos en cada pocillo. A partir de ellas calculamos la concentración inhibitoria 50, IC50, que
es la concentración de quercetina con la que se reduce a un 50% la producción de óxido nítrico, lo que
equivaldría a una reducción de la inflamación

Cálculos

Para calcular la IC50, hacemos las medias de las concentraciones obtenidas de nitritos en cada pocillo, tanto en
los de las células estimuladas con LPS como en las sin estimular. Tras ello calcularemos el porcentaje de
inhibición usando las formulas 1, 2 y 3.

∆ "#2% &'()*'+= "#2 % &'()*'+,-./ - "#2 % &'()*'+ 123 -./

(1)

(2)
∆ "#2% &'()'*+ = "#2 % &'()'*+ ,-./ - "#2 % &'()'*+ 123 -./

∆ -.20 1234256
% #$ℎ#&#'#ó$ = 1 − ×100 (3)
∆ -.20 5678369

A continuación, representamos los valores de % de inhibición frente al log10 de la concentración de nitritos y

hacemos una regresión lineal (representada en naranja) con los datos comprendidos en el intervalo lineal (% de
inhibición de las concentraciones 25, 10 y 15 µM).
 [NO2- ] (µM)
Sin fco
50 µM 25 µM 10 µM 5 µM 1 µM
(control)
13,790 13,705 13,562 10,132 12,134 14,080
12,527 12,042 12,550 11,768 13,629 10,616
sin LPS
12,772 11,432 9,129 11,607 13,381 12,946
11,630 13,739 11,926 13,018 12,157 11,239
Media 12,680 12,730 11,792 11,631 12,825 12,220
34,283 17,045 19,401 26,770 34,458 35,895
33,265 18,162 18,426 25,076 33,674 32,835
con LPS
32,301 17,194 18,844 27,739 33,878 33,301
36,682 18,698 19,946 28,707 34,488 35,357
Media 34,13275 17,77475 19,15425 27,073 34,1245 34,347

Δ[NO-2]control (µM) 21,453 - - - - -

Δ[NO-2]quercetina (µM) - 5,045 7,363 15,442 21,299 22,127
% inhibición - 76,482 65,681 28,021 0,717 -3,141

% inhibición vs log10 [NO2- ]

90
y = 93,031x - 64,564
80
R² = 0,99986
70
60
% inhibición

50
40
30
20
10
0
-10
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
log 10 [NO2- ]

Como vemos la ecuación de la recta tiene la fórmula Y=93,031X-64,564 con un R2 muy bueno de 0,99986. Si
tenemos en cuenta que por definición la IC50 es la concentración de quercetina con la que se consigue el 50 %
de inhibición del efecto, en este caso antiinflamatorio, bastará con despejar la X para una Y igual a 50:

50 + 64,564
!= = 1,23146
93,031

Finalmente, teniendo en cuenta que X estaba en escala logarítmica, obtener el valor de IC50 aplicando la
definición de logaritmo:

!"#10 (&'() ) = 1,23146 !" 50 = 101,23146 = 17,04 µM

Por lo tanto, podemos concluir que la IC50 de la quercetina en la linea celular Raw 264, en cuanto a su potencial
antiinflamatorio, es:

IC50 = 17,04 µM

Bibliografía
[1] Aguirre L., Arias N., Macarulla M. T., Gracia A., Portillo M. P. Beneficial effects of quercetin on obesity and diabetes. Open
Nutraceuticals J. 2011, 4:189–198