Script-tmp-Inta - Anlisis de La Variabilidad Gentica Utilizando

Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales
Licenciatura en Genética
ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD
GENÉTICA UTILIZANDO MARCADORES
MOLECULARES EN EL GÉNERO
MECARDONIA
Alumna:
Zirilli, Patricia Soledad
Trabajo de Tesis para optar al título de:

Licenciada en Genética
2009
Directora
Bioq. Pérez de la Torre, Mariana Cecilia
Co-Directora
Ing. Agr. M.Sc. Sánchez, Marcela Inés
INSTITUTO DE FLORICULTURA
CIRN-CNIA-INTA
23 de Diciembre de 2009
Patricia S. Zirilli, 2009 Marcadores Moleculares en Mecardonia

ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE CUADROS 2
ÍNDICE DE FIGURAS 3
DECLARACIÓN 4
ABREVIATURAS 5
RESUMEN 6
ABSTRACT 7
INTRODUCCIÓN 8
Distribución y Hábitat de las especies en estudio 8
Características ornamentales 12
Extracción de ADN 12
Marcadores Moleculares 13
Técnica ISSRs (Inter Simple Sequence Repeat) 13
Análisis de Diversidad Genética empleando Datos Moleculares 16
OBJETIVOS 20
MATERIALES Y MÉTODOS 21
Material Vegetal 21
Extracción y Cuantificación de ADN 21
Generación de ISSRs 21
Análisis de los Productos de Amplificación 22
Análisis de Datos 22
RESULTADOS 24
Cuantificación del ADN obtenido 24
Productos de Amplificación por PCR 24
Análisis Estadístico 26
DISCUSIÓN 28
CONCLUSIONES 31
ANEXO 32
BIBLIOGRAFÍA 37
AGRADECIMIENTOS 43
~ 1 ~


ÍNDICE DE CUADROS
CUADRO 1: 32
CUADRO 2: 33
CUADRO 3: 34
CUADRO 4: 34
~ 2 ~


ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: 9
FIGURA 2: 11
FIGURA 3: 12
FIGURA 4: 15
FIGURA 5: 17
FIGURA 6: 18
FIGURA 7: 19
FIGURA 8: 24
FIGURA 9: 25
FIGURA 10: 26
FIGURA 11: 27
~ 3 ~


DECLARACIÓN
“Declaro que el material incluido en esta tesis es, a mi mejor saber y entender,
original, producto de mi propio trabajo (salvo en la medida en que se identifique
explícitamente las contribuciones de otros), y que este material no lo he
presentado, en forma parcial o total, como una tesis en otra institución. Autorizo
a la Universidad de Morón a reproducir la misma en forma total o parcial por
cualquier medio.”
Patricia S. Zirilli
~ 4 ~


ABREVIATURAS
Buffer TAE: Buffer Tris - Acético - EDTA
Buffer TE: Buffer Tris - EDTA
dNTP: dinucleotido trifosfato
EDTA: ácido etil diamin tetracético
LT: Loci Totales
MI: Marker Index
ON.: Overnight
OTUs: Unidades Operativas Taxonómicas
P%: Porcentaje de Polimorfismo
pb: pares de base
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
PIC: Contenido de Información Polimórfica
PIM: Perfil de identificación molecular
RAPD: ADN Polimórfico Amplificado al Azar
Rp: Resolving Power
RPM: Revoluciones por minuto
UPGMA: Unweighted Pair Group Method
~ 5 ~


RESUMEN
En el marco del programa de desarrollo de germoplasma nativo del Instituto de

Floricultura del CIRN-CNIA-INTA, debido a sus características ornamentales,
tales como su forma, la variabilidad en el tamaño y color de sus flores, su largo
período de floración, además de su fácil propagación, se incluyó el estudio del
género Mecardonia. Con la finalidad de estimar la diversidad genética presente
en veinticinco individuos pertenecientes al género, se emplearon siete
microsatélites anclados, los cuales generaron un total de 557 loci polimórficos,
con un promedio de 80 loci por iniciador; los valores de Rp variaron entre 11,92 y
25,23; el promedio del PIC fue de 0,130 y el MI varió de 5,875 a 12,160. A partir
de la matriz de similitud genética entre individuos, obtenida mediante la
aplicación del coeficiente de Dice y el análisis de agrupamiento UPGMA se
construyó un fenograma que permitió separar a los 25 individuos en 3 grupos
bien definidos, uno de los cuales incluye a los individuos de M. procumbens var.
tenella, otro agrupa a los individuos de M. procumbens var. flagellaris, mientras
que el último incluye a los individuos de Mecardonia sp junto a individuos de M.
procumbens var. flagellaris, además se calculó un valor de coeficiente de
correlación cofenética de r=0,99 entre la matriz de similitud y el fenograma
generado. Los resultados obtenidos en este trabajo permitieron diferenciar
inequívocamente la totalidad de los individuos analizados, pudiéndose inferir un
alto grado de variabilidad en la población bajo estudio, mostrando que los ISSRs
constituyen una herramienta molecular eficaz cuando se requiera una
manipulación simple, confiable y de bajo costo.
~ 6 ~


ABSTRACT
Twenty five individuals of Mecardonia Ruiz & Pav. genus (Plantaginaceae, ex-
Scrophulariaceae) were selected for their ornamental traits into the context of the
native ornamental germplasm breeding program of Instituto de Floricultura CIRN-
CNIA-INTA. Seven Inter-Simple Sequences Repeats primers were used for
fingerprinting diagnosis. The molecular marker used revealed high levels of
polymorphism, and generated 557 loci. The average of loci per primer was 80;
Rp values ranged from 11.92 to 25.23, and the average of PIC value was 0.130,
whereas MI values varied from 5.875 to 12.160. A Similarity matrix was
constructed with Dice coefficient, following UPGMA cluster analysis. ISSR
showed an “r” value of 0.99 for similarity and cophenetics matrixes comparison.
These results allowed the genetic discrimination of the accessions, inferring a
high variability degree amoung the analyzed individuals. In the same way, the
obtained results suggested that ISSRs are a good choice for molecular analysis
in Mecardonia when a simple manipulation is required.
~ 7 ~


INTRODUCCIÓN
Distribución y Hábitat de las especies en estudio
Distribución
Mecardonia es un género originario de América perteneciente a la familia

Plantaginaceae, cuyos representantes se encuentran distribuidos desde el este
de los Estados Unidos de Norteamérica hasta el norte de la Patagonia Argentina
y Chile central.; constituyendo la región del sur de Brasil, noreste de Argentina y
Uruguay, el centro de diversificación del género (Rossow, 1987, 1999; Souza,
1997). En 1987, Rossow realizó la revisión taxonómica del género reconociendo
10 especies, siendo también reconocidas éstas por Xifreda (1999).
Posteriormente Souza (1997), redujo su número a 7 al realizar distintos cambios
nomenclaturales, reconocidos como válidos por IBODA (2008). Cuatro de estas
especies se consideran nativas de Argentina.
Hábitat
Las variedades incluídas en este género se encuentran en lugares abiertos y

húmedos.
Mecardonia procumbens (Mill.) Small var. tenella (Cham. & Schltdl.)

V.C.Souza, comb. nov. et stat. nov.
Hierbas de 6 cm de alto, procumbentes o rastreras, poco ramificadas. Ramas

rastreras o ligeramente ascendentes, glabros cuadrangulares a
subcuadrangulares. Hojas sésiles a subsésiles, raramente con pecíolo de hasta
0.15 cm long., ovales, ápice agudo o menos frecuentemente obtuso, base
redondeada o más frecuentemente obtuso-cuneada, margen aserrado,
raramente subaserrado, (0,3) 0,5-1,0 cm long., (0,2) 0,3-0,7 cm de lat. internos
0,5-1,6 cm compr. Una flor por nodo; pedicelo suberectos a erectos, (1,1) 1,8-4,4
cm long, hasta 5,0 cm de long. en fructificación; bractéolas lanceoladas, 0,4-0,55
~ 8 ~


cm long; sépalo dorsal oval a oval-elípticas, 0,45-0,65 cm long, 0,25-0,35 cm de

lat, sépalos ventrales oval-lanceoladas, un poco más cortas que dorsal, ca. 0,2
cm lat., laterales lineares-lanceoladas, un poco más cortas que ventral, 0,1-0,15
cm lat; tubo de la corola con el mismo tamaño de hasta 0,2 cm más largo que el
cáliz. Cápsula ovoide a oval-elipsoide, 0,4-0,5 cm long, 0,25-0,3 cm de diámetro
(Souza, 1997) (Figura 1 a y b).
a)
b)
Figura 1: a) M. procumbens var. tenella con flores amarillas, b) Detalle de sus

flores.
~ 9 ~


Mecardonia procumbens (Mill.) Small var. flagellaris (Cham. & Schltdl.)

V.C.Souza, comb. nov. et stat. nov.
Hierbas de 25 cm de alto ascendentes, muy poco ramificadas. Ramas

ascendentes a erectas, cuadrangulares a subcuadrangulares. Hojas lanceoladas
o menos frecuentemente oblanceoladas, elípticas o lineares, sésiles, el ápice
agudo, base aguda a obtusa, margen entero o subaserrado, raramente aserrado,
(0,4) 0,9-1,8 lat., (0,15) 0,3-0,6 lat. Internos 0,7-1,6 cm long. una o dos flores por
nodo, son amarillas con nervios rojizos, a veces rosadas hasta casi moradas, por
excepción blancas; pedicelo suberecto a erecto, 0,9-2,9 cm long, hasta 3,2 cm
long. en fructificación; bractéolas lineares a lineares-lanceoladas, 0,4-0,6 cm
long, sépalo dorsal lanceolado a oval, (0,25) 0,55-0,65 cm long., (0,1) 0,15-0,3
cm lat, sépalos ventrales lanceoladas a lineares-lanceoladas, ca. 0,1 cm más
corto que dorsal, (0,05) 0,1-0,15 cm lat, laterales lineares-lanceoladas, un poco
más corta que ventral, 0,05-0,1 cm lat; corola de un poco menos de 0,2 cm más
largo que el cáliz. Cápsula ovoide a elipsoide, (0,4) 0,5-0,6 cm long, ca. (0,2)
0,25-0,3 cm de diâmetro (Souza, 1997) (Figura 2 a, b, c y d).
a)
~ 10 ~


b)
c)
d)
Figura 2: M. procumbens var. flagellaris a) en maceta, b) c) y d) Detalle de sus

flores con distintas tonalidades.
~ 11 ~


Características Ornamentales
Las características ornamentales de las especies de Mecardonia incluyen la

arquitectura, la diversidad en el tamaño y color de sus flores (diferentes
tonalidades de amarillo, lila, anaranjadas y rosadas) (Figura 3). Son plantas
perennes, con floración en primavera y durante todo el verano. La propagación
se realiza mediante esquejes, los cuales enraizan fácilmente.
Figura 3: Variabilidad en forma y tamaño en flores de Mecardonia.
Tanto el conocimiento de la diversidad, así como de las relaciones genéticas

entre individuos, permiten complementar las estrategias empleadas en los
programas de mejoramiento y conservación. Un programa de mejoramiento
comienza a partir de una caracterización adecuada del germoplasma, tomando
conocimiento de la base genética de la cual se dispone y de la variabilidad
existente en la misma (Cubero, 2003).
Extracción de ADN
La composición bioquímica de los tejidos de las plantas y de las diferentes

especies varía considerablemente (i.e. contenido de lignina, especies leñosas o
herbáceas, etc.), con lo cual, un requisito previo para iniciar estudios con
marcadores moleculares es el ajuste de un protocolo para la extracción de ADN.
Especies estrechamente relacionadas pueden requerir protocolos de
aislamientos diferentes. (Weising et al., 2005).
~ 12 ~


Marcadores Moleculares
Los marcadores moleculares en base a ADN fueron rápidamente utilizados por

genetistas y mejoradores vegetales como herramientas para la caracterización y
diferenciación entre genotipos. Su neutralidad en relación al proceso de
selección, debido a que no se encuentran influenciados ni por el estadío de
desarrollo ni por condiciones ambientales -principal ventaja sobre los
marcadores morfológicos-, su poder de resolución, la celeridad en la obtención
de la información (Debener, 2002) y la determinación de los criterios de
distinguibilidad, uniformidad y estabilidad para las nuevas variedades, son
algunas de las ventajas que ofrecen estas herramientas (De Riek, 2001; Weising
et al., 2005). Algunos de ellos cubren amplias regiones del genoma permitiendo
la generación de una gran cantidad de datos factibles de ser analizados
mediante programas bioinformáticos (Marcucci Poltri et al., 2005; Zelener et al.,
2005). El uso de técnicas moleculares puede considerarse como un sistema
capaz de complementar y subsanar los problemas de la utilización de los datos
morfológicos (Weising et al., 2005; Torales et al., 2005).
Técnica ISSRs (Inter Simple Sequence Repeat) (microsatélites

anclados)
Esta técnica utiliza los motivos de los microsatélites -regiones genómicas

hipervariables que consisten en segmentos cortos de ADN de unos pocos pares
de bases (1 a 4) (Picca et al., 2004), cuyos motivos se repiten en tándem, de
manera aleatoria, a lo largo de todo el genoma (Ratnaparkhe et al., 1998)-, por lo
general de 16-25 pb de largo, como iniciadores únicos en una reacción de PCR
que apunta a múltiples lugares genómicos para amplificar los segmentos de ADN
presentes, cuya longitud puede variar entre 100 pb y 3000 pb, entre dos
regiones idénticas de microsatélites orientadas en sentido opuesto (Pradeep
Reddy et al., 2002). Tienen la ventaja de no requerir información previa sobre
secuencias de ADN para el diseño de los iniciadores, pero como desventaja son
marcadores dominantes lo cual no permite distinguir entre homocigotas y
heterocigotas (Pradeep Reddy et al., 2002). Los iniciadores pueden ser sin
anclar (Gupta et al., 1994) o los utilizados en el presente trabajo, que son
diseñados a partir de las secuencias de microsatélites a las que se les incorpora
un número variable de nucleótidos, generalmente de 2 a 5, sólo en uno de los
~ 13 ~


extremos 5ó 3´ (llamado ancla), y cuya función es minimizar la hibridación

inespecífica del iniciador en diferentes sitios dentro del microsatélite,
incrementando así la reproducibilidad del método (Wolfe et al., 1998; Zietkiewicz
et al., 1994).
Entre los métodos que generan marcadores dominantes de ADN multiloci, los
microsatélites anclados han revelado un alto grado de polimorfismo (Zietkiewicz
et al., 1994) generando información confiable para los análisis de ADN, es una
técnica de gran simplicidad y economía de manejo, que presenta la sensibilidad
necesaria para distinguir entre individuos genéticamente muy próximos
(Sudupack et al., 2004; Pérez de la Torre et al., 2003). Una de las ventajas con
respecto a otros marcadores, como por ejemplo los RAPD (ADN Polimórfico
Amplificado al Azar), es su reproducibilidad, por presentar iniciadores más largos
y temperaturas de hibridación más altas (Nybom; 2004).
La fuente de variablidad de los ISSRs puede ser atribuida a cualquiera de los

siguientes motivos o a la combinación de estos:
ADN templado: la variabilidad en el número de nucleótidos dentro de una

repetición del microsatélite causaría polimorfismos de longitud cuando se
utiliza un iniciador 5ánclado.
La naturaleza del iniciador: el grado de polimorfismo varía con la

naturaleza (sin anclar, 3ánclado, ó 5ánclado) y con la secuencia de las
repeticiones (motivo) del iniciador empleado.
Cuando el microsatélite sin anclar es usado como iniciador, éste podría hibridar
dentro de las unidades de repetición durante la amplificación, lo que conduciría
a la aparición en el gel de una sucesión de bandas imposible de diferenciar unas
de otras. El iniciador anclado en 5´ ó 3´ asegura la hibridación sólo en los
extremos del microsatélite del ADN templado, evitando así la formación de
bandas espúreas. Cuando se utiliza el iniciador 5´, los productos amplificados
incluyen las secuencias microsatélites y conduce a bandas con mayor peso
molecular y un alto grado de polimorfismo (Pradeep Reddy et al., 2002) (Figura
4).
~ 14 ~


Figura 4: Esquema de hibridación de los iniciadores ISSR con anclaje en 3’ o 5’.
En general, los iniciadores con repeticiones: (AG), (GA), (CT), (TC), (AC), (CA)
muestran mayor polimorfismo que los iniciadores con otras repeticiones di-tri o
tetra nucleótido.
La técnica de ISSR fue aplicada satisfactoriamente para el establecimiento de

relaciones genéticas entre los individuos del género Cicer (Sudupack et al.,
2004); en la identificación de variedades de Hordeum vulgare (Fernández et al.,
2002); en el estudio de poblaciones de Astragalus oniciformi (Alexander et al.,
2004), Lactoris fernandeziana (Crawford et al., 2001), Penstemon sp. (Wolfe et
al., 1998); para estimar el grado de diversidad genética a nivel inter y
intraespecífico en el arroz (Joshi et al., 2000), cacao (Charters y Wilkinson,
2000); en la identificación de cultivares como: papa (Solanum tuberosum L.)
(Prevost y Wilkinson, 1999), arroz (Oryza sativa L.) (Bao et al., 2006) y en
especies del género Vigna umbellata (Muthusamy et al., 2008); como así
también en especies ornamentales: i.e. crisantemo (Chrysanthemum indicum L.)
(Yang et al., 2006), Jacaranda sp. (Escandón et al., 2005b y Pérez de la Torre et
al., 2003), Tabebuia heptaphylla (Ulrich et al., 2008), Glandularia (Salvi et al.,
2009), Calibrachoa (Pérez de la torre et al., 2009) y Nierembergia linariaefolia
(chuscho del monte) (Escandón et al., 2007b y Pérez de la Torre et al., 2006), en
estos últimos, fue posible determinar la variabilidad genética en poblaciones de
ambos géneros. Asimismo, los ISSRs han sido utilizados para analizar la
distribución geográfica de poblaciones (Sica, 2005; Xue-Jun Ge, 2005),
demostrar la estabilidad genética de materiales obtenidos por cultivo in vitro,
~ 15 ~


como son los casos de gerbera (Gerbera jamesonii Bolus) (Bhatia et al., 2009),
Evolvulus (Maritano et al., 2009) y Glandularia (Vaccaro et al., 2008).
Análisis de diversidad genética empleando datos moleculares
Marcadores moleculares y diversidad genética
La diversidad genética constituye uno de los niveles biológicos en el que puede

medirse o estimarse la biodiversidad. Esta escala involucra la variación de los
genes dentro de cada especie, donde la diversidad genética representa la
variación heredable dentro y entre poblaciones de organismos. Esta variación se
manifiesta en las modificaciones ocurridas en la secuencia de nucleótidos del
ADN, como consecuencia de la selección, mutación, migración, deriva génica y
la combinación de estos eventos. Tales modificaciones generan cambios en las
frecuencias alélicas y genotípicas, siendo el requisito necesario para mantener
un reservorio de condiciones -de variación- de respuesta al medio, que permita
la evolución y adaptación de las especies (Winzer et al., 2004).
Análisis de Agrupamiento
Esta metodología permite cuantificar la afinidad entre individuos o Unidades

Operativas Taxonómicas (OTUs: Operational Taxonomic Units) a través del
agrupamiento de las unidades taxonómicas que presenten propiedades
similares. De esta manera las OTUs con mayor similitud son matemáticamente
reunidas en un mismo grupo o “cluster”.
Interpretación de datos moleculares
Cada banda amplificada corresponde a un alelo dominante y define un locus

determinado, por lo tanto, sólo pueden ser detectadas dos condiciones: la
presencia de banda (que representa la presencia del locus en estado de
heterocigosis u homocigosis, sin poder discriminar entre ellos) y la ausencia de
banda (que representa la ausencia del locus o la presencia de alelos nulos). Dos
individuos son más similares cuando comparten mayor cantidad de presencia de
banda, codificando este estado con el valor “1”. La coincidencia en la ausencia
~ 16 ~


de bandas, valor “0”, no aporta a la medida de similitud, ya que puede ser

consecuencia de la falta de amplificación de un fragmento (Winzer et al., 2004).
Coeficientes de similitud para variables cualitativas de tipo doble estado
Los marcadores moleculares se ajustan a este tipo de variables. Los coeficientes

de similitud miden las coincidencias y diferencias en los estados de caracteres
entre dos OTUs (Figura 5).
OTU 1
1 0
1 a b
OTU 2 0 c d
Figura 5: Caracterización de dos OTUs donde se generan 4 diferentes

posibilidades.
a= Número de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 1;
b= Número de caracteres donde la primera muestra tiene un 1 y la otra un 0;
c= Número de caracteres donde la primera muestra tiene un 0 y la otra un 1;
d= Número de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 0.
La suma de estos 4 valores dará el total de caracteres medidos (Echenique et

al., 2004).
Existe una amplia gama de coeficientes de similitud, entre los más comúnmente
utilizados se encuentra el Coeficiente de Dice (1945) (Sij = 2a/(2a+b+c), el cual
ignora las ausencias compartidas, y aplica mayor importancia a los factores con
respuesta positiva para ambos individuos (presencias compartidas) (Winzer et
al., 2004).
Algoritmos de clasificación:
Entre los métodos algorítmicos más utilizados se encuentra el Ligamiento

promedio o “Método de agrupamiento de pares no ponderados empleando la
media aritmética “(UPGMA-Unweighted Pair Group Method with Arithmatic
~ 17 ~


Mean- Sokal y Michener, 1958), el mismo considera que el valor de similitud

entre la OTU candidata a incorporarse y el grupo o núcleo es igual a una
similitud promedio, resultante de los valores de similitud entre el candidato y
cada uno de los integrantes del grupo o núcleo (Figura 6).
Figura 6: d (1i, 2j)= distancia promedio entre OTUi y OTUj de los grupos 1 y 2.
Los resultados de los sucesivos pasos de agrupamiento se pueden representar

en un gráfico denominado fenograma (término genérico que se aplica
indistintamente a cualquier tipo de árbol), el cual es una representación
geométrica de una clasificación jerárquica; el mismo se utiliza para representar
las relaciones entre los individuos analizados (Winzer et al., 2004).
A modo de ejemplo se detalla un proceso típico para el análisis de la

información a partir de bandas, utilizando los ISSR como iniciadores (Figura 7).
~ 18 ~


Aplicación del Coeficiente
de Similitud de Dice y
construcción de la Matriz
de Similitud (MS)
Figura 7: Esquema del análisis de agrupamiento con marcadores moleculares

ISSR.
~ 19 ~


OBJETIVO GENERAL
Conocer la variabilidad genética existente en la población del género Mecardonia

sp. disponible en la colección del Instituto de Floricultura, a través de la
aplicación de los ISSR.
Objetivos Parciales
1) Ajustar un protocolo de extracción de ADN, a partir del material de

Mecardonia seleccionado.
2) Poner a punto la técnica de PCR para diferentes iniciadores de ISSR en

Mecardonia.
3) Análisis de los perfiles moleculares que se generen
~ 20 ~


MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Veinticinco individuos del género Mecardonia identificados como Mec1 a Mec25

de acuerdo a la siguiente distribución:
Mec1 a Mec3: Mecardonia sp.
Mec4 a Mec8 y Mec20 a Mec25: M. procumbens var. flagellaris (Cham. &

Schltdl.)
Mec9 a Mec19: M. procumbens var. tenella (Cham. & Schltdl.)
Se utilizó un individuo de Calibrachoa linearis (Hook.) Wijsman (Solanaceae)

(Cal) como fuera de grupo, a manera de control de la técnica.
Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones estándares de invernáculo en el

Instituto de Floricultura (CIRN-CNIA-INTA) (34º36’S, 58º40’W, 26 msm)
Extracción y cuantificación de ADN
La extracción de ADN total se realizó a partir de hojas jóvenes liofilizadas

siguiendo el método “Small-Scale Extraction of High Quality DNA” según los
protocolos de CYMMIT (2005) (Cuadro 1, anexo).
La calidad y cantidad de ADN obtenido se determinó por comparación con el

marcador de peso molecular λ cortado con la enzima Hind III (Pb-L, UNQ) sobre
un gel de agarosa (TAE 1X) (cuadro 2, anexo) al 0,8% teñido con bromuro de
etidio (0,01 mg/mL). El gel fue fotografiado utilizando un transiluminador de luz
ultravioleta.
Generación de ISSRs
Se utilizaron 7 iniciadores ISSR (Cuadro 3, anexo), descriptos por la UBC

(Universidad de la Columbia Británica, Canadá), Blair et al., (1999) y Pérez de la
Torre et al., (2003).
~ 21 ~


Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µl,

conteniendo 30 ng de ADN; 0,5 U de Taq polimerasa; 2,5 µl de buffer de
reacción 10X; 2,0 mM de MgCl2 (Kit Inbio Highway); 0,2 mM de cada dNTP
(Inbio Highway) y 0,8 µM de iniciador (Qiagen Operon). La amplificación de
fragmentos se llevó a cabo en un termociclador Bio Rad, bajo las siguientes
condiciones de ciclado:
Desnaturalización preliminar, 10 min a 94ºC, seguida de 40 ciclos a 94°C por 40

seg, temperatura de hibridación según iniciador (Cuadro 3, anexo) durante 45
seg, 72°C por 90 seg. y extensión final de 10 min a 72ºC.
Análisis de los productos de amplificación
Los productos de PCR se sembraron en un gel de agarosa al 2,5% (TAE 1X),

teñidos con bromuro de etidio (0,05 mg/mL), documentado con el sistema de
fotografía DocIt® de UVP. Las bandas obtenidas fueron estimadas (en pares de
bases –pb-) por comparación con marcadores de peso molecular (100 pb y 50
pb ladder, PB-L, UNQ).
Para evaluar la reproducibilidad del perfil de bandas obtenido, tanto la extracción

de ADN como las reacciones de PCR se llevaron a cabo 3 veces, considerando
para el análisis sólo aquellas bandas claramente definidas. Las bandas con igual
migración fueron consideradas como fragmentos idénticos, independientemente
de su intensidad. El análisis de los perfiles de amplificación se realizó
visualmente con ayuda del soporte bioinformático “Gel-Pro Analyzer” versión 3.1
(Media Cybernetics).
Análisis de datos
Cada fragmento amplificado se consideró como un alelo dominante para cada

locus, clasificando su presencia o ausencia como 1 ó 0, respectivamente,
permitiendo la generación del perfil de identificación molecular para cada
individuo. La matriz binaria de datos resultante del análisis, se usó para calcular
el coeficiente de similitud de Dice, entre todos los posibles pares de entradas.
Con los coeficientes de similitud estimados (Cuadro 4, anexo), se construyó el
fenograma mediante el método UPGMA, los análisis se llevaron a cabo con el
~ 22 ~


programa NTSYS-pc vs. 2.02 (Rohlf, 1998). Se aplicó el test de Mantel (1967) a
fin de determinar el coeficiente de correlación cofenética (r), para verificar el
grado de ajuste entre los datos obtenidos en la matriz de similitud y el fenograma
generado.
El poder de discriminación de cada iniciador ISSR fue evaluado a fin de

caracterizar su capacidad para detectar loci polimórficos entre los genotipos
analizados, para lo cual se calcularon los siguientes parámetros: porcentaje de
polimorfismo (%P), contenido de información polimórfica (PIC) (Powell et al.,
1996; Smith et al., 1997), “marker index” (MI) y el Resolving Power (Rp) (Prevost
& Wilkinson, 1999). El PIC de cada iniciador se estimó según la fórmula: PIC = 1
Σ pi2, donde “pi” es la frecuencia del alelo ith. El MI se calculó como: MI = PIC x
número de bandas polimórficas. El Rp es definido por iniciador como: Rp= Σ Ib,
donde “Ib” es la información de cada banda, la cual toma los valores de: 1-
(2x[0.5-p]), siendo p la proporción de cada individuo que contiene la banda.
~ 23 ~


RESULTADOS
Cuantificación del ADN obtenido
Se obtuvo buena calidad y cantidad de ADN de los 25 individuos analizados; a

modo de ejemplo se muestra la figura 8, en la que se presentan 16 muestras del
total de individuos.
Figura 8: Gel de cuantificación de ADN en agarosa al 0,8% con bromuro de

etidio (0.01 mg/mL). M: marcador de peso molecular λ/Hind lll.
Productos de amplificación por PCR
Con los 7 iniciadores utilizados se obtuvieron los perfiles de bandas de los 25

individuos de Mecardonia analizados en geles de agarosa al 2.5%; a modo de
ejemplo se muestran las Figuras: 9 y 10 con diferentes iniciadores.
a)
~ 24 ~


b)
Figura 9 a) y b): Perfiles de bandas obtenidos de los individuos de Mecardonia

con el iniciador 3’ GA. M1: 50 pb, M2: 100 pb.
a)
b)
~ 25 ~


c)
Figura 10: Perfiles de bandas obtenidos de los individuos de Mecardonia con los
siguientes iniciadores: a) Iniciador 3ÁG, b) Iniciador 5´GA, c) Iniciador 3ÁC. M1:
50 pb, M2: 100 pb.
Análisis estadístico
El cuadro 3 (anexo) describe los iniciadores usados (secuencia, referencias y

temperatura de hibridación -Tº-) y resume los datos observados: número de loci
totales (LT), porcentaje de polimorfismo, el Rp, el PIC y el MI.
Los 7 iniciadores utilizados revelaron un total de 557 loci polimórficos, con un

promedio de 80 loci por iniciador.
El mayor valor de Rp (25,23) fue para los iniciadores 5’CT y 5’GA, mientras que
los iniciadores 3’TG y 3’GA fueron los menos informativos, con un valor de Rp de
11,92 y 21,77 respectivamente (cuadro 3, anexo).
El PIC varió entre valores de 0,113 (5’GA) a 0,160 (5’CT), con un promedio de
0,130; mientras que para el MI se determinaron valores que oscilaron entre
5,875 para el iniciador 3’TG y 12,160 para 5’CT, con un promedio de 10,30 para
los 7 iniciadores utilizados, entre los cuales 5’CT, 5’GA y 5’CA fueron los más
informativos.
~ 26 ~


La figura 11 muestra el fenograma obtenido. Se determinó una alta correlación

(r=0,99) entre la matriz de similitud y la matriz derivada del fenograma.
Figura 11: Fenograma obtenido mediante ISSRs en el cual se muestran las

relaciones genéticas entre los 25 individuos de Mecardonia.
Los 25 genotipos se separaron en 3 grupos bien definidos, uno de los cuales

incluye a los individuos de M. procumbens var. tenella, otro agrupa a los
individuos de M. procumbens var. flagellaris, mientras que el último incluye a los
individuos de Mecardonia sp. junto a individuos de M. procumbens var.
flagellaris. Por su parte, en el control utilizado como fuera de tipo (Calibrachoa.
linearis) manifiesta bajo índice de similitud, separándose claramente de los
grupos correspondientes al género.
~ 27 ~


DISCUSIÓN
La caracterización e identificación genética del germoplasma, mediante
marcadores moleculares, constituyen un área de aplicación de creciente
importancia dentro de la producción vegetal. En particular el empleo de técnicas
moleculares adquiere relevancia en los cultivos ornamentales, ya que la mayoría
de estos carecen de estudios genómicos sobre la base de dichas herramientas
(Escandón, 2004). En lo que respecta a la técnica de ISSRs, si bien se tratan de
marcadores denominados universales o de muy amplio rango de aplicación (Blair
et al., 1999; Weising et al., 2005), para su uso apropiado es necesario el ajuste
de las condiciones de PCR de cada iniciador con el género de interés, dado que
no todos responden de la misma forma, bajo las mismas condiciones, aún en
individuos muy afines. En efecto, Escandón et al. (2005c) y Escandón et al.
(2007b) determinaron valores muy diferentes de Rp para un mismo iniciador,
trabajando con cultivares de Nierembergia linariaefolia muy relacionados ya que
provenían de una misma línea de mejoramiento, lo que indicaría la alta
sensibilidad de la técnica cuando se aplican los iniciadores adecuados.
En el presente trabajo se obtuvieron los perfiles moleculares con la finalidad de

complementar la información requerida sobre descriptores clásicos en el género
y se estimó, además, la diversidad genética entre 25 individuos pertenecientes a
las especies M. procumbens var. tenella, M. procumbens var. flagellaris y 3
individuos del género que todavía no pudieron ser clasificados y se denominaron
como Mecardonia sp. Con tres de los iniciadores probados en Escandón et al.
(2005c) -5’CA, 3’AG y 3’GA- y siete de Escandón et al. (2007b) -5’CT, 3’GA,
5’GA 5’CA, 3’AC, 3’AG y 3’TG, fue posible la identificación inequívoca de los
veinticinco individuos de Mecardonia, así como su agrupamiento por especies,
discriminando M. procumbens var. flagellaris de M. procumbens var. tenella.
Asimismo, algunos de los iniciadores aquí analizados se utilizaron con éxito en
otros géneros, en el caso de Oryza sp., Blair et al. (1999) utilizó los iniciadores
3’GA, 5’GA y 5’CA (entre otros), comunes a este trabajo, con el fin de determinar
el nivel de polimorfismo existente en el genoma de arroz, tomando al %P como
parámetro de comparación, en arroz el mismo fue de: 94,5% para 3’GA; 90,9%
para 5’GA y 81,8% para 5’CA, si bien muy altos, se muestran entre un 5% y 20%
menores en relación a los obtenidos para Mecardonia (100%).
~ 28 ~


En el presente trabajo, al igual que en Manimekalai & Nagarajan (2006), se

utilizaron los iniciadores 3’AG (UBC 808) y 3’AC (UBC 827), estos autores,
evaluaron mediante ISSRs, las relaciones genéticas en 33 entradas de coco
(Cocos nucifera). El iniciador 3’AG resultó menos polimórfico (80%) en C.
nucifera versus el 100% obtenido en Mecardonia. También se observan
diferencias con relación al MI, el mismo fue de 3,147 para coco y de 10,665 en
nuestro caso. Dichos valores resultaron de los más altos en ambos estudios.
Para el iniciador 3’AC, los porcentajes de polimorfismo fueron los mismos
(100%), y en contraposición con nuestro estudio, donde el MI fue uno de los más
altos (10,610), en coco resultó de los valores más bajos. Lo que estaría
indicando la diferente diversidad existente entre los materiales estudiados en
uno y otro caso, reafirmando, además, la sensibilidad de la técnica.
Para las combinaciones genotipos/iniciadores llevadas a cabo en el presente

estudio, los iniciadores 5’CT y 5’GA mostraron los mayores valores de Rp,
siendo las combinaciones 3’TG y 3’GA las menos informativas según este
parámetro (Cuadro 3, anexo).
El alto polimorfismo observado (100%) con los ISSRs empleados en el presente

trabajo, indican un alto nivel de variación genética existente entre los individuos
analizados.
El análisis del fenograma obtenido muestra que los individuos analizados se

distribuyeron en 3 grupos, uno que incluye a los individuos M. procumbens var.
flagellaris y los 3 individuos designados como Mecardonia sp. (Mec1a Mec3), M.
procumbens var tenella (Mec 9 a Mec 19) y por último el grupo de M.
procumbens var. flagellaris (Mec20 a Mec25). La separación detectada entre los
individuos clasificados como M. procumbens var. flagellaris (Mec4 a Mec8 y
Mec20 a Mec25) coincide con el hecho que los individuos denominados como
Mec20 a Mec25 fueron anteriormente considerados como parte de otra especie
del género, denominada M. montevidensis (Dawson, 1979). En este contexto, es
importante aclarar que por más que los índices de similitud sean bajos no implica
que los individuos pertenezcan a diferentes taxas. A los efectos de definir si
existen, o no, diferencias de especie entre estos individuos y aquellos del grupo
Mec4 a Mec8, serían necesarios estudios filogenéticos más profundos (i.e.:
análisis de secuencias de ADN de mitocondria o cloroplasto).
~ 29 ~


Por su parte, los individuos Mec4 a Mec8 (M. procumbens var. flagellaris) (Figura
9 a) mostraron bajos índices de similitud (0,13 a 0,29) (Figura 11), a este mismo
grupo se une el conjunto denominado como Mecardonia sp. (Mec1:0,18; Mec2 y
Mec3: 0,14) de clasificación incierta, pero, tal como se menciona en el párrafo
anterior, se debería realizar un estudio que involucre un mayor número de
marcadores moleculares, morfológicos, además de filogenéticos, a fin de obtener
datos más concluyentes para clasificarlas correctamente.
Por el otro lado, las Figuras: 9 b, 10 a, b y c muestran una relación genética más
estrecha entre las M. procumbens var tenella (Mec 9 a Mec 19), este hecho se
ve sustentado en los altos índices de similitud que se muestran en la Figura 10
(0,95 a 0,79) y esto se debe a que este grupo particular de individuos, tomado en
forma aislada, mostró bandas monomórficas (Figuras: 9 b, 10 a, b y c) con un
promedio de 38,95% de bandas polimórficas.
La utilización de Calibrachoa linearis como control resultó efectiva, con un índice

de similitud de 0,08, es importante destacar que los datos obtenidos tuvieron la
misma distribución se incluya, o no, C. linearis en el cálculo del fenograma (dato
no mostrado).
Con relación a la cobertura del genoma y bajo las condiciones aplicadas en este
estudio, los iniciadores basados en los motivos poli(GA), mostraron una mayor
producción de bandas respecto del resto, siendo el iniciador con motivo poli(GT)
con el cual se obtuvo el menor número de bandas. Resultados similares,
respecto de la capacidad de cobertura del genoma de los iniciadores con motivo
poli (GA), por ejemplo, se han reportado tanto en arroz (Blair et al., 1999) como
en Gerbera (Bathia et al., 2009).
Uno de los aspectos que generan controversias entre diferentes autores es la

capacidad de cobertura del genoma por parte de los diferentes iniciadores
disponibles en el mercado según estén anclados o no y si ese anclado es en 3’ o
5’ [ver Bathia et al., (2009); Pradeep Reddy et al., (2002); Joshi et al., (2000) y
Blair et al., (1999)]. En referencia a los iniciadores anclados, en el presente
estudio no se detectaron diferencias relevantes entre ellos, observándose un
promedio de 72,80±17,29 para los 3’ y uno de 88,70±14,20 para los 5’. Lo que
estaría reafirmando la fuerte influencia de la interacción genoma/iniciador para la
generación de perfiles y el análisis de la variabilidad.
~ 30 ~


CONCLUSIONES
La introducción de marcadores moleculares dentro de estudios biológicos ofrece

nuevas posibilidades para análisis de diversidad y en la determinación de
relaciones genéticas en y entre especies. La inscripción de una nueva variedad
exige como requisito que la misma sea distinguible del resto, además de
uniforme y estable. Si bien aún no es imprescindible para el registro de un
cultivar contar con un perfil molecular, el mismo proporciona una herramienta
extra para luchar por los derechos de obtentor y del productor. En este estudio,
el alto nivel de polimorfismo observado y la sensibilidad de la técnica de los
ISSRs resultaron efectivos para distinguir cada uno de los 25 individuos de la
colección analizada de manera rápida, sencilla y confiable. Se ha logrado
obtener el PIM para cada uno de los materiales analizados, con un promedio de
80 loci por entrada, incrementando el número de caracteres a considerar en la
descripción de una nueva variedad.
~ 31 ~


ANEXO
Cuadro 1: Protocolo de CYMMIT, 2005. Modificado.
∗ Calcular la cantidad de buffer de extracción a utilizar (1,1 mL por muestra)
∗ Precalentar el buffer de extracción + 2% β mercaptoetanol (v/v) a 65ºC.
∗ Agregar 30-40 mg de la muestra liofilizada en un tubo de 2 mL junto con

1000 µL del buffer de extracción precalentado. Agitar.
∗ Llevar al baño termostático (65ºC) por 2 Hs con agitación constante.
∗ Agregar un volumen de cloroformo/octanol. Agitar. Centrifugar 10 min a

12.000 RPM a 2ºC. Separar sobrenadante (De ser necesario, repetir este
paso, centrifugando por 5 min)
∗ Precipitar con medio volumen de isopropanol frío. Dejar a -20ºC por 30

min o bien a -20ºC O.N.
∗ Centrifugar a 13.500 RPM por 40 min a 2ºC. Descartar sobrenadante.
∗ Resuspender en 250 µL de TE 1X hasta disolver. De ser necesario llevar

a baño termostático (55ºC) hasta disolución total del ADN.
∗ Agregar 2.5 µL de RNasa A (10mg/mL) (1% del vol. de resuspensión).

Agitar. Dejar 30 min a 37ºC ó 1 hora a temperatura ambiente.
∗ Agregar un volumen de fenol. Agitar. Centrifugar 10 min a 13.500 RPM a

2ºC. Separar la fase acuosa en un nuevo tubo.
∗ Agregar un volumen de TE 1X al tubo del fenol. Agitar. Centrifugar 10 min

a 13.500 RPM a 2ºC. Separar la fase acuosa y agregarla al tubo anterior.
∗ Agregar un volumen de cloroformo/octanol. Agitar. Centrifugar 10 min a

13.500 RPM a 2ºC. Separar sobrenadante. Repetir este paso (de ser
necesario) centrifugando por 5 min.
∗ Precipitar con 5% (volumen de sobrenadante) de NaCl 5M y medio

volumen de isopropanol frío.
∗ Dejar a -20ºC por 30 min o a -20ºC O.N.
∗ Centrifugar 40 min a 13.500 RPM a 2ºC.
~ 32 ~


∗ Descartar sobrenadante.
∗ Lavar 2 veces con 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 13.500 RPM

por 2 min c/u. Descartar sobrenadante. Secar invertido sobre papel
absorbente.
∗ Resuspender en cantidad necesaria de TE 1X hasta disolver. De ser

necesario llevar a baño termostático (55ºC) por 15 min o hasta disolución
total del ADN.
∗ Conservar a -20ºC.
Cuadro 2: Buffer TAE
Solución de trabajo Solución Stock / litro
1X 50X
242 g de Tris base

40 mM Tris- acetato 57,1 ml de ácido acético glacial
1 mM EDTA 100 ml de 0.5 M EDTA (pH
8.0)
~ 33 ~


Cuadro 3: Resumen de los datos obtenidos con los 7 iniciadores utilizados. T°:
temperatura de hibridación, TL: loci totals, P%: porcentaje de polimorfismo, RP:
Resolving power, PIC: contenido de información polimórfica, MI: marker index.
Iniciador Secuencia (5’-3’) Referencias Tº TL P% Rp PIC MI
P. de la
5'CT CCGGATCC(CT)9 Torre, et al. 62 76 100 25,23 0,16 12,16
2003
Blair et al.
3'GA (GA)9T 52 84 100 21,77 0,12 10,16
1999
Blair et al.
5'CA CCCGGATCC(CA)9 62 86 100 23,46 0,13 10,84
1999
3'AC (AC)8G UBC 52 81 100 22,00 0,13 10,61
Blair, et al.
5'GA CCCGGATCC(GA)9 62 104 100 25,23 0,11 11,75
1999
3'AG (AG)8C UBC 52 79 100 22,38 0,14 10,67
3'TG (TG)8A UBC 52 47 100 11,92 0,13 5,88
TOTAL 557 Promedios 21,71 0,130 10,30
Cuadro 4: Matriz de distancia DICE.
Mec1 Mec2 Mec3 Mec4 Mec5 Mec6 Mec7 Mec8

-------------------------------------------------------------------------
Mec1 | 1.0000
Mec2 | 0.1419 1.0000
Mec3 | 0.1279 0.2119 1.0000
Mec4 | 0.1860 0.1589 0.1667 1.0000
Mec5 | 0.2236 0.1000 0.1146 0.2166 1.0000
Mec6 | 0.1438 0.1212 0.1208 0.2013 0.2899 1.0000
Mec7 | 0.1529 0.1745 0.1687 0.1566 0.0774 0.0272 1.0000
Mec8 | 0.1695 0.1410 0.0925 0.0925 0.1605 0.1299 0.2456 1.0000
Mec9 | 0.0930 0.0530 0.1071 0.0833 0.0382 0.0940 0.0964 0.1156
~ 34 ~


Mec10 | 0.0976 0.0699 0.1125 0.0875 0.0805 0.0851 0.1139 0.1333

Mec11 | 0.0952 0.0952 0.0976 0.0854 0.0654 0.0828 0.1111 0.1302
Mec12 | 0.1011 0.0764 0.1034 0.0920 0.0613 0.1032 0.1047 0.1341
Mec13 | 0.1053 0.0933 0.0958 0.1078 0.0769 0.0946 0.1091 0.1163
Mec14 | 0.1163 0.0795 0.0714 0.0714 0.0510 0.1074 0.0964 0.1040
Mec15 | 0.1017 0.0513 0.1040 0.0925 0.0494 0.0909 0.0936 0.1236
Mec16 | 0.1149 0.0654 0.0941 0.0824 0.0629 0.1060 0.0833 0.1143
Mec17 | 0.1064 0.0719 0.1196 0.0870 0.0694 0.0970 0.1099 0.1376
Mec18 | 0.0914 0.0649 0.0936 0.0819 0.0750 0.0921 0.0828 0.1364
Mec19 | 0.1059 0.0805 0.0964 0.0482 0.0387 0.0816 0.0976 0.1170
Mec20 | 0.0649 0.0602 0.1333 0.1067 0.0863 0.0305 0.0811 0.0645
Mec21 | 0.0972 0.0813 0.0857 0.1286 0.1240 0.0496 0.1014 0.0828
Mec22 | 0.0541 0.0787 0.0833 0.1528 0.0902 0.0640 0.0845 0.0671
Mec23 | 0.1164 0.1071 0.0865 0.1514 0.1264 0.0241 0.1311 0.1368
Mec24 | 0.1006 0.0725 0.1032 0.1419 0.1250 0.0000 0.1307 0.0625
Mec25 | 0.1091 0.1111 0.1118 0.1242 0.1733 0.1127 0.1761 0.1084
Cal | 0.0920 0.0654 0.1059 0.0588 0.0252 0.0397 0.0952 0.1029

-------------------------------------------------------------------------
Mec9 | 1.0000
Mec10 | 0.7625 1.0000
Mec11 | 0.8293 0.8718 1.0000
Mec12 | 0.9310 0.8072 0.8588 1.0000
Mec13 | 0.8193 0.8861 0.9136 0.8837 1.0000
Mec14 | 0.8214 0.7250 0.7561 0.8161 0.7831 1.0000
Mec15 | 0.9364 0.7758 0.8402 0.9497 0.8538 0.8208 1.0000
Mec16 | 0.8235 0.7160 0.7349 0.8409 0.7738 0.8588 0.8571 1.0000
Mec17 | 0.8152 0.8409 0.8222 0.8632 0.8462 0.8043 0.8466 0.7957
Mec18 | 0.7647 0.8712 0.8503 0.8068 0.8521 0.7647 0.8114 0.7907
Mec19 | 0.8675 0.7722 0.8025 0.8372 0.7927 0.7711 0.8421 0.7500
Mec20 | 0.3467 0.3239 0.3014 0.3462 0.3221 0.3200 0.3355 0.3158
~ 35 ~


Mec21 | 0.2429 0.1970 0.1765 0.2466 0.2014 0.2429 0.2345 0.2535

Mec22 | 0.2917 0.2500 0.2429 0.2800 0.2657 0.2917 0.2685 0.3014
Mec23 | 0.2919 0.2599 0.2541 0.2827 0.2609 0.2919 0.2842 0.2781
Mec24 | 0.2581 0.2313 0.2384 0.2484 0.2468 0.2710 0.2500 0.2675
Mec25 | 0.2609 0.2484 0.2548 0.2874 0.2500 0.2484 0.2651 0.2699
Cal | 0.0824 0.0988 0.0723 0.0795 0.0947 0.0706 0.0800 0.0698

-------------------------------------------------------------------------
Mec17 | 1.0000
Mec18 | 0.9032 1.0000
Mec19 | 0.7802 0.7738 1.0000
Mec20 | 0.2892 0.2876 0.3378 1.0000
Mec21 | 0.1923 0.1818 0.2319 0.6393 1.0000
Mec22 | 0.2375 0.2449 0.2817 0.6508 0.7069 1.0000
Mec23 | 0.2488 0.2553 0.3060 0.4551 0.4586 0.5342 1.0000
Mec24 | 0.2105 0.2152 0.2353 0.4380 0.4567 0.4885 0.5930 1.0000
Mec25 | 0.2486 0.2195 0.2264 0.3497 0.4511 0.4234 0.4045 0.5135
Cal | 0.1075 0.1040 0.1071 0.1053 0.0845 0.0685 0.0963 0.0637

Mec25 Cal
-------------------
Mec25 | 1.0000
Cal | 0.0613 1.0000
~ 36 ~


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simple sequence repeat (SSR)-anchored polymorphism chain reaction
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~ 42 ~


AGRADECIMIENTOS
Como culminación de este trabajo quiero agradecer a todas las personas que
formaron parte de este sueño hecho realidad.
Comienzo por mi Directora de tesis, Mariana Pérez de la Torre, por enseñarme,

por las correcciones y por estar cuando necesitaba una mano.
A mi Co-Directora, Marcela Sánchez, por preocuparse tanto en como iba la

tesina, por sus consejos, y sobre todo por corregirme las últimas instancias de la
tesina con muy poco tiempo.
A Alejandro Escandón, por permitirme realizar la tesis en el laboratorio molecular

del Instituto de Floricultura, y por sus correcciones.
A Julián Greppi, por su ayuda, y por brindarme toda la información necesaria

sobre la Mecardonia.
A todos los Profesores de la Facultad de Morón por formarme y capacitarme.
A todas las chicas del Laboratorio Molecular (Lorena, Luciana, Noelia y Pato)
que estuvieron acompañándome en todo el transcurso de la tesina, por
ayudarme, por estar, por los chismes, y sobre todo por las alegrías compartidas.
A Candela por darme una mano cuando lo necesitaba.
A mis amigas de la Facu: Ceci Oneto, Ceci Randazzo, Naty y Marianela, por
estar incondicionalmente, por darme fuerzas, por las charlas, por los apuntes, y
por hacerme más entretenida las clases en la facu.
A mi amiga Caro por estar SIEMPRE en las buenas y en las malas, por
apoyarme en todo, por confiar en mí, y por la hermosa amistad que tenemos.
~ 43 ~


A Papá y Mamá, por estar incondicionalmente, por apoyarme, por los consejos,
enseñanzas, por permitirme estudiar, y por sobre todo agradecerles porque todo
lo que soy es gracias a ustedes ¡¡Los quiero mucho!!.
A mis hermanos: Gaby y Carlos, por estar siempre, por escucharme, apoyarme,
aconsejarme, por ser modelos a seguir, y por ser tan importantes en mi vida
¡¡Los quiero mucho!!.
A mis sobrinos hermosos que tengo: Tomy, Mati, Juli, Lucas y Joaquín, por ser lo
mas preciado, y por tener esa capacidad de sacarme una sonrisa cada vez que
los veo ¡¡Los adoro!!.
A mi amor, Nico, por estar acompañándome a cada momento, por las charlas,
consejos, por la paciencia, por la gran confianza que me tenes, por amarme, y
por elegirme como compañera de vida ¡¡¡TE AMO!!!.
Pato.
~ 44 ~

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Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales

Trabajo de Tesis para optar al título de:

Bioq. Pérez de la Torre, Mariana Cecilia

Ing. Agr. M.Sc. Sánchez, Marcela Inés

Buffer TAE: Buffer Tris - Acético - EDTA

Buffer TE: Buffer Tris - EDTA

dNTP: dinucleotido trifosfato

EDTA: ácido etil diamin tetracético

LT: Loci Totales

MI: Marker Index

OTUs: Unidades Operativas Taxonómicas

P%: Porcentaje de Polimorfismo

pb: pares de base

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

PIC: Contenido de Información Polimórfica

PIM: Perfil de identificación molecular

RAPD: ADN Polimórfico Amplificado al Azar

Rp: Resolving Power

RPM: Revoluciones por minuto

UPGMA: Unweighted Pair Group Method

En el marco del programa de desarrollo de germoplasma nativo del Instituto de

Distribución y Hábitat de las especies en estudio

Mecardonia es un género originario de América perteneciente a la familia

Las variedades incluídas en este género se encuentran en lugares abiertos y

Mecardonia procumbens (Mill.) Small var. tenella (Cham. & Schltdl.)

Hierbas de 6 cm de alto, procumbentes o rastreras, poco ramificadas. Ramas

cm long; sépalo dorsal oval a oval-elípticas, 0,45-0,65 cm long, 0,25-0,35 cm de

Figura 1: a) M. procumbens var. tenella con flores amarillas, b) Detalle de sus

Mecardonia procumbens (Mill.) Small var. flagellaris (Cham. & Schltdl.)

Hierbas de 25 cm de alto ascendentes, muy poco ramificadas. Ramas

Figura 2: M. procumbens var. flagellaris a) en maceta, b) c) y d) Detalle de sus

Las características ornamentales de las especies de Mecardonia incluyen la

Figura 3: Variabilidad en forma y tamaño en flores de Mecardonia.

Tanto el conocimiento de la diversidad, así como de las relaciones genéticas

La composición bioquímica de los tejidos de las plantas y de las diferentes

Los marcadores moleculares en base a ADN fueron rápidamente utilizados por

Técnica ISSRs (Inter Simple Sequence Repeat) (microsatélites

Esta técnica utiliza los motivos de los microsatélites -regiones genómicas

extremos 5´o 3´ (llamado ancla), y cuya función es minimizar la hibridación

La fuente de variablidad de los ISSRs puede ser atribuida a cualquiera de los

 ADN templado: la variabilidad en el número de nucleótidos dentro de una

 La naturaleza del iniciador: el grado de polimorfismo varía con la

Figura 4: Esquema de hibridación de los iniciadores ISSR con anclaje en 3’ o 5’.

La técnica de ISSR fue aplicada satisfactoriamente para el establecimiento de

Análisis de diversidad genética empleando datos moleculares

Marcadores moleculares y diversidad genética

La diversidad genética constituye uno de los niveles biológicos en el que puede

Esta metodología permite cuantificar la afinidad entre individuos o Unidades

Interpretación de datos moleculares

Cada banda amplificada corresponde a un alelo dominante y define un locus

de bandas, valor “0”, no aporta a la medida de similitud, ya que puede ser

Coeficientes de similitud para variables cualitativas de tipo doble estado

Los marcadores moleculares se ajustan a este tipo de variables. Los coeficientes

Figura 5: Caracterización de dos OTUs donde se generan 4 diferentes

a= Número de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 1;

b= Número de caracteres donde la primera muestra tiene un 1 y la otra un 0;

c= Número de caracteres donde la primera muestra tiene un 0 y la otra un 1;

d= Número de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 0.

La suma de estos 4 valores dará el total de caracteres medidos (Echenique et

Entre los métodos algorítmicos más utilizados se encuentra el Ligamiento

Mean- Sokal y Michener, 1958), el mismo considera que el valor de similitud

Los resultados de los sucesivos pasos de agrupamiento se pueden representar

A modo de ejemplo se detalla un proceso típico para el análisis de la

Figura 7: Esquema del análisis de agrupamiento con marcadores moleculares

ADN templado: la variabilidad en el número de nucleótidos dentro de una

La naturaleza del iniciador: el grado de polimorfismo varía con la