UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

VICERRECTORÍA ACADÉMICA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

GUÍA DE LABORATORIO

BIOQUÍMICA GENERAL

III SEMESTRE

DOCENTE:

MSc. Myriam Judith Huérfano Torres

Bogotá, 2018
 MISIÓN

La Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, dentro de una perspectiva

humanística, le apuesta a una educación integral en diversos niveles y modalidades de
Pregrado y Posgrado, la cual se fundamenta en los imperativos axiológicos, las
demandas sociales y los desarrollos tecnológicos y científicos. En su proceso impulsa la
vivencia de valores humanos y ciudadanos que incidan en la formación de
profesionales responsables y críticos que se comprometan con los avances del
conocimiento, el desarrollo socio-cultural y el cuidado del medio ambiente.

VISIÓN

Desde la tradición de seriedad, calidad y eficiencia, la Universidad Colegio Mayor de

Cundinamarca se proyecta, en el año 2030, por ser un referente científico y cultural
como institución líder en la formación integral de profesionales con sólidos principios
éticos, coherentes con las necesidades del país y como una entidad reconocida
nacional e internacionalmente por su acreditación de alta calidad, sus elevados índices
de movilidad, la visibilidad e impacto de la investigación y los logros sobresalientes en
programas de proyección social.
 IDENTIFICACIÓN DEL COMPONENTE
COMPONENTE
TEMÁTICO BIOQUÍMICA GENERAL
(ASIGNATURA):
FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO I P.A. 2018
PERÍODO:
ACADÉMICO: CLÍNICO
ÁREA DE FORMACIÓN BÁSICA TOTAL DE 2
CRÉDITOS:
CAMPO DE DISCIPLINAR NIVEL (SEMESTRE): TERCERO
FORMACIÓN:
NÚCLEO TEMÁTICO: PROCESOS FÍSICO-QUÍMICOS Y
BIOQUÍMICOS DE LOS ORGANISMOS CÓDIGO: 1013121203
VIVOS

JUSTIFICACIÓN DEL COMPONENTE TEMÁTICO

El conocimiento de la bioquímica básica y de los ciclos metabólicos proporciona al estudiante la
capacidad de integrar y correlacionar en términos moleculares, todos los procesos relacionados con las
células vivas, así como establecer una interrelación recíproca entre ésta y la Fisiología, la Genética, y la
Biología Molecular entre otras. Por lo tanto, el dominio este núcleo temático resulta indispensable para
el desempeño profesional por ejemplo en Bacteriología (conocimiento del metabolismo microbiano y de
las pruebas bioquímicas y de biología molecular que permiten identificar un microorganismo;
conocimiento de los fenómenos moleculares que permiten que los microorganismos invadan los tejidos
(fenómeno quórum) y causen patologías y en el laboratorio clínico permite correlacionar los resultados
de las pruebas clínicas con los signos y síntomas clínicos que presentan los pacientes (correlación
clínico-patológica)

COMPETENCIAS GENERALES Y ESPECÍFICAS QUE FORMARÁ Y DESARROLLARÁ EL

COMPONENTE TEMÁTICO
5.1. Genéricas:
El desarrollo de éste componente temático permite que el estudiante desarrolle competencias
genéricas transversales como: comprensión de la literatura científica, desarrollo de lenguaje
oral que fortalece la comunicación, manejo de bases de datos, utilización del inglés, trabajo en
equipo con el que se busca el fortalecimiento de las relaciones interpersonales, la tolerancia, la
iniciativa, el espíritu emprendedor y de liderazgo.
5.2 Específicas:
Con el desarrollo de las temáticas del componente de Bioquímica general el estudiante estará
en capacidad de identificar las macromoléculas que participan en cada uno de los diferentes
ciclos del metabolismo celular y la integración de esto ciclos.
Por otra parte, el estudiante poseerá las habilidades y las destrezas necesarias para realizar los
procedimientos de:
 Toma y separación de muestras de sangre venosa y capilar con el buen uso de las
normas de bioseguridad.
 Conocimiento y aplicación de la espectrofotometría como método analítico, y la
 Realización e interpretación de cromatogramas.
 PRÁCTICA N° 1

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1. INTRODUCCIÓN

El laboratorio de Bioquímica es un área restringida debido a que cuenta con elementos y

reactivos que pueden poner en riesgo la integridad física de quienes desconocen su adecuado
uso. Por lo anterior, es importante conocer las normas establecidas y familiarizarse con el uso
de cada uno de los materiales trabajo para evitar cometer errores o sufrir accidentes durante
su manipulación.

2. OBJETIVOS
- Identificar los riesgos químicos, físicos, biológicos y psicofisiológicos relacionados con
el uso de los elementos, reactivos y equipos de laboratorio de Bioquímica.
- Familiarizarse con las normas de bioseguridad en el laboratorio de Bioquímica.

3. MARCO TEÓRICO
3.1 Factor de riesgo

Es una norma sistemática y organizada de identificar, localizar y valorar los factores y/o
agentes de riesgo en el contexto laboral.
El término “Seguridad Biológica” implica un conjunto de medidas científico-organizativas y
técnicas para proteger al personal, la comunidad y el ambiente.
El trabajo en los laboratorios de Bioquímica y Biología molecular tiene asociado riesgos
biológicos, físicos, químicos y psicofisiológicos.

3.1.1 Clasificación general de Factores y Agentes de Riesgo

 FÍSICOS:
Este tipo de riesgo está determinado por una variedad de agentes:
- Mecánico: objeto en movimiento
- Térmico: altas o bajas temperaturas
- Eléctrico: alto voltaje y conexiones eléctricas
- Radiaciones: ionizantes, radioactividad
- Incendios
- Iluminación
- Ruidos o vibraciones: por funcionamiento de equipos
- Microclima: condiciones de temperatura de instalación
- Presiones anormales

 QUÍMICOS:
Muchas de las sustancias de naturaleza química que se utilizan en un laboratorio de
Bioquímica son por una u otra razón peligrosas; Al manipularlas es necesario conocer y
evaluar sus peligros y determinar la forma apropiada para su seguro manejo, ésta
información se obtiene de las etiquetas y de las hojas de seguridad suministradas por el
fabricante u otras fuentes.

Las etiquetas del fabricante incluyen el nombre del producto, el pictograma de seguridad,
las frases de riesgo entre otras. El etiquetado del puesto de trabajo se emplea cuando el
producto es transferido a otro contenedor diferente al original, allí debe contener el
 nombre del producto, el nombre del fabricante, las frases de riesgo y los consejos de
prudencia.
Las hojas de seguridad proporcionan la información sobre las propiedades físicas, químicas
y toxicológicas de una sustancia y los procedimientos recomendados para una
manipulación segura, uso de equipos para protección, primeros auxilios, tratamiento de
desechos, derrames y otros.
La clasificación de las sustancias químicas depende de su peligrosidad, de lo cual se
establece que existen:
- Tóxicas
- Muy tóxicas
- Corrosivas
- Irritantes
- Inflamables
- Extremadamente inflamables
- Comburentes (en contacto con otras producen reacción exotérmica)
- Explosivas
- Nocivas
- Peligrosas para el ambiente
- Gaseosos (gases, vapores, aerosoles), sólidos (polvos orgánicos o inorgánicos, humos
metálicos), líquidos (rocío, neblinas), compuestos (hidrocarburos), ver figura 1.

Figura 1: pictogramas de seguridad

 BIOLÓGICOS:
Los riesgos biológicos se pueden identificar según: el tipo de material biológico que se
manipula, los procedimientos de rutina realizados en el laboratorio, el manejo de los
desechos biológicos que se generan, el aseo y desinfección de las áreas de trabajo, la
disponibilidad de implementos de protección personal, los protocolos de reconocimiento,
las enfermedades relacionadas con el trabajo, los accidentes e incidentes más comunes
como pinchazos, cortaduras e inhalaciones, las enfermedades ocupacionales adquiridas en
le laboratorio.

Agentes potenciales de lesiones y accidentes:

Manipulación Procedimiento Transporte Almacenamiento

El trabajo en un laboratorio de Bioquímica se lleva a cabo en condiciones especiales que

pueden influir en la salud del personal y tener repercusiones negativas para el ambiente, la
principal característica la constituye la manipulación que se realiza con el material biológico,
específicamente cuando se trabaja con la sangre y sus componentes, los reactivos, los
materiales y equipos empleados.
Durante la manipulación se pueden generar aerosoles que contaminan el ambiente laboral o
los ensayos que se están desarrollando.

3.2 Manejo de residuos

3.2.1 Manejo de residuos sólidos

Cada laboratorio cuenta con canecas para la eliminación de residuos sólidos:

- CANECA GRIS - material reciclable - Se utiliza con BOLSA GRIS

o Disposición final: reciclaje – comercialización.
o Empaque de plástico, bolsa de polietileno, vidrio no contaminado, cajas de cartón,
hojas de papel, periódico, botellas.

- CANECA VERDE: material común, residuos biodegradables - Se utiliza con BOLSA

VERDE
o Disposición final: relleno sanitario
o Residuos de servilletas, barrido, restos de tajalápiz, icopor, papel carbón.

- CANECA ROJA: material infeccioso, residuos sólidos altamente contaminantes en

contacto con residuos tóxicos. Se utiliza con BOLSA ROJA.
o Disposición final: cremación.
o Jeringa sin agujas, gasas, algodón, guantes de látex, material de curación, frascos
plásticos para recolección de muestras.

- GUARDIANES: empleados para la eliminación de agujas, cuchillas, lancetas, ampollas u

otros elementos corto punzantes.
o Disposición final: incineración.

3.2.2 Manejo de residuos líquidos

Las sustancias liquidas utilizadas en el laboratorio deben ser eliminadas de acuerdo al tipo de
sustancia, son almacenadas en contenedores para su posterior inactivación, otras deben ser
tratadas para ser eliminadas (nitrato de plata) y otras pueden ser eliminadas a través del caño
sin consecuencias ambientales.

3.3 Bioseguridad

En el laboratorio se refiere al conjunto de medidas preventivas destinadas a mantener la

vigilancia para proteger la salud.

Los accidentes que ocurren durante el trabajo en el laboratorio generalmente se deben a

descuido, desconocimiento o por no atender las instrucciones establecidas, lo que genera
riesgos que pueden afectar la integridad, de los trabajadores del laboratorio, de la comunidad
y en ocasiones de la familia.

Existen algunas normas de precaución universal que es necesario tener presente en el manejo
del laboratorio. (Consultar cuáles son estas normas a seguir y hacer un decálogo de las que se
consideran básicas para éste laboratorio).
En un laboratorio de Bioquímica las precauciones que se deben adoptar son:

- Conocer la distribución de las diferentes secciones del laboratorio, para evitar posibles
riesgos de contaminación de las muestras que produzcan alteraciones en los
resultados finales.
- Utilizar siempre implementos de protección limpios (guantes, careta, tapabocas, blusa
de laboratorio).
- Lavarse las manos antes y después de trabajar en el laboratorio.
- No tocar con las manos enguantadas ojos, nariz, u otras mucosas expuestas.
- No pipetear líquidos con la boca.
- No comer, beber, fumar o aplicar cosméticos si está en el laboratorio, tampoco guarde
alimentos ni enseres en las áreas de procesamiento.
- Llevar a cabo todos los procedimientos técnicos de forma tal que sea mínimo el riesgo
de producir aerosoles, salpicaduras o derrames.
- Desinfectar el área de trabajo antes y después de cada trabajo utilizando hipoclorito de
sodio 5.000 p.p.m. por mínimo 15 minutos, también se puede utilizar alcohol
antiséptico en superficies.

4. PRE-LABORATORIO
5.
 Consultar sobre las sustancias más utilizadas como desinfectantes en el laboratorio de
Bioquímica.
 Revisar y leer todos los archivos enviados por la docente al correo electrónico.

6. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

- Guantes
- Tapabocas
- Elementos de barrera de bioseguridad

7. PROCEDIMIENTO

7.1 Normas de bioseguridad:

- Realizar lectura previa a la práctica de las guías y las páginas web relacionadas con el
tema en la planificación semestral.
- Hacer uso adecuado de los guantes de látex y tapabocas, seguir lo indicado para su
eliminación.
- Realizar un adecuado lavado de manos, acorde a la normativa.
- Reconocer el área física del laboratorio, su distribución, los implementos y símbolos
relacionados con bioseguridad.

8. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS (Para el post laboratorio)

Con base en la práctica y con la realización de una búsqueda de información, realice la ruta
posible de eliminación de las siguientes sustancias provenientes de un ensayo realizado en un
laboratorio:
 CLÍNICO - suero de paciente seropositivo para VIH
 INDUSTRIAL – Ácido sulfúrico (H2SO4) utilizado en la determinación de grasas en leche.
 AGRÍCOLA- muestra de cultivo de lechuga contaminado con Botrytis cinérea
 AMBIENTAL- muestra de agua a la cual se le determina presencia de metales pesados
(mercurio).
9. POST LABORATORIO

Escriba cuáles son los accidentes más frecuentes que usted considera se pueden presentar en
el desarrollo de su práctica de Bioquímica general, considere las temáticas a trabajar
entregadas por el docente en el cronograma semestral.

Términos a considerar

Carcinógeno: Agente que se sabe o se sospecha que causa cáncer.

Corrosivo: Agente químico que destruye el tejido o los materiales por contacto directo.
Mutágeno: Agente que induce mutaciones en el material genético.
Teratógeno: Agente que se sabe o sospecha que ocasiona daño al feto.
Tóxico: Sustancia que ocasiona daño a la salud, por exposición corta o prolongada,
cuando es ingerida, inhalada o absorbida por la piel o mucosas.

Por favor lea la guía de laboratorio, prepare la temática a trabajar y realice las actividades
planteadas antes de presentarse a la práctica, considere que puede ser la nota del quiz de
ésta práctica.

10. BIBLIOGRAFÍA

 Bernabei, D. Seguridad. Manual para el laboratorio. Alemania: Merck KgaA, D-64293.

 Rodríguez, J; ArgotE, E. y Rodríguez, O. Temas de seguridad biológica. Cuba: Félix
Várela.
 Manual de procedimientos. Gestión Integral de Residuos Hospitalarios y Similares en
Colombia, Ministerio del Medio Ambiente, Ministerio de Salud.
 Schuler, Ingrid. Guías de laboratorio. Biología Molecular. Bogotá: Pontificia Universidad
Javeriana.
 ISS, Cámara de la Industria farmacéutica. El ABC de la seguridad en el laboratorio.
Edición Merck S.A.

11. AUTOEVALUACIÓN

Con base en la discusión de la práctica escriba un decálogo de las normas de bioseguridad que
se deben seguir en el trabajo en el laboratorio de Bioquímica durante el desarrollo del curso.
 PRÁCTICA N° 2
TOMA DE MUESTRA PUNCIÓN VENOSA SISTEMA AL VACIO

1. INTRODUCCIÓN

La toma, transporte y conservación de muestras, son fundamentales para obtener resultados

de óptima calidad y confiabilidad. Por lo tanto, es necesario conocer las normas estandarizadas
que rigen estos procesos.

2. OBJETIVOS

- Conocer y aplicar los procedimientos necesarios para practicar la flebotomía con

sistema vacutainer o al vacío.
- Adquirir destreza en las técnicas de venopunción.

3. MARCO TEÓRICO
3.1 FLEBOTOMÍA

La palabra flebotomía se deriva de la palabra flebos, que significa vena, y tomos que significa
cortar. Traducida literalmente, flebotomía es el acto de realizar un corte en una vena. Cuenta
con más o menos tres mil años de historia. El hábito de la sangría se practico a lo largo de
siglos para ayudar a aliviar las enfermedades de la humanidad.

Estandarización del proceso mediante los siguientes estándares:

Técnicas de extracción de muestra sanguínea:
 Punción venosa (NCCLS documento H3-A5)
 Punción difícil (NCCLS documento H3-A5)
 Punción capilar (NCCLS documento H4-A5)
 Punción arterial (NCCLS documento H11-A4)

3.1.2 Sistemas de extracción de sangre

 Sistema de vacío: también se le conoce como vacutainer o venoject. Es el sistema más

utilizado para la obtención de muestras sanguíneas, debido a que permite que la
sangre pase directamente de la vena al tubo de vacío. Además, los tubos de vacio son
más cómodos de utilizar, más baratos y evitan que se escape la sangre cuando se
cambian. El sistema consta de tres elementos básicos: una aguja estéril con la que se
obtiene la sangre, un soporte (guía o camisa) para asegurar la aguja y el tubo en el que
se ha hecho el vacio (fig. 1). Las agujas están especialmente diseñadas para usarse con
el tubo de vacío; la parte de la aguja que se enrosca en el soporte se denomina “cono”,
ver figura 2

Figura 1. Elementos que conforman el sistema de vacío.

TIPOS DE AGUJAS (Figura 2)

Presentación de agujas Convencional, Eclipse y Flashback.

Holders o portatubos

Figura2. Tipos de agujas vacutainer A. aguja convencional, B. Eclipse y flashback. Portatubos.

Tubo al vacio
Tubo estéril de plástico al vacio, desechable, disponible en varias capacidades de drenado.
Contiene el aditivo apropiado para el tipo de muestran deseada y para la prueba específica de
diagnóstico a realizar.
El tubo vacutainer tiene un tapón de seguridad Hemogard™ especialmente diseñado para
evitar la salpicadura accidental de sangre, cuando este es abierto para el proceso. Además,
Vacutainer™ ofrece toda una gama de tubos (ver figura 3) para pruebas especiales como
determinaciones de elementos en traza, carga viral, glucosa, etc.
 Figura 3. Gama de tubos para pruebas especiales.

Para facilitar su identificación, los tubos de vacio vienen con sus tapones codificados por
colores. En la tabla número 1 se muestran los diferentes tipos de tubos que se consiguen
comercialmente.

sustancia
Color de
Añadida
tapón
Rojo Ninguna
Gel
Gold/amarillo
procoagulante
Heparina de
Verde
sodio o de litio
Azul claro Citrato 3,8%
Violeta EDTA 10%
Fluoruro u
Gris
oxalato
Tabla Nª 1. Código de colores de los tubos de vacio

Para tomar muestras en niños se utilizan tubos al vacio pediátricos que requieren una cantidad
mínima de sangre.

3.1.3 Etapas básicas en la extracción de las muestras de sangre

3.1.3.1 Solicitud

La solicitud de análisis de sangre debe llegar al laboratorio con toda la información necesaria
para poder identificarla y procesarla. Debe incluir: nombre completo del paciente (figura 4),
número de identificación del hospital, nombre del profesional que solicita la prueba,
departamento o unidad para la que se realiza el trabajo y exámenes solicitados.
 Figura 4. El tubo debe llevar nombre completo del paciente, número de identificación
(código del Laboratorio)

3.1.3.2 Preparación del material

Antes de proceder a la extracción de la muestra de sangre se deben seleccionar tubos del tipo,
tamaño y cantidad adecuados. A cada uno de ellos se le debe colocar una etiqueta con la
identificación del paciente. Igualmente, se deben preparar todos los elementos que se
requieren para la toma de la muestra como torundas de algodón, alcohol etílico 70% o Alcohol
antiséptico, jeringas o guías y agujas adecuadas.

3.1.3.3 Identificación del paciente

La persona que va a extraer la muestra de sangre (enfermera, auxiliar de laboratorio, auxiliar
de enfermería, bacteriólogo, etc.), debe confirmar la identidad del paciente. Para esto le
preguntará su nombre completo y lo confrontará con el que figura en el impreso de petición
de análisis y en las etiquetas de los tubos. Si el paciente está hospitalizado, debe confirmar el
nombre con el número y el nombre que figura en la cama o historia clínica de la habitación. Al
ingresar a la misma, solicitar al paciente que diga su nombre completo, si el paciente no puede
contestar, se pedirá a un familiar o enfermera que lo identifique.

3.1.3.4 Verificación del cumplimiento de requisitos

Algunas pruebas requieren que el paciente esté en ayudas o que elimine ciertos
medicamentos o alimentos de su dieta. Por lo tanto, antes de extraer la muestra se debe
verificar el cumplimiento de estas condiciones.

3.1.3.5 Colocación del paciente en posición correcta

El paciente debe sentarse en posición cómoda, con el antebrazo colocado en un apoyabrazos
inclinado y el brazo extendido de manera que forme una línea recta desde el hombro a la
muñeca. El brazo debe apoyarse firmemente en el apoyabrazos y no debe estar doblado a
nivel del codo. Si se le va a extraer sangre a un paciente en posición de cúbito supino, se le
debe hacer descansar confortablemente sobre su espalda. Si se necesita un apoyo adicional, se
le puede colocar una almohada bajo el brazo del que se va a extraer la muestra, el cual debe
permanecer extendido, formando una línea recta desde el hombro a la muñeca.

3.1.3.6 Selección del sitio de la vena donde se va a realizar la punción

La mayoría de procedimientos para extracción de sangre utilizan las venas situadas en el brazo.
Entre ellas, la más usada es la vena cubital media o mediana del codo (figura 5) debido a que
es grande, está cerca a la piel y es la menos dolorosa para el paciente. Si no puede hacerse la
punción en esta vena, puede utilizarse la vena cefálica o la basílica (figura 6), aunque en estas
venas la sangre fluye con más lentitud y tiene tendencia a lastimarse y rodar más fácilmente.
Posición para la toma
La postura ideal para la toma de muestra es mantener el brazo en posición horizontal, se ha
demostrado que existen incrementos significativos en varias determinaciones con respecto a
la postura vertical, debido al aumento de la presión de filtración efectiva cuando se cambia en
esta dirección.

Selección del sitio de punción: Las venas más comúnmente utilizadas son las del área ante
cubital, debido a su accesibilidad, fácil manejo y comodidad del paciente Figura 7.

Figura 7. Venas del antebrazo

Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son las más comúnmente utilizadas
para la punción:
 Vena cefálica, ubicada en la parte superior del antebrazo y del lado del pulgar de la mano.
 Vena basílica ubicada en la parte inferior del antebrazo y del lado meñique de la mano.
 Vena cubital mediana que conecta la vena cefálica y basílica en la fosa anterocubital (flexión
del codo y es la vena de elección).

En el momento de elegir la vena a puncionar se debe tener en cuenta:

* Palpar (mediante el tacto) la vena con el dedo índice para determinar la profundidad, la
dirección y el diámetro.
* Sí en ninguno de los brazos se puede hallar la vena se busca en el lado dorsal de la muñeca,
la mano o el pie.
* Antes de utilizar estas opciones se recomienda que otro flebotomista intente localizar una
vena en el brazo, ver figura 7.
* Existen algunas condiciones especiales que se deben tener en cuenta en el momento de la
selección de la vena. Entre ellas están:
* La muestra obtenida en una zona con hematomas puede dar lugar a resultados erróneos, en
este caso se debe extraer la muestra de otra vena, o del segmento de la vena distal del
hematoma.
* Si el paciente está sometido a terapia intravenosa se debe extraer la muestra del brazo
opuesto, la razón radica en que la sangre obtenida por encima del lugar de la infusión está
diluida con el líquido que se administra y por lo tanto, los resultados de las pruebas serán
errados.
* Los pacientes oncológicos, leucémicos, obesos, con problemas cardiacos, recién nacidos o
niños pequeños, que generalmente presentan venas difíciles, se deben seleccionar un punto
de venopunción en el antebrazo completo, la parte posterior del brazo, las muñecas, las
manos, los tobillos o los pies.
* En personas con diabetes o problemas cardiovasculares o circulatorios, no se pueden utilizar
las venas del tobillo o del pie.
* En pacientes hemodializados no se puede extraer sangre de la fístula. Por lo tanto, se debe
seleccionar una vena del brazo opuesto ver figura 8.

3.1.3.7 Colocación del torniquete

La utilización del torniquete provoca una estasis del retorno venoso que incremente la
prominencia de las venas y facilita la punción. Debe enrollarse cuidadosamente alrededor del
brazo por encima del lugar de extracción, teniendo cuidado de no pellizcar la piel. La
aplicación del torniquete no debe ser mayor a 30 segundos ya que produce alteración en los
resultados de algunas pruebas. Se debe evitar el método de abrir y cerrar la mano, pues esto
causa bombeo de sangre al músculo de la mano.

Torniquete
Su aplicación es recomendada para el uso de venas profundas, poco visibles y poco palpables
(ver figura 9), se debe considerar ciertos pasos:
 Posición (10 cm por encima del lugar de punción)
 Muy alto no hay presión
 Muy bajo posibilidad de hematoma
 Tiempo no más de un minuto en el lugar de punción.
Se ha demostrado que la utilización del torniquete durante un tiempo mayor a un minuto
provoca aumento de un 15% de desviación en valores de coagulación y de un 10% en el
hematocrito.

Figura 9. Torniquete y cómo utilizar

1.1.3.8 Limpieza de la zona de punción
Una vez localizada la vena se debe realizar una limpieza adecuada de la zona con el fin de
evitar cualquier contaminación. Para esto se utiliza una gasa o torunda de algodón empapada
con una solución de
 Etanol 70% o Alcohol antiséptico
 2- solución yodada
 Puede aplicarse con torunda de algodón, trozo de gasa o almohadilla comercial.
 El sitio debe higienizarse con un movimiento circular de adentro hacia afuera.
 Es importante dejar que el área se seque al aire antes de realizar la venopunción para
evitar el ardor y la contaminación de la muestra.
 Si se toca la piel antes de tomar la muestra, se debe repetir el procedimiento.

1.1.3.9 Punción venosa

Puede realizarse con sistema de vacío o con jeringa que será revisado la siguiente practica.
 Con sistema al vacio: primero se coloca la aguja en el soporte o guía, a continuación,
se punciona la vena con el bisel de la aguja hacia arriba, se toma el tubo de vacio con
una mano y se empuja hacia el interior del soporte, mientras que con la otra sostiene
la guía o portatubos; el extremo posterior de la aguja perfora el tapón y activa el vacío
del tubo para extraer la sangre, el tubo debe llenarse hasta que se agote el vacio y
cese el flujo de sangre, lo cual asegura una relación correcta entre anticoagulante y
sangre, sacar el tubo del soporte e insertar el siguiente si fuere necesario, una vez
retirados los tubos se deben mezclar suavemente por inversión las veces que lo
amerite el tubo, con el fin de mezclar la sangre con el anticoagulante, cuando ya se
tengan las muestras necesarias, se coloca una torunda de algodón sobre el sitio de
punción y se retira suavemente la aguja. La torunda se mantiene firmemente hasta
que cese el sangrado. Ver figura 10.
 FIGURA 10. Extracción de sangre por sistema cerrado
Orden de toma
En la toma de las muestras es importante seguir el orden en el uso de los tubos
establecido por las ultimas actualizaciones (NCCLS7 CLS/ H3-AS), para reducir las probables
fuentes de error, como se muestra en la tabla 2

Tabla 2.
Es un punto importante para la conservación y la adecuación de la muestra previo a su
análisis:
 Mientras se llenan los tubos sucesivamente, invertir con suavidad los tubos que ya
se han llenado figura 11.
Con esta precaución se evita:
 Formación de coágulos o micro coágulos (sangre total, plasma)
 Retraso en la retracción de coágulo (suero)
 Errores en los resultados

FIGURA 11. Manera correcta de mezclar los tubos.

 1.1.3.10 Manejo de los residuos
Las agujas se retiran de la jeringa o del tubo de vacio con ayuda del guardián o se
destruyen en un incinerador, las torundas de algodón, las jeringas (sin aguja) las gasas y
curas se descartan dentro de la bolsa roja figura 12.

FIGURA 12. Guardianes donde se depositan las agujas, u elementos corto punzantes

2. Pre laboratorio
1. Defina los siguientes términos: hemólisis, lipemia, ictericia, hematoma.
2. Realice una búsqueda de las siguientes técnicas de extracción de muestra sanguínea y
elabore un cuadro de síntesis de cada una de ellas.
 Punción venosa (NCCLS documento H3-A5)
 Punción difícil (NCCLS documento H3-A5)
 Punción capilar (NCCLS documento H4-A5)
 Punción arterial (NCCLS documento H11-A4)
Nota: Debe traer un recipiente de boca ancha para descartar los desechos líquidos y puntas.

3. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

 Guía o camisa para sistema cerrado
 Aguja para sistema cerrado
 Tubos al vacio con y sin anticoagulante: tapa roja, lila y azul.
 Torniquete
 Guantes
 Gradilla
 Torundas de algodón
 Etanol 70% o Alcohol antiséptico

4. PROCEDIMIENTO

Realizar una lectura previa de la guía de laboratorio.

Reconocer el equipo necesario para venopunción por sistema al vacio o cerrado.
Extraer sangre a un compañero siguiendo el protocolo presentado en la guía.

5. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Durante la recolección de las muestras de laboratorio se pueden presentar las siguientes

situaciones problemáticas:
 a. Paciente al quien se le desarrollo un hematoma posterior a la toma de la muestra por
venopunción.
b. Marcaje erróneo (dos tubos con número de código de identificación diferente que
corresponde al mismo paciente.
c. Accidente laboral (ruptura del tubo de muestra al ser transportado a la sección de
trabajo).
Con base en los conocimientos adquiridos y la práctica realizada, cuál sería la conducta a seguir
ante cada una de las situaciones descritas.

8. POST LABORATORIO
a. Realice un cuadro con las diferencias entre suero y plasma
b. Realice la traducción del siguiente documento:

SPECIMEN CONTAINER TYPES

Most Commonly Used Blood Collection Tubes

Stopper Color Volume Contents and Function

Sterile, no anticoagulant or additives. Collection

of serum for chemical or serological and
Red (RT) 7, 10 mL bacteriologic studies. May be used for any
procedure requiring serum except HLA antibody
tests.

Contains no silicone, gel separators,

anticoagulants, or additives of any kind. Can be
Special Red
7 mL used for collection of serum for HLA antibody
(RT)
screen/PRA and platelet-specific antibody
screen.

Sterile, silica clot activator and inert polymer

serum separator gel. Collection of serum for
Gold (GT) 7 mL chemistry studies. For acceptability, please
refer to the alphabetical section of this manual.
NOT FOR USE FOR BLOOD BANK PROCEDURES!!!

Sterile, contains EDTA (Ethylene Diamine Tetra

Acetate) as the anticoagulant. *MIX WELL!*
Lavender (LT) 5 mL
Primarily for collection of hematology studies,
blood bank procedures and certain chemistries.

Sterile, contains sodium citrate (0.109M, 3.2%)

solution as the anticoagulant. Tube calibrated to
Blue (BLT) 4.5 mL draw only 4.5 ml of blood. Only properly filled
tubes are accepted for testing. *MIX WELL!*
Primarily for collection of coagulation studies.

Sterile, contains potassium oxalate and sodium

fluoride as the anticoagulant. *MIX WELL!* For
Gray (GYT) 3 mL
the collection of glucose and lactate samples.
Not suitable for enzymes or electrolytes.

Green (GRN) 5 mL Sterile, contains lithium heparin as the

 anticoagulant. *MIX WELL! * For collection of
other miscellaneous studies. Electrolytes,
glucose, BUN can be performed more quickly
than from a red top; especially useful for
patients in DKA.

Sterile, contains sodium heparin as the

Special Green
7 mL anticoagulant. For collection of flow cytometry
(SGRN)
specimens. *MIX WELL!*

Sterile, contains ACD (Acid Citrate Dextrose) as

the anticoagulant. *MIX WELL!* For
Yellow (YT) 6 mL determination of HLA-ABC antigens, HLA-B27,
HLA Molecular Typing, G6PD levels and acid
phosphatase levels.

Sterile, contains no anticoagulant. For detection

Royal Blue
7 mL of trace metals (i.e., Arsenic, Zinc, etc.). Contact
(RBL)
lab to acquire this tube.

Sterile, does not contain any anticoagulant,

Pink (PT) 7 mL serum separator, or silicone coating. For
detection of HLA antibodies in serum (CYTS).

Sodium heparin (glass) or K2EDTA (plastic). For

lead determinations. This tube contains less
Tan
than .01µg/mL(ppm) lead. Tube inversions
prevent clotting.

Pearl Top
(PPT, Plasma Contains 9 mg K2EDTA. For viral load monitoring
5 mL
Preparation or viral detection
Tube)

* GENTLY invert tube 5-10 times: DO NOT SHAKE!!!

24 Hour Urine Collection Instructions:
For collection of 24 hour urine, the patient should be carefully instructed to begin with
an empty bladder by voiding and discarding urine at 7:00am, and then collecting all
urine for 24 hours including a 7:00am voiding the following day.
Tomado de: Fuente: http://www.uams.edu/clinlab/specimencont.htm

 BIBLIOGRAFÍA
Devlin, T. Bioquimica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 3 ed Editorial
Reverté, España. Vol. 1 y 2.
 Slockbower, J. Toma de muestra para análisis clínicos. 1ª ed. Editorial Albor,
España.
 González de Buitrago J.M, Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. Ed.
Elsevier, 3ª ed.
 http://www.uams.edu/clinlab/specimencont.htm
 http://images.google.com/imgres?imgurl
 PRÁCTICA N° 3

PUNCIÓN VENOSA CON SISTEMA ABIERTO - JERINGA

SEPARACIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE
MANEJO PIPETA Y CENTRÍFUGAS

TOMA DE MUESTRAS CON SISTEMA ABIERTO - JERINGA

1. INTRODUCCIÓN

2. OBJETIVOS

 Conocer los sistemas abiertos toma de muestra.

 Adquirir destreza en la técnica de venopunción con jeringa.
 Explicar el uso apropiado del material y el procedimiento para la punción capilar
 Identificar el procedimiento para separación de suero y plasma mediante el
método de centrifugación.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 SISTEMA ABIERTO DE EXTRACCIÓN DE SANGRE

 Jeringas de plástico o de cristal

El sistema punción con de jeringa funciona de igual al sistema de vacío, con la

diferencia que la presión que genera el vacío de los tubos está desarrollado por el
flebotomista mediante la presión del embolo de la jeringa; por lo tanto, la sangre
deberá extraerse tirando suavemente el émbolo de la jeringa hacia atrás (figura 1)
hasta realizar un llenado de la jeringa acorde a la necesidad; el volumen a tomar será
el necesario para hacer el llenado óptimo de los tubos teniendo en cuenta
especialmente aquellos que tienen anticoagulante y se realiza siguiendo el orden
establecido para el sistema cerrado; por lo anterior, se comercializan jeringas de
diferentes volúmenes que comprenden desde 2.5ml hasta 50 ml (figura 2) las cuales
están provistas de agujas que están diseñadas para que encajen al sistema y vienen en
varios calibres que abarcan desde 27G hasta 18G.
Para realizar el llenado de los tubos de muestra se retira la aguja de la jeringa con la
ayuda del guardián y se procede a trasvasarla lentamente, dejándola caer por las
paredes del tubo. Nunca se debe agregar la sangre a través de la aguja porque
ocasiona hemolisis de la muestra.
3.2. SEPARACIÓN DE MUESTRAS

El método utilizado en el laboratorio de bioquímica para la separación de muestras es la

centrifugación, que es una técnica que utiliza la fuerza centrífuga para separar fases de distinta
densidad; éste método tiene múltiples aplicaciones en el laboratorio clínico, pero una de las
más frecuentes e importantes es el procesamiento de la sangre para obtener fracciones de
suero, plasma y células.

Para separar por éste método se utiliza la centrifuga que separa partículas de una solución,
utilizando la fuerza centrifuga; ésta fuerza es aplicada a cada partícula en la muestra, la cual
será sedimentada en un índice que es proporcional a la fuerza centrifuga aplicada. La
viscosidad de la muestra y las propiedades físicas de las partículas también afectan el índice de
sedimentación de cada partícula individual; al mezclar la fuerza centrifuga y la viscosidad del
líquido, el índice de sedimentación de las partículas es proporcional al tamaño (peso
molecular) y la diferencia entre densidad y la densidad de la solución.

CENTRIFUGA: Es el equipo utilizado para separar partículas de una solución utilizando la fuerza
centrifuga; ésta fuerza es aplicada a cada partícula en la muestra la cual será sedimentada en
un índice que es proporcional a la fuerza centrífuga aplicada. Al mezclar la fuerza centrifuga,
las propiedades físicas de las partículas, la viscosidad del líquido y el índice de sedimentación
de las partículas es proporcional al tamaño (peso molecular) y la diferencia entre su densidad y
la densidad de la solución.

El proceso de separación de muestras comprende varias etapas: pre centrifugación,

centrifugación y fraccionamiento de las muestras.

PRE CENTRIFUGACIÓN

Es el período de tiempo que transcurre entre la recogida de una muestra y su colocación en la

centrífuga. La sangre debe mantenerse en el tubo original tapado hasta que esté a punto para
la separación. Lo ideal es centrifugar la muestra de sangre tan pronto como se ha completado
la formación del coágulo. En la práctica se acepta un intervalo de 5 a 10 minutos a
temperatura ambiente, de lo contrario, el contacto prolongado del suero con el coágulo
celular puede producir alteraciones significativas en ciertos componentes. Para mejorar la
separación se puede colocar en el baño serológico a 37ºC durante máximo 5 minutos.

Éste proceso se debe realizar con el tubo tapado lo cual elimina la posibilidad de
contaminación exógena de la muestra, evaporación, posibilidad de derrame y la producción de
aerosoles que incrementan el riesgo de infección en el personal al momento de la
centrifugación, y reducir la agitación del liquido, lo cual reduce la posibilidad de hemólisis
también el manejo suave evita la hemólisis y no se verán afectadas: LDH, AST, potasio, hierro,
ALT, fósforo, Proteínas totales, albúmina, magnesio, calcio, fosfatasa ácida y disminución de la
T4. Debe evitarse también prolongada a la exposición a la luz especialmente porque se
afectarían las vitaminas A y B6, beta-carotenos, porfirinas y bilirrubina.

CENTRIFUGACIÓN

Los tubos de sangre se colocan en la centrífuga (figura. 3), de forma que todas las muestras
estén equilibradas. Los tubos del mismo tamaño deben colocarse en sitios exactamente
opuestos. Si se va a procesar un número impar de muestras, se deben utilizar tubos llenos de
agua para equilibrar el peso. Nunca se debe centrifugar un tubo solo. Una vez ubicados las
muestras, se procede a centrifugarlas a 2500 rpm. durante 10 minutos o por 3000 rpm por 5
minutos. Si se deja el tapón puesto durante la centrifugación, se debe tener cuidado al
retirarlo posteriormente debido a que cualquier agitación puede producir una disgregación de
las células empaquetadas.

Figura 3 A. Figura 3 B.

Figura 3. A.Centrifuga, centrifugación. Figura 3 B Muestras centrifugadas.

FRACCIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Una vez se ha terminado de centrifugar la sangre, se procede a sacar los tubos de la centrifuga
con una pinza para este fin; para separar el suero o el pipetas se utilizan pipetas Pasteur
desechables o pipetas automáticas con puntas desechables utilizando puntas adecuadas libres
de metales las cuales son introducidas en el tubo de la muestra para recuperar la parte líquida
que se encuentra en la parte superior del tubo y se distribuye en tubos de distribución o
separación (12mm X 100mm), que pueden ser de vidrio o plástico; aunque por medidas de
seguridad, se prefieren los de poliestireno. La decantación es una mala técnica para transferir
el suero o plasma desde los tubos de extracción a los tubos de distribución, porque pueden
agitarse fácilmente las células sedimentadas y decantarse algunas con la muestra. Todos los
tubos con las muestras se deben marcar con marcador indeleble o no borrable.

Una vez se centrifuga la muestra y dependiendo el tubo en el cual haya sido recolectada podrá
obtenerse:

Suero:

Proviene de una muestra tomada en un tubo sin anticoagulante en el que se ha recogido la

muestra y que se ha dejado coagular previamente; si el tiempo de coagulación no es el
adecuado, la formación latente de fibrina puede causar un problema en las determinaciones
que se efectúan en equipos automáticos, se puede acelerar la coagulación utilizando un
activador como trombina, o partículas de vidrio o sílice; se prefiere no desprender el coagulo
del tubo con un aplicador, porque es una fuente potencial de hemólisis en lo posible se debe
dejar coagular la muestra naturalmente.

Plasma:

Proviene de una muestra tomada en un tubo que contiene un anticoagulante usado en

proporción de 1 parte de anticoagulante + 9 partes de sangre; éste tubo puede ser
centrifugado inmediatamente.

Los anticoagulantes usados son Citrato de sodio al 3,8%, E.D.T.A. a la 10 %, heparina sódica y
heparina de litio. Los dos primeros previenen la coagulación por extracción del Calcio de la
sangre mediante precipitación o unión en forma no ionizada (quelación); estas muestras no
pueden usarse para las determinaciones de Calcio, Magnesio y Fosfatasa alcalina; las muestras
de plasma tomadas con Citrato de sodio al 3,8% (tubo tapa azul) se utilizan para las
determinaciones de eritrosedimentación, pruebas de coagulación y recuento de plaquetas.

El E.D.T.A. 10% es utilizado en pruebas de cuantificación (recuento y verificación de

morfología) de células como el hemograma ya que mantiene la morfología celular; para éste
caso no es satisfactorio usar heparina debido a que puede permitir la agregación de las
plaquetas, lo cual disminuye el número en el recuento.

La heparina (tubo tapa verde) actúa formando un complejo con la antitrombina III y de ésta
manera inhibe las etapas de la activación de los factores de coagulación y por ende la
formación del coagulo; las muestras tomadas con heparina son utilizadas en aquellas pruebas
que deban mantener las células sanguíneas de la manera natural similar a la condición in vivo,
como son las pruebas de citogenética.

Algunas ventajas que tiene el plasma sobre el suero

1) Economía de tiempo, ya que se elimina la espera de la coagulación de la sangre.

2) Rendimiento más alto, en sangre total, puede obtenerse de un 15 a 20 % más de muestra
3) Puede ocurrir coagulación en suero, post centrifugación
4) El resultado del plasma es más representativo del estado biológico
5) Riesgo bajo de hemólisis y trombocitólisis, las plaquetas permanecen intactas, no hay
seudohiperkalemia

Algunas desventajas del plasma sobre el suero

1) En electroforesis de proteínas se altera. El fibrinógeno aparece como una banda en la región

de las gammaglobulinas.
2) Interferencia método-dependiente, los anticoagulantes pueden llevar a la Interferencia del
método.
3) Interferencia del catión, cuando se usan heparina de litio o amonio.

RECOMENDACIONES PARA EL USO DE LA CENTRÍFUGA:

1. Mantener la centrífuga limpia, libre de muestras y polvo.

2. Tapar los tubos durante la centrifugación para prevenir la liberación de material
infeccioso dentro de la centrifuga por formación de aerosoles.
3. La centrifugación se inicia lenta y gradualmente y así mismo se termina.
4. No abrir la centrífuga antes de que cese de girar y no detenerla manualmente.
5. Siempre se debe equilibrar los cestillos o corazas a utilizar, se pueden pesar para este
fin.
6. Se debe permitir un nivel de tolerancia del nivel del líquido a centrifugar, de por lo
menos dos (2) cm del borde superior del tubo al nivel del líquido.
7. Limpiar los soportes o cestillos de la centrifuga con un desinfectante o desinfectante, si
ocurre alguna ruptura de tubos con liberación de material infeccioso.
8. Controlar trimestralmente el número de revoluciones por minuto utilizando un
tacómetro estroboscópico.
9. Se debe revisar el motor y sus partes mensualmente (empaques, escobillones etc.)
10. Anotar cualquier corrección o mantenimiento realizado.
 PIPETAS AUTOMÁTICAS

Son equipos utilizados para medir volúmenes estándares. Se clasifican en:

 TD (vidrio) para dispensar o de transferencia dentro de este grupo están las

serológicas (Graduadas hasta la punta), las volumétricas (con bulbo central) y las de
Mohr (mide la región graduada solamente). Estas son calibradas con agua y por lo
tanto son utilizadas para medir soluciones acuosas. La lectura del menisco debe
hacerse a la temperatura de calibración 20 a 26°C en posición vertical y frente a los
ojos. En soluciones transparentes se lee la parte inferior del menisco en soluciones
coloreada se lee la parte superior. Cuando presentan dos anillos en su extremo
significa que debe soplarse la última gota, las que no lo tienen debe dispensarse el
liquido en posición vertical, la última gota cae al tocar las paredes del recipiente.

 TC utilizado para contener, son llamadas pipetas capilares y son especialmente

utilizadas para volúmenes muy pequeños; cualquier cambio o error al medir o
dispensar podría causar variaciones importantes. Al usar estas pipetas se debe
dispensar el contenido y lavar varias veces en la respectiva solución. Su sistema de
graduación es automático y funcionan con un embolo tipo gatillo. Diseño ergonómico,
las hay para dispensar hasta 49 dispensaciones idénticas, desde 1 µl hasta 5 m; son de
fácil operación con una sola mano, tanto para llenado como para la dispensación
(figura 4)

Figura 4. Tipos de pipetas automáticas

Repetitiva. Multicanal

RECOMENDACIONES PARA SU USO

1. Seleccionar la pipeta que más se acerque al volumen que se va a medir.

2. Verificar la limpieza, ausencia de humedad y rupturas antes de tomar el liquido
3. Con pipetas TD utilizar bombas de caucho, dispensadores mecánicos o eléctricos para
evitar la contaminación con material infeccioso o vapores tóxicos.
4. Importante es secar la parte externa de la punta de la pipeta, con papel absorbente,
utilizando uno diferente para cada muestra, evitando absorber el líquido por la parte
inferior.
5. Dispensar libremente el líquido de la pipeta en posición vertical
6. La pipeta tienes dos topes, el primero define la cantidad a medir y el segundo es usado
para expulsar la última gota de muestra.
7. Cada muestra debe ser trabajada con una punta diferente. Las puntas una vez
utilizadas deben desecharse en un recipiente con hipoclorito de sodio 5.000 p.p.m. por
15 min y luego lavarse.
Las pipetas automáticas requieren ser calibradas por un técnico especializado en el área, pero
se puede realizar la respectiva verificación manual utilizando las siguientes técnicas:
 Por gravimetría
 Por colorimetría.
Pipetas Pasteur de plástico. Existen de diferentes medidas, también sirve para separar los
sueros o plasmas, figura 5.

Figura 5. Pipetas Pasteur de plástico

BAÑO SEROLÓGICO: Equipo utilizado para mantener una temperatura específica que puede
ser entre 25 a 100ºC. Para trabajo en el laboratorio de bioquímica de rutina se mantiene a una
temperatura que generalmente es de 37ºC.

RECOMENDACIONES PARA SU USO

1. Llenar el baño serológico únicamente con agua desmineralizada con unas gotas de
solución bactericida, el nivel del agua no deberá ser inferir de las resistencias, debe
estar por encima de ellas mínimo 2cm. y mantener siempre éste nivel para evitar que
el equipo se queme.
2. Dedicar especial cuidado con derrames de muestras que contamine el agua depositada
y supervisar al aseo y limpieza semanal.
3. Controlar diariamente la temperatura con un termómetro calibrado. Realizar las
correcciones necesarias.
4. Jamás dejarlo encendido sin agua.
5. Para mantener las muestras adecuadamente estables en temperatura, el nivel del
agua deberá estar a la altura de los tubos.

Desecho de residuos.

Las agujas de la jeringa se deben depositar en los guardianes y la jeringa y la torunda en la

caneca roja, la tapa de la aguja y el papel en la bolsa de color gris, siempre y cuando no estén
contaminados con líquidos y fluidos corporales.

4. PRE LABORATORIO

 Realice una búsqueda de las siguiente NORMATIVA y elabore un cuadro de síntesis de

cada una de ellas.

o Documento ISO 15189:2007

o Estándares NCCLS/CLSI.
o NOM 166 SSA1-1997
o NOM ECOL 087-2002.
o Manual de Capacitación. Becton Dickinson.
o OSHA Occupational Health and Safety Management Systems (1.990)
Organización Internacional, enfocada hacia el aseguramiento de la calidad y
seguridad en el área de la salud

5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

 Torniquete
 Guantes
  Gradilla
 Torundas de algodón
 Alcohol isopropílico al 70%
 Pipetas Pasteur
 Viales para separación de muestras

Encontrara en el laboratorio los siguientes equipos

 Centrífuga
 Baño serológico
 Guardianes

6. PROCEDIMIENTO

 Reconocer el equipo necesario para venopunción por sistema abierto - jeringa

 Extraer sangre a un compañero siguiendo el protocolo realizado en la práctica
anterior.
 Centrifugar las muestras como lo indica la guía, tener la precaución de equilibrar la
centrifuga, centrifugar por 5 min a 3000rpm o 2500 por 10min.
 Separar las muestras de suero y/o plasma en tubos limpios, secos y vacíos de 13 x100.
Utilizando las pipetas automáticas o las pipetas Pasteur.
 Marque los tubos y entréguelos a su docente.
 Descarte los residuos y material contaminado, descontamine los tubos con hipoclorito
de sodio y luego lávelos con agua abundante.

7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 ¿Qué significa un tope en la pipeta automática y para qué sirve cada uno?
 ¿Qué temperaturas puede maneja un baño serológico en el laboratorio clínico y para
qué sirve cada una?
 ¿Qué significa equilibrar la centrifuga y porque razón se realiza esta operación?

8. POST LABORATORIO
 Realice un esquema en donde estructure o defina la cascada de la coagulación y
especifique en cuál momento se forma el coágulo y ¿dónde y cómo interviene el
E.D.T.A.?
 Como puede verificar la calibración manualmente de su pipeta automática en el caso
de que se encuentre en su trabajo como Bacterióloga un rural, muy lejos de la cuidad
en donde no se encuentra el técnico que realiza este procedimiento. Realice un
esquema con los procedimientos para la pipeta automática como para la de vidrio.
 De acuerdo con el Manual de Garantía de Calidad en química clínica y hematología del
INAS. Moreno E, Ballesteros V. Moreno A. 2005. ¿Cómo se realiza la limpieza de
material en general del laboratorio y como el material de química clínica? Explique.
 Realice un dibujo de los siguientes equipos y elementos: señale sus partes.
o Centrifuga
o Baño serológico
o Pipetas automáticas
o Pipetas pasteur

9. BIBLIOGRAFÍA
 Devlin, T. Bioquímica. Libro de Texto con aplicaciones clínicas. Editorial Reverté.
España. Vol. 1 y 2.
 Castañeda de Gómez M, León María R, Zambrano F. Manual del programa de garantía
de calidad en química clínica.
 Moreno E, Ballesteros V. Moreno A. Manual de garantía de calidad en química clínica y
hematología del INAS.
 González de Buitrago J.M, Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. Ed. Elsevier, 3ª
ed.
 Almonacid, C.C, Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de
separación. 1º edición. Bogotá, Colombia. Imprenta Nacional.
 PRÁCTICA N° 4

FUNDAMENTOS DE ESPECTOFOTOMETRÍA
MANEJO DE EQUIPOS.

1. INTRODUCCIÓN

Desde hace muchos años se ha utilizado el color como ayuda para reconocer las sustancias
químicas, el reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación permite estudiar la
absorción de sustancias no solamente en la zona del espectro visible, sino también en
ultravioleta e infrarrojo; es así como un gran número de las determinaciones que se realizan
en diferentes áreas de laboratorio, utilizan medidas de energía radiante ya sea absorbida o
reflejada. Debido a esto, es importante que el estudiante conozca y aplique los fundamentos
de las técnicas de espectrofotometría que le permitirán un óptimo desempeño en su vida
profesional.

2. OBJETIVOS

 Aportar elementos para la comprensión del fundamento de los métodos fotométricos

 Reconocer los elementos que conforman un espectrofotómetro

3. MARCO TEÓRICO

3.1 DEFINICIÓN DE TÉRMINOS

 Fotón: Partícula atómica elemental de energía luminosa. Recibe también el nombre de

cuanto o quantum. Cuando el electrón que gira alrededor de un átomo es perturbado
de tal modo que debe reducir su órbita, reduce también su energía y el sobrante es
emitido en forma de fotón o cuanto de luz. En cambio, si la órbita del electrón
aumenta, el átomo absorbe un fotón. Los fotones serían entonces energía irradiada o
absorbida por los átomos en vibración, que se manifiesta como luz.
 Frecuencia: Magnitud que mide el número de oscilaciones (o ciclos) que tienen lugar
en una unidad de tiempo. La frecuencia es un parámetro muy usado en todos aquellos
fenómenos de naturaleza ondulatoria (es decir, basados en ondas), como son la luz, el
sonido y las radiaciones. Una frecuencia elevada indica que la onda es muy energética
y viceversa. Así, por ejemplo, la radiación ultravioleta tiene una frecuencia mayor que
la infrarroja y es más energética.
 Longitud de onda: Parámetro físico que indica el tamaño de una onda. Si se representa
la onda como una serie de crestas regulares (una línea ondulada), la longitud de onda
sería la distancia entre dos crestas consecutivas. Se representa con la letra griega l
(lambda). En la luz, la longitud de onda determina el color de la luz (por ejemplo la
longitud de onda correspondiente al color verde es de 550 nanómetros)
 Radiación: Emisión de energía o partículas que no necesita ser transportada por
ningún fluido, razón por la cual es el medio de propagación de la energía a través del
vacío.
 Radiación electromagnética: Emisión de energía en forma de ondas de naturaleza
electromagnética. Desde el punto de vista corpuscular, la radiación electromagnética
es la emisión de fotones.

3.2 ESPECTROFOTOMETRÍA
3.2.1 Definición
La espectrofotometría se refiere a los métodos cuantitativos de análisis químico, que utilizan la
luz para medir la concentración de las sustancias químicas. Según sea la radiación utilizada, los
métodos espectrofotométricos se clasifican como espectrofotometría de absorción visible
(colorimetría), ultravioleta e infrarroja.

3.2.2 Interacción de la luz con la materia

La luz posee doble naturaleza, corpuscular y ondulatoria. Con base en su carácter ondulatorio,
se comporta como una onda y cumple con las leyes que rigen los movimientos ondulatorios, es
decir, es reflejada, difractada, transmitida, etc. A la vez, con base en su naturaleza corpuscular,
se considera que la luz está conformada por pequeños corpúsculos energéticos denominados
fotones (paquetes individuales de energía), los cuales se mueven en el espacio generando las
ondas y determinando la potencia de una radiación.

Así mismo, la luz está formada por un componente eléctrico y uno magnético, es decir, es
electromagnética y se mueve en el vacío con una velocidad de 300.000 kilómetros por segundo
(por onda).

Cada radiación luminosa está caracterizada por una frecuencia (que no depende del medio en
el cual se transmite una longitud de onda que si depende de él. Existe una relación entre la
energía de la radiación y la longitud de onda en la cual, las longitudes de onda más cortas
tienen mayor energía que las longitudes de onda más largas.

Un rayo de luz puede estar formado por una sola longitud de onda (monocromático) o por
varias de ellas (policromático). Cuando un rayo de luz policromático incide en un elemento
monocromador, se descompone en sus diferentes longitudes de onda. La luz blanca está
formada por un conjunto de radiaciones monocromáticas.

Las técnicas espectrofotométricas se fundamentan en las interacciones de las radiaciones

electromagnéticas sobre la materia.

3.2.3 Espectro electromagnético

El espectro electromagnético está constituido por todas las longitudes de onda descubiertas.
Se ha dividido en varias regiones de la siguiente manera:

 Rayos X: 1-100 nm.

 Ultravioleta: 100-390 nm.
 Visible: 390-700 nm.
 Infrarrojo: 700-100.000 nm.
 Microondas: 100.000-1.000.000 nm.

Para separar la luz se utilizan elementos ópticos denominados monocromadores (rejillas y

prismas de difracción).

3.2.4 Espectro luminoso/ ventana óptica

El ojo humano detecta las radiaciones (longitudes de onda) y el cerebro las registra como
colores. Se denomina espectro de un rayo luminoso al conjunto de radiaciones
monocromáticas que forman ese rayo cuando ya han sido separadas, es decir cuando la luz se
descompone en sus colores individuales. La ventana óptica está conformada por las regiones
del espectro electromagnético donde se tiene la sensación de color. Corresponde al rango
visible (400 - 780 nm). Por encima de los 780 nm se tienen las radiaciones infrarrojas y por
debajo de los 380 nm las ultravioletas (tabla No 1, figura No 1),

nm Color observado
400 Violeta (mezcla de rojo y azul)
440 Azul
470 Verde (mezcla de amarillo y azul)
565 Amarillo
590 Anaranjado (mezcla de amarillo y
rojo)
700 Rojo

Tabla No 1. Colores observados en el espectro visible

Figura No 1. Espectro luminoso

3.2.5 Absorción de la luz

El color de una sustancia se produce debido a que esta absorbe selectivamente algunas
longitudes de onda del espectro, transmitiendo otras que corresponden al color. Ej. Un objeto
que el ojo humano observa de color rojo, absorbe todas las radiaciones del espectro
electromagnético visible, pero no las que corresponden a este color, las cuales son reflejadas.
Las soluciones coloreadas absorben las radiaciones del color complementario al de ellas; así las
soluciones que se ven rojas deben absorber radiaciones del rango verde. (Tabla No 2)

Color de la solución Color absorbido nm

Violeta verde-amarillo 570-580
Azul amarillo 570-600
naranja
Verde naranja
rojo 600-800
violeta 380-450
Amarillo azul 450-470
Naranja azul-verdoso 460-480
Rojo verde 490-590
Tabla No 2. Colores absorbidos en el espectro visible

El grupo atómico responsable de la absorción de una molécula de una sustancia se denomina

cromóforo. La representación gráfica de las absorciones de una sustancia a diferentes
longitudes de onda se denomina espectro de absorción o curva espectral.

Las moléculas pueden absorber la radiación electromagnética y pasar a un estado excitado,

permitiendo la realización de estudios de absorción (colorimetría, espectrometría), ó pueden
reflejarla permitiendo la realización de estudios de dispersión (turbidimetría, nefelometría).

Los espectros emitidos por los átomos de los diferentes elementos son muy distintos y se
extienden más allá de la región visible. Cualquier elemento en una muestra puede descubrirse
examinando el espectro emitido por la misma e identificando los espectros conocidos de los
elementos de que está compuesta.
En las identificaciones biomédicas, los espectros de absorción son mucho más importantes que
los de emisión, además, en los sistemas biológicos existen moléculas análogas que son difíciles
de separar por métodos químicos; una de estos sistemas lo constituyen las hemoproteinas, en
donde cada miembro de este grupo puede identificarse por su espectro de absorción, ya que
cada uno de estos difiere de todos los demás. El grado de absorción de ciertas longitudes de
onda características, permite el cálculo de la cantidad de constituyente presente. Esta
determinación se puede realizar mediante la utilización de diversos instrumentos como son el
espectrómetro, capaz de medir las longitudes de onda en que aparecen diversos aspectos
notables; el fotómetro que puede medir y comparar la intensidad emitida por dos muestras, o
la que pasa a través de ellas y el espectrofotómetro que es a la vez espectrómetro y
fotómetro.

3.2.6 Leyes que rigen la absorción de radiaciones electromagnéticas

1. La absorción de luz por una solución depende la radiación incidente (Po). A mayor
potencia incidente, mayor será la potencia transmitida. (Pt)

2. La relación entre la intensidad de la luz transmitida y el incidente se denomina

transmitancia (T). La transmitancia se expresa en relación a 1 o a 100:

T = Pt/Po ó %T = Pt/Po x 100

Sin embargo, es más frecuente expresarla en términos de absorbancia (A)

Donde A = 2 –log% T

3. Ley de Lambert Beer: La intensidad de luz absorbida por una sustancia en disolución
cuando un haz de luz la atraviesa, es función de la distancia atravesada y de la
concentración de la sustancia

Abs = e · c · l

e = coeficiente de extinción molar (M-1·cm-1). Está relacionado con la probabilidad

que la sustancia sufra una transición espectroscópica con luz de una longitud de onda
dada. Es por tanto diferente para cada longitud de onda.

c = concentración de la sustancia (M)

l =ancho de la cubeta (cm)

La ley de Lambert-Beer permite determinar la concentración de una sustancia a partir

de la Abs

El valor de absorbancia es más útil que el de transmitancia en espectrofotometría, debido a

que la gráfica de la absorbancia versus la concentración es una línea recta, mientras que una
gráfica de transmitancia versus concentración es exponencial; esto significa que la absorbancia
se incrementa con el aumento de la concentración de una solución. La interrelación de
absorbancia y concentración se puede expresar por la ecuación de una línea recta y = mx+b,
donde m es la pendiente de la línea y b es el intercepto en el eje de las y. Si la medida se hace
de tal manera que b=0 (o sea, una solución que no contiene colorante y por lo tanto no
absorbe) y si se sustituye la absorbancia por y, la concentración por x y las variantes por m se
obtiene la fórmula de Lambert-Beer expresada como A = C en donde A es igual a la
absorbancia y C igual a la concentración
3.3 ESPECTROFOTÓMETROS

Son instrumentos que se utilizan para las medidas de absorción de las radiaciones
electromagnéticas.

Figura No 2. Espectrofotómetro
Los principales componentes de un espectrofotómetro de un solo haz son: fuente de energía
radiante, sistema de selección de la longitud de onda, dispositivo para la cubeta de muestra,
detector de energía radiante y dispositivo de lectura de la señal generada por el detector.

Figura No 3. Componentes de un espectrofotómetro

3.3.1 Fuente de energía o lámparas

La función de las lámparas es emitir el rayo de luz policromática que después o antes de pasar
por el monocromador va a hacerse incidir en la muestra. Estas emiten rangos de longitudes de
onda dependiendo de la naturaleza del filamento en las lámparas incandescentes, y del gas en
las de descarga. En la tabla No. 3 se indican algunos tipos de lámparas y sus rangos de
utilización.
FUENTE O LÁMPARA TIPO RANGO(nm) CARACTERÍSTICA
Tungsteno o wolframio I 325-1500 Haz continuo en el rango de
longitudes de onda en el cual
se utiliza.
Hidrógeno o deuterio D 150-390 Continua
Mercurio D 253 -579 Discontinua

I = incandescente D = descarga
Tabla No 3. Lámparas
 3.3.2 Sistema de selección de la longitud de onda

 Filtros de paso: Son los sistemas más sencillos. Están formados por láminas de vidrio o
plástico que dejan pasar de forma selectiva las longitudes de onda deseadas,
absorbiendo el resto.
 Monocromadores: Son las unidades que permiten que los rayos policromáticos
puedan ser separados en rayos monocromáticos. En ellos la energía radiante de la
fuente es dispersada por un prisma o una rejilla de difracción en un espectro, a partir
del cual se aísla la longitud de onda deseada por medio de una rendija adecuada. Un
sistema monocromador consiste básicamente de: Una rendija de entrada que
proporciona una imagen óptica estrecha de la fuente de radiación, un lente colimador
que hace paralela la radiación procedente de la rendija de entrada, una red de
difracción o un prisma para dispersar la radiación incidente, otro lente colimador para
reformar las imágenes de la rendija de entrada sobre la rendija de salida y una rendija
de salida para aislar la banda espectral deseada, bloqueando toda la radiación
dispersada excepto la del intervalo deseado.

Fig. No 4. Monocromador

 Filtros de interferencia: Son sistemas más complejos. Están formados por dos placas
de semitransparentes de metal, generalmente plata, que encierran una capa de un
dieléctrico (CaF2 o MgF2) de espesor determinado y protegidos por láminas delgadas
de vidrio duro. Estos filtros son más monocromáticos que los otros filtros.

3.3.3 Cubetas
Las cubetas son recipientes donde se colocan las soluciones para las medidas de absorbancia.
Pueden ser cuadradas, redondas o rectangulares y se construyen en vidrio, plástico o cuarzo.
Dependiendo del material, la cantidad de la luz absorbida por la cubeta varía
significativamente. En el rango ultravioleta se utilizan celdas de cuarzo; en el visible, celdas de
vidrio, cuarzo o plástico incoloro; en el infrarrojo se utilizan celdas de cloruro de sodio.

Figura No 5. Cubetas
Los instrumentos modernos traen celdas de flujo, es decir celdas a las cuales está acoplada una
unidad de succión que “chupa” la muestra desde un recipiente cualquiera.

3.3.4 Detectores de energía radiante

Los detectores de los espectrofotómetros convierten la energía luminosa que les llega en
energía eléctrica. Los más utilizados son las células de barrera y los fotomultiplicadores.

 Células de barrera: consisten en un soporte de hierro sobre el que se coloca una capa
de un semiconductor como el selenio. Esta capa se recubre de otra transparente, de
un metal como la plata. La superficie con el selenio actúa como electrodo negativo,
mientras que el hierro actúa como electrodo positivo. La luz recogida por la plata llega
al selenio, induciendo una corriente eléctrica que va hasta el soporte de hierro. El flujo
electrónico es directamente proporcional a la intensidad de la luz incidente y puede
medirse en el amperímetro.

 Fotomultiplicadores: son tubos electrónicos que además de detectar la señal

luminosa, la amplifican. Utilizan como cátodos metales sensibles a la luz, capaces de
emitir electrones en proporción directa a la energía luminosa que les llega. En este
sistema los electrones producidos por la placa fotosensible son atraídos hacia otra
placa de la cual salen mayor número de electrones y estos son luego enviados a otra
placa donde se vuelve a repetir el fenómeno y así sucesivamente.

3.3.5 Dispositivos de lectura

La señal eléctrica generada en el detector es llevada hasta dispositivos adecuados que reflejen
su valor.
Los más utilizados son los sistemas de reflexión de aguja y los de lectura digital. En ambos
casos, la señal eléctrica es reflejada en unidades de absorbancia o transmitancia.

4. PRE LABORATORIO
 Defina: precisión, exactitud, sensibilidad y límite de detección.
 Enumere las razones por las cuales se pueden producir desviaciones en la ley de
Lambert-Beer
 Enumere las aplicaciones de la espectrofotometría

5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

 Espectrofotómetro
 Cubetas
 Soluciones de azul de metileno
 Frasco lavador
 Papel milimetrado

6. PROCEDIMIENTO

GUÍA: Utilización del espectrofotómetro:

El docente realizará la demostración del uso de los espectrofotómetros disponibles en el

laboratorio, por favor tome nota al procedimiento el cual es específico para cada equipo.
A continuación se describe un procedimiento general que puede tenerse como base para el
uso de los espectrofotómetros:

a. Conectar el equipo a una fuente de luz y encenderlo al menos 15 min antes de hacer la
medición, comprobar que el aparato da una señal estable de ajuste del cero de
absorbancia.

b. Seleccionar la longitud de onda a la cual se necesita hacer la medición, con el mando

correspondiente.

c. Seleccionar la opción para medir en absorbancia.

d. Tomar una cubeta de medida, procurando no manchar con los dedos las paredes de la
cubeta que se expongan al haz de luz del espectrofotómetro.

e. Vertir en cubetas de lectura un volumen de las soluciones de blanco, patrón y

muestras de tal manera que se ocupe las tres cuartas partes del volumen total de cada
cubeta.

f. Si el equipo tiene un solo compartimiento de lectura, colocar la cubeta de blanco,

verificando que las paredes lisas de la misma queden expuestas a la dirección del haz
de luz del espectrofotómetro y rrealizar el ajuste del cero de absorbancia; (si el equipo
tiene carro de compartimentos colocar las cubetas en el siguiente orden: Blanco,
patrón y muestras teniendo en la misma recomendación del paso del haz de luz)

g. Colocar la cubeta de patrón en el compartimiento y realizar la lectura de medición en

absorbancia y proceder a leer de la misma manera cada una de las cubetas con las
muestras.

7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

8. POST LABORATORIO

Con los datos obtenidos en el procedimiento de la práctica elabore la gráfica del espectro
(Curva espectral - longitud de onda vs. absorbancia) y determine la longitud de onda adecuada
en la que se debe leer la solución trabajada en la clase.

9. BIBLIOGRAFÍA

 Chang R. Química. McGraw Hill Interamericana Editores.

 González de Buitrago J.M, Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. Ed. Elsevier, 3ª
ed.
 Torrenegra, R. Introducción al análisis químico Moderno. Pontificia Universidad
Javeriana. Bogotá, Colombia.
 Almonacid, C.C, Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de
separación. 1º edición. Bogotá, Colombia. Imprenta Nacional.

E:\Espectrofotometría Laboratorio.htm
E:\Espectroscopía 1.htm
E:\Espectrofotometria.htm
E:\Espectro de ondas electromagnéticas - Monografias_com.htm
 PRÁCTICA N° 5
ESPECTROFOTOMETRÍA II

CURVA ESPECTRAL Y CURVA DE CALIBRACIÓN

1. INTRODUCCIÓN

Curva espectral de una sustancia química indica las características de absorción de dicha
sustancia con relación a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva espectral se
presenta como Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de
absorción, o en función de la transmitancia, denominándose el espectro, espectro de
transmisión.

Resulta de la retención de cantidades discretas de energía radiante por la capa de material

interpuesta en la trayectoria de la radiación, aunque la energía absorbida corresponde a una
misma longitud de onda se observa una banda de absorción y no líneas, así la curva del
espectro está constituida por las lecturas que realiza el aparato para reproducir un gráfico en
función de una longitud de onda especifica, con el fin de apreciar los trazos que capta el
espectrofotómetro. Así la determinación cuantitativa de una especie, con base en
observaciones que dependan de la cantidad de radiación absorbida dependen de la
comparación entre el valor de la absorción de un patrón de referencia y la absorción de la
muestra.

Los espectrofotómetros deben permitir efectuar la comparación entre la señal obtenida por
una mezcla que no contiene el analito y otra que si lo tiene para poder tener la señal de esa
diferencia. Así el registro de la variación del coeficiente de absortividad molar, de la
absorbancia A, o de la transmitancia T, en función de la longitud de onda origina el "espectro"
o curva espectral de una sustancia química que indica las características de absorción de dicha
sustancia con relación a la longitud de onda. Generalmente la curva espectral se presenta
como “Absorbancia vs longitud de onda” y el espectro se denomina espectro de absorción, o
en función de la transmitancia, denominándose espectro de transmisión.

2. OBJETIVOS

 Adquirir experiencia en el uso del espectrofotómetro

 Identificar la longitud de onda OPTIMA para lectura de una solución.
 Identificar la importancia de las curvas de calibración

3. MARCO TEÓRICO
CURVA ESPECTRAL

La curva espectral permite determinar la longitud de onda en la cual la solución presenta la

máxima absorción de luz. Por lo tanto, el trazado espectral de una solución da información
sobre el color y la naturaleza química de la sustancia que la compone.

El docente entregará a cada grupo de trabajo una solución coloreada la cual deberá ser leída
por los estudiantes en el rango de longitud de onda correspondiente al color, la curva se
trazará con los datos obtenidos de las lecturas al cambiar la longitud de onda en 5 nm. en el
rango correspondiente a la muestra.
CURVA DE CALIBRACIÓN PARA CUANTIFICACION DE PROTEINAS TOTALES POR MÉTODO DE
BIURET

Las proteínas son las macromoléculas más abundantes en las células. Son la forma en la que la
información genética se expresa. A pesar de que las proteínas son diferentes en las distintas
especies, todas están constituidas por los mismos 20 aminoácidos sólo que en diferente orden.
Las proteínas varían entre ellas porque tienen una secuencia de aminoácidos diferente. La
estructura primaria de las proteínas es la que se debe a los enlaces covalentes de la molécula.
Esta definición comprende la secuencia de aminoácidos y puentes disulfuro. Todas las
propiedades de las proteínas están determinadas por la estructura primaria. Las cadenas
peptídicas forman arreglos unidos por puentes de hidrógenos. Los átomos de oxígeno
carbonílicos forman puentes de hidrógeno con los hidrógenos de la amida. Puede presentarse
un arreglo ordenado de puentes de hidrógeno; la hélice alfa y la hoja plegada. Algunas partes
de la proteína pueden estar plegadas y otras pueden estar en hélice o incluso pueden estar al
azar. La estructura terciaria es una conformación tridimensional. La estructura cuaternaria es
la asociación de dos o más cadenas completas (Wade 1993).
Hay muchas clases de proteínas de acuerdo a la función que cumplen. Muchas proteínas
cumplen con una función catalítica a estas se les conoce como enzimas. También hay
proteínas en el plasma que se unen y transportan diferentes sustancias, por ejemplo la
hemoglobina que se une al oxígeno y lo transporta en el torrente sanguíneo. Existen otras
proteínas que el organismo usa para almacenamiento de nutrientes. Hay otras proteínas que
tienen la capacidad de contraerse, cambiarse de forma y moverse. Algunas proteínas
intervienen en la defensa de los organismos como las inmunoglobulinas. Algunas proteínas
ayudan a regular la actividad fisiológica y celular

Las proteínas se pueden clasificar por su forma. Las proteínas globulares son cadenas
polipeptídicas dobladas en forma compacta. Éstas son solubles en agua y se difunden fácil.
Las proteínas fibrosas son insolubles, largas con cadenas polipeptídicas que se extienden y no
se doblan. Hay una clase de proteínas filamentosas que participan en los eventos contráctiles.
Muchas proteínas contienen solamente aminoácidos y no contienen otros grupos químicos.
Estas son las proteínas simples. Sin embargo, hay otros tipos de proteínas que contienen otro
componente químico además de los aminoácidos. A estas proteínas se les conoce como
conjugadas. La parte que no es aminoácido se llama el grupo prostético

El método de Biuret es uno de los métodos más utilizados para la determinación de proteínas
en el cual la intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la
proteína.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS: REACCIÓN DEL BIURET

 Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio

alcalino se unen con los electrones no saturados de los
átomos de nitrógeno y oxígeno de los enlaces de todas las
proteínas.
 La cantidad de color producido es proporcional a la
concentración de proteínas y es medida
espectrofotométricamente a 550 nm (Wharton 1972).
Los
péptidos y proteínas producen una reacción coloreada muy usada para la valoración de los
mismos, llamada reacción del Biuret. Las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con
los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta.

Se necesitan 2 ó más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado. Esta prueba
sirve para la identificación de tripéptidos en adelante (Wharton 1972).

Este método es generalmente aplicable porque el número de enlaces peptídicos por unidad de
peso para todas las proteínas es casi el mismo. Sin embargo, el método es un poco insensible
siendo el límite menor de 0.25mg de proteínas. Los buffers tris así como otras sustancias
encontradas en extractos de tejidos crudos interfieren con esta prueba (Wharton 1972).

Las sustancias que dan el color violeta tienen dos grupos –CONH2 unidos directamente o por
un carbono o nitrógeno. Las estructuras peptídicas se encuentran en proteínas y sus
derivados contienen enlaces peptídicos Los compuestos que contienen –CH2NH2, -C(NH)NH2 Y
–CSNH2 en lugar de los grupos –CONHH2, también dan positivo para la prueba de Buiret
(Stawnton, 1967).

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de

dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco.

H2N CO NH2 Q
H2N CO NH CO NH2
H2N CO NH2
Urea Biuret

Violeta-púrpura

O C C O
NH HN
RC H H CR
Cu2+
O C C O
NH HN
RC H H CR

Complejo proteína-Cu(II)

4. PRE LABORATORIO

Escriba las diferencias entre suero y plasma.

Investigue: cuando se trabaja en espectrofotometría a que se refiere:

 Sensibilidad
 Límite de detección (LOD)
 Límite de cuantificación (LOQ)
 Rango
5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

 Equipo completo para toma de muestras. Obtener su muestra problema N° 1

 Suero entregado por la docente. Muestra problema N° 2
 Patrón de Albúmina (8 g/dl)
 Reactivo Biuret – o estuche para determinación de Proteínas totales
 Pipetas automáticas y tubos de ensayo
 Papel milimetrado
 Espectrofotómetro
 Puntas
 Gradilla

6. PROCEDIMIENTO

CURVA ESPECTRAL:

 Cada grupo de trabajo debe tomar la muestra entregada por el docente y realizar
mediciones en absorbancia de la solución problema, en el espectrofotómetro a partir
de 400 nm hasta 700 nm tomando la lectura cada 5 nm.
 Diagramar las lecturas en papel milimetrado así Eje x longitud de onda y eje y
absorbancia encontrada.
 Con base en la curva diagramada, determinar la longitud de onda óptima para la
lectura de la solución problema entregada.

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS - MÉTODO DE BIURET

a. Se colocan en una gradilla inicialmente 5 tubos de ensayo que deben estar limpios y
secos. Se numeran del 1 al 5 con un marcador permanente al agua, los cuales serán
para montar la curva de calibración, además disponga de 4 tubos más para el montaje
de las pruebas de proteínas de cada uno de los miembros del grupo de trabajo.

b. Complete el siguiente cuadro para la realización de los cálculos para la preparación de

los patrones partiendo de un patrón de Albúmina provisto par el Laboratorio Central
(acorde a la disponibilidad - información que entregará el docente previamente):
 Patrón de
Tubo Albúmina H2O Concentración
(nº) 8 o 7 g/dl (microlitros)
(microlitros)
1 6g/dl
2 4g/dl
3 3g/dl
4 2g/dl
5 1g/dl

c. Cada una de las mesas de trabajo preparará uno de los patrones según la distribución
del docente.
d. Una vez preparados los patrones cada mesa de trabajo montará una curva de
calibración siguiendo las instrucciones del inserto de la casa comercial para
Determinación de proteínas por Biuret, teniendo en cuenta de montar además las
muestras de plasma o suero de cada uno de los integrantes del grupo de trabajo.

e. Medir en el espectrofotómetro siguiendo las normas adecuadas para el uso del

equipo.

f. Una vez realizadas las lecturas, lavar y limpiar las celdas.

Con los datos de absorbancia de los patrones realizar la gráfica de la curva de
calibración en papel milimetrado teniendo en cuenta que en el eje X va la
Concentración y en el eje Y la absorbancia.
7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 ¿Cómo se elige la longitud de onda óptima de trabajo para una solución?

 ¿Qué es una curva espectral?
 Con base en la curva de calibración (Concentración – eje X, Absorbancia eje Y,); ubique
los valores de absorbancia de las muestras en la curva y halle la concentración de
 proteínas totales de cada muestra y entregue al docente la curva realizada con los
valores de proteínas totales de las muestras trabajadas.

8. POST LABORATORIO

En espectrofotometría:
1. ¿Qué es la Linealidad de un método?

Absorbancia (A)
Rango de linealidad

A

C

Concentración (C)

2. Como se relaciona una Recta de calibrado Absorbancia vs. Concentración de analito.

3. Cuáles pueden ser los errores de una calibración inadecuada

4. ¿Qué es el Límite de Detección (LOD)?

5. ¿Qué es el Límite de Cuantificación (LOQ)?

6. ¿Qué es el Rango?

7. ¿Qué protocolo habría que utilizar para determinar la concentración de proteína de una
muestra desconocida?

9. BIBLIOGRAFÍA.

 http://www.geocities.com/laboratorio_de_quimica_2000/index.htm
 Angel M, Gilberto. Interpretación Clínica del Laboratorio. Ed. Médica Panamericana.
 Barham D, Trinder P. Anayst
 Fossati P, Principel, Berti G. Clin Chem.
 Angel M, Gilberto. Diccionario del Laboratorio Clínico. Ed. Médica Panamericana.
 González de Buitrago J.M, Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. Ed. Elsevier, 3ª
ed.
 Almonacid, C.C, Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de
separación. 1º edición. Bogotá, Colombia. Imprenta Nacional.
 PRÁCTICA N° 6

TÉCNICA DE PUNTO FINAL o COLORIMÉTRICA

1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas de punto final son las herramientas básicas para determinar y conocer “Procesos
fisicoquímicos y bioquímicos de los organismos vivos”, dichas pruebas químicas que sirven de
ayuda diagnóstica al médico específicamente para definir un problema metabólico, un daño
metabólico o también para definir otras patologías.

2. OBJETIVOS
1. Conocer los principios básicos de algunos de los métodos para la medición de
sustancias.
2. Identificar los posibles problemas o errores que pueden presentarse en las
diferentes etapas del proceso analítico

3. MARCO TEÓRICO

FASES DEL PROCESO ANALÍTICO

Cuando el médico solicita un examen de laboratorio, se pone de manifiesto una serie de pasos
que llevan a la obtención de un informe analítico. Las fases que se requieren para realización
de una prueba analítica son: pre analítica o pre instrumental, analítica o instrumental y Post
analítica y post instrumental.

1. FASE PRE ANALÍTICA O PRE INSTRUMENTAL

Corresponde a todos los pasos que anteceden a la manipulación instrumental de una muestra
biológica, ellos son: preparación del paciente, recogida o toma de la muestra, conservación de
la muestra.

2. FASE ANALÍTICA O INSTRUMENTAL

Corresponde a la realización misma del ensayo o prueba y el cálculo de los resultados; para su
realización, se realizan las mediciones del reactivo, los patrones o estándares, los calibradores
y las muestras, se tienen en cuenta el tiempo de incubación, la lectura de la prueba en el
equipo y la realización de los cálculos pertinentes para generar el resultado final.

3. FASE POST ANALÍTICA O POST INSTRUMENTAL

Esta fase corresponde al informe del resultado; para que haya una utilidad clínica, éste
resultado debe reportarse con prontitud y precisión, por lo cual debe ser claro y presentar los
valores de referencia de la prueba reportada.

SUSTANCIAS UTILIZADAS EN LA PRÁCTICA BIOQUÍMICA:

SUERO CONTROL

Son mezclas o pool de sueros de origen bovino, porcino, equino o humano en los que se han
determinado las concentraciones de varios analitos; el propósito de este suero es determinar
el grado de Precisión y Exactitud con la que se trabaja en el laboratorio. La medición de los
controles se debe hacer a diario y se realiza el registro de los datos, al cabo de 30 días se
procede a realizar el tratamiento estadístico establecido en el programa de Control de calidad
del laboratorio lo cual permite establecer los valores de referencia propios de la población que
se está trabajando, ya que los valores que aparecen en los insertos de las casas comerciales
fabricantes de estos sueros no siempre coinciden con los valores de la población en todos los
sitios geográficos.

ESTÁNDAR O PATRÓN
Es una solución que tiene un analito de concentración conocida que es usado como referencia
para determinar la cantidad de éste analito en la muestra que a analizar.

Para hallar la concentración del analito en la muestra se calcula el valor de una constante o
FACTOR que permite realizar el cálculo y se obtiene con los valores de concentración del
patrón y el valor de su lectura en absorbancia y la aplicación de la siguiente fórmula:

Concentración del Patrón

FACTOR = ________________________
Absorbancia del Patrón

El valor del factor obtenido se introduce en el equipo (acorde a necesidad y tipo de equipo); si
la técnica es manual, el factor se multiplica por cada las absorbancias de muestras y
calibradores o controles.

Para hallar la concentración del analito en muestras y controles directamente se aplica la

siguiente fórmula:

Abs. de la muestra
CONCENTRACIÓN DE LA = ____________________ X Concentración del
MUESTRA Y/O CONTROL Abs. del Patrón Patrón

CONTROL O CALIBRADOR
Es una solución que contiene varios analitos de concentración conocida y que se utiliza para
calibrar los equipos y sirve como referencia para varias pruebas, se puede conseguir en el
comercio como Patológico y Normal.

4. PRE LABORATORIO
 De acuerdo con el inserto de la casa comercial que sea adjudicado ¿cuál es la
reacción que permite la identificación del analito analizado?
 ¿Qué es una técnica enzimática colorimétrica?
 ¿Cuáles analitos se cuantifican por técnicas de punto final?

5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPO

 Uniforme completo y normas de bioseguridad

 Equipo para toma de muestra de sangre
 Tubos de vidrio 10 x 75 secos y limpios
 Frasco boca ancha
 Gadilla
 Pipetas de vidrio
 Materiales de escritorio. Calculadora, lápiz, esfero, marcador de vidrio.
 Papel absorbente.
6. PROCEDIMIENTO
 PRÁCTICA TÉCNICA COLORIMÉTRICA.

El estudiante debe realizar la lectura del inserto de la prueba a realizar, provisto por el
laboratorio Central y hacer la interpretación de la prueba necesaria para montar la técnica.

El procedimiento consta de tres partes:

PRIMERA PARTE - Toma de una muestra.

Los estudiantes deben obtener las muestras de sangre en ayunas y realizar la separación de los
sueros acorde al procedimiento aprendido en la práctica de toma de muestra venosa.

Durante el procedimiento, los estudiantes deberán identificar posibles errores en la fase pre
analítica, se registrarán y discutirán en grupo para tener en cuenta en el resultado de la
prueba.

SEGUNDA PARTE - Fase instrumental

El grupo de estudiantes por mesa de trabajo deben realizar el montaje de la técnica acorde a la
descripción del inserto provisto por el laboratorio Central (Glicemia, colesterol Total)

TERCERA PARTE

Realice el cálculo y elabore un informe del valor de las muestras obtenidas en el laboratorio
para ser entregado al paciente.

El informe deberá tener los siguientes datos:

1. Logo del laboratorio y nombre del mismo

2. Datos de identificación del paciente
3. Fecha de realización del examen
4. Prueba realizada y valor obtenido en el análisis
5. Valor de referencia o variabilidad biológica del analito
6. Rango del control interno de la prueba (Valor establecido en el inserto de Control
normal)
7. Firma del responsable del análisis

7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Anotar todas las posibles fallas encontradas durante el desarrollo de las tres
fases del proceso.
 Entregar el informe realizado del analito obtenido.
 Cómo se reconstituye un suero control que se encuentra liofilizado?

8. POS LABORATORIO
 Defina que es un control de calidad interno.
 De acuerdo a la fotocopia del CONTROL normal o patológico cual es la
variabilidad o rango de la glicemia?.
 Situación Problémica:
Los Bacteriólogos están en un Laboratorio Clínico particular y van a tomar a dos pacientes las
siguientes pruebas de Laboratorio: Acido úrico, colesterol total, triglicéridos, glicemia basal y
un uroanálisis; redacte las instrucciones que usted le daría a los pacientes para la toma de
estos exámenes

Ejercicio de diluciones para recordar...

Para el desarrollo de la práctica de laboratorio es necesario preparar Hipoclorito de Na en una

concentración de 5.000 ppm a partir del blanqueador doméstico de concentración de 14%.
Realice los cálculos para preparar 1300 mL.

Para determinar la creatinuria es necesario hacer una dilución 1/20 de la muestra de orina;
realice los cálculos para preparar 10 mL la dilución para la realizar de la técnica.

9. BIBLIOGRAFÍA

 Moreno, E; Noy, Moreno, A. L. Manual de garantía de calidad en Química clínica y

Hematología. Bogotá, D.C.: Instituto Nacional de Salud
 Rodríguez, J. Argote E, Rodríguez O. 2001. Temas de seguridad biológica. Editorial Félix
Varela, Ciudad de la Habana, Cuba.
 González de Buitrago J.M, Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. Ed. Elsevier, 3ª
ed.
 ISS, Cámara de la Industria farmacéutica. El ABC de la seguridad en el laboratorio.
Edición Merck Colombia S.A.
 Insertos de casas comerciales de puebas disponibles en laboratorio central
 Almonacid, C.C, Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de
separación. 1º edición. Bogotá, Colombia. Imprenta Nacional.
 PRÁCTICA N° 7

TÉCNICA CINÉTICA

1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas cinéticas son las herramientas básicas para determinar y conocer “Procesos
fisicoquímicos y bioquímicos de los organismos vivos”, éstas pruebas químicas que sirven
como ayuda diagnóstica al clínico para definir diferentes patologías y alternaciones
metabólicas.

2. OBJETIVOS
 Conocer los principios básicos de las técnicas cinéticas en la medición de
diferentes analitos.
 Identificar las posibles dificultades que pueden presentarse en la realización
de una prueba cinética enzimática.

3. MARCO TEÓRICO

PRUEBA CINÉTICA ENZIMÁTICA

La cinética enzimática es una prueba sensible que requiere un manejo cuidadoso, ya que tiene
varios factores determinantes como la temperatura (se debe realizar de preferencia en una
celda termo estabilizada a 37°C, sin embargo, las casas comerciales presentan la probabilidad
de realizarlas a 25°C y 30°C), el tiempo, el pH, la longitud de onda de lectura (Ultra violeta) y el
tipo de equipo que se utilice en el proceso

CARACTERÍSTICAS DE LAS TÉCNICAS CINÉTICAS

Las técnicas cinéticas son pruebas de alta sensibilidad en las que se busca medir la actividad de
una enzima, requieren un manejo cuidadoso, están sujetas a la temperatura de reacción por lo
que se pueden realizar a 25°C, 30°C y 37°C garantizando que la reacción se realice en una
temperatura constante por lo que se recomienda la utilización de celdas termo estabilizadas a
la temperatura que se elija, la reacción está mediada por la oxidación o la reducción de
cofactores que participen en la reacción, el volumen de muestra en la reacción es mínima por
lo que es importante que la medición sea exacta, el tiempo de reacción es mínimo por lo que
es importante tener destreza en el manejo de la prueba, el equipo de lectura debe garantizar
la longitud de onda en el rango U.V. (334 nm, 340 nm o 365 nm), la realización del cálculo
(determinación de Delta Extinción o Delta Absorbancia), elección del Factor (depende de la
longitud de onda de lectura y temperatura de reacción).

Las técnicas cinéticas pueden ser de dos tipos:

 Continuas: En éstas, la reacción medida corresponde a la oxidación (curva

descendente) o reducción (curva ascendente) del cofactor en frecuencias de
tiempo igual. Se hacen más de dos puntos de medición.

 Discontinuas: Se realiza una medición al principio y la otra al final de la reacción,

se determina la determinación de Delta Extinción o Delta Absorbancia y se
multiplica por el factor de la prueba, es llamada también técnica de dos puntos.
En el siguiente cuadro es posible observar algunas diferencias básicas entre las técnicas
cinéticas y las de punto final:

Técnicas de punto final Técnicas cinéticas

Miden reacciones químicas y enzimáticas que Miden actividad de una enzima a un pH, y
se realizan en un tiempo y temperatura temperatura definida en intervalos de tiempo igual.
definida
Se lee en λ desde 390 a 700 nm (rango visible) Se lee en λ de 334, 340 y 365 nm (rango U.V.)
Se leen formación de COLOR que ser presenta Se lee cambio de absorbancia (ascendente o
por la reacción con cromógenos descendente) que se presenta por la oxidación o la
reducción de un cofactor
Hay una única lectura al final de la reacción Hay varias mediciones en frecuencia de tiempo igual
Se lee contra blanco de reactivo El blanco que se utiliza es celda de aire

Las reacciones presentan variación en el color Los reacciones no presentan variación de color
La temperatura de reacción puede ser La temperatura de reacción es de 25°C, 30°C y 37°C
temperatura ambiente o de 37°C
4. PRE LABORATORIO

 De acuerdo con el inserto de la casa comercial que sea adjudicado por el

Laboratorio Central, ¿Cual es la reacción que se lleva acabo al valorar la
actividad enzimática por el método cinético?
 ¿Qué es una técnica cinética enzimática por oxidación?
 ¿Qué es una técnica enzimática cinética por reducción?
 ¿Cómo se realiza el cálculo para determinar la actividad enzimática en una
técnica cinética? ¿Cómo se elige el factor a utilizar en una técnica cinética?

5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

Cada estudiante deberá llevar al laboratorio los siguientes materiales de trabajo:

 Uniforme completo y normas de bioseguridad

 Equipo para toma de muestra de sangre
 Tubos de vidrio 10 x 75 secos y limpios
 Frasco boca ancha
 Gradilla
 Pipetas de vidrio
 Materiales de escritorio. Calculadora, lápiz, esfero, marcador de vidrio.
 Papel absorbente

6. PROCEDIMIENTO

El estudiante debe realizar la lectura del inserto de la prueba a realizar, provisto por el
laboratorio Central y hacer la interpretación de la prueba necesaria para montar la técnica.
El procedimiento consta de tres partes:

PRIMERA PARTE - Solicitar al docente la muestra problema. (Patológica)

SEGUNDA PARTE - Fase instrumental

 El grupo de estudiantes por mesa de trabajo deben realizar el montaje de la técnica acorde a la
descripción del inserto provisto por el laboratorio Central (Glicemia, colesterol Total)

TERCERA PARTE

Realice el cálculo y elabore un informe de la actividad enzimática de las muestras obtenidas en

el laboratorio para ser entregado al paciente.

El informe deberá tener los siguientes datos:

1. Logo del laboratorio y nombre del mismo

2. Datos de identificación del paciente
3. Fecha de realización del examen
4. Prueba realizada y valor obtenido en el análisis
5. Valor de referencia o variabilidad biológica del analito
6. Rango del control interno de la prueba (Valor establecido en el inserto de Control
normal)
7. Firma del responsable del análisis

7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Anotar todas las posibles equivocaciones llevadas a cabo en las tres fases del proceso de
muestras
 Entregar el informe realizado de la actividad enzimática de la enzima que se haya
adjudicado.

8. POS LABORATORIO

Describa ¿Qué es control de calidad externo?

9. BIBLIOGRAFÍA

 Rodríguez, J. Argote E, Rodríguez O. 2001. Temas de seguridad biológica. Editorial Félix Varela,
Ciudad de la Habana, Cuba.
 ISS, Cámara de la Industria farmacéutica. El ABC de la seguridad en el laboratorio. Edición
Merck Colombia S.A.
 González de Buitrago J.M, Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. Ed. Elsevier, 3ª ed.
 Insertos de casas comerciales de puebas disponibles en laboratorio central
 Almonacid, C.C, Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de separación. 1º
edición. Bogotá, Colombia. Imprenta Nacional.
 PRACTICA N° 8

CROMATOGRAFÍA DE CARBOHIDRATOS EN ORINA

1. INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos son derivados aldehídicos o cetónicos de los alcoholes polihídricos, están
ampliamente distribuidos en vegetales y animales, en los cuales tienen participación
estructural, de reserva y metabólica.
El monosacárido glucosa es una de las biomoléculas más importantes en el organismo animal
se obtiene por la digestión de otros carbohidratos, se absorbe en el epitelio intestinal, viaja por
el torrente sanguíneo vía porta y es en el hígado en donde a partir de glucosa se pueden
formar otros carbohidratos que desempeñan funciones específicas; por ejemplo, el glucógeno
para almacenamiento, ribosa de los ácidos nucléicos, galactosa en la lactosa de la leche, en los
glucolípidos, glucoproteínas, mucoproteínas y proteoglicanos.
La literatura científica reporta numerosas enfermedades que tienen relación con la inadecuada
digestión ya sea extracelular o intracelular, absorción y metabolismo de los carbohidratos; tal
es el caso de la diabetes mellitus, galactosemia, intolerancia a la lactosa, disacaridurias,
enfermedades del almacenamiento del glucógeno (glucogenosis) y mucopolisacaridosis entre
otras.
Muchas de estas anormalidades se detectan por medio del análisis clínico de la orina pues los
carbohidratos causantes de las patologías mencionadas son excretados en cantidades
anormalmente altas.
Una técnica utilizada para determinar la presencia de carbohidratos en la orina es la
cromatografía en capa fina, constituyéndose en una herramienta económica y de fácil
ejecución para el diagnóstico de enfermedades asociadas con la excreción anormal de
carbohidratos.

1. OBJETIVOS

- Observar los carbohidratos presentes en una muestra de orina desconocida a través de

una técnica de separación de mezclas: cromatografía en capa fina.
- Relacionar la presencia de algunos carbohidratos en una muestra de orina con
alteraciones patológicas de su metabolismo.

2. MARCO TEORICO

3.1 Significado clínico de Carbohidratos en orina

- La lactosa: o disacárido de la leche, existe de manera natural solamente en esta secreción.

Durante la infancia, la mayor parte de los seres humanos es capaz de digerir la lactosa, ya que
solo se requiere la presencia de una enzima intestinal que es la -D-galactosidasa o lactasa
para obtener galactosa y glucosa; sin embargo grupos numerosos de adultos de algunas
poblaciones presentan intolerancia a la lactosa por no poseer la enzima lactasa.
Cuando la lactosa no es digerida, produce en el colon CO2, H2 y ácidos orgánicos irritantes
debido a la fermentación bacteriana. Los síntomas comprenden distensión abdominal, dolor,
diarrea acuosa y náuseas.

- La fructosa: es un componente importante de la dieta ya que con la glucosa forma el

disacárido sacarosa (azúcar de cocina). Su metabolismo es esencialmente hepático iniciando
con una fructoquinasa específica que la convierte en fructosa-1-fosfato y enseguida otros
productos metabólicos que prosiguen el camino catabólico glicolítico u otras vías alternativas,
como la gluconeogénica.
El déficit hereditario de la fructoquinasa específica conduce a la situación patológica conocida
como fructosuria esencial y el de la aldolasa 2 hepática a la más grave condición de
intolerancia a la fructosa, que conlleva a la acumulación intracelular de fructosa-1-fosfato,
provocando alteraciones del metabolismo de los glúcidos.
- La galactosa: procedente de la lactosa, se transforma en el hepatocito, en galactosa-1-
fosfato por una galactoquinasa específica. Entre las patologías relacionadas, la más grave
es la galactosemia congénita, por deficiencia de la enzima galactosa-1-fosfato
uridiltransferasa. El sistema nervioso del neonato se degenera.

- La glucosa: realizado el proceso de digestión en el interior del tubo digestivo, los

monosacáridos (glucosa casi en exclusiva) son los que se absorben a través del intestino, y por
vía sanguínea pueden ser transportados al músculo e hígado, donde se almacenan en forma de
glucógeno mediante una serie de reacciones denominadas glucogénesis, en las que se
consume energía. También pueden ser transportados hasta las células que necesitan energía
en ese momento, penetrando en su interior: aquí tras un proceso laborioso, conocido como
glucolisis que puede tener lugar en condiciones aerobias o anaerobias, la célula consigue
energía para sus procesos metabólicos.

De esta forma se mantiene los niveles sanguíneos de glucosa que son necesarios para las
células cerebrales, que no tienen posibilidad de reserva y están a merced de la glucosa
circulante. La utilización de glucosa aumenta considerablemente por efectos de la insulina, ya
que esta facilita la entrada de glucosa a las células.

Normalmente solo se excretan mínimas cantidades de glucosa (hasta 100 mg en 24 horas). La

glucosa pasa libremente al filtrado glomerular en donde alcanza la misma concentración que
en la sangre, pero en condiciones fisiológicas, es reabsorbida por completo por el epitelio
tubular. En la práctica tiende a aparecer glucosa en orina cuando el azúcar sanguíneo
sobrepasa los 180 mg/dl; este valor se conoce como umbral renal para la glucosa. En algunas
personas este umbral es mucho más bajo y se encuentra glucosa en la orina cuando la
concentración sanguínea está por debajo del valor umbral promedio. De lo dicho
anteriormente, podemos deducir que si la tasa de filtración o de riego sanguíneo renal
disminuye, puede no presentarse glucosuria, aunque existan en la sangre altas
concentraciones de glucosa. Esta es una de las razones principales por las cuales el umbral
renal parece aumentar con la edad y puede no presentarse glucosuria en el shock aunque la
glucosa sanguínea esté muy alta.

a. Cromatografía:

Es una técnica que separa compuestos con características similares por migración diferencial
durante su paso a través de un medio poroso. Los compuestos son separados como resultado
de su afinidad diferencial por una fase estacionaria (sólido ó líquido) o por una fase móvil (gas
ó líquido).
Algunas propiedades de estas dos fases determinan que los compuestos interactúen con estas
fases: adsorción, intercambio iónico, solubilidad relativa en fase estacionaria vs fase móvil, etc.
Existen diferentes procedimientos cromatográficos que hacen uso de estas propiedades.

Adsorción
Es la retención de un compuesto químico sobre la superficie de la fase estacionaria, en la cual
interactúa por medio de unos sitios químicamente activados que son los encargados de
retener las sustancias según su naturaleza química y afinidad. La adsorción depende de la
naturaleza de la fase estacionaria, fase móvil y los compuestos de la mezcla, así como también
de la temperatura y la concentración de esta.

Absorción
Es la retención de los compuestos sobre la fase estacionaria, debido únicamente a la
formación de enlaces químicos.

i. Cromatografía de capa fina (CCF)

A pesar de ser una técnica que no permite procesar grandes cantidades de muestra
simultáneamente, es útil como prueba confirmatoria en la identificación de sustancias
desconocidas en muestras.
- Un ejemplo de ella es la cromatografía de adsorción en el que el adsorbente es silica. Debido
a que la muestra interactúa un tanto con la silica, esta no migra tan rápido como el frente de
solvente.
LA CCF separa moléculas sobre la base de cómo ellas pueden adsorberse a la silica.

- La composición del solvente toma ventajas en CCF. Este tiene dos funciones:
- Transporta la muestra a través del lecho cromatográfico.
- Compite con la muestra por espacio en la capa adsorbida de moléculas.
La elección del solvente depende de cómo funcionan:
- Si el solvente es muy polar, este puede prevenir la adsorción de la muestra a la silica.
La muestra puede viajar rápidamente a través del lecho cromatográfico.
- Con un solvente menos polar, la muestra gasta algún tiempo en adsorberse a la silica y
se mueve más lentamente que el propio solvente.
El objeto es elegir un solvente el cual su composición sea soluble pero que marque diferencias
con los compuestos de composición química similar.

- Determinación de Rf:
La distancia tomada por cada compuesto desde el origen o línea base, relativa al frente de
solvente se define como el Rf en donde:

Rf = Distancia de migración del compuesto desde el origen

Distancia de migración del solvente desde el origen

Cada compuesto tiene un valor particular de Rf cuando se mide en condiciones específicas, tal
como solvente, temperatura, si es cromatografía ascendente o descendente, y el adsorbente
usado. Por tanto, es adecuado correr un control positivo, dado que tantas variables pueden
dar resultados inconsistentes.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Fue desarrollada a mediados de los años setenta. Esta técnica cromatográfica permite la
separación, identificación, purificación y cuantificación de los componentes de una muestra,
permitiendo su análisis preciso y exacto. Existen dos métodos universalmente utilizados de
HPLC: HPLC en fase normal y HPLC en fase reversa. La diferencia fundamental entre las dos
técnicas es que en la primera (fase normal), la fase estacionaria es más polar que la fase móvil,
mientras que en fase reversa la fase móvil es más polar que la estacionaria, utilizándose en
esta última, solventes de considerable polaridad, como agua, metanol y acetonitrilo. La más
utilizada es la técnica en fase reversa, en donde la separación cromatográfica se debe a
interacciones hidrofóbicas (no polares o poco polares) entre los compuestos químicos de la
mezcla y la fase estacionaria. La afinidad de las sustancias por la fase estacionaria o por la fase
móvil, determina la retención gradual sobre el soporte sólido, de tal manera que al pasar la
mezcla a través de la fase estacionaria (empacada en una columna arrastrada por la fase móvil)
produce la separación; las primeras fracciones que salen de la columna serán las más afines
por el solvente, es decir las más polares, y luego saldrán las menos polares, afines a la fase
estacionaria.

4. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales:
Láminas de silica gel (Fase estacionaria) 10X10cm
Tubos de centrífuga (2)
Pipetas de vidrio (0.1, 1 y 2ml) (3)
Tubos de ensayo (4) gradilla
Vaso de precipitado 100ml (1)
Horno
Centrífuga
Cámara cromatográfica
Aspersor
Capilares
Pipetas 0.5 l
Bandeja de aluminio
Espátula

Reactivos:
 Soluciones stock: preparar 5 ml de cada uno de los siguientes patrones.

Solución de lactosa 1.5 mg/ml en HCl, 0.01N

Solución de glucosa 1.5 mg/ml en HCl, 0.01N
Solución de galactosa 1.5 mg/ml en HCl, 0.01N
Solución de fructosa 1.5mg/ml en HCl 0.01 N
Solución de xilosa 1.5 mg/ml en HCl, 0.01 N

 Patrón de carbohidratos: preparados a partir de las anteriores soluciones stock de

carbohidratos de concentración 1mg/ml, en HCl, 0.01N en volúmenes iguales. (mezclar 100
l de cada solución stock)

 Solventes (Fase móvil)

-Butanol Acido acético: Eter Agua destilada
Proporción (en ml) 9: 6: 3: 1:

 Reveladores

- Horno eléctrioco para secado por calor a 180°

Material de prueba
Orinas normales, orinas patolócigas de pacientes

5. PROCEDIMIENTO
5.1 Obtención de las muestras:

- Orina normal colectada en condiciones asépticas en la primera micción de la mañana

- Orina patológica de pacientes con diabetes mellitus, galactosuria, lactosuria ó disacariduria.
- Centrifugar las muestras a analizar a 2500 rpm. por 5 minutos

5.2 Preparación de la placa de cromatografía:

Marcar suavemente con lápiz la placa (acetato) sobre la cual se va a desarrollar el proceso.

Marcar a 1cm con

Lápiz. Frente de
Corrida.

0.5 mm

Marcar a 1cm con

Lápiz. Punto de
Origen
Marcar a 1 cm desde el borde lateral, para la siembra.

5.3 Preparación de la cámara de cromatografía:

Saturar la cámara de cromatografía con el solvente seleccionada por lo menos 2 horas antes
del proceso. Es recomendable sellar la tapa colocando vaselina para permitir el vacío necesario
y lograr una excelente saturación.

5.4 Siembra de las muestras:

- En la línea que se demarcó como punto de origen en la placa, sembrar las muestras
(soluciones de patrones, mezclas de carbohidratos, orina normal u orina de pacientes)
preferiblemente en banda y en una cantidad de 0.5l y a una distancia de 0.8 mm.

- Una vez sembradas las muestras dejar secar la placa por lo menos 10 minutos, esto garantiza
que las siembras se fijen en la fase estacionaria.

- Colocar la placa seca en la cámara pre- saturada, situándola de manera que el punto de
origen quede hacia abajo en contacto con la fase móvil.

- Permitir el desarrollo de la cromatografía hasta el momento en que la fase móvil alcance el

punto marcado como frente de partida. Sacar la placa y secarla hasta que el solvente se
evapore totalmente (no se perciba el olor particular). Distribuir uniformemente sobre la placa
en un horno a 120 0C y dejar hasta que se empiecen a visualizar las bandas.
6. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

- Interpretar el cromatograma obtenido comparando el desplazamiento y color de las bandas

de los patrones con los de las muestras sembradas.

- Medir las relaciones de frente (Rf) para cada una de las bandas obtenidas
- Observe las estructuras cíclicas o de Haworth de los carbohidratos utilizados como patrones
(lactosa, glucosa, fructosa, galactosa) y de la xilosa que aparece en forma lineal o de Fischer
- Determinar la fórmula molecular y el peso molecular de cada una de ellas.
O

H OH CH2OH
CH2 OH
HO H O CH OH H O OH
H 2 H
H OH H OH OH H
HO OH HO H
OH H H OH
CH2OH CH2OH
HO O O OH
H
H H
OH H HO H
H H O H
H OH H HO
D-xilosa -D-fructofuranosa  -D-glucopiranosa -D-galactopiranosil--D-
glucopiranosa

Describa brevemente sobre las siguientes técnicas que permiten separar aminoácidos de una
mezcla:
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina de adsorción y de partición (normal y fase
invertida)
 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), describiendo las partes de un
cromatógrafo líquido.

9. BIBLIOGRAFÍA

 Apuntes sobre cromatografía. Bogotá: Pontificia Univerdiad Javeriana. Bioquímica.

Laboratorio e metabolopatías.
 Murray, Robert. Et al. Bioquímica de Harper. 15 ed. México, Manual Moderno.
 Lozano, J et al. Bioquímica y Biología molecular para ciencias de la salud. 2a edición.
MacGraw-Hill, Interamericana.
 Hicks, JJ. Bioquímica. McGraw-Hill, Interamericana.
 Almonacid, C.C, Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de
separación. 1º edición. Bogotá, Colombia. Imprenta Nacional.