Profesor: Freddy Villanueva Cotrina

 Aspergilosis pulmonar invasiva

 Diagnostico microbiológico y no
microbiológico
 Diagnostico molecular de Aspergilosis
 Selección del regiones blanco
 Obtención del ADN
 Técnica molecular empleada
 Aspergillus sp. son hongos filamentosos saprofitos del ambiente.
 Especies implicadas: A. fumigatus (80-90%), A. flavus, A. terreus,
A. niger, A. nidulans, A. clavatus.
 Aspergilosis pulmonar invasiva (API) es la forma mas frecuente
de la enfermedad invasiva.
 La inhalación de las conidias conllevan a colonización de las vías
aéreas que puede resultar en neumonía y enfermedad invasiva.
 Población susceptible y tasa de mortalidad : pacientes
neutrópenicos (50%) y trasplantados de medula ósea (90%).
 La presentación clínica de API incluye dolor torácico pleurítico,
hemoptisis, disnea, tos seca y fiebre.

Yeghen T, Kibbler CC, Prentice HG, et al. Management of invasive pulmonary aspergillosis in hematology patients: a
review of 87 consecutive cases at a single institution. Clin Infect Dis 2000; 31:859–68.
 Muestras a evaluar: esputo, secreciones y lavados bronquiales,
suero, tejido pulmonar, entre otros.
 El estudio de tejido pulmonar (histopatológico y microbiológico)
continua siendo el “Gold standard” en el diagnostico de API.
 El aislamiento de una especie de Aspergillus a partir del esputo
es altamente predictivo (80–90%) de API en pacientes
inmunocomprometidos (neutrópenicos y TAMO).
 Las muestras de LBA presentan una mayor sensibilidad y
especificidad para el diagnostico de API. Además, son útiles para
la detección de antígenos de Aspergillus y excluir otras
infecciones.
Ruhnke M, Bohme A, Buchheidt D, et al. Diagnosis of invasive fungal infections in hematology and oncology–
guidelines of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology
DGHO). Ann Hematol 2003; 82(Suppl. 2):S141–8.

Soubani AO, Qureshi MA. Invasive pulmonary aspergillosis following bone marrow transplantation: risk factors and
diagnostic aspect. Haematologia 2002; 32:427–37.
 EXAMEN DIRECTO
 KOH 20% y
Coloración GRAM
 Baja sensibilidad
 Hifas dicotómicas
(ángulo de 45o)

CULTIVO
• Agar sabouraud + antibiótico
• Incubar a 25oC. Son de crecimiento rápido (3-5 días)
• Se recomienda siembra por duplicado
 HISTOPATOLOGÍA: Coloración Hematoxilina- eosina, Gomorri-
Grocot

 INMUNOSEROLOGÍA: IEF, CIEF, ELISA (detección de

Galactomanano y 1,3 Beta D-Glucano)
 La detección de GM en fluidos corporales es muy
útil en el diagnóstico de API.
 GM: es un polisacárido de pared celular, liberado
por Aspergillus sp en su crecimiento.
 El GM sérico puede ser detectado varios días
antes: presencia de signos clínicos, radiografía de
tórax anormal o un cultivo positivo.
 Utilidad: permite la confirmación temprana del
diagnóstico y evalúa la evolución de la infección
durante el tratamiento
 Falsos positivos: contaminación en la toma de
muestra, en el transporte y en el laboratorio, así
como alguna reacción cruzada.
¿Qué hongo está infectando a
mi paciente?
¿Cuál será el tratamiento más
efectivo?
¿Cuán rápido puedo saber el
tratamiento oportuno?
 La incidencia de las IFI han ido en aumento en las últimas
décadas y vienen siendo una de las mayores causas de
morbilidad-mortalidad en pacientes inmunocomprometidos.
 Los métodos clásicos de diagnostico, microbiológico y
recientemente serológicos, presentan diversas limitaciones.
 Existe la necesidad de una rápida e inequívoca identificación
etiológica para lograr eficacia en el tratamiento antifúngico.
 En la actualidad, se continúa explorando otras posibilidades
diagnósticas capaces de solventar las limitaciones existentes
de los métodos empleados.
 La reacción en cadena de polimerasa (PCR) y sus variantes
tienen la especificidad y sensibilidad necesarias para
identificar especies fúngicas en corto tiempo y poca carga
fúngica .
 El desarrollo de la tecnología PCR se basa en tres pasos
fundamentales:
1. Selección de una región blanco específica de DNA/RNA para
identificar el hongo.
2. Obtención completa del DNA/RNA de la muestra clínica.
3. Correr un método para identificar la presencia de la región
blanco en la muestra.
• a) Secuencias específicas (primers) tomadas de bancos de datos genómicos y b)
Clonación y secuenciación de regiones arbitrarias del genoma fúngico.
• Los genes ribosomales (DNA ribosomal ) son los mas usados ya que se encuentran
en todos los organismos y en número elevado de copias ; mejor detección del
hongo y mayor sensibilidad de la PCR.
 El DNAr consta de tres genes: la subunidad
larga 28S, la subunidad corta 18S y el gen
5.8S.
 Separados por regiones espaciadoras (internal
transcribed spacer o ITS) y conformando una
unidad que se repite muchas veces.
 Estas subunidades tienen secuencias
conservadas que permiten el diseño de sondas
universales, mientras que la región ITS es de
gran variabilidad, lo que permite el diseño de
sondas específicas para especies.
 Sandhu et al. desarrollaron 21 sondas específicas cuyo blanco
era la subunidad grande de rRNA de 5 especies del género
Aspergillus, 8 de Candida, Coccidioides immitis, Cryptococcus
neoformans, Histoplasma capsulatum, y Sporothrix schenckii.
 Secuenciaron una sección del gen 28S de unos 100 hongos,
secuencias que permitieron desarrollar sondas universales (a
partir de las secuencias comunes) y sondas específicas (a partir
de las secuencias específicas de cada especie).
 Cada sonda fue específica y no ocurrieron falsos positivos.
Además, los agentes patógenos identificados coincidieron con
el resultado de métodos tradicionales.
 A partir del gen 18S rRNA, Einsele et al. desarrollaron otras
sondas que fueron probadas en su especificidad y sensibilidad
en134 especies fúngicas y 85 no fúngicas.
 El ensayo detectó e identificó la mayoría de las especies
relevantes de Candida y Aspergillus a un límite de 1 unidad
formadora de colonia por ml de sangre.
 La amplificación fue 100% sensible para todos los hongos
probados, con la excepción de H. capsulatum que fue la única
especie no-Aspergillus que hibridó con la sonda de este hongo.
 Con estas sondas, los autores pudieron seguir el curso del
tratamiento antifúngico en los pacientes.
 En los casos de aspergilosis invasiva, de 88 muestras positivas
al inicio del tratamiento, sólo quedaron 22 a las tres semanas.
 La causa mas común de API sigue siendo Aspergillus fumigatus.
 Sin embargo el desarrollo de cepas con resistencia a
anfotericina por Aspergillus terreus y la emergencia de otras
especies conllevan a la necesidad de identificar todas las
especies patógenas.
 La evaluación de muestras como suero, plasma y sangre total
es optimo. En un estudio multicentrico se encontró que PCR –
Aspergillus usando LBA tiene similar sensibilidad y
especificidad que usando muestras de suero.
 Además los autores proponen que un solo PCR negativo
excluye la enfermedad y que se necesita 2 o mas resultados de
PCR positivos para confirmar la enfermedad.
 COLECCIÓN DE LA MUESTRA
 Muestra clínica: muestras respiratorias son las mas estudiadas y
apropiadas, además de las muestra de sangre y LCR.
 Cepa de Aspergillus spp: cepa pura y entre 3 a 7 dias de resiembra.

METODO
 Cosecha de conidias e hifas fúngicas: raspado del micelio, preparación
de solución y concentración por centrifugación.
 Lisis de pared celular: mediante shock térmico por congelación (-70 oC)
y ebullición
 Tratamiento enzimático: proteinasa K
 Purificación del DNA: método de extracción por columnas por Mini Kit
QIAamp DNA (Qiagen).
 Medición de la concentración de DNA: lectura de la absorción a 260
nm (C. minima 100 ng/ml).
 Reacciones de amplificación se utilizaron:
 Primers y sondas:
 sonda tRNA FL (con marcador de fluoresceína en terminación 3`)
 sonda tRNA LC (con marcador LC Red 640 en terminación 5`)
 La mezcla de PCR optimizado (20 ul) : primers , sondas, ADN
molde, mastermix y agua PCR.
 Ciclos de amplificación (45) : desnaturalización a 95 °C,
hibridación de los primers y sondas a 60 °C y extensión a 72 °C.
 Medición de fluorescencia : al finalizar la fase de hibridación de
cada ciclo.
 Lectura de la amplificación del ADN molde: software del equipo
lector
 El valor CQ (ciclo de cuantificación) es el punto de corte a partir
del cual las amplificaciones son consideradas como positivas.
 Las curvas de amplificación de ADN por PCR en tiempo real
(qPCR) muestran de manera exponencial las unidades
relativas de fluorescencia (RFU) producidas a medida que
avanzan los ciclos del qPCR hasta llegar a su plateau en el
ciclo 45. Cada línea coloreada representa una muestra
distinta ya amplificada.
 La curva de fluorescencia obtenida después del PCR en
tiempo real demuestra amplificación absoluta, estimada en
RFU (Unidades Relativas de Fluorescencia) consistentes en la
mayoría de las muestras.
 Se considera positivo una curva sobre los 42 ciclos
 Las técnicas moleculares se aplican principalmente en el diagnostico
de las micosis invasivas debido a dificultades en su diagnostico .
 Una falta de consenso respecto al tipo de muestra, técnica de
extracción, técnica molecular e interpretación de resultados viene
limitado el impacto del diagnostico molecular.
 La performance de cualquier método PCR depende del diseño y uso
optimo de las oligonucleótidos, optimización del ensayo, extracción
del acido nucleído y la posible terapia antifúngica.
 Un sistema PCR provee gran sensibilidad sin afectar la especificidad y
puede ser usado para confirmar o descartar una infección.
 Los resultados falso-positivos por contaminación ambiental y uso
inapropiado de oligonucleótidos son una preocupación mayor.
 Los métodos moleculares serán parte de la rutina de laboratorio
complementando a los métodos actuales en el diagnóstico
micológico.
Preguntas?

GRACIAS 